專(zhuān)利名稱(chēng)：用于進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法、試劑盒和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于定量測(cè)量樣品中的細(xì)胞量的方法、試劑盒和系統(tǒng)。 現(xiàn)有技術(shù)以下是被認(rèn)為與描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的技術(shù)狀態(tài)有關(guān)的技術(shù)的清單。(1)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第W006/065350號(hào)(金佰利國(guó)際公司(Kimberly Clark Worldwide Inc.))(2)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第06U850號(hào)(日本密理博株式會(huì)社(Nihon Millipore Kogyo KK))(3)美國(guó)專(zhuān)利第5，258，285號(hào)(福斯電器控股公司(Foss Electric Holding AS))(4)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第2008014607號(hào)(5)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第W092/(^632號(hào)(新銳爾公司(Sierra Cytometry))(6)瓊斯 D. L. (Jones, D. L. )，Μ. Α.布萊斯福德(Μ. A. BraiIsford)和 J. _L.多克 特(J.-LDrocourt). 1999.固相激光掃描細(xì)胞術(shù)用于計(jì)數(shù)制藥用水中的微生物的新兩 小時(shí)方法(Solid-phase, laser-scanning cytometry :a new two-hour method for the enumeration of microorganisms in pharmaceutical water). M Mi^lii, (Pharmacop. Forum)25 :7626-764背景技術(shù)：
樣品、尤其是液體樣品中生物實(shí)體的定量測(cè)量對(duì)于測(cè)定污染和感染的程度、疾病 狀態(tài)等極為重要。例如，在微生物學(xué)中是利用菌落形成單位(CFU/ml)來(lái)度量細(xì)菌或真菌數(shù)量。盡管微生物包括孢子、無(wú)活性(不可培養(yǎng))微生物和可繁殖微生物等形式，但僅定 量可繁殖微生物的方式具有重要意義。例如，在食品和飲料工業(yè)的質(zhì)量控制過(guò)程、與消費(fèi)者 接觸的物品(例如醫(yī)藥品和個(gè)人護(hù)理品)的制造、水生系統(tǒng)(例如河流湖泊和海洋)的環(huán) 境保護(hù)、公共安全性(例如，城市供水系統(tǒng)；水井；例如水池溫泉和海灘等娛樂(lè)用水的細(xì)菌 監(jiān)測(cè))各種工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程、保健相關(guān)性感染和醫(yī)療護(hù)理規(guī)定中，可繁殖微生物的定量是一 個(gè)重要問(wèn)題。分裂的(可培養(yǎng))微生物的定量通常是基于細(xì)菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)的專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室程 序。需要在較長(zhǎng)的培育時(shí)間內(nèi)維持使微生物在固體和液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特定條件，并在 培育結(jié)束時(shí)，測(cè)定CFU (CFU/ml)。在實(shí)驗(yàn)室中，CFU通常是根據(jù)稀釋次數(shù)和樣品體積使計(jì)數(shù) 的菌落的總數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)計(jì)算。這種方法需要實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、有資質(zhì)的工作人員以及可能持 續(xù)一天到一個(gè)月的較長(zhǎng)的時(shí)間。盡管此方法涉及耗人力且耗時(shí)的工作，但CFU仍是目前管 理機(jī)構(gòu)認(rèn)可的進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。此項(xiàng)技術(shù)中提供了多種方法來(lái)檢測(cè)測(cè)試樣品中的微生物，作為細(xì)胞計(jì)數(shù)的替代方 法，這些方法中利用了顏色或熒光標(biāo)記。例如，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第W006/065350號(hào)(金佰利國(guó)際公司(Kimberly ClarkWorldwide Inc.))描述了一種半定量或定量檢測(cè)所提供的樣品中微生物的存在的方法。 此方法利用了一種測(cè)試染料，其在一種或一種以上微生物存在下會(huì)出現(xiàn)可檢測(cè)的顏色改 變。例如，所述測(cè)試染料是一種會(huì)對(duì)微生物組分(例如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)與細(xì)胞外部的環(huán) 境之間的極性差異起反應(yīng)的溶劑化變色染料(solvatochromic dye)(例如雷查特氏染料 (Reichardt‘ s dye))。歐洲專(zhuān)利第EP0612850號(hào)描述了一種測(cè)定樣品溶液中活的微生物細(xì)胞的數(shù)量的 方法，其包含使樣品溶液濾過(guò)具有疏水性的濾膜，以將微生物截留在疏水障壁內(nèi)；向其中施 加ATP提取劑的細(xì)霧以提取出微生物中的發(fā)光成分；向其中再施加針對(duì)所提取的發(fā)光成 分的液體發(fā)光誘導(dǎo)劑的細(xì)霧，以使所述成分發(fā)光；和使用能夠測(cè)量發(fā)光量的構(gòu)件，測(cè)量發(fā)光量。美國(guó)專(zhuān)利第5，258，285號(hào)描述了一種測(cè)定包含細(xì)菌和體細(xì)胞的細(xì)胞群中細(xì)菌的
數(shù)量的方法。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第US2008/014607號(hào)描述了一種用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)液體樣品 中可能存在的指定種類(lèi)的活細(xì)胞的基于生物發(fā)光的方法，其包含測(cè)量指定的非病毒種類(lèi)的 活細(xì)胞中以ATP形式表達(dá)的總游離細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸(adenyl nucleotide, AN)的含量。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第W092/20263號(hào)描述了 一種用于檢測(cè)、鑒別和/或計(jì)數(shù)牛奶 中活細(xì)胞的方法，其中用熒光染料(例如酯酶依賴(lài)性染料、核酸結(jié)合性染料，和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) 氧化活性的染料)選擇性標(biāo)記活細(xì)胞，隨后進(jìn)行鑒別和/或計(jì)數(shù)。美國(guó)專(zhuān)利第7，312，073號(hào)描述了一種用于定量活細(xì)胞的方法，其中將并入標(biāo)記物 的溶膠-凝膠液體前體貫穿固定于載玻片上作為薄層涂層。在培育期間，使所述載玻片與 含有從測(cè)試樣品中分離的微生物的過(guò)濾器接觸。在培育過(guò)程中，微生物將攝取一個(gè)或一個(gè) 以上標(biāo)記物。隨后照射載玻片，并檢測(cè)由微生物中所含的標(biāo)記物發(fā)射的信號(hào)，由此產(chǎn)生影像 以供微生物的檢測(cè)計(jì)數(shù)。另外，用于計(jì)數(shù)制藥用水中微生物的兩小時(shí)方法描述于瓊斯(Jones)等人(藥典 論壇(Pharmacop. Forum) 1999，25，7626-7645))中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于細(xì)胞膜動(dòng)力學(xué)的利用，根據(jù)細(xì)胞膜動(dòng)力學(xué)，可培養(yǎng)(分裂的)細(xì)胞將 持續(xù)進(jìn)行膜運(yùn)輸。本發(fā)明者現(xiàn)設(shè)想，在可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞中，細(xì)胞膜內(nèi)化，與內(nèi)部的膜隔 室融合，隨后以比非分裂細(xì)胞高得多的速率再并入膜中。具體點(diǎn)說(shuō)，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)利用能夠締合膜并內(nèi)化于微生物細(xì)胞的細(xì)胞 內(nèi)隔室中的熒光染料對(duì)微生物細(xì)胞染色，使得所述染料在細(xì)胞內(nèi)積累。此內(nèi)化過(guò)程具有一 個(gè)特有的特征，即，在第一時(shí)間段Tl后，積累達(dá)到平穩(wěn)的平臺(tái)期，并且在特有的第二時(shí)間段 T2中，積累量穩(wěn)定保持此平臺(tái)期。另外，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)對(duì)于指定的微生物細(xì)胞類(lèi)型或一組微生物細(xì)胞，第 一時(shí)間段Tl與第二時(shí)間段T2是某一(某些)細(xì)胞類(lèi)型所特有的。換句話(huà)說(shuō)，對(duì)于指定的 細(xì)胞類(lèi)型(或一組細(xì)胞)，當(dāng)在相同的預(yù)定條件下測(cè)量時(shí)，Tl與T2將基本上保持恒定。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種測(cè)定指示測(cè)試樣品中可培養(yǎng)的微 生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的方法，所述方法包含
(i)使容易攜帶可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微生 物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(Tl)，所述第一時(shí)間段 (Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信號(hào)基 本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(Tl)后，于第二時(shí)間段(T2)期間，且在此期間所述信號(hào) 基本上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞，所述 檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目 的數(shù)量值。本發(fā)明也提供一種用于測(cè)定測(cè)試樣品中等于可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞數(shù)目的數(shù)量值 的試劑盒，所述試劑盒包含(i)至少一種能夠締合微生物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑，(ii)有關(guān)使所述至少一種信號(hào)發(fā)射劑與所述樣品接觸達(dá)第一時(shí)間段(Tl)的說(shuō) 明，所述第一時(shí)間段(Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所 述樣品發(fā)射的信號(hào)基本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(iii)有關(guān)從所述樣品中去除未締合的信號(hào)發(fā)射劑的說(shuō)明；(iv)有關(guān)由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)和選擇發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞的說(shuō)明， 所述檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)，所述檢測(cè)和選擇是在所述Tl后 于第二時(shí)間段0 期間進(jìn)行，并且在此期間，所述信號(hào)基本上保持在所述平臺(tái)期；(ν)有關(guān)使用所述所選的信號(hào)發(fā)射物體來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目 的數(shù)量值的說(shuō)明。本發(fā)明還提供一種用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量 值的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含(i)載體，其用于保存樣品，并允許樣品與一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑接觸；(ii)檢測(cè)器，其用于檢測(cè)樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體，并輸出其對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)；(iii)存儲(chǔ)單元，其包含具有預(yù)定的選擇參數(shù)和多個(gè)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)化因子的數(shù)據(jù)庫(kù)， 每一選擇參數(shù)和每一標(biāo)準(zhǔn)化因子對(duì)于某一微生物細(xì)胞或?qū)τ谀骋唤M微生物細(xì)胞具有特異 性；(iv)處理單元，其用于接收來(lái)自所述檢測(cè)器的輸出數(shù)據(jù)、來(lái)自所述存儲(chǔ)單元的一 個(gè)或一個(gè)以上所述參數(shù)和所述標(biāo)準(zhǔn)化因子，并用所述參數(shù)和所述標(biāo)準(zhǔn)化因子處理所述輸出 數(shù)據(jù)，以測(cè)定所述樣品中指示所述可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。本發(fā)明還提供一種機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，其明確地實(shí)施可由所述機(jī)器執(zhí)行的 指令程序，以執(zhí)行用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的方法， 所述方法包含(i)使容易攜帶可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的所述測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微 生物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(Tl)，所述第一時(shí)間 段(Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信 號(hào)基本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；
(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(Tl)后，于第二時(shí)間段(T2)期間，且在此期間所述信 號(hào)基本上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)和選擇發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì) 胞，所述檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目 的數(shù)量值。此外，也提供一種計(jì)算機(jī)程序，其包含當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)執(zhí)行本發(fā)明 所有步驟的計(jì)算機(jī)程序代碼構(gòu)件，所述計(jì)算機(jī)程序是在程序存儲(chǔ)裝置中實(shí)施。


為了解本發(fā)明并且看其實(shí)際上如何進(jìn)行，現(xiàn)將僅通過(guò)非限制性實(shí)例，參考附圖來(lái) 描述實(shí)施例。圖1是展示作為樣品的時(shí)間函數(shù)的熒光強(qiáng)度的圖，所述樣品包含來(lái)源于城市用水 的細(xì)菌細(xì)胞(-■“)、分離的大腸桿菌(- “)和綠膿桿菌(-▲“)的混合物，其熒經(jīng)光染 料FM1-43染色。圖2是繪制樣品中微生物細(xì)胞的CFU/ml計(jì)數(shù)相對(duì)于同一樣品中微生物細(xì)胞的量 的定量測(cè)量的圖，所述定量測(cè)量是通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)獲得。圖3A-;3B是展示通過(guò)常規(guī)方法所獲得的CFU/ml計(jì)數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)CFU/ml)與根據(jù)本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施例所獲得的CFU當(dāng)量之間的相關(guān)性(圖3A)以及每一測(cè)試樣品各值(CFU當(dāng) 量與常規(guī)CFU/ml)之間的相關(guān)性(圖:3B)。表2中的結(jié)果也繪制成圖，以圖3A( 表示CFU當(dāng)量，■表示標(biāo)準(zhǔn)CFU)提供，CFU 當(dāng)量與標(biāo)準(zhǔn)CFU之間的相關(guān)性在圖:3B中呈現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明大體提供在用常規(guī)信號(hào)發(fā)射劑對(duì)樣品染色之后在數(shù)分鐘內(nèi)定量測(cè)量樣品 (通常為液體樣品)中可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的量的方法、試劑盒和系統(tǒng)。常規(guī)微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，例如下文論述的異向板計(jì)數(shù)器(Heterotropic Plate Count, HPC)，通常需要培養(yǎng)微生物細(xì)胞若干小時(shí)以區(qū)別死細(xì)胞與可培養(yǎng)微生物細(xì)胞且僅計(jì) 數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞。一些可培養(yǎng)微生物細(xì)胞鑒別為菌落形成單位(CFU/ml)。為此，本發(fā)明允許 在幾分鐘內(nèi)僅計(jì)數(shù)可培養(yǎng)微生物細(xì)胞以得到等于CFU的數(shù)量值。因此，本發(fā)明得到CFU當(dāng) 量，同時(shí)與常規(guī)方法相比，縮短所需的時(shí)間且降低所需的成本。雖然本發(fā)明的CFU當(dāng)量與常 規(guī)菌落形成單位測(cè)量(例如HPC)相關(guān)，但可能存在一些不同且任何所述不同的差異都不會(huì) 超過(guò)30%以上、優(yōu)選不大于10%且更優(yōu)選不大于5%。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語(yǔ)“可培養(yǎng)微生物細(xì)胞”或“可培養(yǎng)細(xì)胞”用于表示當(dāng)放置 在合適的受控培養(yǎng)基上時(shí)可分成兩個(gè)(子)細(xì)胞的顯微鏡或超顯微鏡尺寸的任何細(xì)胞(例 如母細(xì)胞)。因此，術(shù)語(yǔ)“非可培養(yǎng)微生物細(xì)胞”表示即使有活力，當(dāng)放置在培養(yǎng)條件下時(shí)也 不且不能分成子細(xì)胞的細(xì)胞。微生物細(xì)胞可包括(但不限于)細(xì)菌，例如大腸菌類(lèi)細(xì)菌(Coliforming bacteria)(大腸桿菌(Ε. Coli))、腸細(xì)菌(沙門(mén)菌屬(salmonella)、李斯特菌屬(listeria)、志賀菌屬(shigella))、假單胞菌群(Pseudomonas group)(銅綠假單胞 |if (pseudomonas auriginosa) > 5 7 Iix Ifi lif (pseudomonas f luorescensa)) > ^f 菌群(Staphylococcus group)(金黃色葡萄球菌(staphilococus aureus)、糞鏈球菌 (streptococcus fecalis))、鏈球菌群(Streptococcus group)禾口 甲燒菌等；霉菌，例 如黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌群(penicillium group)等；酵母，例如念珠菌 群(Candida group) > Sachramises group 等；原蟲(chóng)，例如隱 包子蟲(chóng)群(Cryptosporidium group)、賈地蟲(chóng)群(Giardia group)、變形蟲(chóng)(Amoeba)等；藻類(lèi)，例如綠藻(green algae) 等；嗜酸細(xì)菌(Acidophylic bacteria, TAB)；軍團(tuán)菌群(legionella group)；弧菌 (Vibrio)物種等。本發(fā)明可獲得各種應(yīng)用，優(yōu)選但非排他性地為在需要基本上立即鑒別和定量樣品 中的微生物污染(例如引起疾病(病原性)因子)時(shí)。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明方法可適用于定 量測(cè)量飲用水中微生物細(xì)胞的量。一些其它應(yīng)用可能與工業(yè)微生物學(xué)(例如存在于食物或 飲料中的細(xì)胞、個(gè)人護(hù)理、工業(yè)工藝和衛(wèi)生保健相關(guān)感染)、水生系統(tǒng)(飲用水、工藝用水、 廢水、天然水源、改水，例如游泳池、礦泉療養(yǎng)地和海灘等)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(血漿、唾液、尿、 咽喉樣品、胃腸液)、環(huán)境微生物學(xué)(土壤、空氣表面)等相關(guān)。如上文所指示，本發(fā)明提供的用于幾乎實(shí)時(shí)測(cè)定樣品中可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的量的 解決方案是基于膜運(yùn)輸?shù)睦没蚣?xì)胞膜向細(xì)胞間隔室的移動(dòng)，這些在可培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)生的 程度是在有活力但非可培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)生的程度的1. 5、3、6、12且甚至高達(dá)20倍。非可培養(yǎng) 細(xì)胞可包括例如孢子、合成代謝細(xì)胞等。因而，發(fā)明者因此假設(shè)如果可用與膜締合的膜信號(hào) 發(fā)射劑對(duì)細(xì)胞的膜染色且發(fā)生膜運(yùn)輸，那么與非可培養(yǎng)細(xì)胞相比，信號(hào)發(fā)射劑在可培養(yǎng)細(xì) 胞中積聚的程度更高，從而從這些可培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“基本上立即”或“立即”或“幾乎實(shí)時(shí)”表示從起始本發(fā)明方法到捕捉到測(cè)試 樣品的至少一個(gè)可推斷(通常且優(yōu)選通過(guò)影像處理，將在下文進(jìn)一步論述)根據(jù)本發(fā)明的 CFU當(dāng)量的影像的時(shí)間窗不到20分鐘，優(yōu)選不到15分鐘，更優(yōu)選不到10分鐘。換句話(huà)說(shuō)，
本發(fā)明方法是瞬時(shí)的，不需要長(zhǎng)期(數(shù)小時(shí))培養(yǎng)細(xì)胞以測(cè)定測(cè)試樣品中可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種測(cè)定指示測(cè)試樣品中可培養(yǎng)的微 生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的方法，所述方法包含(i)使容易攜帶可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微生物細(xì) 胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(Tl)，所述第一時(shí)間段(Tl) 足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信號(hào)基本上 達(dá)到平臺(tái)期的水平；(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(Tl)后，于第二時(shí)間段(T2)期間，且在此期間所述信號(hào) 基本上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)信號(hào)發(fā)射可培養(yǎng)細(xì)胞，所述檢 測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目 的數(shù)量值。根據(jù)本發(fā)明的方法包含提供易具有可培養(yǎng)微生物細(xì)胞和允許培養(yǎng)所述細(xì)胞的條件的樣品。所述條件可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員基于可用技術(shù)容易地確定且通常將視懷疑樣 品中存在的微生物細(xì)胞或微生物細(xì)胞群的類(lèi)型而定。所述條件可例如與HPC所需的條件相 似或相同。測(cè)試樣品可為液體、半液體以及干物質(zhì)。當(dāng)樣品是液體樣品時(shí)，可在起始測(cè)定分析 之前加以干燥。樣品不需要達(dá)到完全干燥，而是從其中去除至少一部分液體，以濃縮樣品中 的細(xì)胞得到細(xì)胞濃縮物。濃縮液體樣品中的微生物細(xì)胞可使用生物實(shí)驗(yàn)室中可用的任何方法。這些方法包 括(但不限于)經(jīng)由合適的過(guò)濾器過(guò)濾樣品、離心和其它干燥技術(shù)。用一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑對(duì)樣品(原樣或從其中去除至少一部分液體之后 的樣品)染色。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)發(fā)射劑”表示在適當(dāng)條件下發(fā)射可檢測(cè)信號(hào)的 任何化學(xué)實(shí)體。信號(hào)發(fā)射劑可為光發(fā)射劑(例如比色劑)或發(fā)光發(fā)射劑，后者為例如光致 發(fā)光(包括熒光或磷光)、化學(xué)發(fā)光、輻射發(fā)光、熱發(fā)光；或細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域熟知的任何其它信 號(hào)發(fā)射劑。根據(jù)本發(fā)明可使用的發(fā)光發(fā)射部分的實(shí)例包含(但不限于)生物發(fā)光劑，包 括基于熒光素的試劑(6-0-β-吡喃半乳糖基熒光素)、熒光劑，包括Alexa Fluor家族 (英杰公司(Invitrogen))的成員、PromoFluor 染料(普莫金公司(PromoKine))HiLyte Fluors (安納斯派克公司(AnaSpec))、DyLight Fluors (皮爾斯(Pierce)，賽默飛世爾科 技(Thermo Fisher Scientific))和ATTO染料系列(ATT0-TEC和西格瑪-阿爾德里奇 (Sigma-Aldrich)) 0所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，根據(jù)本發(fā)明可使用多種熒光劑或其它發(fā) 光劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑包含發(fā)光劑，優(yōu)選結(jié)合于親脂性連接子的熒光部分，從 而允許締合，例如用可培養(yǎng)細(xì)胞膜包埋至少一部分所述試劑，從而通過(guò)膜運(yùn)輸將所述試劑 內(nèi)化于細(xì)胞中。信號(hào)發(fā)射劑締合于可培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜通常是非特異性的且是試劑親脂性的結(jié) 果(例如歸因于發(fā)光部分連接于親脂性連接子)。因此，非特異性信號(hào)發(fā)射劑通常用于獲得 總可培養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)(TCBC)。本發(fā)明還允許即使樣品具有微生物混合物，也能獲得樣品中特異性類(lèi)型的可培養(yǎng) 微生物細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)。此舉可使用各種特異性信號(hào)發(fā)射劑單獨(dú)或與非特異性信號(hào)發(fā)射劑 組合實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“特異性的”或“特異性”在術(shù)語(yǔ)“特異性信號(hào)發(fā)射劑”的情況下用于表示對(duì)膜 或特異性細(xì)胞類(lèi)型(需要在樣品中檢測(cè)的細(xì)胞)的細(xì)胞內(nèi)組分具有親和力和/或選擇性結(jié) 合的試劑。特異性信號(hào)發(fā)射劑可包含靶向?qū)嶓w，即對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞外組分具有結(jié)合特異性的配 體。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向信號(hào)發(fā)射劑使得其可內(nèi)化于可培養(yǎng)細(xì)胞中，從而允許僅檢測(cè)那些 已內(nèi)化有信號(hào)發(fā)射劑的細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，靶向(特異性)信號(hào)發(fā)射劑不內(nèi)化于其靶向的細(xì)胞中，且由這一 特異性信號(hào)發(fā)射劑與非特異性信號(hào)發(fā)射劑的組合檢測(cè)這些細(xì)胞。為此目的，非特異性信號(hào) 發(fā)射劑提供總可培養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)，且特異性信號(hào)發(fā)射劑提供細(xì)胞類(lèi)型(信號(hào)特異性結(jié)合的細(xì) 胞類(lèi)型)的總計(jì)數(shù)。然后疊加從用兩種信號(hào)發(fā)射劑獲得的影像發(fā)射的信號(hào)，以便從僅那些發(fā)射兩個(gè)信號(hào)的細(xì)胞，即滿(mǎn)足可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)與能夠結(jié)合特異性試劑的細(xì)胞推斷。信號(hào)發(fā)射劑的特異性還可使用酶促實(shí)體實(shí)現(xiàn)(例如在酶活化對(duì)某一細(xì)胞類(lèi)型具 有特異性的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)時(shí))。所述酶可包括(但不限于)作用于鄰硝基苯基-D-吡喃半 乳糖苷以產(chǎn)生信號(hào)發(fā)射降解產(chǎn)物的酶。其可有助于鑒別樣品中的具有產(chǎn)生信號(hào)發(fā)射降解產(chǎn) 物的特異性酶的特異性細(xì)胞群體。在又一實(shí)例中，特異性(靶向)可通過(guò)使用細(xì)胞特異性抗體(單克隆以及多克隆) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。抗體實(shí)例可包括抗沙門(mén)菌屬LPS抗體、抗CD18抗體、大腸桿菌LPS抗體(例如大 腸桿菌J5 LPS抗體)、抗沙門(mén)菌屬鞭毛抗原抗體、抗大腸桿菌K99附著因子抗體。作為另一 實(shí)例，抗體可為免疫脂質(zhì)體(連接于脂質(zhì)體的抗體)。在又一實(shí)例中，特異性可使用噬菌體(例如熒光噬菌體)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因?yàn)楸景l(fā)明方 法在數(shù)分鐘內(nèi)提供數(shù)量值，所以有可能在熒光噬菌體損害細(xì)胞之前完成分析。舉例來(lái)說(shuō)，可 使用噬菌體蘭巴噬大腸菌體(Lamba Coliphage 1，LGl)檢測(cè)大腸桿菌并定量。非特異性與特異性信號(hào)發(fā)射劑的組合的實(shí)例可為(但不限于)結(jié)合于霍亂B毒素 結(jié)合蛋白質(zhì)以檢測(cè)霍亂物種的發(fā)光部分，同時(shí)可使用連接于大腸桿菌特異性膜脂多糖的發(fā) 光部分定量大腸桿菌，各與非特異性信號(hào)發(fā)射劑(例如實(shí)例中使用的FM1-43)組合使用。應(yīng)注意，所述試劑可不斷發(fā)射信號(hào)，或所述信號(hào)可通過(guò)諸如細(xì)胞內(nèi)隔室內(nèi)所發(fā)生 的酶促過(guò)程(所述酶促反應(yīng)操縱所述試劑發(fā)射信號(hào)或酶促降解產(chǎn)物發(fā)射信號(hào)(如上所述)) 的刺激、輻射刺激等產(chǎn)生。接觸期期間，信號(hào)發(fā)射劑締合細(xì)胞的膜。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語(yǔ)“締合”表示試 劑與細(xì)胞的膜的任何類(lèi)型的相互作用；其包括(但不限于)靜電鍵結(jié)、離子鍵結(jié)、共價(jià)鍵結(jié)、 包埋標(biāo)記物的至少一部分于細(xì)胞的膜中、抗原-抗體鍵結(jié)、受體-配體鍵結(jié)等。在本發(fā)明的 情況下，術(shù)語(yǔ)“締合”還涵蓋已內(nèi)化于細(xì)胞中的任何信號(hào)發(fā)射劑。易攜帶可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的樣品的接觸時(shí)間應(yīng)足以使信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于細(xì)胞中 且足以細(xì)胞內(nèi)積聚信號(hào)發(fā)射劑。發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，歸因于可培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)生的膜運(yùn)輸?shù)某潭?大于非可培養(yǎng)細(xì)胞，所述可培養(yǎng)微生物細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)具有較大量的積聚試劑。在給定條件 下，非可培養(yǎng)細(xì)胞與可培養(yǎng)細(xì)胞之間的積聚試劑的量可相差1. 5、3、6、12且甚至高達(dá)20倍。 發(fā)明者另外確定，細(xì)胞內(nèi)試劑的積聚達(dá)到平臺(tái)期。試劑達(dá)到平臺(tái)期所需的時(shí)間在本文中定義為“Tl”。時(shí)間Tl是細(xì)胞類(lèi)型的特征且 是預(yù)定的。Tl的預(yù)定可通過(guò)用信號(hào)發(fā)射劑對(duì)所選細(xì)胞類(lèi)型染色且檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變 化直到信號(hào)強(qiáng)度基本上無(wú)變化來(lái)達(dá)成。信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯變化的時(shí)間點(diǎn)即定義為達(dá)到平臺(tái)期 的時(shí)間。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“平臺(tái)期”表示細(xì)胞內(nèi)積聚的信號(hào)發(fā)射劑的水平保持同一值 達(dá)至少50、250且甚至長(zhǎng)達(dá)900秒。為了說(shuō)明起見(jiàn)，提及本文提供的實(shí)例，所述實(shí)例顯示含有分離的大腸桿菌的樣品 經(jīng)非特異性信號(hào)發(fā)射劑FMl-43(分子探針公司(Molecular probes)制造)染色需要約90 至110秒的Tl來(lái)使捕捉的信號(hào)的水平達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平；而也經(jīng)FM1-43染色的含有分離的綠 膿桿菌(Ps. aeruginosa)的樣品需要約70至100秒的Tl來(lái)達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。因?yàn)橐滋幱跍y(cè)試樣品中的細(xì)胞(或細(xì)胞群)的Tl是事前確定的，所以有可能確定 洗滌除去未締合且優(yōu)選未內(nèi)化信號(hào)發(fā)射劑的時(shí)間點(diǎn)。所述試劑的洗滌可利用所屬領(lǐng)域中已 知的任何技術(shù)達(dá)成。所述技術(shù)可包括(但不限于)過(guò)濾(例如用常規(guī)微生物過(guò)濾器)、離心(例如4500rpm以上)和允許分離細(xì)胞與溶解或懸浮于樣品液體中的未締合試劑的任何其 它技術(shù)。檢測(cè)締合有信號(hào)發(fā)射劑的細(xì)胞作為信號(hào)發(fā)射物體。然而，應(yīng)了解，信號(hào)發(fā)射劑也可 締合樣品中的不為完整可培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞組分或其它人工產(chǎn)物，且可提供假信號(hào)。類(lèi)似地， 信號(hào)可來(lái)自聚集的信號(hào)發(fā)射劑(即未充足溶解于樣品中)。因此，所述方法提供檢測(cè)及選 擇僅那些起源于締合有試劑且內(nèi)部?jī)?nèi)化有試劑的細(xì)胞的信號(hào)發(fā)射物體的工具。在本發(fā)明的 情況下，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)發(fā)射物體”表示測(cè)試樣品中的發(fā)射信號(hào)的任何光學(xué)點(diǎn)。信號(hào)發(fā)射物體未 必要具有細(xì)胞尺寸，且實(shí)際上可能歸因于由從細(xì)胞發(fā)射的信號(hào)形成的環(huán)繞細(xì)胞的暈圈而較 大，特別是當(dāng)成像的細(xì)胞在焦點(diǎn)外(“模糊圈”)時(shí)。此由當(dāng)將信號(hào)發(fā)射細(xì)胞成像時(shí)，透鏡的 光射線(xiàn)錐未聚焦于完美焦點(diǎn)引起。檢測(cè)和選擇在信號(hào)達(dá)到平臺(tái)期之后在第二時(shí)間段T2進(jìn) 行。這一時(shí)間段T2表示從信號(hào)發(fā)射物體發(fā)射的信號(hào)基本上穩(wěn)態(tài)地保留在平臺(tái)期期間的時(shí) 間窗。在T2期間，檢測(cè)數(shù)個(gè)信號(hào)參數(shù)。這些參數(shù)包括從信號(hào)發(fā)射物體發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng) 度、測(cè)試樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體的尺寸、信號(hào)發(fā)射物體的形態(tài)。微生物細(xì)胞或微生物細(xì)胞群的選擇標(biāo)準(zhǔn)要求從檢測(cè)物體發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度至少 低于預(yù)定上限，且在一些實(shí)施例中，在預(yù)定強(qiáng)度范圍內(nèi)。因此，舍棄例如從細(xì)胞片段(死亡 和損害的細(xì)胞)發(fā)射的低于預(yù)定最低水平的信號(hào)強(qiáng)度或例如從試劑聚集體發(fā)射或從樣品 中的非細(xì)胞體發(fā)射的高于預(yù)定最大水平(上限)的信號(hào)強(qiáng)度。選擇標(biāo)準(zhǔn)還要求信號(hào)發(fā)射物體具有預(yù)定尺寸范圍。其包括舍棄低于最低閾值(例 如與細(xì)胞片段相關(guān))或高于最大閾值(例如來(lái)自樣品中的大型體)的物體。另外，選擇標(biāo)準(zhǔn)可要求信號(hào)發(fā)射物體具有預(yù)定形態(tài)。應(yīng)了解，細(xì)胞形態(tài)一般表示 給定細(xì)菌物種的特征且所述細(xì)胞具有多種形態(tài)。這些形態(tài)可包括基本上圓形(例如球菌 O^oci))、基本上細(xì)長(zhǎng)形(例如桿狀菌(Bacilli))、桿狀形態(tài)等。信號(hào)發(fā)射物體通常將具有 對(duì)應(yīng)于(類(lèi)似于)發(fā)射所述信號(hào)的細(xì)胞的形狀。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng)形信號(hào)發(fā)射物體通常將來(lái) 源于細(xì)長(zhǎng)形微生物細(xì)胞。物體形狀的檢測(cè)不僅允許舍棄非微生物信號(hào)發(fā)射物體(即人工產(chǎn) 物)，而且可有助于鑒別發(fā)射信號(hào)的細(xì)胞的類(lèi)型。在一個(gè)實(shí)施例中，需要至少滿(mǎn)足強(qiáng)度參數(shù)和尺寸參數(shù)，以便檢測(cè)和選擇信號(hào)發(fā)射 物體。應(yīng)注意，所述選擇參數(shù)可隨應(yīng)用而變化。例如，對(duì)于測(cè)試飲用水，范圍、閾值和所選 形狀都不同于測(cè)試?yán)绾乃|(zhì)而預(yù)定者。以下非限制性實(shí)例顯示，對(duì)于至少包含大腸桿菌和綠膿桿菌的微生物混合物，測(cè) 定的尺寸范圍為直徑0. 8-2 4!11，且測(cè)定的強(qiáng)度參數(shù)低于25461^且在60-2討61^的范圍內(nèi)，實(shí) 例中未顯示)。在一個(gè)實(shí)施例中，需要達(dá)到至少兩個(gè)參數(shù)，較佳強(qiáng)度參數(shù)和尺寸參數(shù)，以便鑒別信 號(hào)發(fā)射物體。一旦鑒別出信號(hào)發(fā)射物體達(dá)到了預(yù)定的選擇標(biāo)準(zhǔn)，即選出這些物體，并由其推 算出數(shù)量值。在一個(gè)實(shí)施例中，將其強(qiáng)度的均方根值相加；較佳用預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)化因子使此相 加得到的強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)化(例如，通過(guò)使用預(yù)定的等式(參看下文的材料與方法))，由此得 到指示樣品中可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值(即，CFU當(dāng)量)。標(biāo)準(zhǔn)化因子對(duì)于某一 細(xì)胞類(lèi)型或每一測(cè)試樣品類(lèi)型(即，每一應(yīng)用)的某一組細(xì)胞具有特異性，并且是基于事先在每一應(yīng)用的控制條件下測(cè)量的測(cè)試樣品中所述細(xì)胞的量測(cè)定。例如，先在對(duì)照條件下并 通過(guò)將如所述從捕捉的影像獲得的值與借助于例如HPC等常規(guī)方法得到的細(xì)胞計(jì)數(shù)(CFU/ ml)相關(guān)，來(lái)測(cè)定某一地理位置的飲用水的標(biāo)準(zhǔn)化因子。隨后，使用此標(biāo)準(zhǔn)化因子將來(lái)在所 述位置進(jìn)行飲用水質(zhì)量的測(cè)定(參看材料與方法)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，測(cè)定包含大腸桿菌與綠膿桿菌的混合物的測(cè)試樣品的標(biāo) 準(zhǔn)因子(等式)0. 025x+0. 3375 (χ為總熒光值的對(duì)數(shù)坐標(biāo))。本發(fā)明還提供測(cè)定等于測(cè)試樣品中可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的試劑盒， 所述試劑盒包含-至少一種能夠締合微生物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑，-有關(guān)使所述至少一種信號(hào)發(fā)射劑與所述樣品接觸達(dá)第一時(shí)間段(Tl)的說(shuō)明，所 述第一時(shí)間段(Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射 的信號(hào)基本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；-有關(guān)從所述樣品中去除未締合的信號(hào)發(fā)射劑的說(shuō)明；-有關(guān)由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)和選擇發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞的說(shuō)明，所 述檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)，所述檢測(cè)和選擇是在所述Tl后于 第二時(shí)間段0 期間進(jìn)行，并且在此期間，從樣品發(fā)射的信號(hào)基本上保持在所述平臺(tái)期；-有關(guān)使用所述所選的信號(hào)發(fā)射物體來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目的 數(shù)量值的說(shuō)明。試劑盒還可包含說(shuō)明在用所述信號(hào)發(fā)射劑對(duì)樣品染色之前從所述樣品中去除至 少一部分液體的說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，試劑盒包含多個(gè)信號(hào)發(fā)射劑。因此，為某一應(yīng)用(即專(zhuān) 用于測(cè)試家用市政水的質(zhì)量的試劑盒)所特有的所述多個(gè)試劑將包括對(duì)市政水中通常發(fā) 現(xiàn)的微生物細(xì)胞具有特異性的試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，說(shuō)明書(shū)包括選擇待檢測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞群的指南，而且包括為所述 細(xì)胞或細(xì)胞群預(yù)定的信號(hào)強(qiáng)度上限和/或信號(hào)強(qiáng)度范圍、欲檢測(cè)的物體的尺寸范圍和預(yù)定 的信號(hào)發(fā)射物體的形態(tài)以及選擇那些滿(mǎn)足所述指南的物體的說(shuō)明。此外，根據(jù)這一特定方面，試劑盒可包含一個(gè)或一個(gè)以上預(yù)定細(xì)胞特異性標(biāo)準(zhǔn)化 方程式，各方程式對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞類(lèi)型、真菌或其它微生物類(lèi)型具有特異性；和用于由其推斷 CFU當(dāng)量數(shù)量值的所述預(yù)定方程式的使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明還提供一種用于測(cè)定指示測(cè)試樣品中可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值 的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含-載體，其用于保存樣品和用于允許所述樣品與一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑接 觸；-檢測(cè)器，其用于檢測(cè)樣品中的信號(hào)發(fā)射物體和輸出其相應(yīng)數(shù)據(jù)；-存儲(chǔ)單元，其包含具有預(yù)定選擇參數(shù)和一個(gè)或一個(gè)以上預(yù)定細(xì)胞特異性標(biāo)準(zhǔn)化 因子的數(shù)據(jù)庫(kù)，各選擇參數(shù)各標(biāo)準(zhǔn)化因子對(duì)于微生物細(xì)胞或一組微生物細(xì)胞具有特異性；-處理單元，用于從所述檢測(cè)器接收輸出數(shù)據(jù)和用于從所述存儲(chǔ)單元接收選擇參 數(shù)和對(duì)于微生物細(xì)胞或一組微生物細(xì)胞具有特異性的所述標(biāo)準(zhǔn)化因子并且用所述參數(shù)和 所述標(biāo)準(zhǔn)化因子處理所述輸出數(shù)據(jù)，以由其測(cè)定等效于樣品中所述可培養(yǎng)微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。所述載體可以是可保存生物學(xué)細(xì)胞的任何容器。在一個(gè)實(shí)施例中，載體包含用于 從所述樣品中濾除至少一部分液體并且保存半干或干燥樣品的過(guò)濾器。本發(fā)明的檢測(cè)器通常包含發(fā)光成像系統(tǒng)，例如能夠捕捉由測(cè)試樣品發(fā)射的發(fā)光信 號(hào)的一個(gè)或一個(gè)以上影像的照相機(jī)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的照相機(jī)的非限制性實(shí)例包括電荷 耦合裝置(charge-coupled device ；CCD)、CM0S檢測(cè)器、光電二極管(PD)檢測(cè)器、光電倍增 管(photomultiplier tube ；PMT), γ粒子計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器或發(fā)光物體成像領(lǐng)域中已知 的任何其它信號(hào)捕捉裝置。影像處理單元配置成接收由測(cè)試樣品發(fā)射的一個(gè)或一個(gè)以上影像并且基于信號(hào) 發(fā)射物體的選擇參數(shù)對(duì)其鑒別樣品中可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“處理單元”表示經(jīng)預(yù)編程以由樣品中的信號(hào)發(fā)射物體收集 測(cè)量信號(hào)參數(shù)并且進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的任何數(shù)據(jù)處理和分析實(shí)用程序，其由根據(jù)預(yù)定條件選擇 信號(hào)參數(shù)和基于所選選擇參數(shù)輸出數(shù)量值組成。為此目的，所述處理單元帶有配置成進(jìn)行 所述分析的以電腦為基礎(chǔ)的程序。在一個(gè)實(shí)施例中，影像處理單元是配置成在整個(gè)信號(hào)發(fā)射物體中選擇信號(hào)強(qiáng)度在 預(yù)定范圍內(nèi)、大小在預(yù)定范圍內(nèi)并且具有預(yù)定形態(tài)的那些物體；并且對(duì)所選信號(hào)發(fā)射物體 測(cè)定均方根值強(qiáng)度。處理單元進(jìn)一步配置成基于由所選物件發(fā)射的均方根值強(qiáng)度輸出數(shù)量 值。在另一實(shí)施例中，影像處理單元配置成用從數(shù)據(jù)庫(kù)得到的標(biāo)準(zhǔn)化因子標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量 值以獲得等效于CFU/ml計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化值。本發(fā)明已以說(shuō)明性方式進(jìn)行描述，并且應(yīng)了解已使用的術(shù)語(yǔ)打算具有描述而非限 制的詞語(yǔ)的性質(zhì)。顯然，根據(jù)上述教示，本發(fā)明的許多修改和變化是可能的。因此，應(yīng)了解 除下文具體所述外，本發(fā)明可在隨附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)實(shí)踐。除非本文另外明確指示，否則如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用，形式“一 (a/an)，， 和“所述”包括單數(shù)以及復(fù)數(shù)指示物。舉例來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)參數(shù)”包括一個(gè)或一個(gè)以上參數(shù)。此外，如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“包含”打算是指方法、試劑盒和系統(tǒng)包括所述要素，
但不排除其它要素。類(lèi)似地，“基本上由......組成”用于定義方法試劑盒和系統(tǒng)包括所述
要素，但排除在本發(fā)明的執(zhí)行方面可能具有基本有效性的其它要素?！坝?.....組成”的意
思應(yīng)是排除超過(guò)微量要素的其它要素。由這些轉(zhuǎn)換術(shù)語(yǔ)各自定義的實(shí)施例都在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。此外，所有數(shù)值(例如濃度或劑量或其范圍)都是近似值，其是規(guī)定值正負(fù)變化至 多20%，有時(shí)至多10%。應(yīng)了解，即使不一定總是明確地規(guī)定，所有數(shù)值符號(hào)也應(yīng)當(dāng)作之前 加上術(shù)語(yǔ)“約”。還應(yīng)了解，盡管未必明確地規(guī)定，本文所述的試劑也僅為示范性的并且其等 效物為所屬領(lǐng)域所已知。非限制性示范性實(shí)施例的描述艦在以下非限制性實(shí)例中，使用包含城市用水(自來(lái)水)與預(yù)定濃度的細(xì)菌混合的 樣品來(lái)測(cè)定本發(fā)明的方法的效率。
在各樣品中，使用本發(fā)明的方法以及標(biāo)準(zhǔn)CFU計(jì)數(shù)(檢查水和廢水的標(biāo)準(zhǔn)方法 (Standard Methods for Examination of Water & Wastewater)(勒諾 S.克雷斯?fàn)?Lenore S. Clescerl)(編輯)，阿諾德E.格林堡(Arnold Ε. Greenberg)(編輯)，安德魯D.伊頓 (Andrew D. feton)(編輯)·第18版，2002.)定量有活力的可繁殖微生物的量。比較結(jié)果 并且本發(fā)明的方法的功效與CFU方法的相關(guān)性為R2 = 0. 997。材料與方法微牛物細(xì)胞提供三種微生物細(xì)胞原料制劑從自來(lái)水中分離出大腸桿菌(第一種制劑)和綠膿桿菌(第二種制劑)的天然形 式，用于大腸桿菌、胰蛋白胨膽汁X-葡糖苷酸(Tryptone Bile X-Glucuronide ；TBX)培養(yǎng) 基(普洛麥格公司(!Iomega)制造)和用于綠膿桿菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂(Cetrimide agar)(普洛麥格公司(!Iomega)制造)。第三種制劑含有常規(guī)自來(lái)水并稱(chēng)為微生物混合物 制劑(因?yàn)槠渫ǔ：形⑸锘旌衔?。將培養(yǎng)和分離的大腸桿菌和綠膿桿菌以及自來(lái)水制劑各轉(zhuǎn)移到肉湯生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中并通過(guò)使用溶菌肉湯(Lysogeny broth ；LB)培養(yǎng)基(普洛麥格公司(Promega)，目錄號(hào) 7290A)震蕩來(lái)培育。用于三種制劑的培育條件大腸桿菌-35°C，18小時(shí)；綠膿桿菌-30 "C，40小時(shí)；水微生物細(xì)胞混合物-30°C，72小時(shí)。通過(guò)離心(6，000RPM, 5分鐘)，使用Iso標(biāo)準(zhǔn)PBS將培養(yǎng)的制劑沖洗三次。在此階 段，如通過(guò)微生物過(guò)濾CFU計(jì)數(shù)所測(cè)定的微生物濃度測(cè)定為約10lclCFU/ml，大腸桿菌；109CFU/ml，綠膿桿菌；和108CFU/ml，來(lái)源于水的微生物混合物。隨后，用無(wú)菌PBS稀釋微生物制劑(大腸桿菌和綠膿桿菌)，同時(shí)按原樣使用自來(lái) 水細(xì)菌混合物制劑或用無(wú)菌自來(lái)水(通過(guò)過(guò)濾自來(lái)水通過(guò)0. 22μπι微生物過(guò)濾器(密理博 公司(Milipore)制造)制備)稀釋。使用微生物過(guò)濾(0.45um過(guò)濾器)程序，用范圍為 0. 01毫升到1公升的懸浮液測(cè)試體積制備異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)(Heterotrophic Plate Count ； HPC) (Standard Methods for Examination of Water & Wastewater) / 勒諾 S.克雷斯?fàn)?(Lenore S. Clescerl)(編輯)，阿諾德 Ε·格林堡(Arnold Ε. Greenberg)(編輯)，安德魯 D.伊頓(Andrew D. Eaton)(編輯)·第 18 版，2002.)。在 PCA (普洛麥格公司(Promega)， 目錄號(hào)7157A)培養(yǎng)基上使用如下培育條件培育過(guò)濾器大腸桿菌-35 °C，24小時(shí)；綠膿桿菌是30 V，48小時(shí)；細(xì)菌混合物是30°C，72小時(shí)。CFU計(jì)數(shù)的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為1公升測(cè)試體積。熒光染型在以下實(shí)驗(yàn)中，使用濃度為lyg/ml PBS溶液的FM1-43苯乙烯基染料(西川S. (Nishikawa S.)佐佐木F. (Sasaki F.)苯乙烯基染料FM1-43在非洲爪蟾的側(cè)線(xiàn)器官的 毛細(xì)胞中的內(nèi)在化(Internalization of styryl dye FM 1-43 in the hair cells of lateral line organs in Xenopus larvae),組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)(Histochem Cytochem), 1996 44(7) :733-41)。染餼方法在室溫(約25°C)下使用FM1-43苯乙烯基染料進(jìn)行微生物細(xì)胞制劑的熒光染色。 使用細(xì)胞的單層制劑測(cè)定染色的時(shí)間和工作時(shí)間窗，且確定信號(hào)需要2分鐘達(dá)到信號(hào)平臺(tái) 期(Tl，參見(jiàn)下文Tl和T2的測(cè)定)并且所述平臺(tái)期在穩(wěn)定狀態(tài)下保持約600秒時(shí)間(Tl， 參見(jiàn)下文Tl和T2的測(cè)定)。在染色結(jié)束時(shí)，用iso標(biāo)準(zhǔn)PBS沖洗培養(yǎng)物三次。應(yīng)注意對(duì)于 過(guò)濾器表面粘著的培養(yǎng)物或懸浮的培養(yǎng)物使用相同染色方法(即這對(duì)于單層制劑不具有 特異性)。熒光成像使用Axiovert 200 顯微鏡(卡爾蔡司公司(Karl Zeiss))，1· 3NA Plan Neofluor XlO物鏡(BP450-490激發(fā)過(guò)濾器(激發(fā)450-490nm ；光束分離器FT 5IOnm ；發(fā)射 515-565nm;卡爾蔡司公司(Karl Zeiss))獲得信號(hào)發(fā)射樣品的熒光影像。影像捕捉使用標(biāo)準(zhǔn)^^^⑶！!! qe (柯克公司(Cooke Corp. )) 512 X 512CCD捕捉影像。影像處理使用Imageftx)+軟件Q002)進(jìn)行影像處理和數(shù)據(jù)收集。Tl和T2的測(cè)定為測(cè)定Tl，由原料制劑制備三種樣品，即包含天然存在于自來(lái)水中的細(xì)菌混合物 的自來(lái)水樣品(在如上文所述培養(yǎng)于培養(yǎng)基上和用PBS洗滌后)；分離的大腸桿菌的第二 樣品(在如上文所述培養(yǎng)和用PBS洗滌后)；和分離的綠膿桿菌的第三樣品(在如上文所 述培養(yǎng)和用PBS洗滌后)。根據(jù)HPC方法分析來(lái)自各原料制劑的樣品，獲得相應(yīng)常規(guī)CFU/ml計(jì)數(shù)。隨后用PBS稀釋各樣品，獲得約1000CFU/ml濃度的樣品。隨后用FM1-43對(duì)各樣 品染色并且每10秒以單層成像(如上文所述)直到由單層發(fā)射的信號(hào)達(dá)到平臺(tái)期。信號(hào) 達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)刻測(cè)定為T(mén)l。T2的測(cè)定在另一組從三種制劑稀釋的三種所述樣品中，在樣品染色后約110秒，用PBS洗滌 樣品，并且在10秒的時(shí)間順序以單層成像，直到信號(hào)開(kāi)始消退。信號(hào)開(kāi)始消退的時(shí)間點(diǎn)測(cè) 定為T(mén)2。以上程序重復(fù)三次。繪制在測(cè)量階段期間捕捉的信號(hào)的強(qiáng)度并且結(jié)果在圖1中展示。CFU當(dāng)量的測(cè)定為鑒別CFU當(dāng)量(即用標(biāo)準(zhǔn)CFU/ml計(jì)數(shù)校準(zhǔn)本發(fā)明的測(cè)量)，收集和使用來(lái)自三 處不同地理位置(A、B和C)的自來(lái)水的總共三種樣品。如上文關(guān)于Tl測(cè)定所述制備來(lái)自 各位置的制劑，獲得分離的大腸桿菌和綠膿桿菌樣品以及細(xì)菌混合物樣品。對(duì)于各位置，基 于HPC方法推測(cè)各細(xì)菌細(xì)胞的濃度或各制劑的總細(xì)菌計(jì)數(shù)(即獲得稀釋前的TBC)，接著用無(wú)菌水稀釋來(lái)自細(xì)菌混合物制劑的樣品(即來(lái)自各位置，總共3個(gè))，獲得四個(gè)近似濃度， 1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml 和 lCFU/ml,即總共 12 個(gè)樣品。根據(jù)HPC方法并且也根據(jù)本發(fā)明的方法分析12個(gè)樣品的每一者。在后者情況下， 如上文所述用FM1-43對(duì)各樣品染色，120秒后用無(wú)菌水洗滌(即在平臺(tái)期開(kāi)始時(shí))并且立 即成像(在約150-180秒時(shí))。根據(jù)信號(hào)選擇參數(shù)處理影像。具體來(lái)說(shuō)，一旦捕捉到影像， 就對(duì)滿(mǎn)足選擇參數(shù)的物體計(jì)數(shù)，并且測(cè)定其均方根強(qiáng)度。選擇的結(jié)果在下表1A-1B中提供。將從以上制備的樣品中分離的大腸桿菌和綠膿桿菌確切地處理成細(xì)菌混合物樣 品。觀察到變化的動(dòng)力學(xué)類(lèi)似于細(xì)菌混合物，并且由類(lèi)似濃度的細(xì)菌混合物樣品獲得的信 號(hào)不存在顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。本發(fā)明的方法的驗(yàn)證由如上文所述的三處不同位置制備總共48個(gè)微生物測(cè)試樣品(每一位置得到4 個(gè)樣品，每一樣品一式三份)。具體來(lái)說(shuō)，用無(wú)菌水X10、X100稀釋或不稀釋來(lái)自各位置 的制劑(細(xì)胞濃度未知)。同樣，從各位置，通過(guò)用0.22 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾器(硝基纖維素，密理 博(Milipore)制造)對(duì)原料制劑的一個(gè)樣品滅菌。隨后用FM1-43對(duì)各測(cè)試樣品染色，用無(wú)菌水洗滌并使用常規(guī)HPC方法或如上文所 述的本發(fā)明的方法分析。結(jié)果在下表2中展示。熒光測(cè)量所有熒光測(cè)量和相應(yīng)CFU計(jì)數(shù)都在室溫(約25°C )下進(jìn)行。成像和信號(hào)處理出于影像分析目的，當(dāng)通過(guò)對(duì)應(yīng)于12- 像素(在這些非限制性實(shí)例中所用的特 定設(shè)置下)的光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，微生物信號(hào)發(fā)射物體(即計(jì)數(shù)用的物體)測(cè)定為大小為 0. 8-1.5μπι。這些是選擇標(biāo)準(zhǔn)。在本文所提供的非限制性實(shí)例中，除非另有規(guī)定，否則樣品在染色后150到180秒 (即在染色2分鐘后不久)成像。此外，對(duì)于邪4灰度級(jí)(或介于60-2MGL之間)的“微 生物物體”的最大熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)曝光時(shí)間。曝光時(shí)間調(diào)整為0. 8秒。使用平均計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)偏差(以％表示)測(cè)定數(shù)量值。MM本發(fā)明是基于以下了解可繁殖(可培養(yǎng))微生物細(xì)胞可將細(xì)胞外細(xì)胞壁的脂質(zhì) 部分內(nèi)化于細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行濃縮一段時(shí)間(比不可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞快)。膜運(yùn)輸速率和其 細(xì)胞內(nèi)濃度水平與細(xì)胞活性有關(guān)，在可繁殖微生物中極高。因此，發(fā)明者已設(shè)想這一現(xiàn)象可 用于區(qū)別樣品中有活力的可繁殖細(xì)胞和定量所述細(xì)胞的量。Tl和Τ2的測(cè)定圖1展示直到信號(hào)達(dá)到平臺(tái)期時(shí)FM1-43的累積是在染色后約120秒。因此這個(gè) 時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記為T(mén)l。穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)染料累積在平臺(tái)期開(kāi)始115到550秒的時(shí)間窗內(nèi)維持穩(wěn)定。換句話(huà)說(shuō)， 細(xì)胞混合物的細(xì)胞內(nèi)隔室內(nèi)的熒光染料累積在115秒后變得穩(wěn)定且照那樣保持至少550 秒。因此，已確定，對(duì)于液體樣品中的大腸桿菌和/或銅綠假單胞菌(Sp. Aeruginosa)的定 量測(cè)定，約115至約550秒的時(shí)間窗是有效測(cè)量窗T2。CFU當(dāng)量的測(cè)定
處理如上文所述用于測(cè)定CFU當(dāng)量的12個(gè)微生物樣品的影像，從其中選擇滿(mǎn)足預(yù) 定選擇標(biāo)準(zhǔn)的物體(即當(dāng)通過(guò)對(duì)應(yīng)于12- 像素、2M灰度級(jí)的最大強(qiáng)度的光學(xué)顯微鏡觀察 時(shí),大小為0. 8-1. 5 μ m)。所選物件的強(qiáng)度的所測(cè)定均方根值以及通過(guò)常規(guī)HPC方法獲得的CFU/ml計(jì)數(shù)包 括在表1A-1B中?；趯?duì)于原料制劑獲得的CFU/ml計(jì)數(shù)測(cè)定近似濃度。通過(guò)位置(A、B或 C)和每一位置的樣品數(shù)目(X1、X2或X3)鑒別不同樣品。表IA 細(xì)菌混合物樣品的分析
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的方法，所述方 法包含(i)使容易攜帶可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的所述測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微生 物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(Tl)，所述第一時(shí)間段 (Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信號(hào)基 本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(Tl)后，于第二時(shí)間段(1 期間，且在此期間所述信號(hào)基本 上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞，所述檢測(cè) 是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含在用所述信號(hào)發(fā)射劑對(duì)所述樣品進(jìn)行染色之 前，從所述測(cè)試樣品中去除至少一部分液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述液體去除是借助過(guò)濾或離心中的一種或一種 以上進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包含一種或一種以 上類(lèi)型的微生物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至45中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述信號(hào)發(fā)射劑為發(fā)光劑或 光發(fā)射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的方法，其包含使所述樣品與至少一種其 它信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述其它信號(hào)發(fā)射劑對(duì)懷疑存在于所述樣品中的所選微生物細(xì)胞具有 特異性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其包含檢測(cè)由所述樣品中的每一信號(hào)發(fā)射劑所發(fā)射的 信號(hào)，和由所述信號(hào)測(cè)定所述樣品中指示可培養(yǎng)的特定微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其用于測(cè)定多個(gè)數(shù)量值，每一個(gè)值都將指示所述樣 品中某一特定微生物細(xì)胞或一組特定微生物細(xì)胞的數(shù)目。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述選擇參數(shù)包含兩個(gè)或兩 個(gè)以上選自以下的參數(shù)由信號(hào)發(fā)射物體發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度、所述信號(hào)發(fā)射物體的尺寸、所 述信號(hào)發(fā)射物體的形態(tài)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中僅檢測(cè)至少一信號(hào)強(qiáng)度低于預(yù)定上限且尺寸在 物體尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)發(fā)射物體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中僅檢測(cè)至少一信號(hào)強(qiáng)度在預(yù)定強(qiáng)度范圍內(nèi)且尺 寸在物體尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)發(fā)射物體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一權(quán)利要求所述的方法，其包含針對(duì)所述所選的物體計(jì) 算所述數(shù)量值。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述數(shù)量值包含所述所選物體的均方根強(qiáng)度。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中將所述數(shù)量值標(biāo)準(zhǔn)化以與菌落形成單元 (CFU)計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)，所述經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)量值為CFU當(dāng)量。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化包含用所述數(shù)量值乘以預(yù)定的細(xì)胞 特異性標(biāo)準(zhǔn)化因子，得到所述CFU當(dāng)量。
16.一種用于測(cè)定等效于測(cè)試樣品中可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的試劑盒， 所述試劑盒包含(i)至少一種能夠締合微生物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑，( )有關(guān)使所述至少一種信號(hào)發(fā)射劑與所述樣品接觸達(dá)第一時(shí)間段(Tl)的說(shuō)明，所 述第一時(shí)間段(Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣 品發(fā)射的信號(hào)基本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(iii)有關(guān)從所述樣品中去除未締合的信號(hào)發(fā)射劑的說(shuō)明；(iv)有關(guān)由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)和選擇發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞的說(shuō)明，所述 檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)，所述檢測(cè)和選擇是在所述Tl后于第 二時(shí)間段0 期間進(jìn)行，并且在此期間，所述信號(hào)基本上保持在所述平臺(tái)期；(ν)有關(guān)使用所述所選的信號(hào)發(fā)射物體來(lái)由此測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的 數(shù)目的數(shù)量值的說(shuō)明。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其包含有關(guān)在用所述信號(hào)發(fā)射劑對(duì)所述樣品進(jìn)行 染色之前，從所述樣品中去除至少一部分所述液體的說(shuō)明。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或16所述的試劑盒，其包含超過(guò)一種信號(hào)發(fā)射劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述信號(hào)發(fā)射劑為發(fā)光 劑或光發(fā)射劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述信號(hào)發(fā)射劑為熒光染料。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其包含選擇參數(shù)，和有關(guān)使 用至少兩個(gè)所述選擇參數(shù)從所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體中選出發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)的微生物 細(xì)胞的說(shuō)明。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述選擇參數(shù)包含預(yù)定的信號(hào)強(qiáng)度上限、信 號(hào)強(qiáng)度范圍、在預(yù)定的信號(hào)發(fā)射物體的尺寸范圍內(nèi)的尺寸和信號(hào)發(fā)射形態(tài)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其包含有關(guān)使用至少兩個(gè)所述選擇參數(shù)僅選擇信 號(hào)強(qiáng)度低于預(yù)定的上限或在物體尺寸范圍內(nèi)并且尺寸在預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)發(fā)射物體 的說(shuō)明。
24.根據(jù)權(quán)利要求15至23中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其包含有關(guān)由所述所選的物 體計(jì)算所述數(shù)量值的說(shuō)明。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的試劑盒，其中所述說(shuō)明包含計(jì)算所述所選物體的均方根強(qiáng) 度，以便由此獲得所述數(shù)量值。
26.根據(jù)權(quán)利要求16至25中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其包含有關(guān)用標(biāo)準(zhǔn)化因子使 所述數(shù)量值標(biāo)準(zhǔn)化以獲得菌落形成單元(CFU)計(jì)數(shù)當(dāng)量的說(shuō)明。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的試劑盒，其包含一個(gè)或一個(gè)以上預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)化因子，以及 有關(guān)使用所述預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)化因子，由測(cè)量的數(shù)量值推導(dǎo)出所述CFU當(dāng)量的說(shuō)明。
28.一種用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的系統(tǒng)，所述 系統(tǒng)包含(i)載體，其用于固定所述樣品，并允許樣品與一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑接觸；( )檢測(cè)器，其用于檢測(cè)所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體，并輸出其對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)；(iii)存儲(chǔ)單元，其包含具有預(yù)定的選擇參數(shù)和多個(gè)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)化因子的數(shù)據(jù)庫(kù)，每一 選擇參數(shù)和每一標(biāo)準(zhǔn)化因子對(duì)于某一微生物細(xì)胞或?qū)τ谀骋唤M微生物細(xì)胞具有特異性；(iv)處理單元，其用于接收來(lái)自所述檢測(cè)器的輸出數(shù)據(jù)、來(lái)自所述存儲(chǔ)單元的一個(gè)或 一個(gè)以上所述參數(shù)和所述標(biāo)準(zhǔn)化因子，并用所述參數(shù)和所述標(biāo)準(zhǔn)化因子處理所述輸出數(shù) 據(jù)，以測(cè)定所述樣品中指示所述可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的所述數(shù)量值。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的系統(tǒng)，其中所述載體包含用于從所述樣品中濾出至少一部 分液體的過(guò)濾器。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀或四所述的系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器包含用于捕捉所述測(cè)試樣品內(nèi) 信號(hào)發(fā)射物體的影像的照相機(jī)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)，其中所述處理單元經(jīng)配置以由從所述檢測(cè)器接收的 數(shù)據(jù)測(cè)定所檢測(cè)的每一信號(hào)發(fā)射物體的信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)發(fā)射物體的尺寸、信號(hào)發(fā)射物體的 形態(tài)。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀至31中任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中所述處理單元經(jīng)配置以選 擇信號(hào)強(qiáng)度低于預(yù)定的強(qiáng)度閾值且尺寸在預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)發(fā)射物體。
33.根據(jù)權(quán)利要求觀至31中任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中所述處理單元經(jīng)配置以選 擇信號(hào)強(qiáng)度在預(yù)定強(qiáng)度范圍內(nèi)且尺寸在預(yù)定范圍內(nèi)的信號(hào)發(fā)射物體。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的系統(tǒng)，其中所述處理單元經(jīng)配置以基于由所述所選的 信號(hào)發(fā)射物體所發(fā)射的強(qiáng)度的均方根輸出數(shù)量值。
35.根據(jù)權(quán)利要求觀至34中任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中所述處理單元經(jīng)配置以用 從所述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的標(biāo)準(zhǔn)化因子使所述數(shù)量值標(biāo)準(zhǔn)化。
36.根據(jù)權(quán)利要求觀至35中任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其包含具有一種或一種以上信 號(hào)發(fā)射劑的卡匣，所述系統(tǒng)經(jīng)過(guò)預(yù)先編程，從而允許所述卡匣將所述一種或一種以上信號(hào) 發(fā)射劑釋放到所述載體中，并允許所述一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑與所述載體中的測(cè)試樣 品接觸。
37.根據(jù)權(quán)利要求觀至35中任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其包含卡匣陣列，所述卡匣各 自攜帶信號(hào)發(fā)射劑，所述系統(tǒng)經(jīng)過(guò)預(yù)先編程，從而允許將一種或一種以上信號(hào)發(fā)射劑從所 述卡匣陣列釋放到所述載體中。
38.一種機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，其明確地體現(xiàn)可由所述機(jī)器執(zhí)行的指令程序，以執(zhí) 行用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值的方法，所述方法包含(i)使容易攜帶可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的所述測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微生 物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(Tl)，所述第一時(shí)間段 (Tl)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信號(hào)基 本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(Tl)后，于第二時(shí)間段(1 期間，且在此期間所述信號(hào)基本 上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)和選擇發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞，所 述檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的程序存儲(chǔ)裝置，其可由所述機(jī)器執(zhí)行以執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求 1至15中任一權(quán)利要求所述的方法。
40.一種計(jì)算機(jī)程序，其包含當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1至15 中任一權(quán)利要求所述的所有步驟的計(jì)算機(jī)程序代碼構(gòu)件，所述計(jì)算機(jī)程序是在程序存儲(chǔ)裝 置中體現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于測(cè)定測(cè)試樣品中指示例如大腸桿菌(E.Coli)、綠膿桿菌(Ps.Aeroginosa)或微生物細(xì)胞混合物等可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值(例如總微生物計(jì)數(shù))的方法、試劑盒和系統(tǒng)，所述方法包含(i)使容易攜帶可培養(yǎng)的微生物細(xì)胞的所述測(cè)試樣品與至少一種能夠締合所述微生物細(xì)胞的膜的信號(hào)發(fā)射劑接觸，所述接觸將持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間段(T1)，所述第一時(shí)間段(T1)足以使所述信號(hào)發(fā)射劑內(nèi)化于所述微生物細(xì)胞中，達(dá)到使得由所述樣品發(fā)射的信號(hào)基本上達(dá)到平臺(tái)期的水平；(ii)從所述測(cè)試樣品中去除未內(nèi)化的信號(hào)發(fā)射劑；(iii)在所述第一時(shí)間段(T1)后，于第二時(shí)間段(T2)期間，且在此期間所述信號(hào)基本上保持在所述平臺(tái)期，由所述樣品內(nèi)信號(hào)發(fā)射物體檢測(cè)發(fā)射信號(hào)的可培養(yǎng)細(xì)胞，所述檢測(cè)是基于針對(duì)所述可培養(yǎng)細(xì)胞而預(yù)定的選擇參數(shù)；和(iv)根據(jù)所述所選的信號(hào)發(fā)射物體，測(cè)定所述測(cè)試樣品中指示可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目的數(shù)量值。所述試劑盒包含一種或一種以上所述信號(hào)發(fā)射劑及其使用說(shuō)明。本發(fā)明還提供一種機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，其明確地體現(xiàn)可由所述機(jī)器執(zhí)行的指令程序，以便執(zhí)行所述方法；以及一種計(jì)算機(jī)程序，其包含用于執(zhí)行所述方法的計(jì)算機(jī)程序代碼構(gòu)件。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102089419SQ200980126982
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日
發(fā)明者埃隆·卡普蘭, 弗拉迪米爾·格魯克曼 申請(qǐng)人:塔康特精確有限公司