專利名稱：發(fā)現(xiàn)用于前列腺癌診斷和治療之生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)的方法及其確立的生物標(biāo)志物測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于確立診斷癌癥(特別是前列腺癌，無論是局限性或非局限性前 列腺癌)及其治療和/或預(yù)后之生物標(biāo)志物測(cè)定和/或藥物靶標(biāo)的方法的領(lǐng)域。本發(fā)明 的另一目的是提出針對(duì)這些診斷目的和/或患者分級(jí)的特異性生物標(biāo)志物測(cè)定，以及使 用這些特異性生物標(biāo)志物測(cè)定進(jìn)行診斷的方法。
背景技術(shù)：
盡管經(jīng)過十年的研究努力，但前列腺癌的診斷和治療仍是臨床中的主要挑戰(zhàn)。 由于前列腺癌的完全消退與治愈僅在其早期階段才可能發(fā)生，因此令人遺憾地該疾病的 發(fā)展是“靜默(silent)”的，所以對(duì)較快發(fā)展和潛在危險(xiǎn)病變的早期檢測(cè)對(duì)于患者健康來 說至關(guān)重要。可用于前列腺癌的最佳的非侵入性診斷測(cè)試是檢測(cè)血液中的前列腺特異性抗原 (Prostate Specific Antigen, PSA)連同直腸指檢(digital rectalexamination, DRE)。 PSA
是前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。PSA也稱為激肽釋放酶IlKkallikreinlll)、精液素 (seminin)、semenogelase、Y -精漿蛋白以及P_30抗原，其為34kD糖蛋白，在正常男性
血清中少量存在，在前列腺癌和其它前列腺疾病中常有所升高。測(cè)量PSA的血液測(cè)試連 同DRE是前列腺癌早期檢測(cè)的現(xiàn)有最有效的測(cè)試。高于正常水平的PSA與局限性(Ioc) 和轉(zhuǎn)移性(met)前列腺癌(CaP)均有關(guān)。單獨(dú)使用PSA的診斷準(zhǔn)確性僅約為60%，并且該方法在特異性方面有明顯缺 點(diǎn)(太多的假陽(yáng)性病例接受不必要的前列腺活檢或手術(shù))。事實(shí)上，前列腺感染、刺激 (irritation),良性前列腺肥大(增大)或增生(BPH)以及最近射精也可導(dǎo)致PSA水平升 高，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，即使出現(xiàn)基于同時(shí)對(duì)多種參數(shù)(例如游離的和總的PSA)進(jìn)行測(cè)量的新方 法作為增加總體診斷準(zhǔn)確性的工具，但是仍缺乏可靠的、非侵入性的診斷/預(yù)后方法。 血液中的大多數(shù)PSA與血清蛋白結(jié)合。少量未與蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為游離的PSA。在患 前列腺癌的男性中，游離(非結(jié)合)PSA與總PSA的比值降低。如果游離PSA與總PSA 的比值低于25%，則癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加。比值越低，則發(fā)生前列腺癌的可能性越高。但是， 在射精后，總PSA和游離PSA均立刻增加，在24小時(shí)內(nèi)緩慢恢復(fù)到基線水平，并且與 CaP無關(guān)的其它機(jī)制也能夠影響游離PSA與總PSA的比值。與診斷類似地，由于前列腺癌的異質(zhì)性，對(duì)該疾病的治療和/或預(yù)后仍是巨大 的挑戰(zhàn)。盡管已提出前列腺癌癥的多種機(jī)制，但是缺少合適的能夠?qū)颊叻旨?jí)的特征標(biāo) 記(signature)，并且用于治療性干預(yù)治療的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白仍未有找到。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供確立用于對(duì)癌癥(特別是前列腺癌，無論是局限性或非局限性的前列腺癌)進(jìn)行診斷、預(yù)后、治療以及監(jiān)測(cè)治療和/或用于患者分級(jí)的生物 標(biāo)志物測(cè)定和/或藥物靶標(biāo)的經(jīng)改進(jìn)方法。應(yīng)當(dāng)指出，從原理的角度來看，本發(fā)明所提 出的方法不限于癌癥，而是可以應(yīng)用到任何類型的人或動(dòng)物疾病或功能失調(diào)。從實(shí)踐的 角度來看，僅有的限制有時(shí)在于，應(yīng)當(dāng)存在可用于下述轉(zhuǎn)換方法(tnmslational approach) 的模型系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)指出，不僅來自小鼠(或一般的動(dòng)物，例如非人模型)的候選物是本發(fā) 明的一部分。潛在的候選標(biāo)志物可從多種來源確定，還包括人組織、近端液(proximal fluid)、動(dòng)物模式細(xì)胞系、數(shù)據(jù)挖掘等。然而，在系統(tǒng)生物學(xué)方法更加一般化的背景下，動(dòng)物模型對(duì)于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物 具有非常獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。假定在不同癌癥(其影響不同的組織)中細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)被干擾。進(jìn)一 步假定，不同表現(xiàn)的癌癥可具有相同或重疊的干擾(perturbation)，動(dòng)物(如小鼠)模型允 許特異性地應(yīng)用一個(gè)孤立的干擾或限定的干擾組合來確定靶組織對(duì)該干擾如何響應(yīng)。如 果進(jìn)一步假定，構(gòu)成該響應(yīng)(干擾的直接作用，例如，如果激酶缺失或發(fā)生突變，則磷 酸肽缺失)的某些蛋白質(zhì)或補(bǔ)償性作用在靶組織中留下特異性指紋，則使用我們本文所 述的方法可在血清中檢測(cè)這些指紋中的一些。遺傳限定小鼠模型的明顯特點(diǎn)在于允許限 定與特定基因突變(在本申請(qǐng)中，如PTEN)有關(guān)的變化，所述突變是我們已知的在人類 癌癥中也存在的突變，并因而直接提示應(yīng)當(dāng)關(guān)注和治療的患者亞類(個(gè)體化醫(yī)療)。在規(guī) 劃臨床試驗(yàn)時(shí)，對(duì)于患病人群中分子標(biāo)志物種類的普遍程度和頻率具有扎實(shí)的了解常常 是重要的。可選擇那些很可能良好響應(yīng)的患者用于所謂“患者分級(jí)”方法中?；诖?信息，可以針對(duì)給定的嚴(yán)格的標(biāo)志物譜來估計(jì)可用人群的規(guī)模。對(duì)經(jīng)保存組織進(jìn)行的回 顧性研究例如允許在臨床階段設(shè)計(jì)必須確定之前快速并較早地測(cè)定那些參數(shù)。本發(fā)明的另一目的是提出用于這些診斷/治療/監(jiān)測(cè)/預(yù)后/患者分級(jí)目的的特 異性生物標(biāo)志物測(cè)定，以及使用這些特異性生物標(biāo)志物測(cè)定進(jìn)行診斷/治療/監(jiān)測(cè)/預(yù)后 /患者分級(jí)的方法。因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及用于確立對(duì)癌癥(或一般而言的疾病/功能失 調(diào))進(jìn)行診斷/治療/監(jiān)測(cè)/預(yù)后/患者分級(jí)之生物標(biāo)志物測(cè)定的方法，其包括下列步 驟 (a)基于對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的組織樣 品蛋白質(zhì)組以及血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身之樣品蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)/ 肽成分濃度(豐度)的測(cè)量，并定性地選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示明顯差異行 為的那些作為潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而鑒定出潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物 標(biāo)志物。如上指出地，在此步驟中，使用非人樣品不是必需的，此步驟也可以使用人來 源的樣品，如人組織、近端液等。任選地，此步驟之后可以進(jìn)行步驟(b)通過對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以 及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身之樣品蛋 白質(zhì)組中潛在的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行定量質(zhì)譜測(cè)量，并選擇在健康和癌癥樣品蛋 白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的定量差異行為的那些作為候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從 而對(duì)步驟(a)中鑒定出的潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)然，在此驗(yàn)證 步驟中，質(zhì)譜僅是一種測(cè)量方式并且也是優(yōu)選的測(cè)量方式。也可以使用與最終用于診斷/預(yù)后/治療之方法類似或相同的不同方法(例如使用親和試劑)。然后進(jìn)行步驟(C)通過對(duì)來自健康人個(gè)體以及來自患癌人個(gè)體的血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身之樣品蛋白質(zhì)組中的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)譜測(cè) 量和/或基于抗體的測(cè)定，并選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的和/ 或基于親和試劑之測(cè)定(優(yōu)選基于抗體之測(cè)定)可測(cè)得的差異行為的那些作為蛋白質(zhì)/肽 生物標(biāo)志物，從而對(duì)步驟(a)中鑒定出或者任選地步驟(b)中經(jīng)驗(yàn)證的候選蛋白質(zhì)/肽生 物標(biāo)志物進(jìn)行確認(rèn)；(d)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出經(jīng)步驟(C)確認(rèn)的單個(gè)或成組蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物作 為用于檢測(cè)癌癥患者之特征標(biāo)記。優(yōu)選地，基于親和試劑的測(cè)定是如上所述的基于抗體的測(cè)定方法/方式，并且 例如選用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或多重微珠陣列測(cè)定(Multiplex BeadArrayAssay)或
其它用于測(cè)量特定蛋白質(zhì)濃度的方法。如上所述，所述方法不僅可用于測(cè)定癌癥生物標(biāo)志物系統(tǒng)，還可用于測(cè)定針對(duì) 生物體之其它疾病或功能失調(diào)類型的生物標(biāo)志物系統(tǒng)。在上述方法(以及下文討論中)的 這些情形中，表述“癌癥”(例如，針對(duì)樣品來說)實(shí)質(zhì)上可以被表述“患病”或“功 能失調(diào)”所替代。因此，本發(fā)明的一個(gè)主旨是提高針對(duì)檢測(cè)(前列腺)癌癥之非侵入性診斷方法的 準(zhǔn)確性，另一方面是鑒定出用于臨床實(shí)踐的新的治療性/成像用靶標(biāo)。我們已建立了針 對(duì)(前列腺)癌癥生物標(biāo)志物和/或藥物靶標(biāo)鑒定的方案，其總結(jié)在圖1中，在下文中將 進(jìn)行詳細(xì)論述。該方法基于三個(gè)主要方面⑴基于使用遺傳限定小鼠模型在體內(nèi)最初鑒定出候選生物標(biāo)志物和/或藥物靶 標(biāo)、而后在人臨床樣品中進(jìn)行驗(yàn)證的轉(zhuǎn)換方法。(II)我們實(shí)驗(yàn)室建立的用于分離、鑒定和定量N-連接糖蛋白的領(lǐng)先的基于質(zhì)譜 之方法和生物信息學(xué)方法，以及(III)找出用于檢測(cè)前列腺癌癥患者的特定特征標(biāo)記的多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。根據(jù)所提出方法的第一優(yōu)選實(shí)施方案，其應(yīng)用于前列腺癌的診斷。為此目的， 所述癌癥樣品蛋白質(zhì)組選用患前列腺癌個(gè)體的樣品蛋白質(zhì)組。此外，組織樣品為前列腺 組織樣品，其中這些可以是局限性或非局限性前列腺癌的樣品。相應(yīng)地，選擇衍生的蛋 白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物用于診斷前列腺癌，可用于治療前列腺癌或監(jiān)測(cè)前列腺癌之治療。根據(jù)所提出方法的另一實(shí)施方案，在步驟(a)中，來自樣品蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)均 選用糖蛋白(優(yōu)選N-連接糖蛋白)，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)構(gòu)成了與癌癥藥物靶標(biāo)和生物標(biāo)志 物發(fā)現(xiàn)高度相關(guān)的蛋白質(zhì)組亞類。優(yōu)選地，在所述步驟(a)的第一步中，對(duì)相應(yīng)樣品的蛋白質(zhì)組進(jìn)行消化(優(yōu)選通 過使用胰蛋白酶和/或LysC(然而，其它消化系統(tǒng)也是可使用的)來實(shí)現(xiàn))，隨后使用固 相提取進(jìn)行提取(優(yōu)選使用SPEG法，其在下文中將更詳細(xì)地論述)。相應(yīng)地，所測(cè)定的 生物標(biāo)志物優(yōu)選為N-連接糖蛋白和/或其肽片段。理論上，至少對(duì)于步驟(a)以及特別地針對(duì)其組織樣品時(shí)可使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。 但是，為了更真實(shí)地模擬人疾病或功能失調(diào)的復(fù)雜性，優(yōu)選地選擇來自體內(nèi)來源的樣 品，并且最優(yōu)選地，所述非人哺乳動(dòng)物個(gè)體選用小鼠，優(yōu)選地，在分析和/或進(jìn)一步處理蛋白質(zhì)組之前，對(duì)步驟(a)中樣品的鼠前列腺組織進(jìn)行灌流以完全去除前列腺組織中的 血液(在其它疾病或功能失調(diào)的情形中，可以對(duì)相應(yīng)的組織或器官作類似處理)。如上 文已指出地，由于幾個(gè)原因，因此動(dòng)物模型是優(yōu)選的。該優(yōu)選方式的三個(gè) 主要原因如下所述-樣品是同質(zhì)的，即樣品來源的個(gè)體在遺傳上相同并具有相同的病變-病變對(duì)應(yīng)于在人癌癥中觀察到的病變，因此準(zhǔn)確地模擬腫瘤發(fā)展_重現(xiàn)性可以一再制備非常類似的樣品，而這對(duì)于人來說是不可能的-限定的干擾在人中，我們無法控制導(dǎo)致癌癥的干擾。在動(dòng)物模型中，可以 組織特異性和時(shí)間特異性的方式施加單個(gè)或組合的干擾。在步驟(a)中僅鑒定出蛋白質(zhì)/其片段之后，優(yōu)選地，僅選擇在健康和癌癥樣品 來源之間顯示非常明顯之差異行為的蛋白質(zhì)/其片段。為此目的，觀察所測(cè)量信號(hào)的差 異行為(豐度差異)，僅選擇那些顯示足夠差異行為的信號(hào)(對(duì)應(yīng)于特定蛋白質(zhì)/其片段) 用于下一步的進(jìn)一步評(píng)估。差異行為可以是這樣的情形，即當(dāng)比較健康與癌癥樣品信號(hào)時(shí)，特定信號(hào)充分 地增加/降低；然而，也可以是另一種情形，即在癌癥或健康樣品信號(hào)中沒有信號(hào)，但 分別在健康或癌癥樣品信號(hào)中有清晰可測(cè)的信號(hào)。因此，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，確 定步驟(a)中存在充分之差異行為的選擇標(biāo)準(zhǔn)選自以下的組在前列腺組織和血清中受調(diào)節(jié)的生物標(biāo)志物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并在血清 中檢出的潛在生物標(biāo)志物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并分泌的潛在生物標(biāo)志物；僅在癌癥 小鼠之前列腺組織和血清中檢出的潛在生物標(biāo)志物；前列腺特異性的并在癌組織或血清 中受調(diào)節(jié)的潛在生物標(biāo)志物；前列腺特異性的并且分泌的潛在生物標(biāo)志物；在前列腺組 織或血清中高度受調(diào)節(jié)的潛在生物標(biāo)志物，優(yōu)選地差異倍數(shù)大于4;基于現(xiàn)有知識(shí)選擇 的潛在生物標(biāo)志物，優(yōu)選地特征在于已知其在癌癥發(fā)展中的生物學(xué)功能；或者其組合， 優(yōu)選地使用這些標(biāo)準(zhǔn)中至少五個(gè)或最優(yōu)選地使用所有的組合。在這些優(yōu)選的具體標(biāo)準(zhǔn) 中，以下標(biāo)準(zhǔn)的組合能得到可最終用于人診斷/治療的生物標(biāo)志物系統(tǒng)在前列腺組織 和血清中受調(diào)節(jié)的生物標(biāo)志物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并在血清中檢出的潛在生物標(biāo)志 物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并分泌的潛在生物標(biāo)志物；在前列腺組織或血清中高度受調(diào) 節(jié)的潛在生物標(biāo)志物，優(yōu)選地差異倍數(shù)大于4;基于現(xiàn)有知識(shí)選擇的潛在生物標(biāo)志物， 優(yōu)選地特征在于已知其在癌癥發(fā)展中的生物學(xué)功能。優(yōu)選地，如果健康樣品信號(hào)與癌癥樣品信號(hào)之間的差異倍數(shù)大于1.5或小于 0.75，則進(jìn)行選擇(選擇意味著相應(yīng)的蛋白質(zhì)/其片段(意指蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的片段) 將進(jìn)入下一步驟)。這特別適用于上述選擇標(biāo)準(zhǔn)中的前三項(xiàng)。典型地，在步驟(a)中，第一步通過使用(鳥槍法)質(zhì)譜技術(shù)來鑒定樣品中蛋白 質(zhì)/經(jīng)消化蛋白質(zhì)的肽，第二步使用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(優(yōu)選無標(biāo)記的定量技術(shù)) 用于鑒定健康和癌癥樣品之間的性質(zhì)差異(通常為豐度差異)。優(yōu)選地，在步驟(a)中， 通過使用將質(zhì)譜信號(hào)對(duì)應(yīng)于特定蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)片段的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，將質(zhì)譜測(cè)得的蛋白 質(zhì)/蛋白質(zhì)片段信號(hào)歸于相應(yīng)的蛋白質(zhì)。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，在步驟(b)中，通過使用定量?jī)?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(優(yōu)選為專門 合成的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行絕對(duì)定量。
還優(yōu)選在步驟(b)和/或步驟(C)中使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，優(yōu)選為選擇反應(yīng)監(jiān) 測(cè)(selected reaction monitoring，SRM)，優(yōu)選與液相色譜聯(lián)用，作為質(zhì)譜方法。關(guān)于 使本說明書內(nèi)容在合理范圍內(nèi)的這些技術(shù)及其定義和參數(shù)，參考出版物RDomon和 R.Aebersold, Mass Spectrometry andProtein Analysis (Science 312，121 (2006))以及其中弓 I
用的相應(yīng)參考文獻(xiàn)。關(guān)于用于分析蛋白質(zhì)組的這些分析工具，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容明確包括在本說明書內(nèi)。本發(fā)明還涉及可使用上述方法確立的或使用此類方法特別確立的癌癥診斷生物 標(biāo)志物測(cè)定和/或治療性靶標(biāo)。特別地，這樣的生物標(biāo)志物測(cè)定和/或治療靶標(biāo)可以 在對(duì)相應(yīng)方法之說明的背景下由下文進(jìn)一步列舉的集合組成，所以例如針對(duì)局限性前列 腺癌的癌癥診斷/治療生物標(biāo)志物測(cè)定(用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌，特別是用于與良性 前列腺增生相區(qū)分)可以基于對(duì)人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中選自從以下衍 生的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段中至少兩種、優(yōu)選至少三種之濃度的聯(lián)合測(cè)量ASPN、 VTN、AOC3、LOX、PGCP> PSAP> THBSl、CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4、AKAP13、CP、CPE、CPM> ICAMl、MSMB> TM9SF3、GALNTL4。整個(gè)說明書中一般使用的基因名稱(此處給出的)、條目名稱、 蛋白質(zhì)名稱(縮寫)和登錄號(hào)根據(jù)UniProt Consortium(www.uniprot.org)定義，其包括歐 洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)、瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)資源(Protein Information Institute, PIR)。優(yōu)選地，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)量，優(yōu)選地使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，更優(yōu)選 與液相色譜和/或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)聯(lián)用，以檢測(cè)這些蛋白質(zhì)/其片段。本發(fā)明還涉及使用上述方法可確立的或使用此類方法特別確立的癌癥診斷生物 標(biāo)志物測(cè)定和/或治療性靶標(biāo)。特別地，這樣的生物標(biāo)志物測(cè)定和/或治療靶標(biāo)可以 在相應(yīng)方法之說明的背景下由下文進(jìn)一步列舉的集合組成，所以例如對(duì)局限性前列腺 癌的癌癥診斷/治療生物標(biāo)志物測(cè)定可以基于ASPN和任選地VTN與以下之一種的組 合AOC3、LOX、PGCP> PSAP> THBSU CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUU CTSD、OLFM4衍生的蛋白質(zhì)/其片段。此外，本發(fā)明涉及用于診斷、治療和/或治療性監(jiān)測(cè)(人體)疾病或功能失調(diào) (優(yōu)選癌癥，最優(yōu)選前列腺癌(局限性的或非局限性的))的癌癥診斷/治療生物標(biāo)志物測(cè) 定，其包括對(duì)人血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身中至少兩種、優(yōu)選至少三 種或至少5種蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物(例如根據(jù)上述方法進(jìn)行測(cè)定)。所述測(cè)定可以例如 是基于抗體的測(cè)定，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，但也可以是LC-SRM測(cè)定。為了提高這種癌癥診斷生物標(biāo)志物測(cè)定的可靠性，可以將其與基于親和試劑的 測(cè)定(例如用于檢測(cè)另外系統(tǒng)(如前列腺特異性抗原(PSA)的基于抗體的測(cè)定(如酶聯(lián) 免疫吸附分析(ELISA))聯(lián)用)。另外，此時(shí)也可使用例如利用微珠技術(shù)的針對(duì)一系列抗 體的多重測(cè)定技術(shù)。本發(fā)明還涉及通過測(cè)量(優(yōu)選聯(lián)合測(cè)量)人血清、血漿或任何其它血液衍生物 或血液本身中的ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段以及VTN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度來 診斷局限性前列腺癌的方法。為了提高準(zhǔn)確性，優(yōu)選進(jìn)行另一種(或甚至幾種)測(cè)量， 即測(cè)量選自從以下衍生的蛋白質(zhì)/其片段AOC3、LOX、PGCP> PSAP, THBS1。如果與PSA測(cè)量聯(lián)用，則另外的蛋白質(zhì)/其片段可額外選自CFH、CLU、KIT、TFRC、 LGALS3BP、G0LPH2。優(yōu)選地，在這樣的方法中，所述測(cè)量使用通常與在前的液相色譜技術(shù)聯(lián)用的串 聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(優(yōu)選地使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM))來進(jìn)行。作為替代或另外地，可以使用 基于抗體的測(cè)定(例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來檢測(cè)這些蛋白質(zhì)/其片段。可以 使用組合的方法，因此例如一個(gè)系統(tǒng)(或一組系統(tǒng))可以使用SRM (如果例如ELISA不 可用時(shí))來測(cè)定，而其余的系統(tǒng)可以使用基于抗體的技術(shù)(例如ELISA技術(shù))來測(cè)定。在這樣的方法中，通常對(duì)于局限性前列腺癌的陽(yáng)性診斷來說，ASPN衍生之蛋白 質(zhì)/其片段的濃度須高于55ng/ml，優(yōu)選地高于60ng/ml，任選地，與此同時(shí)，VTN衍生 之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于3500ng/ml，優(yōu)選地低于3300ng/ml。如果(根據(jù)優(yōu)選地)測(cè)量另一種上述額外系統(tǒng)，
則AOC3衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于250ng/ml，優(yōu)選地低于220ng/ ml,和/或LOX衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于580ng/ml，優(yōu)選地低于550ng/ ml,和/或PGCP衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于550ng/ml，優(yōu)選地高于570ng/ ml,和/或PSAP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于33000ng/ml，優(yōu)選地低于 32500ng/ml,更優(yōu)選地低于 32250ng/ml，和/或THBSl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于12500ng/ml，優(yōu)選地高于 13000ng/ml,更優(yōu)選地高于 13500ng/ml，和/或LGALS3BP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于390ng/ml，優(yōu)選地高于 400ng/ml,和/或GOLPH2衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于80ng/ml，優(yōu)選地高于 90ng/ml,和/或HYOUl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度必須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于 40ng/ml,和/或CTSD衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于32ng/ml，優(yōu)選地低于25ng/ ml,和/或OLFM4衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于20ng/ml，優(yōu)選地低于15ng/ ml,優(yōu)選地，在這樣的方法中，使用聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血液本 身中選自從以下衍生的至少3種蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段的濃度ASPN、HYOUU CTSD, OLFM4來進(jìn)行測(cè)量，用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌以 與良性前列腺增生相區(qū)別。對(duì)于診斷/監(jiān)測(cè)來說，優(yōu)選地使用基于親和試劑的測(cè)定(優(yōu) 選基于抗體的測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))額外地對(duì)人血清、血漿或血液衍生 物或血液本身中的前列腺特異性抗原(PSA)的濃度進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于陽(yáng)性診斷來說更優(yōu)選 地，前列腺特異性抗原(PSA)的濃度須高于2ng/ml，優(yōu)選地高于4ng/ml。在此背景下，對(duì)于局限性前列腺癌的陽(yáng)性診斷或監(jiān)測(cè)來說優(yōu)選地，ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度因而須高于55ng/ml，優(yōu)選地高于60ng/ml ；和/或HYOUI衍生 之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于40ng/ml ；和/或CTSD衍生之蛋 白質(zhì)/其片段的濃度須低于32ng/ml，優(yōu)選地低于25ng/ml ；和/或0LFM4衍生之蛋白 質(zhì)/其片段的濃度須低于20ng/ml，優(yōu)選地低于15ng/ml。應(yīng)指出，針對(duì)上文給出的閾值濃度以及下文的詳述，這些可取決于特定的測(cè)量 技術(shù)，例如本文所用的方法(即SRM)將測(cè)量所有種類(如游離的和結(jié)合的種類)，而例 如基于抗體的測(cè)定(如ELISA)則可能能夠區(qū)分這兩種形式，導(dǎo)致如果使用后一種方法的 話則出現(xiàn)不同的閾值濃度。因而本文給出的數(shù)值特別地涉及使用SRM方法的測(cè)量值，如 果使用不同的方法，則可能需要類推轉(zhuǎn)換。但這種轉(zhuǎn)換是在本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范疇之 內(nèi)的。本發(fā)明還涉及通過測(cè)量(優(yōu)選聯(lián)合測(cè)量)人血清、血漿或任何其它血液衍生物或 血液本身中的ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的 濃度并優(yōu)選地與測(cè)量選自從PSAP、GSPTl、CEACAMU HYOUl、EFNA5、KIT衍生
之另一種蛋白質(zhì)/其片段聯(lián)用的極高準(zhǔn)確性方法，用于診斷轉(zhuǎn)移性前列腺癌。優(yōu)選地，如上述用于診斷局限性前列腺癌的方法所述，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(優(yōu) 選地使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM))進(jìn)行測(cè)量，更優(yōu)選地與液相色譜和/或基于抗體的方法 (如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))聯(lián)用以用于檢測(cè)這些蛋白質(zhì)/其片段。對(duì)于非局限性(轉(zhuǎn)移性)前列腺癌的陽(yáng)性診斷來說，ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于60ng/ml，優(yōu)選地高于65ng/ml，最 優(yōu)選地高于68ng/ml，并且同時(shí)CTSD衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于120ng/ml，優(yōu)選地高于130ng/ml，最 優(yōu)選地高于133ng/ml，并且同時(shí)THBSl衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須低于12000ng/ml，優(yōu)選地低于11500ng/ ml,最優(yōu)選地低于10750ng/ml，并且同時(shí)GALNTL4衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于1400ng/ml，優(yōu)選地高于1600ng/ ml,最優(yōu)選地高于1650ng/ml，并且同時(shí)VTN衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于3000ng/ml，優(yōu)選地高于3150ng/ml，最 優(yōu)選地高于3300ng/ml。如果(根據(jù)優(yōu)選地)測(cè)量另一種上述額外系統(tǒng)， 則PSAP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于33000ng/ml，優(yōu)選地高于34000ng/ ml,和/或GSPT1衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于450ng/ml，優(yōu)選地高于 500ng/ml,更優(yōu)選地高于510ng/ml，和/或CEACAM1衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于 38ng/ml (此閾值是唯一根據(jù)ELISA測(cè)定計(jì)算出的值)， 和/或HYOUl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于80ng/ml，優(yōu)選地高于89ng/ ml, 和/或EFNA5衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于60ng/ml，優(yōu)選地高于65ng/ ml,
和/或KIT衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于90ng/ml，優(yōu)選地高于95ng/ ml ο如上所述，無論對(duì)于局限性或非局限性前列腺癌癥診斷來說，將對(duì)上述系統(tǒng)的 測(cè)量與對(duì)血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身中另一些參數(shù)(其并非上述生物 標(biāo)志物測(cè)定方法的結(jié)果)的測(cè)量聯(lián)用可以是有利的。例如，對(duì)于診斷來說，可以使用基 于抗體的測(cè)定(例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來額外地測(cè)量人血清、血漿或任何其它 血液衍生物或血液本身中的前列腺特異性抗原(PSA)，其中對(duì)于陽(yáng)性診斷來說，前列腺 特異性抗原(PSA)的濃度通常須高于2ng/ml，優(yōu)選地高于4ng/ml。本發(fā)明另外的實(shí)施方案列在后附的權(quán)利要求中。



在附圖中顯示了本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案圖1是用于發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和確認(rèn)生物標(biāo)志物之綜合蛋白質(zhì)組方法的總覽。該圖分 為兩個(gè)主要部分第一部分是使用動(dòng)物模型的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證階段，第二部分是使用人患者 樣品的確認(rèn)階段；斜體數(shù)字表示經(jīng)鑒定并考慮用于下一步的糖蛋白數(shù)；其中a)從來自 健康和癌癥小鼠的組織和血清中選擇性地富集N-糖肽，使用來自CaP小鼠模型的前列腺 組織來體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CaP特異性的特征標(biāo)記；這產(chǎn)生了一組785種糖蛋白作為后一步驟的來 源；對(duì)于同樣的鼠組織和血清樣品進(jìn)行基于質(zhì)譜的無標(biāo)記的定量；這得到352種糖蛋白 在癌癥和良性樣品間比較的相對(duì)定量；然后選出164種符合標(biāo)準(zhǔn)的糖蛋白用于進(jìn)一步的 研究；其中b)這些候選生物標(biāo)志物中的41種可以在小鼠血清中得以確認(rèn)，并且其中 C)通過基于質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)和ELISA在人患者中確認(rèn)了 43種候選物；通 常，人與動(dòng)物步驟間的界限是靈活的；例如，也可以在人樣品中進(jìn)行驗(yàn)證步驟，如果這 樣的收集確實(shí)有用的話；圖2顯示了小鼠糖蛋白質(zhì)組目錄(Mouse Glycoproteome Catalog)的總覽，其中在
小鼠前列腺組織和血清中鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)目用文氏圖(Venn diagram)顯示；下方顯示 了可進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)數(shù)；以及圖3顯示所選候選物在多參數(shù)方法中的區(qū)分準(zhǔn)確度；遵循通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件得 到的規(guī)律對(duì)患者進(jìn)行分類；正確預(yù)測(cè)的百分?jǐn)?shù)定義為該模型的準(zhǔn)確度；如上所示，基 因名稱根據(jù)UniProt Consortium (www.uniprot.org)來定義，其包括歐洲生物信息研究所 (EBI)、瑞士生物信息研究所(SIB)和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)資源(PIR)；第一行中陰影表示 的條目指示可在一個(gè)測(cè)定內(nèi)互換的系統(tǒng)。對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述參考附圖(其目的在于示意本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，而非限制本發(fā)明)，圖 1顯示用于發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和確認(rèn)生物標(biāo)志物之綜合蛋白質(zhì)組方法的總覽。該圖分為兩個(gè)主要 部分第一部分是使用動(dòng)物模型(小鼠)進(jìn)行的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證階段(a)和(b)，第二部分是 在人患者樣品中的確認(rèn)階段(C)。在以下實(shí)施例中，所述方法用于確定針對(duì)前列腺癌的生物標(biāo)志物。如上所述， 這不應(yīng)理解為本發(fā)明的實(shí)際要旨，因?yàn)楸痉椒梢缘韧貞?yīng)用于其它類型的癌癥(例如 乳腺癌、肺癌、卵巢癌等)，并且它還可以等同地一般性應(yīng)用于其它類型的疾病或功能失調(diào)(例如多尿癥(diabetes)(糖尿病(mellitus)或其它類型)；神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾 茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏病、克雅氏癥；自身免疫病，例如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎；感染性疾病，如瘧疾、HIV;心血管疾病，例如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化。 如上所述，使用動(dòng)物模型的主要優(yōu)勢(shì)在于可以施加特定的、限定的干擾，并測(cè)量這些干 擾的結(jié)果。同樣的干擾還可能與其它類型的癌癥相關(guān)，這意味著可以將標(biāo)志物視為所引 發(fā)之干擾的合理結(jié)果，而不是像“疾病相關(guān)的”這樣的一般性表述可表示的。在最初的發(fā)現(xiàn)階段，使用健康小鼠和前列腺癌小鼠的前列腺組織樣品、血清樣品或者兩者，因此有四個(gè)不同系列的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于差異行為的確定，僅對(duì)健康/癌癥小鼠 的組織樣品進(jìn)行比較，另一方面對(duì)健康/癌癥小鼠的血清樣品進(jìn)行比較。在第一步驟(a)中，使用胰蛋白酶對(duì)組織(如下詳述進(jìn)行制備)和血清樣品進(jìn)行 消化，從相應(yīng)蛋白質(zhì)組的消化產(chǎn)物中選出N-連接的糖基化蛋白質(zhì)，并使用SPEG技術(shù)進(jìn) 行提取(下文有詳細(xì)描述)。然后使用質(zhì)譜(特別地“鳥槍法”)進(jìn)行隨后的糖蛋白鑒定，在該階段無需確 定差異行為。這樣在前列腺組織中總共檢測(cè)到532種糖蛋白，在血清中檢測(cè)到253種糖 蛋白。總共檢測(cè)到785種糖蛋白，這是因?yàn)橛?10種蛋白質(zhì)同時(shí)在組織和血清中檢測(cè)到 (如圖2所示)。下一步使用無標(biāo)記的定量測(cè)定，其目的在于檢測(cè)蛋白質(zhì)片段信號(hào)的差異行為。 該實(shí)驗(yàn)是液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)，其中質(zhì)譜測(cè)量根據(jù)色譜的洗脫譜來進(jìn)行。使用此 實(shí)驗(yàn)，可以追蹤健康/癌癥樣品間的差異行為。該無標(biāo)記定量步驟中未顯示差異行為的 那些信號(hào)/蛋白質(zhì)片段從上述785種糖蛋白中排除，得到352種經(jīng)定量的蛋白質(zhì)，其中 279種來自組織樣品，160種來自血清樣品(如圖2所示)。對(duì)這352種經(jīng)定量的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步地選擇，僅保留那些顯示明顯差異行為 并符合下表1中所列及討論的8項(xiàng)依據(jù)中至少一項(xiàng)的蛋白質(zhì)。使用這些依據(jù)進(jìn)行篩選后， 得到164種潛在的候選生物標(biāo)志物系統(tǒng)，其通過使用電子注解(electronic annotation)將信 號(hào)對(duì)應(yīng)于特定的糖蛋白。在第二步驟(b)(其為任選的步驟)中，使用非人系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證或進(jìn)一步定性， 其中使用最終生物標(biāo)志物測(cè)定方法將要使用的最終分析工具。在此步驟(b)中，相應(yīng)地 僅對(duì)健康/癌癥小鼠的血清進(jìn)行分析，再次對(duì)其進(jìn)行消化并按照步驟(a)中所述提取糖蛋 白，但是隨后使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)(即液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜方法)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行絕對(duì)定 量，其使用專門提供(合成)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量。主要由于操作的原因，在進(jìn)入步驟(b)的164個(gè)系統(tǒng)中僅有41個(gè)可被絕對(duì)定 量。相應(yīng)的41個(gè)系統(tǒng)列在表2中，并在下文有更詳細(xì)的論述。因此，對(duì)于下一步來說，使用來自步驟(a)的所有164個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行最終的確認(rèn)步 驟(c)。步驟(b)的結(jié)果通過使用RT-PCR、免疫組化、Western印跡進(jìn)行驗(yàn)證。在步驟(c)中進(jìn)行與步驟(b)中幾乎相同的步驟，但此時(shí)使用人來源的健康/癌 癥個(gè)體的血清樣品。根據(jù)SRM測(cè)定，得到37個(gè)候選物?？赡軙r(shí)，使用現(xiàn)有的ELISA 測(cè)定對(duì)進(jìn)入步驟(C)的164個(gè)候選物進(jìn)行進(jìn)一步地驗(yàn)證，得到另外11個(gè)可能的候選物。由于某些系統(tǒng)來自SRM驗(yàn)證以及來自ELISA確認(rèn)，因此最終得到43個(gè)候選生 物標(biāo)志物系統(tǒng)。它們列在表3中。
理論上，可以將這些中任何一個(gè)以及可能地與一個(gè)或幾個(gè)聯(lián)用以用于檢測(cè)前列腺癌。由于 通過同時(shí)保持盡可能高的準(zhǔn)確性來減少必需的測(cè)量數(shù)，因此對(duì)全部43個(gè)系 統(tǒng)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(更詳細(xì)的討論見下文)，這與患者的數(shù)據(jù)收集相關(guān)聯(lián)，得到圖3中給 出的最終測(cè)定。圖3A)中給出了 5個(gè)準(zhǔn)確度特別高的測(cè)定，并注意到，在所有測(cè)定中都存在 ASPN和VTN。因此，相應(yīng)地，這些基因衍生的糖蛋白或這些糖蛋白的片段高度指示 出良性前列腺增生(BPH)和局限性前列腺癌(locPCa)之間的差別。相應(yīng)的準(zhǔn)確度高于 80%,因此約比現(xiàn)有技術(shù)中PSA方法的準(zhǔn)確度高出20%。額外引入使用ELISA的PSA測(cè)量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)還發(fā)現(xiàn)了區(qū)分BPH與IocPCa的
9個(gè)生物標(biāo)志物測(cè)定，如圖3B)所示。再次地，在所有這些系統(tǒng)中均存在ASPN和VTN 衍生的糖蛋白。這些聯(lián)合測(cè)量的準(zhǔn)確度比未采用PSA測(cè)量的方法又高出10%，最終得到 針對(duì)前列腺癌檢測(cè)的迄今尚未到達(dá)過的極高準(zhǔn)確度。額外引入使用ELISA的PSA測(cè)量和更多數(shù)據(jù)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)還發(fā)現(xiàn)了區(qū)分BPH 和IocPCa的5個(gè)生物標(biāo)志物測(cè)定，如圖3C)所示。在這些系統(tǒng)的每一個(gè)中，ASPN、 OLFM4、HYOUU CTSD衍生的糖蛋白中有三個(gè)存在于系統(tǒng)中。相應(yīng)的準(zhǔn)確度仍高于 80%,因此約比現(xiàn)有技術(shù)中PSA方法的準(zhǔn)確度高出20%。最后，圖3D)中給出了區(qū)分IocPCa與metCPa的生物標(biāo)志物測(cè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。 在每個(gè)測(cè)定中使用六個(gè)系統(tǒng)的聯(lián)合測(cè)量，可達(dá)到100%的準(zhǔn)確度。上文表明，本發(fā)明所提出的方法不僅為靶向開發(fā)高準(zhǔn)確度的生物標(biāo)志物測(cè)定提 供了強(qiáng)大的工具。此外，其還表明，針對(duì)前列腺癌的具體情形，本發(fā)明確立的生物標(biāo)志 物測(cè)定顯示出預(yù)料不到的高準(zhǔn)確度，其超出了迄今文獻(xiàn)中所報(bào)道的任何準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)⑴轉(zhuǎn)換方法該轉(zhuǎn)換方法基于在前列腺癌小鼠模型中對(duì)感興趣的候選生物標(biāo)志 物進(jìn)行最初鑒定，并將這些候選物在人臨床樣品中進(jìn)行確認(rèn)。為了鑒定將要用于臨床中 的候選生物標(biāo)志物(稱為“診斷或治療靶標(biāo)”)，我們開始分析來自患前列腺癌的遺傳限 定小鼠(Pten條件性敲除(cKO)，例如見US 2006/0064768)以及具有完好的Pten等位基 因并且未患這種腫瘤的對(duì)照小鼠的前列腺組織和血液。使用小鼠模型的依據(jù)我們決定使用遺傳限定的Pten條件性敲除模型是因?yàn)檫@ 些小鼠在腫瘤抑制基因Pten缺失后發(fā)生早期上皮前列腺癌。其表型與人局限性前列腺癌 非常相關(guān)，因此成為鑒定能夠區(qū)分人局限性前列腺癌和良性增生病變(良性前列腺增生 或BPH)的新型生物標(biāo)志物的理想起點(diǎn)。并且，使用Pten cKO小鼠模型允許鑒定將要特 異性用于對(duì)具有PTEN突變或任何源自PTEN信號(hào)途徑中突變之失衡的患者進(jìn)行分級(jí)的治 療性/成像靶標(biāo)和生物標(biāo)志物。使用小鼠模型有利于對(duì)候選生物標(biāo)志物進(jìn)行最初鑒定， 因?yàn)榍傲邢俳M織非常同質(zhì)性，并且主要變量(如環(huán)境條件和時(shí)間進(jìn)程)可以被控制，其與 高度異質(zhì)性的人組織不同。令人感興趣的是，與人相比，小鼠中前列腺癌組織體積與血 液總體積的比值要高出40 40000倍。這當(dāng)然是內(nèi)在的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)轭A(yù)期該模型中血液蛋 白質(zhì)組中的變化比人患者樣品中更容易發(fā)現(xiàn)。最后，只有鼠組織可以為了消除血液污染 物而有效地進(jìn)行灌注(見下文)。組織中的血液蛋白質(zhì)污染物常常掩蓋濃度特別低的蛋白質(zhì)的鑒定。并且，灌注后的組織中沒有血液使得可以進(jìn)行沒有任何潛在偏向性的比較蛋 白質(zhì)組學(xué)(血液-組織)(見表1，依據(jù)1、2、4、7)。
權(quán)利要求
1.確立癌癥診斷/預(yù)后生物標(biāo)志物測(cè)定的方法，其包括以下步驟(a)基于對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的組織樣品蛋 白質(zhì)組以及血清、血漿或血液衍生物或血液本身之樣品蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)/肽成分濃度 的測(cè)量，并定性地選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示明顯差異行為的那些作為潛在 的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而鑒定出潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物和藥物靶 標(biāo)；(b)任選地，通過對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的血 清、血漿或血液衍生物或血液本身之樣品蛋白質(zhì)組中潛在的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行 定量質(zhì)譜測(cè)量，并選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的定量差異行為 的那些作為候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而對(duì)步驟(a)中鑒定出的潛在的候選蛋白質(zhì)/ 肽生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證；(c)通過對(duì)來自健康人個(gè)體以及來自患癌人個(gè)體的血清、血漿或血液衍生物或血液 本身之樣品蛋白質(zhì)組中的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量和/或基于親和試劑的測(cè) 定，并選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的和/或基于親和試劑之測(cè) 定可測(cè)得的差異行為的那些作為蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而對(duì)步驟(a)中鑒定出或者任 選地步驟(b)中經(jīng)驗(yàn)證的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物進(jìn)行確認(rèn)；(d)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出經(jīng)步驟(c)確認(rèn)的單個(gè)或成組蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物作為用 于檢測(cè)癌癥患者和/或用于癌癥預(yù)后和/或患者分級(jí)的特征標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥樣品蛋白質(zhì)組是患前列腺癌個(gè)體的樣品 蛋白質(zhì)組，其中所述組織樣品是前列腺組織樣品，其中優(yōu)選地使用局限性或非局限性前 列腺癌的樣品，并且其中選擇所述蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物用于前列腺癌的診斷，和/或，其中在步驟(a)中，來自樣品蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)全部選用糖蛋白，優(yōu)選 N-連接的糖蛋白，并且其中優(yōu)選地在第一步中，消化樣品之蛋白質(zhì)組，優(yōu)選使用胰蛋 白酶和/或Lys C進(jìn)行消化，隨后使用固相提取進(jìn)行提取，并且其中所述生物標(biāo)志物是 N-連接的糖蛋白和/或其肽片段，和/或其中所述非人哺乳動(dòng)物個(gè)體是小鼠，并且其中優(yōu)選地在分析和/或進(jìn)一步處理 蛋白質(zhì)組之前，對(duì)步驟(a)中樣品之小鼠前列腺組織進(jìn)行灌注以完全去除前列腺組織中的 血液。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)的選擇標(biāo)準(zhǔn)選自在前列腺組織和血清中受調(diào)節(jié)的潛在生物標(biāo)志物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并在血清中檢出的潛在生物標(biāo)志物；在前列腺組織中受調(diào)節(jié)并分泌的潛在生物標(biāo)志物；僅在癌癥 小鼠之前列腺組織和血清中檢出的潛在生物標(biāo)志物；前列腺特異性的并在癌癥組織或血 清中受調(diào)節(jié)的潛在生物標(biāo)志物；前列腺特異性的并且分泌的潛在生物標(biāo)志物；在前列 腺組織或血清中高度受調(diào)節(jié)的潛在生物標(biāo)志物，優(yōu)選地差異倍數(shù)大于4;基于現(xiàn)有知識(shí) 選擇的潛在生物標(biāo)志物，優(yōu)選地特征在于已知其在癌癥發(fā)展中的生物學(xué)功能；或者其組 合，優(yōu)選地使用這些標(biāo)準(zhǔn)中至少五種或最優(yōu)選地使用所有這些標(biāo)準(zhǔn)的組合，并且其中優(yōu)選地如果健康樣品信號(hào)與癌癥樣品信號(hào)之間的差異倍數(shù)大于1.5或小于 0.75、更優(yōu)選地大于1.75和小于0.5，則進(jìn)行選擇。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)中，第一步中通過使用鳥槍法質(zhì)譜技術(shù)來鑒定樣品中的蛋白質(zhì)/經(jīng)消化的肽，第二步中使用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技 術(shù)、優(yōu)選無標(biāo)記的定量技術(shù)來鑒定健康和癌癥樣品之間差異性質(zhì)，和/或，其中在步驟(b)中，通過使用定量?jī)?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)、優(yōu)選專門合成的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 絕對(duì)定量，和/或，其中在步驟(b)中和/或在步驟(C)中，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、優(yōu)選地使用選 擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)、優(yōu)選與液相色譜聯(lián)用來作為質(zhì)譜方法，和/或，其中在步驟(a)中，通過使用數(shù)據(jù)庫(kù)信息將質(zhì)譜檢測(cè)出的蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)片 段信號(hào)對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)中所述基于親和試劑的方 法/測(cè)定是基于抗體的方法/測(cè)定，優(yōu)選地選用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或多重微珠 陣列測(cè)定。
6.使用前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法能夠確立和/或確立的癌癥診斷和/或治療 和/或預(yù)后和/或患者分級(jí)用生物標(biāo)志物測(cè)定。
7.用于診斷和/或治療前列腺癌的癌癥診斷和/或治療和/或預(yù)后和/或患者分級(jí)用 生物標(biāo)志物測(cè)定，其包括在人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中測(cè)量根據(jù)權(quán)利要求 1-5之一項(xiàng)方法確定的至少兩種、優(yōu)選至少三種蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，并優(yōu)選地與用于 檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)的基于親和試劑的測(cè)定、優(yōu)選基于抗體的測(cè)定例如酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定(ELISA)聯(lián)用。
8.用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌、特別是用于與良性前列 腺增生相區(qū)別的方法，其使用聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中選自從 以下衍生之蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段中至少2種、優(yōu)選至少3種的濃度ASPN、VTN、 AOC3、LOX > PGCP > PSAP > THBSl、CFH > CLU、KIT、TFRC > LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4、AKAP13、CP、CPE、CPM> ICAMl、MSMB> TM9SF3、GALNTL4。其中優(yōu)選地，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、優(yōu)選地使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)、更優(yōu)選與液相 色譜和/或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)聯(lián)用來檢測(cè)這些蛋白質(zhì)/其片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌的 方法，其使用聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中的ASPN衍生之蛋白質(zhì) /其片段的濃度，任選地與VTN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的測(cè)量聯(lián)合，優(yōu)選地與選自從以 下衍生的另一種蛋白質(zhì)/其片段的測(cè)量聯(lián)合AOC3、LOX、PGCP、PSAP, THBSU CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4,其中優(yōu)選地對(duì)于局限性前列腺癌的陽(yáng)性診斷或監(jiān)測(cè)來說，ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于55ng/ml，優(yōu)選地高于60ng/ml，并且同時(shí)，其中，如果根據(jù)優(yōu)選地進(jìn)行額外測(cè)量的話，則VTN衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須低于3500ng/ml，優(yōu)選地低于3300ng/ml，AOC3衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于250ng/ml，優(yōu)選地低于220ng/ml，和/或LOX衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于580ng/ml，優(yōu)選地低于550ng/ml，和/或PGCP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于550ng/ml，優(yōu)選地高于570ng/ml，和/或PSAP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于33000ng/ml，優(yōu)選地低于32500ng/ ml,最優(yōu)選地低于32250ng/ml，和/或THBSl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于12500ng/ml，優(yōu)選地高于 13000ng/ml,最優(yōu)選地高于 13500ng/ml，和/或LGALS3BP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于390ng/ml，優(yōu)選地高于 400ng/ml,和/或GOLPH2衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于80ng/ml，優(yōu)選地高于90ng/ml,和/或HYOUl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于40ng/ml， 和/或CTSD衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于32ng/ml，優(yōu)選地低于25ng/ml， 和/或OLFM4衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于20ng/ml，優(yōu)選地低于15ng/ml。
10.用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌以用于與良性前列腺 增生相區(qū)別的方法，其使用聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中選自從 ASPN、HYOUU CTSD、OLFM4衍生的至少3種蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段的濃度，并 且其中為了診斷/監(jiān)測(cè)，使用基于親和試劑的測(cè)定、優(yōu)選基于抗體的測(cè)定例如酶聯(lián)免疫 吸附測(cè)定(ELISA)額外地測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血液本身中前列腺特異性抗 原(PSA)的濃度，并且其中優(yōu)選地對(duì)于陽(yáng)性診斷來說，前列腺特異性抗原的濃度須高于 2ng/ml、優(yōu)選地高于4ng/ml。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌 的方法，其中對(duì)于局限性前列腺癌的陽(yáng)性診斷或監(jiān)測(cè)來說ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于55ng/ml，優(yōu)選地高于60ng/ml， 和/或HYOUl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于40ng/ml， 和/或CTSD衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于32ng/ml，優(yōu)選地低于25ng/ml， 和/或OLFM4衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須低于20ng/ml，優(yōu)選地低于15ng/ml。
12.用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)非局限性前列腺癌、特別是用于與局限 性前列腺癌相區(qū)別的方法，其通過使用優(yōu)選地聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生物或血 液本身中ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃 度，其中優(yōu)選地使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、優(yōu)選地使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)、更優(yōu)選地與液相 色譜和/或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)聯(lián)用來檢測(cè)這些蛋白質(zhì)/其片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)非局限性前列腺 癌癥的方法，用于與局限性前列腺癌相區(qū)別，其使用聯(lián)合測(cè)量人血清、血漿或血液衍生 物或血液本身中ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白質(zhì)/其片段 的濃度，優(yōu)選地與測(cè)量選自從PSAP、GSPTl、CEACAMU HYOUl、EFNA5、KIT衍 生的另一種蛋白質(zhì)/其片段聯(lián)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用于診斷和/或用于治療和/或用于監(jiān)測(cè)非局限性 前列腺癌的方法，其中對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的陽(yáng)性診斷來說ASPN衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于60ng/ml，優(yōu)選地高于65ng/ml，最優(yōu)選 地高于68ng/ml，并且同時(shí)CTSD衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于120ng/ml，優(yōu)選地高于130ng/ml，最優(yōu)選 地高于133ng/ml，并且同時(shí)THBSl衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須低于12000ng/ml，優(yōu)選地低于11500ng/ml，最 優(yōu)選地低于10750ng/ml，并且同時(shí)GALNTL4衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于1400ng/ml，優(yōu)選地高于1600ng/ml， 最優(yōu)選地高于1650ng/ml，并且同時(shí)VTN衍生之蛋白質(zhì)/片段的濃度須高于3000ng/ml，優(yōu)選地高于3150ng/ml，最優(yōu)選 地高于 3300ng/ml。其中如果根據(jù)優(yōu)選地進(jìn)行額外測(cè)量的話，則PSAP衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于33000ng/ml，優(yōu)選地高于34000ng/ml,和/或GSPTl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于450ng/ml，優(yōu)選地高于500ng/ ml,更優(yōu)選地高于510ng/ml，和/或CEACAM1衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于35ng/ml，優(yōu)選地高于38ng/ ml (此閾值是唯一根據(jù)ELISA測(cè)定計(jì)算出的值)，和/或HYOUl衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于80ng/ml，優(yōu)選地高于89ng/ml， 和/或EFNA5衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于60ng/ml，優(yōu)選地高于65ng/ml， 和/或KIT衍生之蛋白質(zhì)/其片段的濃度須高于90ng/ml，優(yōu)選地高于95ng/ml。
15.根據(jù)權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)于診斷/監(jiān)測(cè)來說，使用基于 親和試劑的測(cè)定、優(yōu)選基于抗體的測(cè)定例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)額外地測(cè)量人血 清、血漿或血液衍生物或血液本身中前列腺特異性抗原(PSA)的濃度，并且其中對(duì)于陽(yáng) 性診斷來說，所述前列腺特異性抗原的濃度須高于2ng/ml，優(yōu)選地高于4ng/ml，并且其 中特別地針對(duì)診斷/監(jiān)測(cè)局限性前列腺癌來說，所述前列腺特異性抗原的濃度優(yōu)選地須 高于2ng/ml，優(yōu)選地高于5ng/ml，最優(yōu)選地高于8ng/ml，并且其中對(duì)于非局限性前列腺 癌的陽(yáng)性診斷來說，所述前列腺特異性抗原的濃度優(yōu)選地須高于lOOng/ml，優(yōu)選地高于 150ng/ml,更優(yōu)選地高于175ng/ml。
16.權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)之方法用于分期和/或診斷目的的用途，特別地用于局限 性前列腺癌的早期檢測(cè)和診斷，和/或用于治療選擇和/或用于治療監(jiān)測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于確立癌癥診斷/治療用生物標(biāo)志物測(cè)定和藥物靶標(biāo)的方法，其包括下列步驟(a)基于對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的組織樣品蛋白質(zhì)組以及血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身樣品蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)/肽成分濃度的測(cè)量，并定性地選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示明顯差異行為的那些作為潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而鑒定潛在的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)；(b)任選地，通過對(duì)來自健康非人哺乳動(dòng)物個(gè)體以及來自患癌非人哺乳動(dòng)物個(gè)體的血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身樣品蛋白質(zhì)組中潛在的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行定量質(zhì)譜測(cè)量，并選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的定量差異行為的那些作為候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而對(duì)步驟(a)中鑒定出的潛在候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證；(c)通過對(duì)來自健康人個(gè)體以及來自患癌人個(gè)體的血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身樣品蛋白質(zhì)組中的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量和/或基于抗體的測(cè)定(如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))，并選擇在健康和癌癥樣品蛋白質(zhì)組間顯示出質(zhì)譜可測(cè)得的和/或基于抗體之測(cè)定可測(cè)得的差異行為的那些作為蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物，從而對(duì)步驟(a)中鑒定出或者任選地步驟(b)中驗(yàn)證的候選蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物進(jìn)行確認(rèn)；(d)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出經(jīng)步驟(c)確認(rèn)的單個(gè)或成組蛋白質(zhì)/肽生物標(biāo)志物作為用于檢測(cè)癌癥患者之特征標(biāo)記。本發(fā)明還涉及使用人血清、血漿或任何其它血液衍生物或血液本身對(duì)癌癥(特別是局限性或非局限性前列腺癌)進(jìn)行高度可靠之診斷的特異性生物標(biāo)志物測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102027373SQ200980117399
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者伊戈?duì)枴の黢R, 威廉·克雷克, 托馬斯·塞爾尼, 拉爾夫·席斯, 西爾克·吉勒森, 魯?shù)婪颉ぐ２鳡柕?申請(qǐng)人:圣加倫州立醫(yī)院, 埃斯蘇黎世公司