專利名稱：人乳頭狀瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析試驗的制作方法
人乳頭狀瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析試驗本項發(fā)明應(yīng)用相關(guān)參照此專利應(yīng)用范圍受利于美國臨時專利申請序號61/131，991，2008年6月13號提 交，和美國臨時專利申請序號61/192，912，2008年9月22日提交。每一上述相關(guān)之專利申 請，在此以提及方式納入。圖示概述圖IA說明以抗E7單克隆抗體經(jīng)免疫組織化學(xué)(IHC)組織芯片染色，鱗狀細(xì)胞癌 (SCC)組織的代表性圖。圖IB說明圖IA之鱗狀細(xì)胞癌個案正常上皮細(xì)胞(與腫瘤組織相距15毫米)代 表性圖。圖IC說明以相同抗E7單克隆抗體，經(jīng)免疫組織化學(xué)組織芯片染色鱗狀細(xì)胞癌樣 本的代表性圖。圖ID說明圖IC腫瘤細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)染色放大代表性圖。圖2A說明以抗E7單克隆抗體，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色腺癌(ADC)腫瘤細(xì)胞樣本之 代表性圖。圖2B說明圖2A腺癌樣本之相關(guān)正常上皮細(xì)胞(與腫瘤組織相距15毫米)代表 性圖。圖2C說明圖2A腺癌細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)染色放大代表性圖。圖3A說明第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤結(jié)構(gòu)不良細(xì)胞代表性染色圖，依據(jù)另一發(fā)明 實施案例，以老鼠單克隆抗人乳頭狀瘤病毒E7抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗。圖;3B說明圖2A結(jié)構(gòu)不良上皮細(xì)胞之放大表表性圖，指出第三級子宮頸上皮內(nèi)贅 瘤結(jié)構(gòu)不良之細(xì)胞核染色。圖4A說明第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤結(jié)構(gòu)不良細(xì)胞代表性染色圖，依據(jù)一發(fā)明實 施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗。圖4B說明圖IA之第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本結(jié)構(gòu)不良組織鄰近之正常上皮細(xì) 胞代表性染色圖，以相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗。圖4C說明第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤組織之結(jié)構(gòu)不良性上皮細(xì)胞染色結(jié)果，依據(jù) 另一發(fā)明實施案例，以與圖IA相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫組 織化學(xué)試驗。圖4D說明另一第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤組織之結(jié)構(gòu)不良性上皮細(xì)胞染色結(jié)果， 依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以與圖IC相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免 疫組織化學(xué)試驗。圖5A說明臨床檢體診斷為意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)之染色結(jié)果，依據(jù) 一發(fā)明實施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC)試驗。圖5B說明與圖5A相同之臨床檢體染色結(jié)果，依據(jù)一發(fā)明實施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖6A說明臨床檢體診斷為第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤之染色結(jié)果，依據(jù)一發(fā)明實 施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖6B說明另一診斷為第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤臨床檢體之染色結(jié)果，依據(jù)另一 發(fā)明實施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖7A說明臨床檢體診斷為第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明 實施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖7B說明另一也診斷為第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤臨床檢體之染色結(jié)果，以圖7A 相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行染色。圖7C說明與圖7B相同之臨床檢體的另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，以相同老鼠之抗 人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行染色。圖7D說明與圖7B相同之臨床檢體的另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，以相同老鼠之抗 人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行染色。圖7E說明與圖7B相同之第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本的另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 圖，但依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行染色。圖7F說明與圖7E相同之第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本的另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 圖，以相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行染色。圖7G說明與圖:3B相同之第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本染色結(jié)果，但以老鼠之抗 P16單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖8說明臨床診斷為腺癌之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之抗人乳 頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖9A說明臨床診斷為鱗狀細(xì)胞癌之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之 抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖9B說明與圖9A相同之鱗狀細(xì)胞癌樣本染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老 鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。 圖9C說明與圖9A相同之鱗狀細(xì)胞癌樣本染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老 鼠之抗P16單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖IOA說明臨床診斷為正常樣本之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之 抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖IOB說明與圖6A相同之臨床樣本染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之 抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖IlA說明另一子宮頸抹片樣本之細(xì)胞質(zhì)染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以 老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖IlB說明與圖IlA相同樣本之細(xì)胞核染色結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7 單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖IlC說明另一子宮頸抹片樣本之細(xì)胞質(zhì)染色結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒 E6單克隆抗體進(jìn)行試驗。

圖12A說明臨床診斷為第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明
7實施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖12B說明與圖12A相同第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 結(jié)果，以相同老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖12C說明與圖12A相同第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 結(jié)果，以相同老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖12D說明與圖12A相同第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 結(jié)果，但依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞 化學(xué)試驗。圖12E說明與圖12D相同第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之另一免疫細(xì)胞化學(xué)染色 結(jié)果，以相同老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖12F說明與圖12A相同第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤樣本之染色結(jié)果，依據(jù)另一發(fā) 明實施案例，以老鼠之抗P16單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。圖13A說明偵測人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白之免疫印跡法結(jié)果，依據(jù)一發(fā)明實施案 例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒Ll單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖1 說明另一偵測人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白之免疫印跡法結(jié)果，以與圖1相同之 老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒Ll抗體進(jìn)行試驗。圖14A說明與圖13A相同偵測人乳頭狀瘤病毒E6蛋白免疫印跡法之結(jié)果，依據(jù)另 一發(fā)明實施案例，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖14B說明與圖1 相同偵測人乳頭狀瘤病毒E6蛋白免疫印跡法之結(jié)果，依據(jù)另 一發(fā)明實施案例，使用與圖14A相同之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行試驗。圖15B說明與圖13A及圖14A相同免疫印跡法之結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，以 老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體偵測人乳頭狀瘤病毒E7蛋白。圖16說明由10組子宮頸抹片樣本之細(xì)胞裂解物，抗體基因芯片試驗分析之平均 螢光強度結(jié)果，依據(jù)另一發(fā)明實施案例，偵測各式人乳頭狀瘤病毒蛋白和細(xì)胞內(nèi)生性蛋白 質(zhì)。圖17為圖16中10組細(xì)胞裂解物每一樣本之螢光強度結(jié)果，依據(jù)發(fā)明另一實施案 例，偵測人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白。圖18為圖16中10組細(xì)胞裂解物每一樣本之抗體基因芯片分析螢光強度結(jié)果，依 據(jù)發(fā)明另一實施案例，偵測人乳頭狀瘤病毒E7蛋白以及細(xì)胞pl6 INMa蛋白。圖19為圖16中10組細(xì)胞裂解物每一樣本之抗體基因芯片分析螢光強度結(jié)果，依 據(jù)發(fā)明另一實施案例，偵測人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白以及細(xì)胞p53蛋白。圖20為圖16中10組細(xì)胞裂解物每一樣本之抗體基因芯片分析螢光強度結(jié)果，依 據(jù)發(fā)明另一實施案例，偵測人乳頭狀瘤病毒E7蛋白以及來自Rb蛋白之細(xì)胞磷酸鹽。圖21為另一圖片說明樣本S2之抗體芯片分析螢光強度結(jié)果。圖22圖16中10組細(xì)胞裂解物每一樣本之抗體芯片分析螢光強度結(jié)果，依據(jù)發(fā)明 另一實施案例，偵測細(xì)胞p21 WAFl以及p53蛋白。圖23說明酶聯(lián)免疫吸附試驗試驗結(jié)果，針對臨床診斷為鱗狀細(xì)胞癌，或與人乳頭 狀瘤病毒陰性血清樣本比對后為人乳頭狀瘤病毒陽性(經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)測試)之人體血清 樣本，偵測其人乳頭狀瘤病毒E6，E7和Ll蛋白，依據(jù)發(fā)明另一實施案例，以兔子之抗人乳頭狀瘤病毒多克隆抗體作為包被及偵測。圖M說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACQ進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒16L1重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒16L1單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒16L1多克隆抗體作為偵測抗體。圖25說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACQ進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒16E6重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒16E6單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒16E6多克隆抗體作為偵測抗體。圖沈說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACQ進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒18E6重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒18E6單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒18E6多克隆抗體作為偵測抗體。圖27說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACQ進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒16E7重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒16E7單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒16E7多克隆抗體作為偵測抗體。圖觀說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACQ進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒16E6重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒16E6單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒16E6多克隆抗體作為偵測抗體。圖四說明以螢光流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行夾心珠法偵測人乳頭狀瘤病毒18E6重 組蛋白之結(jié)果，以老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒18E6單克隆抗體作為包被抗體，以兔子之抗人 乳頭狀瘤病毒18E6多克隆抗體作為偵測抗體。圖30A說明利用與金顆粒共軛之兔子之抗人乳頭狀瘤病毒Ll多克隆抗體進(jìn)行之 單步驟測流試驗用以偵測人乳頭狀瘤病毒Ll重組蛋白(由左至右875，435，0微克/毫 升)之結(jié)果，其與金顆粒共軛之兔子之抗人乳頭狀瘤病毒Ll多克隆抗體在與人乳頭狀瘤病 毒Ll蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)后會自薄膜上剝離，由此作為偵測試劑。圖30B說明單步驟測流試驗偵測鱗狀細(xì)胞癌病患血清樣本(左)之人乳頭狀瘤病 毒Ll重組蛋白之結(jié)果，與正常血清(人乳頭狀瘤病毒陰性)做比較，使用與圖30B相同之 方法。圖30C說明利用與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行之 單步驟測流試驗用以偵測人乳頭狀瘤病毒E6重組蛋白(由左至右10，2，0微克/毫升)之 結(jié)果，其與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體在與人乳頭狀瘤病毒E6 蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)后會自薄膜上剝離，由此作為偵測試劑。圖30D說明單步驟測流試驗偵測鱗狀細(xì)胞癌病患血清樣本(由左至右為第一及第 二)人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白之結(jié)果，與正常血清(人乳頭狀瘤病毒陰性)做比較，使用與 圖30C相同之方法。圖30E說明利用與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體進(jìn)行之 單步驟測流試驗用以偵測人乳頭狀瘤病毒E6重組蛋白(由左至右875，435，0微克/毫 升)之結(jié)果，其與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體在與人乳頭狀瘤病 毒E6蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)后會自薄膜上剝離，由此作為偵測試劑。圖30F說明利用與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行之 單步驟測流試驗用以偵測人乳頭狀瘤病毒E7重組蛋白(由左至右0，660，66，6. 6，0.66微克/毫升)之結(jié)果，其與金顆粒共軛之老鼠之抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體在與人乳頭 狀瘤病毒E7蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)后會自薄膜上剝離，由此作為偵測試劑。圖30G說明單步驟測流試驗偵測人乳頭狀瘤病毒陽性患血清樣本(左)人乳頭狀 瘤病毒E7蛋白之結(jié)果，與人乳頭狀瘤病毒陰性血清(右)做比較，使用與圖30F相同之方 法。本項發(fā)明摘要本項發(fā)明主體提供利用各式抗人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之單克隆抗體進(jìn)行各式 免疫試驗原位偵測人乳頭狀瘤病毒蛋白，此人乳頭狀瘤病毒蛋白包括感染高風(fēng)險或低風(fēng)險 人乳頭狀瘤病毒型，其可被單一特異性單克隆抗體或一般泛抗體偵測到。在一實施案例中， 一方法用來偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染，利用一種或多種能與人乳頭狀瘤病毒早期蛋白 產(chǎn)生鍵結(jié)之單克隆抗體，進(jìn)行臨床人類檢體之免疫試驗和人體細(xì)胞核染色。在另一實施案 例中，一方法用來偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染，利用一種或多種抗體，產(chǎn)生多種純化后人 乳頭狀瘤病毒重組蛋白，對臨床檢體之人體細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗，并比較細(xì)胞核與 細(xì)胞質(zhì)之染色。另一方法亦用來偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染，利用多種抗體與篩選自E6， E7，L1及其組合群蛋白之人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，進(jìn)行臨床人類檢體之免疫試驗，并 以兩種以上抗體比較人體細(xì)胞染色情形，若至少一種以上抗體試驗呈陽性染色結(jié)果，則表 示人體受人乳頭狀瘤病毒感染。在一方面，本發(fā)明提供一抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體，能應(yīng)用于一免疫試驗中， 對人乳頭狀瘤病毒晚期感染之人類細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色。在另一面項中，本發(fā)明提供一抗 人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體和抗人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體，能應(yīng)用于一免疫試驗 中，對人類細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核染色，以表示在疾病發(fā)展階段中之人乳頭狀瘤病毒感染狀況。人 乳頭狀瘤病毒感染之人體細(xì)胞的細(xì)胞核染色，顯示人乳頭狀瘤病毒之早期感染，而細(xì)胞質(zhì) 之染色，則指出病變增生成為晚期疾病階段。使用于免疫試驗之抗人乳頭狀瘤病毒單克隆 抗體包括，抗人乳頭狀瘤病毒E7、抗人乳頭狀瘤病毒E6和濃縮人乳頭狀瘤病毒Ll單克隆 抗體，以及其結(jié)合。在另一面項中，本發(fā)明提供一抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體和人乳 頭狀瘤病毒E7蛋白，作為生物標(biāo)記，用以偵測子宮頸癌之增生。此外，本發(fā)明提供多種免疫 試驗之實施方法，包括免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。單克隆抗體對人乳頭狀瘤病毒 蛋白具有高度專一性，亦可用于人乳頭狀瘤病毒偵測之免疫試驗。在一實施案例中，以抗人 乳頭狀瘤病毒單克隆抗體對上皮組織樣本的細(xì)胞核染色，可顯示一般人乳頭狀瘤病毒之感 染。在另一實施案例中，以抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體對上皮組織樣本之細(xì)胞質(zhì)染色，可 顯示人乳頭狀瘤病毒感染之病變增生。在另一方面，提供臨床檢體免疫試驗之試劑盒，包含抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗 體其能對人乳頭狀瘤病毒感染之人類細(xì)胞之細(xì)胞核進(jìn)行染色，顯示人乳頭狀瘤病毒之感 染；對人乳頭狀瘤病毒感染之人類細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，則顯示人乳頭狀瘤病毒晚期疾 病階段之感染。在另一方面，人體人乳頭狀瘤病毒感染之偵測試劑盒，包含一抗人乳頭狀瘤 病毒單克隆抗體，其能用于人類臨床檢體中進(jìn)行免疫試驗，能對來自臨床之人體細(xì)胞進(jìn)行 細(xì)胞核染色，并與人體細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)染色做比較。本發(fā)明提供各式免疫試驗，包括免疫組織化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)分析，及流細(xì)胞試 驗，利用各式抗人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之單克隆抗體進(jìn)行各式免疫試驗原位偵測人乳頭狀瘤病毒蛋白，此人乳頭狀瘤病毒蛋白包括感染高風(fēng)險或低風(fēng)險人乳頭狀瘤病毒型，其可 被單一特異性單克隆抗體或一般泛抗體偵測到。本發(fā)明亦提供人乳頭狀瘤病毒免疫細(xì)胞化 學(xué)試驗、人乳頭狀瘤病毒流細(xì)胞試驗和人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗，偵測子宮頸細(xì) 胞或組織中人乳頭狀瘤病毒蛋白之存在。此外，單克隆抗體對人乳頭狀瘤病毒蛋白具有高 度專一性，可用于人乳頭狀瘤病毒免疫細(xì)胞化學(xué)或人乳頭狀瘤病毒流細(xì)胞試驗。在一實施案例中，一免疫細(xì)胞試驗方法用來原位偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染， 偵測玻片上含有人類細(xì)胞薄層之生物檢體中，來自多種人乳頭狀瘤病毒型之人乳頭狀瘤病 毒蛋白，利用多種抗體對人類細(xì)胞薄層進(jìn)行染色。方法包含提供來自人體之臨床檢體，將 檢體制備成不正常和正常形態(tài)之人類細(xì)胞均勻混合物溶液，將混合物于玻片上制成細(xì)胞薄 層，以一種或多種抗多種純化后人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之抗體，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗， 玻片上臨床檢體中的不正常和正常形態(tài)之細(xì)胞混合物中，來自一種或多種人乳頭狀瘤病毒 型之一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白可被原位染色。在另一實施案例中，提供偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染之方法，包括提供人類臨 床檢體，該檢體被制備成含有不正常和正常型態(tài)之人類細(xì)胞混合物之溶液，并以試劑標(biāo)記 一種或多種抗體，。利用一種或多種抗一種或多種純化后人乳頭狀瘤病毒重組蛋白抗體，對 含有不正常和正常型態(tài)之人類細(xì)胞混合物進(jìn)行染色。該方法進(jìn)一步包含進(jìn)行一樣或多樣流 細(xì)胞試驗，將含有不正常和正常型態(tài)之人類細(xì)胞混合物之溶中單一細(xì)胞分離以進(jìn)行偵測， 偵測液態(tài)臨床檢體不正常和正常型態(tài)之人類細(xì)胞混合物中，一種或多種人乳頭狀瘤病毒型 之人乳頭狀瘤病毒蛋白之存在。在一實施案例中，產(chǎn)生一種或多種抗一種或多種純化后人乳頭狀瘤病毒重組蛋白 之抗體，其中至少一種抗體可辨識人乳頭狀瘤病毒早期蛋白。在另一實施案例中，此一種或 多種抗體以試劑進(jìn)行標(biāo)記，將人體生物樣本中之多種人類細(xì)胞制備成溶液，各式抗體與來 自各種人乳頭狀瘤病毒型之各種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，與被標(biāo)記的抗體反應(yīng)，藉 由試劑的表達(dá)被偵測到。在另一實施案例中，試劑包括比色試劑、螢光染色試劑和其他試 劑，作為流細(xì)胞試驗中人類細(xì)胞分離和定性之試劑。此外，提供一進(jìn)行免疫試驗之試劑。該試劑包含抗體前封閉液、抗體后封閉液、抗 人乳頭狀瘤病毒抗體作為一級抗體、與抗老鼠或抗兔子免疫球蛋白共軛之辣根過氧化物酶 或生物素、或其他作為二級抗體之試劑，含有適當(dāng)試劑之溶液作為二級抗體之基質(zhì)被偵測。在另一實施案例中，提供試劑盒偵測人體人乳頭狀瘤病毒感染，包含抗人乳頭狀 瘤病毒單克隆抗體，其能與人乳頭狀瘤病毒早期蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，以用來進(jìn)行臨床檢體之免 疫細(xì)胞化學(xué)試驗，該檢體被制備成含有不正常和正常型態(tài)之人類細(xì)胞混合物之溶液，，并置 于玻片上形成細(xì)胞薄層，將一種或多種來自一種或多種人乳頭狀瘤病毒型之人乳頭狀瘤病 毒蛋白加以原位染色。本發(fā)明提供多種固態(tài)表面免疫試驗，利用各式抗人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之單克 隆抗體進(jìn)行各式免疫試驗原位偵測人乳頭狀瘤病毒蛋白，此人乳頭狀瘤病毒蛋白包括感染 高風(fēng)險或低風(fēng)險人乳頭狀瘤病毒型，其可被單一特異性單克隆抗體或一般泛抗體偵測到。 本發(fā)明亦提供人乳頭狀瘤病毒膜免疫印跡分析法、蛋白質(zhì)晶片基因芯片試驗、人乳頭狀瘤 病毒微粒試驗、人乳頭狀瘤病毒測流快速試驗、人乳頭狀瘤病毒垂直通透快速試驗、人乳頭 狀瘤病毒微流體快速試驗、酶免疫分析方法(EIA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，偵測生物檢體如子宮頸細(xì)胞或組織中人乳頭狀瘤病毒蛋白之存在。此外，亦提供進(jìn)行這些試驗的試 劑和設(shè)備。在一實施案例中，提供一方法偵測多種人乳頭狀瘤病毒蛋白，提供一抗人乳頭狀 瘤病毒抗體，能與臨床檢體中來自各種人乳頭狀瘤病毒型之多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生 鍵結(jié)，提供一固體表面，包被抗人乳頭狀瘤病毒抗體或表達(dá)于細(xì)胞裂解物溶液中的病毒蛋 白；將臨床檢體制程細(xì)胞裂解溶液，其中含有多種人乳頭狀瘤病毒蛋白。方法進(jìn)一步包含抗 人乳頭狀瘤病毒抗體與細(xì)胞裂解物溶液進(jìn)行反應(yīng)，形成一含有多種人乳頭狀瘤病毒蛋白與 抗人乳頭狀瘤病毒抗體復(fù)合物之固態(tài)玻片，偵測玻片上的復(fù)合物，確認(rèn)臨床檢體中人乳頭 狀瘤病毒蛋白之表達(dá)。在另一實施案例中，提供一方法偵測生物樣本中，來自不同人乳頭狀瘤病毒型的 一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白之存在，并將生物樣本制成細(xì)胞裂解溶液，將抗人乳頭狀 瘤病毒第一抗體包被于固態(tài)表面，與細(xì)胞裂解溶液中的抗人乳頭狀瘤病毒第二抗體進(jìn)行反 應(yīng)。兩者抗體皆能與來自多種人乳頭狀瘤病毒型之人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)。方法進(jìn) 一步包括在固態(tài)表面形成多種人乳頭狀瘤病毒蛋白與抗人乳頭狀瘤病毒一級、二級抗體之 復(fù)合物，藉偵測固態(tài)表面上復(fù)合物的形成，可偵測生物樣本中一種或多種人乳頭狀瘤病毒 蛋白之表達(dá)。此外，依據(jù)本發(fā)明一實施案例，提供一測流系統(tǒng)，可偵測制備成細(xì)胞裂解物溶液的 臨床樣本中，來自一種或各種人乳頭狀瘤病毒型的一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白，此測 流系統(tǒng)包括在玻片一端之固態(tài)表面包被上抗人乳頭狀瘤病毒抗體，該第一抗人乳頭狀瘤 病毒抗體可與來自各式人乳頭狀瘤病毒型之一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，因 此能將細(xì)胞裂解物溶液中的人乳頭狀瘤病毒蛋白捕捉至固態(tài)表面；在玻片之另一端包被上 第二抗人乳頭狀瘤病毒抗體，流經(jīng)玻片之細(xì)胞裂解物溶液測流進(jìn)入后，與第二抗體反應(yīng)形 成復(fù)合體，該第二抗體能與一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，因此能偵測臨床樣 本中人乳頭狀瘤病毒蛋白之表達(dá)。在一方面，抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體由抗一種或多種帶有各式人乳頭狀瘤病毒 基因之重組蛋白產(chǎn)生，該抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體可捕捉固態(tài)表面上，細(xì)胞裂解溶液中 的多種人乳頭狀瘤病毒蛋白。在另一方面，抗人乳頭狀瘤病毒第二抗體由帶有相同人乳頭 狀瘤病毒基因之相同第一重組蛋白產(chǎn)生，該抗人乳頭狀瘤病毒第二抗體能與固態(tài)表面上， 細(xì)胞裂解溶液中的多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)并進(jìn)行偵測。范例.范例一表達(dá)、純化并制備人乳頭狀瘤病毒重組蛋白，作為抗原，產(chǎn)生抗血清及抗 人乳頭狀瘤病毒抗體，以融合瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選形成單克隆抗體。人乳頭狀瘤病毒重組蛋白可為任何人乳頭狀瘤病毒蛋白及早期或晚期基因之人 乳頭狀瘤病毒蛋白，包括但不僅限于E2，E6，E7，Ll及L2，且可形成多種人乳頭狀瘤病毒型。 E6，E7及Ll之全段多肽序列，不僅難以被獲得，且蛋白純化時產(chǎn)生非預(yù)期之聚集現(xiàn)象，造成 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定和低度表達(dá)，且純化后之蛋白抗原表達(dá)量低。例如，許多早期E6原致癌蛋白 包含許多半胱氨酸，因而正確的E6原致癌蛋白拓圖需要許多適切的雙硫鍵之形成。此外， 某些免疫學(xué)試驗使用早期E6和E7蛋白之小分子勝肽，其偵測特異性和敏感度極低，且不適 合作為臨床活體診斷之工具。因此，本專利發(fā)明提供之重組蛋白，重組人乳頭狀瘤病毒原致癌蛋白之部分序列或全段續(xù)列，形成重組雜交蛋白。1).各式帶有人乳頭狀瘤病毒16E6和人乳頭狀瘤病毒18E6基因的重組蛋白之克 隆和產(chǎn)生。一來自人乳頭狀瘤病毒范例病毒型人乳頭狀瘤病毒16之E6早期原致癌范例 基因被克隆，此克隆基因具有474個鹼基對(b.p.)之脫氧核醣核酸片段，包含全部人乳頭 狀瘤病毒16E6基因之157種胺基酸編碼區(qū)，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得并加以擴增。分 離出的脫氧核醣核酸片段之脫氧核醣核酸序列經(jīng)由與基因銀行資料庫的比對進(jìn)行確認(rèn)。重 組蛋白人乳頭狀瘤病毒18E6亦可被獲得。所有克隆步驟依據(jù)"分子克隆"，實驗室手冊， Sambrook,Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 一書所 描述之方法。此外，人乳頭狀瘤病毒18E6基因亦被克隆及確認(rèn)脫氧核醣核酸序列。2).各式帶有人乳頭狀瘤病毒16E7和人乳頭狀瘤病毒18E7基因的重組蛋白之克 隆和產(chǎn)生。一來自人乳頭狀瘤病毒范例病毒型人乳頭狀瘤病毒16之早期原致癌范例基因 E7被克隆，此克隆基因具有294個鹼基對(b.p.)之脫氧核醣核酸片段，包含全部人乳頭狀 瘤病毒16E7基因之99種胺基酸編碼區(qū)，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)獲得并加以擴增。分離出的脫氧 核醣核酸片段之脫氧核醣核酸序列經(jīng)由與基因銀行資料庫的比對進(jìn)行確認(rèn)。人乳頭狀瘤病 毒18E7重組蛋白亦被獲得。此外，來自不同人乳頭狀瘤病毒型的E7脫氧核醣核酸片段，可 由不同臨床檢體或來源被克隆。3).帶有人乳頭狀瘤病毒16L1和人乳頭狀瘤病毒18L1基因的重組蛋白之克隆和 產(chǎn)生。一來自人乳頭狀瘤病毒范例病毒型人乳頭狀瘤病毒16之早期范例基因被克隆，1596 個鹼基對(b. p.)之脫氧核醣核酸片段，包含全部人乳頭狀瘤病毒16L1基因之531種胺基 酸編碼區(qū)，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)獲得并加以擴增。分離出的脫氧核醣核酸片段之脫氧核醣核酸 序列經(jīng)由與基因銀行資料庫的比對進(jìn)行確認(rèn)。此外，來自不同人乳頭狀瘤病毒型的Ll脫氧 核醣核酸片段，可由不同臨床檢體或來源被克隆。由His-標(biāo)記表達(dá)系統(tǒng)獲得人乳頭狀瘤病毒16L1蛋白之N端重組片段。人乳頭狀 瘤病毒16L1N端重組蛋白之分子量約為34KD。LlC端片段亦可被獲得。人乳頭狀瘤病毒 18L1重組蛋白也能被獲得，做為抗原產(chǎn)生抗血清、多克隆抗體和單克隆抗體。此專利描述之多種重組蛋白可表達(dá)于各種合適之系統(tǒng)中，諸如細(xì)菌、病毒、酵母菌 和哺乳類表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、酵母菌、桿狀病毒和哺乳類之細(xì)胞培養(yǎng)等。雖多勝肽可由 其他方式獲得，專利提供之實施案例中，多種重組蛋白大部分(或幾乎)為其原始型式，此 構(gòu)型在免疫分析試驗中，更有可能與來自人乳頭狀瘤病毒感染人體組織之抗體產(chǎn)生鍵結(jié)。 例如，GST, MBP或His標(biāo)志-人乳頭狀瘤病毒16-E6，人乳頭狀瘤病毒18E6，人乳頭狀瘤病 毒16E7，人乳頭狀瘤病毒18E7，人乳頭狀瘤病毒16L1，和人乳頭狀瘤病毒18L1重組蛋白， 利用IPTG驅(qū)動誘導(dǎo)，在大腸桿菌BL21(DE3)中被表達(dá)。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，標(biāo)志-人乳頭 狀瘤病毒重組蛋白經(jīng)由培養(yǎng)細(xì)胞裂解后溶解部分被獲得，并純化至濃度約為0. 1到1毫克 /毫升或更高。人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之純度，經(jīng)電泳PAGE分析，預(yù)估大于90%。人乳 頭狀瘤病毒重組蛋白可用以偵測臨床檢體中人乳頭狀瘤病毒抗體之存在與否，也可做為抗 原制造多克隆抗血清和單克隆抗體。此專利描述之各式表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)包含多種人乳頭狀瘤病毒重組蛋白，放大 至1公升，10公升或100公升甚至更高，以獲得大量可溶的重組蛋白進(jìn)行純化。細(xì)胞裂解后 可溶解部分，通過各式層析管柱，在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中與人乳頭狀瘤病毒重組蛋白之標(biāo)記
13位置鍵結(jié)；標(biāo)志-人乳頭狀瘤病毒重組蛋白在由管柱中被沖提出來，濃縮至100毫升，10毫 升或1毫升。純化后的水溶性人乳頭狀瘤病毒重組蛋白進(jìn)一步以中性酸鹼值緩沖液或磷酸 鹽緩沖液濃縮和透析，作為抗原產(chǎn)生抗人乳頭狀瘤病毒蛋白之抗血清。由溶解部份純化出 的水溶性人乳頭狀瘤病毒重組蛋白，摺疊方式與其在活體狀態(tài)下原始摺疊方式相似。生產(chǎn)各種不同造型之單克隆抗體，獲得高質(zhì)量的純化后人乳頭狀瘤病毒重組蛋白 是很重要的，抗體能辨識一般或特殊的抗原表位，用以偵測人乳頭狀瘤病毒感染。純化后 人乳頭狀瘤病毒重組蛋白，經(jīng)由測試確認(rèn)與來自臨床人乳頭狀瘤病毒感染檢體之人乳頭狀 瘤病毒抗體的鍵結(jié)能力。該純化后之人乳頭狀瘤病毒重組蛋白可作為抗原產(chǎn)生抗血清和抗 體，在活體中辨識人乳頭狀瘤病毒自然病毒蛋白。范例二 生產(chǎn)抗人乳頭狀瘤病毒多克隆抗 體·純化大腸桿菌中表達(dá)之人乳頭狀瘤病毒E6，E7或Ll重組蛋白，以磷酸鹽濃縮透析 后作為抗原。免疫反應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，以酶聯(lián)免疫吸附試驗分析每一獲得之血清，接著 程序性增加及出血。收集滴定度最佳之血液，產(chǎn)生之血清經(jīng)由蛋白質(zhì)A管柱或親合性管柱 進(jìn)行免疫球蛋白(Ig)之純化；純化后之免疫球蛋白G(IgG)作為人乳頭狀瘤病毒免疫針測 分析之抗人乳頭狀瘤病毒抗體。此專利發(fā)明描述的單克隆抗體、多克隆抗體和血清之獲得、純化和試驗，無論致病 原因、細(xì)胞病灶、發(fā)炎反應(yīng)或癌癥之發(fā)展情況，可用以偵測人乳頭狀瘤病毒感染。其他研究 者嘗試發(fā)展抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體卻未得成果，因未能得到足夠之人乳頭狀瘤病毒 蛋白來產(chǎn)生單克隆抗體；無法產(chǎn)生高度專一性之單克隆抗體，因抗原不具免疫抗原性；或 產(chǎn)生之抗體無法辨識臨床檢體早期人乳頭狀瘤病毒感染之人乳頭狀瘤病毒原始病毒造型。 一些抗體產(chǎn)生抗突變之勝肽，僅能辨識晚期子宮頸癌，但不確定其抗體辨識人乳頭狀瘤病 毒野型之自然蛋白或任何早期人乳頭狀瘤病毒感染。此外，晚期人乳頭狀瘤病毒之偵測對 疾病介入和治療已太遲。此專利發(fā)明所描述之臨床抗體應(yīng)用，可藉適當(dāng)之臨床檢體經(jīng)人乳頭狀瘤病毒免疫 偵測分析被證實，如酶聯(lián)免疫吸附試驗試驗、免疫細(xì)胞化學(xué)試驗、免疫組織化學(xué)試驗。本發(fā) 明之新型單克隆抗體和抗血清獲得方法，可與具有早期細(xì)胞病灶，如子宮頸上皮內(nèi)贅瘤和 晚期人乳頭狀瘤病毒相關(guān)之子宮頸癌，之臨床檢體的人乳頭狀瘤病毒蛋白反應(yīng)并產(chǎn)生鍵 結(jié)。此單克隆抗體和抗血清，為人乳頭狀瘤病毒相關(guān)致病原和早期晚期子宮頸癌發(fā)展之偵 測和篩選，提供了強而有利的偵測工具，因此提供疾病發(fā)展之介入和早期治療之渠道。范例三發(fā)展抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體純化在大腸桿菌表達(dá)之人乳頭狀瘤病毒E6，E7或Ll重組蛋白，以磷酸鹽濃縮和透 析后作為抗原。小鼠之免疫反應(yīng)測試按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，以酶聯(lián)免疫吸附試驗分析滴定每 一獲得之血清，接著程序性增加及出血。當(dāng)小鼠之血清達(dá)最佳化時，以標(biāo)準(zhǔn)步驟融合小鼠之 脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。克隆融合細(xì)胞，如融合瘤細(xì)胞，并進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。1).融合瘤細(xì)胞篩選為獲得本專利所描述對各種人乳頭狀瘤病毒蛋白具有專一 性鍵結(jié)能力之人乳頭狀瘤病毒產(chǎn)生抗體之融合瘤細(xì)胞，藉由篩選各種原始抗原和其他人乳 頭狀瘤病毒蛋白作為正向篩選，非相關(guān)性的蛋白則作為負(fù)向篩選，以進(jìn)行融合瘤細(xì)胞克隆。 例如，兩種以上純化后人乳頭狀瘤病毒重組蛋白被篩選出，用以抗每一融合瘤細(xì)胞之克隆， 并用以測試和了解所獲得的每一產(chǎn)生抗體之融合瘤細(xì)胞株之專一性。
2).融合瘤細(xì)胞株庫以免疫分析方法(如酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶免疫分析方法和 其他試驗)克隆所希望之陽性反應(yīng)及陰性反應(yīng)之融合瘤細(xì)胞，并克隆至單一細(xì)胞。每一單 一細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)而生長，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)每毫升含一百萬個細(xì)胞時，將細(xì)胞冷凍保純在攝氏 零下80度或液態(tài)氮中，作為細(xì)胞庫之存貯。3).腹水之產(chǎn)生每一融合瘤細(xì)胞株在組織培養(yǎng)中生長，并注射至小鼠體中以產(chǎn) 生腹水。產(chǎn)生并收集之腹水做為以G蛋白管柱純化之免疫球蛋白，每一融合瘤細(xì)胞株純化 出之免疫球蛋白是同型的，可應(yīng)用于人乳頭狀瘤病毒免疫分析范例四人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗.1).人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試劑和試驗在一實施案例中，提供進(jìn)行人乳 頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗的試劑。試劑包括抗原擷取試劑、抗體前封閉液、抗體后封閉 液、抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體、與抗老鼠或抗兔子免疫球蛋白共軛之辣根過氧化物酶或 生物素或其他試劑作為之第二抗體、以及一溶液其中含有適當(dāng)之試劑作為第二抗體被偵測 之基質(zhì)?？乖瓟X取試劑包含低酸鹼值、中性酸鹼值或高酸鹼值之緩沖溶液。前抗體封閉液 包含一些蛋白質(zhì)、牛血清蛋白(BSA)、血清或其他試劑，用以終止由抗體所產(chǎn)生非之特異性 鍵結(jié)。后抗體封閉液與前抗體封閉液相似，含有少量蛋白質(zhì)或血清，與第一抗體進(jìn)行培養(yǎng)。 含有人乳頭狀瘤病毒抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用?？谷巳轭^狀 瘤病毒抗體可以辣根過氧化物酶、生物素或其它可被做為偵測基質(zhì)之適當(dāng)試劑直接標(biāo)記。 含有第二抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用?；|(zhì)溶液由可做為偵測 基質(zhì)之當(dāng)試劑組成，包括DAB(3. 3' -diaminobenzidine)作為一組成成分或兩種成分，或 AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazole)基質(zhì)作為一組成成分或兩種成分，或其他基質(zhì)。一旦子宮頸組織被制成和固定后，便進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗，玻片上的組織與抗 原擷取試劑一起加熱沸騰一段時間，然后將玻片冷卻至室溫，以前抗體封閉液進(jìn)行封閉一 段時間后，與人乳頭狀瘤病毒抗體進(jìn)行培養(yǎng)。以磷酸鹽、水或其他緩沖液清洗玻片，除去任 何未鍵結(jié)之人乳頭狀瘤病毒抗體；將玻片與第二抗體進(jìn)行培養(yǎng)，如抗老鼠IgG辣根過氧化 物酶，以適當(dāng)之基質(zhì)進(jìn)行偵測。試舉一例，當(dāng)過氧化物酶和過氧化氫存在時，DAB被氧化產(chǎn) 生棕色沉淀，和酵素活性部位上之酒精不溶性沉淀；沉淀顏色依酵素含量呈淡金棕色至深 金棕色，顯微鏡下金棕色沉淀，表示人乳頭狀瘤病毒抗體與玻片上組織細(xì)胞中表達(dá)的人乳 頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生專一性鍵結(jié)。此試驗可在室溫或高溫下加速鍵結(jié)反應(yīng)進(jìn)行，該人乳頭 狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗可徒手操作或以免疫組織化學(xué)自動儀進(jìn)行，提供了人乳頭狀瘤 病毒感染和人乳頭狀瘤病毒原致癌蛋白原位偵測之有力工具。因此，人乳頭狀瘤病毒免疫 組織化學(xué)染色試驗是非常有用的確認(rèn)檢查，對于結(jié)構(gòu)不良細(xì)胞之確認(rèn)，人乳頭狀瘤病毒免 疫組織化學(xué)染色提供人乳頭狀瘤病毒感染或人乳頭狀瘤病毒原致癌蛋白表達(dá)情形之進(jìn)一 步信息。此外，不同階段之子宮頸細(xì)胞結(jié)構(gòu)不良，人乳頭狀瘤病毒E6和E7原致癌蛋白之過 度表達(dá)，可能表示子宮頸上皮內(nèi)贅瘤之增生或子宮頸癌之發(fā)展。2).樣本選擇與制備爲(wèi)了分析本發(fā)明所提供之抗人乳頭狀瘤病毒抗體是否能原 位偵測不同子宮頸上皮內(nèi)贅瘤病程或癌癥之人乳頭狀瘤病毒蛋白，以免疫組織化學(xué)試驗分 析子宮頸組織，包括含有第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤(子宮頸上皮內(nèi)贅瘤第二級伴隨中度病 灶表達(dá))之高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤(子宮頸上皮內(nèi)贅瘤第三級伴隨重度病灶表達(dá))、含有鱗狀細(xì)胞癌(SCC，子宮頸癌最常見之癌癥)之侵襲性癌癥和 腺癌(ADC，腺型腫瘤)。將蠟質(zhì)組織塊切割成4微米，至于玻片上培養(yǎng)在60°C隔夜；去蠟質(zhì) /脫水部分則不遮蔽，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色程序。將純化后的抗人乳頭狀瘤病毒蛋白 單克隆抗體稀釋作為第一抗體，染色步驟依序為第二抗體溶液、清洗和適當(dāng)之基質(zhì)試劑。當(dāng) 片段形成時，立即以去離子水將玻片懸浮，以四溴螢光素進(jìn)行復(fù)染，脫水后蓋上蓋玻片。3).組織芯片為了在一次均質(zhì)試驗反應(yīng)中同時分析多個樣本，以組織基因芯片 將許多樣本同時點在玻片上。將來自第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤，第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤 或非侵襲性癌癥共84組樣本制備成三個組織基因芯片一陣列包含30個第二級子宮頸上 皮內(nèi)贅瘤個體以及其周圍正常上皮細(xì)胞；另一陣列包含30個第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤個 體以及其周圍正常上皮細(xì)胞；最后一陣列包含12%子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌以及其周圍正 常上皮細(xì)胞，12個腺癌樣本及其正常上皮相關(guān)細(xì)胞，距離腫瘤邊緣至少15毫米的陰道或子 宮頸黏膜。在每一子宮頸上皮內(nèi)贅瘤病例中，選擇一腫瘤形成之代表性組織陣列點，和另一 代表其正常相關(guān)組織之基因芯片點；在非侵襲性癌癥病例中，選擇兩個組織為陣列點，和一 個正常相關(guān)組織基因芯片點。取得人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核酸比對之組織玻片后，回收 來自相關(guān)蠟嵌入組織塊之2毫米的陰道或子宮頸黏膜。在每一子宮頸上皮內(nèi)贅瘤病例中， 選擇一腫瘤形成之代表性組織陣列點圓形組織陣列點。4).人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核酸測試每一病例之人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核 酸比對，使用fesyChip 人乳頭狀瘤病毒點墨法或HR-人乳頭狀瘤病毒晶片，藉由修飾有 MY11/GP6+聚合酶鏈反應(yīng)-基準(zhǔn)之反-免疫印跡分析法進(jìn)行確認(rèn)，其在尼龍濾膜上含有13 種特異性之寡核苷酸，以全部細(xì)胞脫氧核醣核酸作為核苷酸的來源，放大后藉雜交進(jìn)行偵 測。5).免疫組織化學(xué)程度和數(shù)據(jù)分析組織芯片上每一陣列點之染色結(jié)果，由專業(yè) 之解剖病理學(xué)家以顯微鏡進(jìn)行分析，腫瘤細(xì)胞或結(jié)構(gòu)不良性細(xì)胞之面積，經(jīng)細(xì)胞染色后計 算其百分比，染色深淺分為0-3個等級。正常鄰近上皮細(xì)胞，或與其相關(guān)之結(jié)構(gòu)不良細(xì)胞和 腫瘤相距15毫米的陰道或子宮頸黏膜。在每一子宮頸上皮內(nèi)贅瘤病例中，選擇一腫瘤形成 之代表性組織陣列點的正常組織皆納入等級分類；所有數(shù)據(jù)結(jié)果皆由專業(yè)病理學(xué)家進(jìn)行分 級，將10%的染色部分切下以進(jìn)行陽性或陰性試驗，所有數(shù)據(jù)在表1-17中顯示。為證明能夠偵測非侵襲性子宮頸癌之人乳頭狀瘤病毒蛋白，鱗狀上皮細(xì)胞癌是最 常見的子宮頸癌，將鱗狀細(xì)胞癌癌組織進(jìn)行人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗。圖1A-1D 說明以老鼠人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體進(jìn)行鱗狀上皮細(xì)胞癌組織免疫組織化學(xué)染色之 結(jié)果。圖IA說明以濃縮人乳頭狀瘤病毒E7老鼠單克隆抗體，對組織基因芯片中的鱗狀細(xì) 胞癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色之代表性影像圖。圖IB說明圖IA中，鱗狀細(xì)胞癌個案之 正常上皮細(xì)胞(與腫瘤組織相距15毫米)代表性影像圖。圖IC說明使用相同濃縮人乳頭 狀瘤病毒E7老鼠單克隆抗體，對組織基因芯片另一鱗狀細(xì)胞癌樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染 色之代表性影像圖。圖ID說明圖IC中腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)以相同濃縮人乳頭狀瘤病毒E7抗 體染色后之放大影像圖。研究結(jié)果顯示，E7原致蛋白癌的表達(dá)可在鱗狀細(xì)胞癌組織中的腫 瘤細(xì)胞被偵測到，黑色實心箭頭標(biāo)示出腫瘤細(xì)胞中E7蛋白之特異性染色，而空心箭頭則標(biāo) 示出未被染色的正常細(xì)胞。這些結(jié)果顯示，鱗狀細(xì)胞癌子宮頸組織中的人乳頭狀瘤病毒E7 蛋白，可藉由濃縮人乳頭狀瘤病毒E7抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗被原位偵測。
在另一類型非侵襲性子宮頸癌的人乳頭狀瘤病毒蛋白偵測中，圖2A-2C說明以相 同老鼠人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體，對子宮頸腺癌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示， 腺癌組織中的腫瘤細(xì)胞，可偵測到E7原致癌蛋白的表達(dá)，黑色實心箭頭標(biāo)示出腫瘤細(xì)胞中 E7蛋白之專一性染色，而空心箭頭則標(biāo)示出未被染色之正常細(xì)胞。圖2A說明以圖1中相 同之濃縮人乳頭狀瘤病毒E7抗體，對腺癌多克隆樣本之腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色 的代表性影像圖。圖2B圖2A中，腺癌樣本之相關(guān)性正常上皮細(xì)胞(與腫瘤組織相距15毫 米)代表性影像圖。圖2C說明圖2A中腺癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色放大影像圖，由放大的 影像圖可標(biāo)示出在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中E7蛋白表達(dá)的位置。這些結(jié)果顯示，以E7單克隆抗 體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，可偵測腺癌的腫瘤細(xì)胞，且與鱗狀細(xì)胞癌染色型態(tài)相似。分析每一侵襲性癌癥之人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)結(jié)果，表1說明M個免疫 組織化學(xué)侵襲性癌癥樣本細(xì)胞質(zhì)(C)、細(xì)胞核(N)染色之結(jié)果，在圖1A-1D和圖2A-2C中， 以C或N表示濃縮人乳頭狀瘤病毒E7抗體染色之百分比。附加的抗人乳頭狀瘤病毒抗體 包含其他抗E7抗體、抗人乳頭狀瘤病毒E6抗體，如MAbl和MAb 7，以及抗人乳頭狀瘤病毒 Ll抗體，皆以相同的組織基因芯片進(jìn)行測試。為了進(jìn)行各種抗人乳頭狀瘤病毒抗體之免疫 組織化學(xué)染色，使用另一濃縮人乳頭狀瘤病毒抗體對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色，免疫組織化 學(xué)分級結(jié)果說明于表1，人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核酸比對之結(jié)果亦說明于表中，作為相關(guān) 性樣本。表1結(jié)果說明，以抗E7抗體對鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，可發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞核和細(xì)胞質(zhì)皆被染色；然而，與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核染色做比較，細(xì)胞質(zhì)的染色程度較大。 在其鄰近正常上皮細(xì)胞中，僅在細(xì)胞核偵測到人乳頭狀瘤病毒E7蛋白的表達(dá)，而未在細(xì)胞 質(zhì)中測得人乳頭狀瘤病毒E7蛋白表達(dá)，與正常鄰近細(xì)胞做比較，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)明顯的 被染色。這些結(jié)果說明，鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組織中的腫瘤細(xì)胞，在其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中可偵 測到人乳頭狀瘤病毒E7蛋白的表達(dá)。E7蛋白的表達(dá)位置在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而非正常 上皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞，顯示出其對腫瘤存在特異性。藉由抗E7抗體，偵測表達(dá)在正常鄰近 上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的人乳頭狀瘤病毒E7蛋白，可顯示原致癌蛋白表達(dá)的人乳頭狀瘤病 毒感染。使用其他抗人乳頭狀瘤病毒抗體的類似染色型態(tài)說明于表1，結(jié)果顯示此處所描述 之人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)試驗，可偵測到表達(dá)于子宮頸組織腫瘤細(xì)胞中的人乳頭狀 瘤病毒早期基因，如E6和E7，以及晚期基因Ll蛋白。比較人乳頭狀瘤病毒免疫組織化學(xué)及人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核酸比對之結(jié) 果，抗E7抗體對所有測試樣本中的人乳頭狀瘤病毒型呈陽性反應(yīng)。此處所描述之濃縮E7 單克隆抗體可偵測單一人乳頭狀瘤病毒型感染，諸如人乳頭狀瘤病毒16，人乳頭狀瘤病毒 18，人乳頭狀瘤病毒33和人乳頭狀瘤病毒45此類與癌癥相關(guān)之人乳頭狀瘤病毒型(高風(fēng) 險人乳頭狀瘤病毒型)。單一抗E7單克隆抗體也可偵測多種病毒型感染的人乳頭狀瘤病 毒，如人乳頭狀瘤病毒11，人乳頭狀瘤病毒16，人乳頭狀瘤病毒18，人乳頭狀瘤病毒52，人 乳頭狀瘤病毒58，人乳頭狀瘤病毒51和人乳頭狀瘤病毒59這些病毒型之結(jié)合，包含高風(fēng) 險、低風(fēng)險和非原致癌基因α-人乳頭狀瘤病毒；然而，多重人乳頭狀瘤病毒型之感染，其 中至少含有一種高風(fēng)險型人乳頭狀瘤病毒。這些結(jié)果顯示，本發(fā)明中描述之濃縮Ε7抗體是 非專一性的，因此可作為有利之工具，偵測子宮頸癌常見之一般高風(fēng)險病毒型的人乳頭狀 瘤病毒Ε7蛋白。
表1 :12個鱗狀細(xì)胞癌生物檢體和12個腺癌生物檢體之免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (% stained染色百分比)以及人乳頭狀瘤病毒脫氧核醣核酸比對結(jié)果(C 細(xì)胞質(zhì)；N 細(xì)胞 核；Dys 結(jié)構(gòu)不良性或腫瘤細(xì)胞)
權(quán)利要求
1.一種偵測人類感染乳突狀病毒的方法，包括收集人類臨床樣本進(jìn)行免疫學(xué)試驗，以一種或多種以上之單克隆抗體，對臨床樣本中 人類細(xì)胞之細(xì)胞核進(jìn)行染色。
2.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，當(dāng)人類細(xì)胞核染色呈陽性反應(yīng)時，表示疾病發(fā)展 階段處于疾病之早期階段，諸如早期結(jié)構(gòu)不良增生階段、低度鱗狀上皮細(xì)胞病變、高度鱗狀 上皮細(xì)胞病變、第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤、第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤、第三級子宮頸上皮內(nèi) 贅瘤，以及其上述組合群構(gòu)成。
3.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，當(dāng)人類細(xì)胞質(zhì)染色呈陽性反應(yīng)時，表示人乳頭狀 瘤病毒感染可能發(fā)展成晚期病變，諸如晚期結(jié)構(gòu)不良增生、高度鱗狀上皮細(xì)胞病變、第二級 或第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤、侵襲性子宮頸癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、腺癌，以及其上述組合群 構(gòu)成。
4.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，其一種或多種單克隆抗體是由一種或多種純化后 之乳頭狀瘤病毒重組蛋白所產(chǎn)生。
5.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，發(fā)展出的一種或多種單克隆抗體與至少一種人類 乳頭狀瘤早期病毒蛋白具有鍵結(jié)能力。
6.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，發(fā)展出的一種或多種單克隆抗體與至少一種人類 乳頭狀瘤晚期病毒蛋白具有鍵結(jié)能力。
7.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，發(fā)展出的一種或多種單克隆抗體與至少一種早期 及至少一種晚期之人乳頭狀瘤病毒蛋白具有鍵結(jié)能力。
8.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，發(fā)展出的一種或多種單克隆抗體包含一抗體，其 與人類乳頭狀瘤早期病毒蛋白具有鍵結(jié)能力，并包含另一抗體其與人類乳頭狀瘤晚期蛋白 具有鍵結(jié)能力。
9.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，其一種或多種單克隆抗體是由濃縮人乳頭狀瘤病 毒E6單克隆抗體、抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體、抗人乳頭狀瘤病毒Ll單克隆抗體，以 及其上述組合群構(gòu)成。
10.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，進(jìn)一步包含有以一種或多種抗人乳頭狀瘤病毒 重組蛋白之抗體，對臨床樣本之人體細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗；并比較臨床樣本人體細(xì) 胞之細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色。
11.根據(jù)申請專利范圍第10項之方法，臨床樣本人體細(xì)胞之細(xì)胞核染色呈陽性反應(yīng)較 細(xì)胞質(zhì)多者，表示由族群中所篩選出之人乳頭狀瘤病毒感染病人處于疾病之早期階段，諸 如早期結(jié)構(gòu)不良增生、低度鱗狀上皮細(xì)胞病變、高度鱗狀上皮細(xì)胞病變、子宮頸上皮內(nèi)贅瘤 (第一級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤，第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤，第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤)，以及 其上述組合群構(gòu)成。
12.根據(jù)申請專利范圍第10項之方法，臨床樣本人體細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)染色呈陽性反應(yīng)較 細(xì)胞核多者，表示由族群中所篩選出之人乳頭狀瘤病毒感染病人處于疾病之晚期階段，諸 如晚期結(jié)構(gòu)不良增生、第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤、侵襲性癌癥，以及其上述組合群構(gòu)成。
13.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，進(jìn)一步包含以兩種或多種能與人乳頭狀瘤病毒 蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)之抗體，對臨床樣本之人體細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗，由族群中所篩選出 之相關(guān)蛋白如E6，E7，L1蛋白，以及由上述組成的構(gòu)成群組；以兩種以上抗體比較人體細(xì)胞染色之結(jié)果，染色結(jié)果呈陽性反應(yīng)者，表示該人體受人乳頭狀瘤病毒之感染。
14.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，免疫組織化學(xué)試驗可用來偵測各種病程階段之 人乳頭狀瘤病毒感染，由群組中篩選出的疾病階段包括早期人乳頭狀瘤病毒感染、晚期人 乳頭狀瘤病毒感染、早期子宮頸細(xì)胞病灶、晚期子宮頸細(xì)胞病灶、低度鱗狀上皮細(xì)胞病變、 高度鱗狀上皮細(xì)胞病變、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞、子宮頸上皮內(nèi)贅瘤(第一級子宮頸 上皮內(nèi)贅瘤，第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤，第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤)、發(fā)展中子宮頸癌、腺癌 多克隆、鱗狀上皮細(xì)胞癌，及其上述組合群構(gòu)成。
15.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，進(jìn)一步包含有提供一來自人體之臨床樣本，該 臨床樣本含有型態(tài)正常與不正常之人體細(xì)胞；將該樣本制備成一薄層細(xì)胞平鋪于玻片表 面；以一種或多種經(jīng)由一種或多種純化后之乳頭狀瘤病毒重組蛋白所產(chǎn)生之抗體，進(jìn)行免 疫細(xì)胞化學(xué)試驗分析，其中至少有一種抗體與人類乳頭狀瘤早期病毒蛋白具有鍵結(jié)能力； 并對玻片上臨床樣本中各式人乳頭狀瘤病毒蛋白型所產(chǎn)生的人乳頭狀瘤病毒蛋白進(jìn)行染 色。
16.根據(jù)申請專利范圍第1項之方法，進(jìn)一步包含有進(jìn)行多項流細(xì)胞偵測，由型態(tài)正 常與不正常之人體細(xì)胞之混和物中分離出每一細(xì)胞，以偵測每一個體細(xì)胞；分析臨床樣本 液態(tài)溶液，其型態(tài)不正常和正常之細(xì)胞混和物中含有多種人乳頭狀瘤病毒型，偵測來自各 種人乳頭狀瘤病毒型的人乳頭狀瘤病毒蛋白之表達(dá)。
17.偵測人體中各種人乳頭狀瘤病毒蛋白之方法，包含提供一能與來自各種人乳頭 狀瘤病毒型之各式人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)之抗人乳頭狀瘤病毒抗體；將臨床樣本制 備成細(xì)胞裂解物溶液，該溶液含有各式人乳頭狀瘤病毒蛋白；提供一包被至少一種蛋白之 固態(tài)表面，該蛋白由族群所中篩選出，包含有抗人乳頭狀瘤病毒抗體，以及各式表達(dá)于細(xì)胞 裂解物溶液中的蛋白質(zhì)；將抗人乳頭狀瘤病毒抗體與細(xì)胞裂解物溶液進(jìn)行反應(yīng)；在固態(tài)表 面上形成一由抗人乳頭狀瘤病毒抗體與各式人乳頭狀瘤病毒蛋白組成之復(fù)合體；分析該復(fù) 合體，以偵測臨床樣本中各式人乳頭狀瘤病毒蛋白表達(dá)。
18.根據(jù)申請專利范圍第17項之方法，其各式人乳頭狀瘤病毒蛋白，包括人乳頭狀瘤 病毒E6蛋白、人乳頭狀瘤病毒E7蛋白、人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白，以及由上述組成的構(gòu)成群 組。
19.根據(jù)申請專利范圍第17項之方法，其固態(tài)表面，包括磁珠表面、試紙表面、快速試 驗試紙表面、膜表面、重直流系統(tǒng)膜表面、微流系統(tǒng)表面、轉(zhuǎn)漬膜表面、蛋白芯片表面、玻璃 表面、微孔盤底部表面，及其上述組合群構(gòu)成。
20.根據(jù)申請專利范圍第19項之方法，以螢光流式細(xì)胞儀偵測各式磁珠固態(tài)表面之復(fù) 合體。
21.根據(jù)申請專利范圍第19項之方法，以抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體固著于試紙一 端，于試紙另一端加入抗人乳頭狀瘤病毒第二抗體和細(xì)胞裂解物溶液，在溶液測向流經(jīng)試 紙表面前，便與抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體形成一固著復(fù)合體而可被加以偵測。
22.根據(jù)申請專利范圍第19項之方法，以抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體固著于重直流系 統(tǒng)之膜表面，并依序加入抗人乳頭狀瘤病毒第二抗體和細(xì)胞裂解物溶液，當(dāng)溶液流經(jīng)重直 流快速測試系統(tǒng)時，與抗人乳頭狀瘤病毒第一抗體形成一固著復(fù)合體而可被加以偵測。
23.根據(jù)申請專利范圍第19項之方法，復(fù)合體流經(jīng)微流體系統(tǒng)，可在其表面被偵測到。
24.根據(jù)申請專利范圍第17項之方法，細(xì)胞裂解物溶液中各式之人乳頭狀瘤病毒蛋 白，與抗人乳頭狀瘤病毒抗體進(jìn)行反應(yīng)前，被包被于固態(tài)表面。
25.根據(jù)申請專利范圍第M項之方法，細(xì)胞裂解物溶液中各式之人乳頭狀瘤病毒蛋 白，被包被于轉(zhuǎn)漬膜之固態(tài)表面。
26.根據(jù)申請專利范圍第M項之方法，細(xì)胞裂解物溶液中各式之人乳頭狀瘤病毒蛋 白，被包被于微孔盤之固態(tài)表面，抗人乳頭狀瘤病毒抗體則預(yù)先標(biāo)記上篩選出的偵測試劑， 該試劑包括酵素共軛之生物素和奈米金顆粒，及其上述組合群構(gòu)成；偵測試劑表達(dá)的固態(tài) 表面上，形成由各式人乳頭狀瘤病毒蛋白和抗人乳頭狀瘤病毒抗體所組成的復(fù)合體，表示 樣本中含有各式人乳頭狀瘤病毒蛋白之表達(dá)。
27.根據(jù)申請專利范圍第17項之方法，抗人乳頭狀瘤病毒抗體在與含有各式人乳頭狀 瘤病毒蛋白之細(xì)胞裂解物溶液進(jìn)行反應(yīng)前，先包被于固態(tài)表面，以偵測樣本中人乳頭狀瘤 病毒之感染。
28.根據(jù)申請專利范圍第27項之方法，抗人乳頭狀瘤病毒抗體在與細(xì)胞裂解物溶液進(jìn) 行反應(yīng)前，被包被在蛋白芯片之固態(tài)表面上。
29.根據(jù)申請專利范圍第27項之方法，抗人乳頭狀瘤病毒抗體在與細(xì)胞裂解物溶液進(jìn) 行反應(yīng)前，被包被在微流體系統(tǒng)之固態(tài)表面上。
30.根據(jù)申請專利范圍第17項之方法，偵測固態(tài)表面上之復(fù)合體，可進(jìn)一步偵測含有 抗人乳頭狀瘤病毒抗體之標(biāo)記蛋白偵測試劑之表達(dá)、細(xì)胞裂解物溶液中各式蛋白之表達(dá)、 第二抗體與抗人乳頭狀瘤病毒抗體產(chǎn)生鍵結(jié)，及其上述組合群構(gòu)成，其中第二抗體之種類 依抗人乳頭狀瘤病毒抗體而異，抗人乳頭狀瘤病毒抗體亦可與臨床檢體中，來自各式人乳 頭狀瘤病毒型中的多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)。
31.根據(jù)申請專利范圍第30項之方法，由篩選出之試驗方法，分析偵測試劑是否表達(dá)， 包括以試劑之顏色改變作為直接定性分析、以酶聯(lián)免疫吸附試驗分析儀、流式細(xì)胞儀基因 芯片掃描器、和等讀取數(shù)據(jù)，以及其組合群。
32.根據(jù)申請專利范圍第31項及第1項之方法，進(jìn)一步包括在固態(tài)表面上包被一抗體， 以偵測細(xì)胞蛋白，并比較臨床樣本中，細(xì)胞蛋白和多種人乳頭狀瘤病毒蛋白之表達(dá)量。細(xì)胞 蛋白是由下列族群中所篩選出，諸如pl6INK4a，E2F，Ki-67 (MIB-I), MYC蛋白，CDK4，周期 素-A，周期素-B，周期素-E，端粒酶-TERC，MCM2蛋白，T0P2A蛋白，熱休克蛋白40 (HSP40)，熱 休克蛋白60 (HSP6tl)，熱休克蛋白70 (HSP7tl)，CA9/MN蛋白，層粘連蛋白5，層粘連蛋，brn-3a， CDK N2蛋白，拓樸異構(gòu)酶2A，微粒體維持蛋白_2，微粒體維持蛋白_4，微粒體維持蛋白-5， 生長素蛋白，VEGF蛋白，p53，RB, p27(kipl)，和p21 (waf)，以及其組合群。
33.測流系統(tǒng)可偵測制備成細(xì)胞裂解物溶液的測臨床樣本中，來自各種人乳頭狀瘤病 毒型的多種人乳頭狀瘤病毒蛋白，包括在玻片一端之固態(tài)表面包被上抗人乳頭狀瘤病毒 抗體，該第一抗人乳頭狀瘤病毒抗體可與來自各式人乳頭狀瘤病毒型之多種人乳頭狀瘤病 毒蛋白產(chǎn)生鍵結(jié)，因此能將細(xì)胞裂解物溶液中的人乳頭狀瘤病毒蛋白捕捉至固態(tài)表面；在 玻片之另一端包被上第二抗人乳頭狀瘤病毒抗體，流經(jīng)玻片之細(xì)胞裂解物溶液測流進(jìn)入 后，與第二抗體反應(yīng)形成復(fù)合體，該第二抗體能與一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白產(chǎn)生鍵 結(jié)，因此能偵測臨床樣本中人乳頭狀瘤病毒蛋白之表達(dá)。
34.一偵測人體中人乳頭狀瘤病毒感染之試劑盒，包含抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體進(jìn)行臨床樣本之免疫試驗，并比較樣本細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之染色程度。
35.一偵測人體中人乳頭狀瘤病毒感染之試劑盒，包含能與人乳頭狀瘤病毒早期蛋 白產(chǎn)生鍵結(jié)之抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體，將臨床樣本制備成含有型態(tài)不正常與正常細(xì) 胞之溶液，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)試驗。將樣本溶液在玻片上平鋪為一細(xì)胞薄層，對來自各式人 乳頭狀瘤病毒型之一種或多種人乳頭狀瘤病毒蛋白進(jìn)行原位染色。
36.根據(jù)申請專利范圍第35項之試劑盒，其抗人乳頭狀瘤病毒抗體，包括抗人乳頭狀 瘤病毒E7單克隆抗體、濃縮人乳頭狀瘤病毒E6單克隆抗體、濃縮人乳頭狀瘤病毒Ll抗體 與抗人乳頭狀瘤病毒E7單克隆抗體之結(jié)合、濃縮人乳頭狀瘤病毒Ll抗體與濃縮人乳頭狀 瘤病毒E6單克隆抗體之結(jié)合、濃縮人乳頭狀瘤病毒E6抗體與濃縮E7單克隆抗體之結(jié)合， 以及其組合群。
37.根據(jù)申請專利范圍第35項之試劑盒，其抗人乳頭狀瘤病毒單克隆抗體用以偵測各 種病程階段之人乳頭狀瘤病毒感染，篩選出之病程階段包括早期人乳頭狀瘤病毒感染、晚 期人乳頭狀瘤病毒感染、早期子宮頸細(xì)胞病灶、晚期子宮頸細(xì)胞病灶、低度鱗狀上皮細(xì)胞病 變、高度鱗狀上皮細(xì)胞病變，意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞、子宮頸上皮內(nèi)贅瘤(第一級子宮 頸上皮內(nèi)贅瘤，第二級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤，第三級子宮頸上皮內(nèi)贅瘤)、發(fā)展中子宮頸癌、腺 癌多克隆、鱗狀上皮細(xì)胞癌，以及其組合群。
全文摘要
本發(fā)明實施案例，提供方法、單克隆抗體、多克隆抗體、試驗和試劑盒，偵測人乳頭狀瘤病毒感染，包括各式人乳頭狀瘤病毒型之感染及早期或晚期人乳頭狀瘤病毒相關(guān)性或特異性之蛋白和抗體。在單一試驗中，單克隆抗體可偵測高風(fēng)險及低風(fēng)險人乳頭狀瘤病毒型之原致癌基因，且不受限于試驗之形式，提供一可專一性偵測侵襲性子宮頸癌之有利工具。本專利發(fā)明亦對子宮頸癌之生物標(biāo)記進(jìn)行確認(rèn)，生物標(biāo)記可配合試驗方法，可用于偵測早期癌前病灶或癌癥晚期之發(fā)展?fàn)顩r。
文檔編號G01N33/53GK102066931SQ200980131077
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者鄭淑玲 申請人:鄭淑玲