專利名稱：分選細(xì)胞的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分選細(xì)胞的方法及裝置，特別是涉及使用受控的能量源修飾所關(guān) 注的細(xì)胞群的方法及裝置，方式是選擇性地去除、富集或改變?cè)撊褐械募?xì)胞、病毒或微粒。
背景技術(shù)：
流式細(xì)胞分選可實(shí)現(xiàn)對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞、病毒、小體或微粒(下文稱為細(xì)胞)的群進(jìn) 行選擇、富集、分配或劃分。選擇標(biāo)準(zhǔn)包括個(gè)體細(xì)胞的可測(cè)量特性或復(fù)合體或小體的可測(cè)量 特性，前者可以在不借助化學(xué)試劑的情況下從細(xì)胞外部進(jìn)行檢測(cè)，后者與細(xì)胞相關(guān)，或者可 以使之與細(xì)胞相關(guān)。例如，可以通過對(duì)細(xì)胞與一種或多種標(biāo)記的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)和/或定量 來測(cè)量或大致估計(jì)細(xì)胞的特性，所述標(biāo)記例如為發(fā)熒光或經(jīng)修飾呈熒光性的分子、復(fù)合體 或小體。這種熒光分子、復(fù)合體和/或小體可以根據(jù)細(xì)胞的定性或定量特性而有差別地與 細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，這些特性包括它們就蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷蛋白、糖蛋白、磷脂、糖脂、核酸(包括核 酸的數(shù)量、序列或組織)、碳水化合物、鹽/離子以及在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞上或與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的任何 其它分子而言的組成。另外，這種熒光分子、復(fù)合體和/或小體可以根據(jù)細(xì)胞的物理或生理 特性而有差別地與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，這些特性的例子包括但不限于細(xì)胞膜滲透性、細(xì)胞膜組成、 細(xì)胞膜流動(dòng)性、化學(xué)或膜電位、存活能力、化學(xué)梯度、運(yùn)動(dòng)性、還原或氧化電位或還原或氧化 態(tài)以及其它參數(shù)或特性。對(duì)于細(xì)胞來說，無論是標(biāo)記的或未標(biāo)記的、修飾的或未修飾的，可以作為細(xì)胞選擇 的基礎(chǔ)的其它細(xì)胞可測(cè)量特性可以包括但不限于與細(xì)胞相互作用的光的特性，如熒光性、吸光度、反射率、散射性、極化性或其它特 性；細(xì)胞的電學(xué)特性或細(xì)胞對(duì)其環(huán)境的影響的電學(xué)特性，包括電導(dǎo)率、電感、電阻、膜 電位或膜電壓或其它特性；細(xì)胞的磁特性或電磁特性，包括磁性、順磁性、磁共振和/或細(xì)胞與電磁能的相互 作用；細(xì)胞的外形、圖像或形態(tài)學(xué)特性；以及就任何物質(zhì)或參數(shù)而言的細(xì)胞組成，可通過任何方式直接或間接地進(jìn)行測(cè)量。此外，直接或間接、單獨(dú)或組合地測(cè)量這類參數(shù)可以反映對(duì)細(xì)胞所關(guān)注的簡單或 復(fù)雜特性。這種特性的一個(gè)例子是包含在二倍體、單倍體或配子基因組中的性染色體，根據(jù) 細(xì)胞類型和生物體的情況，該性染色體可以是X染色體或Y染色體或二者的組合。對(duì)性染
7色體內(nèi)含物的確定可以通過采用直接或間接測(cè)量或利用一種或多種方法進(jìn)行測(cè)定來推斷。 這種方法包括測(cè)量相對(duì)或絕對(duì)確定的細(xì)胞的DNA含量；某些DNA序列的存在與否，或表示某 些DNA序列存在與否的標(biāo)記物的存在與否；細(xì)胞的大小，或細(xì)胞組成部分或細(xì)胞器的大小； 蛋白質(zhì)或細(xì)胞性染色體內(nèi)含物的其它特性標(biāo)記物的存在與否及位置，或這種標(biāo)記表達(dá)的組 合或模式；或反映細(xì)胞性染色體組成的任何其它的測(cè)量?？梢赃M(jìn)行多種其它的此類測(cè)量或 特性的測(cè)定，用以識(shí)別在特定實(shí)例、情況、系統(tǒng)、疾病、病癥、過程或環(huán)境中所關(guān)注的細(xì)胞。這種細(xì)胞測(cè)量可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞群、器官、組織或生物體的定量和/或定性測(cè) 定。這種測(cè)定可應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括但不限于診斷、生物醫(yī)學(xué)研究、工程學(xué)、流行病學(xué)、醫(yī) 藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、牲畜管理、動(dòng)物學(xué)、生物制藥業(yè)以及其它領(lǐng)域。除了能進(jìn)行這種測(cè)量外，根 據(jù)上述細(xì)胞術(shù)法測(cè)定的特征或參數(shù)，現(xiàn)有的方法及裝置可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。對(duì)所關(guān)注的細(xì) 胞進(jìn)行富集、采集或分隔，或者在制劑中除去非所需或非所關(guān)注的細(xì)胞，由此可以對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行正選或負(fù)選。根據(jù)可如上所述進(jìn)行測(cè)定的任何參數(shù)、特征或參數(shù)或特征的組合可以對(duì)這 種選擇進(jìn)行控制。通過包括或涉及上述方法識(shí)別的細(xì)胞可以被分離、分隔、富集、耗盡或收集到任意 數(shù)量的任何組中。一種常見的分離方法(如圖IA所示)利用靜電力使含具有所需或非所 需特性的(多個(gè))細(xì)胞的帶電或帶靜電的液流、(多個(gè))液滴轉(zhuǎn)向。根據(jù)具體的應(yīng)用情況， 收集或丟棄轉(zhuǎn)向的細(xì)胞，如圖IA所示。其它分離方法包括使用具有閥的流控裝置使液流中 的細(xì)胞轉(zhuǎn)向至另外的途徑、通道、管路或元件中供后續(xù)的采集或處理用，如圖IB所示。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選有許多方法和系統(tǒng)。在這些方法和系統(tǒng)中，有些是專門 設(shè)計(jì)用來對(duì)哺乳動(dòng)物精細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選的，特別是把精細(xì)胞分為攜帶X染色體的精 細(xì)胞群和/或攜帶Y染色體的精細(xì)胞群，目的是提高由經(jīng)分選的精子得到的受精卵產(chǎn)生所 需性別的后代的幾率。例如，奶農(nóng)可能期望分選公牛的精子，以便通過用具有X染色體的精 子進(jìn)行人工授精、體外受精或其它方法得到牛胚胎，從而產(chǎn)生更多的雌性牛犢。流式細(xì)胞分選方法面臨一系列挑戰(zhàn)，特別是在分選哺乳動(dòng)物精細(xì)胞供以后產(chǎn)生后 代之用的方面。重要的是，用于標(biāo)記和/或區(qū)分細(xì)胞的方法和/或用于分選細(xì)胞的方法不 能對(duì)細(xì)胞的存活能力產(chǎn)生不利的影響。通常，所述方法和/或系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)(例 如，更快的分選、提高準(zhǔn)確度等)與所述方法和/或系統(tǒng)的其它目標(biāo)沖突。必須平衡考慮各 種因素，包括細(xì)胞經(jīng)受的溫度、溫度變化、壓力和/或壓力變化、細(xì)胞暴露的流體環(huán)境、施加 于細(xì)胞的力以及細(xì)胞的壽命。例如，隨著溫度的升高，熒光分子(例如，熒光色素)進(jìn)入細(xì) 胞中與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合的速率(S卩，細(xì)胞被染色的速率)可增大。因此，系統(tǒng)的處理能 力(至少染色過程的處理能力)可隨著細(xì)胞環(huán)境溫度的升高而提高。然而，經(jīng)證實(shí)溫度的升 高對(duì)細(xì)胞的存活能力和/或細(xì)胞保持存活的持續(xù)時(shí)間是不利的。相反，將細(xì)胞保持在適合 存活能力的最佳溫度下可能會(huì)增加對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色(以及測(cè)量和分選)所需的時(shí)間，從而 使過程所花費(fèi)的時(shí)間比可行的要長，或者在完成所述過程所需的時(shí)間過后細(xì)胞無法存活。有關(guān)分選細(xì)胞的另一個(gè)挑戰(zhàn)涉及細(xì)胞的物理及光學(xué)特性。特別是，扁平或以其它 方式非對(duì)稱的細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物血紅細(xì)胞或精細(xì)胞)表現(xiàn)出各向異性的能量(例如光)發(fā) 射。細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)雜幾何形狀和/或細(xì)胞邊界的復(fù)雜幾何形狀的作用是以一定方式折射和 /或反射光，這些方式高度依賴于細(xì)胞相對(duì)于用來區(qū)分細(xì)胞的任何照射源和/或檢測(cè)器的 取向。例如，將哺乳動(dòng)物精細(xì)胞通過流式細(xì)胞分選分為具有X或Y染色體的群通常涉及使用與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合的熒光分子將細(xì)胞染色。大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種的X染色體與Y染色 體之間的DNA含量差異(Y染色體含有的DNA通常少于X染色體)導(dǎo)致含X染色體的細(xì)胞 有相對(duì)較高的熒光性。然而，X染色體和Y染色體的DNA含量差異通常僅為百分之幾，并且， 通常細(xì)胞的幾何形狀和/或取向?qū)λ鶛z測(cè)的熒光性的影響百分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 X染色體與Y 染色體之間的DNA含量差異百分?jǐn)?shù)。另外，這種分析要求細(xì)胞單個(gè)通過檢測(cè)區(qū)，這樣檢測(cè)器 不會(huì)將來自二個(gè)細(xì)胞的熒光性解析成來自單細(xì)胞的熒光性。流式細(xì)胞分選系統(tǒng)通常采用鞘包芯式(core-in-sheath)流控裝置攜帶細(xì)胞通過 檢測(cè)區(qū)。如圖IC所示，將細(xì)胞52的水性懸浮液的相對(duì)慢速移動(dòng)流50注入至鞘液的相對(duì)較 快的移動(dòng)流M。這樣的設(shè)置將細(xì)胞52聚集成被稱為芯流的液流56。通過適當(dāng)?shù)剡x擇芯懸 浮液和鞘液的壓力和隨之而來的速度，由鞘流施加的流體動(dòng)力使芯流變窄，芯流中的細(xì)胞 縱向分布，從而使它們?cè)谝毫髦斜灰来螖y帶。使芯流拉長和變窄的力具有定向細(xì)胞52的附 加效果，這樣使細(xì)胞52的縱軸58與單行流56的流動(dòng)方向平行。然而，細(xì)胞對(duì)縱軸58的取 向仍有些許的隨機(jī)性。因此，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞52經(jīng)過檢測(cè)區(qū)時(shí)，入射到細(xì)胞上的光、從細(xì)胞發(fā)出 的光(例如熒光)和由細(xì)胞反射出的光仍依賴于細(xì)胞52的取向。特別是對(duì)于許多類型的 哺乳動(dòng)物精細(xì)胞來說確實(shí)如此。關(guān)于精細(xì)胞在流式細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)相對(duì)于細(xì)胞的照射和檢測(cè)的取向問題，存在著許多 解決方案。例如，圖ID示出一種解決方案，該方案采用在管62上切出的斜面尖頭60向鞘 流66中注入樣本流64。該扁平的斜面尖頭60有助于在鞘流66內(nèi)將細(xì)胞相對(duì)于它們的縱 軸58定向，這樣使細(xì)胞的扁平面趨于排列在一致的方向上。另一種解決方案(可與斜面尖 頭方案結(jié)合)采用二個(gè)相互垂直的檢測(cè)器68和70 (0度檢測(cè)器68和90度檢測(cè)器70)，該 二個(gè)檢測(cè)器結(jié)合使用以估計(jì)每個(gè)經(jīng)過檢測(cè)區(qū)72的細(xì)胞52的取向并測(cè)量那些被發(fā)現(xiàn)適當(dāng)定 向的細(xì)胞的熒光性，從而可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的精確量化。采用細(xì)胞相對(duì)于縱軸的流體動(dòng)力定 向的方案通常產(chǎn)生這樣的群，其中樣本流中約70%或更少的細(xì)胞達(dá)到了熒光測(cè)量所需的排 列，這降低了儀器的處理能力，并導(dǎo)致不適當(dāng)定向的細(xì)胞的丟棄。再一種針對(duì)與細(xì)胞幾何形狀和取向有關(guān)的問題的解決方案利用沿與攜帶細(xì) 胞的鞘包芯式液流同軸的光學(xué)檢測(cè)。在一個(gè)這樣的方案中，使用頂置式照射光學(xué)器件 (epi-illumination optics)照射細(xì)胞和檢測(cè)由細(xì)胞發(fā)出的光。如圖IE所示，鞘流76攜帶 的樣本流74直接向顯微鏡物鏡78移動(dòng)，消除了對(duì)細(xì)胞(例如，精細(xì)胞80)相對(duì)于細(xì)胞80 的縱軸82的取向的依賴性。然而，細(xì)胞80朝向物鏡78的軌跡要求細(xì)胞80在經(jīng)過檢測(cè)區(qū) 82 (S卩，物鏡78的焦點(diǎn)84)后立即改變軌跡。系統(tǒng)通過使用液體的橫向流86完成此軌跡變 化。分析之后，橫向液流86、鞘流76和液流74的匯流88可能會(huì)引起個(gè)體細(xì)胞位置的不確 定性。因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)過檢測(cè)區(qū)82后，匯集流內(nèi)的細(xì)胞80的位置立即變得不可預(yù)測(cè)，所以這種 位置的不確定性可以使系統(tǒng)無法進(jìn)行細(xì)胞分選操作。圖IF示出的再一種解決方案利用一個(gè)或多個(gè)拋物面反射鏡102均勻地照射細(xì)胞 和/或從細(xì)胞徑向集光。系統(tǒng)使用噴嘴104發(fā)射含個(gè)體細(xì)胞92的液流/射流106。液流 106移動(dòng)經(jīng)過檢測(cè)區(qū)94并通過拋物面反射鏡102上的孔96。在經(jīng)過檢測(cè)區(qū)后的某點(diǎn)上，液 流106被分割為可帶電的液滴90。此后可以對(duì)每一液滴90進(jìn)行分選，方式例如是，使帶電 液滴90和帶電偏轉(zhuǎn)器板98偏轉(zhuǎn)，從而將液滴偏轉(zhuǎn)到一個(gè)或多個(gè)容器100中。問題是，這種 “空氣中的射流(jet-in-air) ”構(gòu)造使得當(dāng)液流106離開噴嘴104時(shí)，液流106(以及包含在液流106內(nèi)的細(xì)胞92)的壓力下降。壓力的突然變化(以及噴嘴本身內(nèi)的壓力升高)和 隨后細(xì)胞92進(jìn)入容器100時(shí)的碰撞一樣，會(huì)對(duì)細(xì)胞92的存活能力產(chǎn)生不利影響。因此液 流106離開噴嘴104時(shí)的壓力和速度必須保持低于任何可能損壞細(xì)胞92的閾值，而細(xì)胞的 損壞會(huì)降低系統(tǒng)的處理能力。另外，液滴90通過大氣的移動(dòng)可能要求一些環(huán)境約束條件， 包括室內(nèi)空氣的清潔(例如，“無塵室”)和溫度控制。所以，盡管流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)相對(duì)先進(jìn)，本領(lǐng)域中仍然不斷地要求提供更有效、更靈 敏和更精確的方法及裝置來進(jìn)行細(xì)胞分離和/或識(shí)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了采用流式細(xì)胞術(shù)的方法及裝置，用于檢測(cè)、通過功能和/或物理性 修飾而選擇性地改變、和收集細(xì)胞群中所需或非所需的細(xì)胞。和現(xiàn)有常見的細(xì)胞分選方法 及裝置不同，本方法不依賴拋物面反射鏡或正交檢測(cè)來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分類。而本方法 使用物鏡，該物鏡具有與通過檢測(cè)區(qū)的樣本流同軸的光軸。本方法可依賴或不依賴于細(xì)胞 液流的轉(zhuǎn)向或分離或?qū)⒓?xì)胞分類到不同的接收容器或通路，這些也都是現(xiàn)有常見的細(xì)胞分 選方法及裝置中的情況。本方法設(shè)想使用可控能量源，例如但不限于電磁輻射源(如激光器)，對(duì)已經(jīng)利用 細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)識(shí)別的細(xì)胞群中的所需或非所需的細(xì)胞進(jìn)行照射。對(duì)于所關(guān)注的細(xì)胞來說， 在細(xì)胞儀中對(duì)它們進(jìn)行分析之后，在某些方面在對(duì)它們進(jìn)行分析后的一秒鐘內(nèi)，同時(shí)細(xì)胞 還保持于裝置的液流中，根據(jù)其所測(cè)量的特性或特征，將可控能量源選擇性地導(dǎo)向所關(guān)注 的細(xì)胞。所施加的能量可以在功能上和物理上改變這種細(xì)胞。根據(jù)本方法或裝置的具體用 途和具體實(shí)施例，可以在功能上和物理上消耗所得細(xì)胞群中的非所需細(xì)胞，或以能隨后實(shí) 現(xiàn)所需細(xì)胞的富集或非所需細(xì)胞的去除的方式修飾所得細(xì)胞群。所述方法及裝置廣泛適用 于需要富集或消耗細(xì)胞的應(yīng)用當(dāng)中。在一些實(shí)施例中，所述方法和/或裝置改變含有細(xì)胞 群中所需和非所需細(xì)胞的液體，可能不會(huì)直接改變細(xì)胞，其中已經(jīng)利用細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)對(duì)所 述細(xì)胞群進(jìn)行了識(shí)別。在這種實(shí)施例中，所述方法和/或裝置可依靠細(xì)胞液流的轉(zhuǎn)向或分 離或?qū)⒓?xì)胞分類到不同的接收容器或通路。所述方法及裝置的一方面包括基于包含在細(xì)胞中的性染色體X或Y對(duì)細(xì)胞群中的 精細(xì)胞進(jìn)行富集、選擇、功能性改變或消耗的用途。所述方法及裝置包括對(duì)細(xì)胞儀的流體及 光學(xué)系統(tǒng)使用替代性的設(shè)計(jì)，在一方面包括垂直于液流定向光學(xué)測(cè)量部件和/或細(xì)胞改變 能量源的裝置，在另一方面所包括的裝置中，也可以或作為另外的選擇將一些此類部件按 與液流同軸和/或成斜角的方式定向。通過在細(xì)胞分析過程中觀察細(xì)胞，不依賴于細(xì)胞相對(duì)于其最長軸的取向而精確地 對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分類，隨后利用該分類確定是否對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾、衍化、破壞、殺死或破碎， 所述流式細(xì)胞方法及裝置能提供新的方法及裝置以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的正選或負(fù)選。在細(xì)胞測(cè)量的 同時(shí)或細(xì)胞測(cè)量之后的一秒鐘內(nèi)，本發(fā)明所述的方法及裝置對(duì)所需或非所需細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用 力、能量或輻射，在那些細(xì)胞中產(chǎn)生變化，從而在物理上或功能上改變它們。根據(jù)具體用途 或應(yīng)用的要求，這種被改變的細(xì)胞或它們的碎片或衍生物在一方面可保留在所得制劑中， 或者在另一方面被富集或除去。描述的一個(gè)實(shí)施例可實(shí)現(xiàn)從攜帶Y染色體的精子中功能性和/或物理性地分離攜帶X染色體的精子，和/或從攜帶X染色體的精子中功能性和/或物理性地分離攜帶Y 染色體的精子。在這個(gè)實(shí)施例中，利用具有公知特性的DNA結(jié)合化學(xué)物質(zhì)間接地測(cè)量精 子群中個(gè)體精子的相對(duì)DNA含量，這些化學(xué)物質(zhì)例如但不限于雙苯酰亞胺、STOR染料(如 SYBR-14), Hoechst 33342, Hoechst 33258、溴化乙錠、吖啶橙、DAPI、色霉素、光神霉素、橄 欖霉素以及本領(lǐng)域中已知當(dāng)與DNA結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出熒光性增強(qiáng)的其它化學(xué)物質(zhì)。通過當(dāng)細(xì)胞 在向觀察點(diǎn)流動(dòng)的液流中運(yùn)動(dòng)時(shí)優(yōu)選使用物鏡觀察該細(xì)胞來完成所述測(cè)量，其中所述物鏡 具有與液流的流動(dòng)同軸的光軸。據(jù)推測(cè)，含相對(duì)較多DNA(即較高DNA含量)的細(xì)胞含較大 的X染色體，而含相對(duì)較少DNA (即較低DNA含量)的細(xì)胞含較小的Y染色體。在一些期望 最終制劑中的細(xì)胞只具有一種性染色體的方法實(shí)施例中，所述方法一方面在進(jìn)行細(xì)胞分析 的同時(shí)，或者在另一方面，在進(jìn)行細(xì)胞分析后的一秒或更短的時(shí)間內(nèi)，利用導(dǎo)向細(xì)胞的激光 能量源，其中可快速調(diào)節(jié)激光能量源以照射含非所需性染色體的細(xì)胞和/或性染色體含量 不確定的細(xì)胞。在本實(shí)施例的一個(gè)方面，本方法使用的激光能量源儲(chǔ)存的能量在質(zhì)量和/ 或數(shù)量上足以對(duì)非所需細(xì)胞進(jìn)行修飾、衍化、破壞、失活和/或殺死。選定細(xì)胞中的這種變 化在一方面涉及細(xì)胞的破碎，或者在另外的方面中是破壞性較小的，這取決于應(yīng)用的情況。 例如，在將識(shí)別和/或分離的精子用于受精和/或生殖的方法實(shí)施例中，一方面，例如通過 破壞細(xì)胞中的DNA分子的序列或結(jié)構(gòu)，或者通過降低其活動(dòng)性，使其在用于人工授精時(shí)大 部分不育，使非所需細(xì)胞不能生育可存活的后代，在這方面足以生產(chǎn)所需的制劑。在其它方 面，以一些其它方式使非所需細(xì)胞不能活動(dòng)，殺死、修飾它們或使它們失活，從而影響非所 需細(xì)胞的生殖能力。在另一方面，以允許隨后從所需細(xì)胞的制劑中除去或部分除去非所需 細(xì)胞來對(duì)它們進(jìn)行修飾或衍化。在另一實(shí)施例中，細(xì)胞儀的配置采用一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件，在一方面，所述光學(xué)元 件用于測(cè)量細(xì)胞的特性，和/或在另一方面，所述光學(xué)元件用于向細(xì)胞傳遞能量，其中至少 一個(gè)光學(xué)元件，優(yōu)選物鏡的光軸，與經(jīng)受分析的細(xì)胞流同軸定向。因此，在一些實(shí)施例中，所 提供的方法及裝置使用光學(xué)元件，特別是使用與液流同軸設(shè)置的物鏡，來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射、 測(cè)量或傳遞能量。在另一實(shí)施例中，所提供的方法及裝置使用單獨(dú)或組合的一個(gè)或多個(gè)附 加光學(xué)元件，它們與液流成90度設(shè)置，用以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量或傳遞能量。在又一實(shí)施例中， 所提供的方法及裝置使用單獨(dú)或組合的一個(gè)或多個(gè)附加光學(xué)元件，它們的設(shè)置與液流非同 軸，用以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量或傳遞能量。再一實(shí)施例中，所提供的方法及裝置使用單獨(dú)或組合 的一個(gè)或多個(gè)附加光學(xué)元件，它們與液流成斜角設(shè)置，用以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量或傳遞能量。用 在本文中的“斜角，，是諸如銳角或鈍角的角，其不是直角或直角的倍數(shù)。一些實(shí)施例提供修飾細(xì)胞群中所關(guān)注的細(xì)胞的方法，包括使所關(guān)注的細(xì)胞與可控 能量源接觸的步驟，所述可控能量源在將細(xì)胞群中的細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞后對(duì)所關(guān)注 的細(xì)胞進(jìn)行修飾，在經(jīng)由能量源修飾后不用從細(xì)胞群中分離所關(guān)注的細(xì)胞。一些實(shí)施例提供識(shí)別細(xì)胞群中所關(guān)注的細(xì)胞亞群的方法，包括使細(xì)胞群與可控能 量源接觸的步驟，所述可控能量源修飾所關(guān)注的細(xì)胞亞群中的細(xì)胞，其中的接觸發(fā)生于在 對(duì)流式細(xì)胞儀的樣本液流中的細(xì)胞進(jìn)行首次分析之后，且在首次分析后不超過約一秒鐘進(jìn) 行接觸，細(xì)胞保留在流式細(xì)胞儀的樣本液流內(nèi)，其中在那些所關(guān)注的細(xì)胞流向詢問區(qū)時(shí)，首 次分析將細(xì)胞亞群中的細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞，且其中可控能量源通過流式細(xì)胞儀修飾 樣本流中所關(guān)注的細(xì)胞。
在一些實(shí)施例中，首次分析包括檢測(cè)具有所需特性的所關(guān)注的細(xì)胞，該所需特性 選自所需的蛋白質(zhì)組成、DNA組成、細(xì)胞表面標(biāo)記物、分子大小、吸光度、光反射、熒光性、 光散射、極化、電特性、磁性、形態(tài)特性、細(xì)胞膜滲透性、細(xì)胞膜流動(dòng)性和氧化還原態(tài)。在一些實(shí)施例中，在細(xì)胞群經(jīng)過流式細(xì)胞儀中的液流時(shí)使細(xì)胞群與能量源接觸。 在相關(guān)的實(shí)施例中，在將液流中的細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞之后且在之后的一秒鐘之內(nèi)使 所關(guān)注的細(xì)胞與能量源接觸。在一些實(shí)施例中設(shè)想將能量源與液流同軸設(shè)置。進(jìn)一步設(shè)想將能量源與液流成90 度角設(shè)置，或者與液流成斜角設(shè)置。在另一實(shí)施例中，通過科勒(Kohler)和/或頂置式照 射光學(xué)器件將能量源傳遞至所關(guān)注的細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，將能量源導(dǎo)向細(xì)胞流上的一 點(diǎn)，該點(diǎn)在細(xì)胞特性的測(cè)量位置的下游。在另一實(shí)施例中，將能量源導(dǎo)向細(xì)胞流上的一點(diǎn)， 該點(diǎn)在細(xì)胞特性的測(cè)量位置的下游，并且在液流從其初始流動(dòng)方向上轉(zhuǎn)向或轉(zhuǎn)彎后。在一些實(shí)施例中，當(dāng)細(xì)胞在流向觀察點(diǎn)的液流中移動(dòng)時(shí)，優(yōu)選通過使用物鏡觀察 該細(xì)胞，由此完成一種或多種分析，其中所述物鏡具有與液流的流動(dòng)同軸的光軸。在一些實(shí) 施例中，液流在經(jīng)過觀察點(diǎn)后改變方向，同時(shí)仍可確定液流內(nèi)的細(xì)胞順序和/或位置。在一 些實(shí)施例中，根據(jù)一種或多種分析，可控能量源可選擇性地改變一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí) 施例中，可控能量源與新導(dǎo)向的液流同軸設(shè)置，而在其它實(shí)施例中，可控能量源與新導(dǎo)向的 液流垂直或成斜角設(shè)置。在可包括或不包括可控能量源的一些實(shí)施例中，噴嘴可噴射液流， 形成可用已知方法(例如使用可控能量源施加靜電荷、控制各液流通路中的壓力等)分選 的液滴。在一些相關(guān)的實(shí)施例中，以選自以下的方式將可控能量源導(dǎo)向液流中的細(xì)胞位 置連續(xù)液流、脈沖液流、間歇通/斷循環(huán)、能量源的定期聚焦或散焦以及能量源向液流的 間歇快速轉(zhuǎn)向。在一些實(shí)施例中，受控能量源是電磁源。在一些實(shí)施例中，能量源是激光器。在一些實(shí)施例中，對(duì)細(xì)胞的修飾選自對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、分裂 和破碎。在另外的方面，使用可通過電、磁、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、熒光或其它 化學(xué)手段檢測(cè)的標(biāo)記將細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記是添加光活 化型化學(xué)化合物或標(biāo)記物。在相關(guān)的實(shí)施例中，所關(guān)注的細(xì)胞被識(shí)別為具有所需的特性，該所需特性選自所 需的蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)含量、DNA組成、DNA含量、細(xì)胞表面標(biāo)記物、分子大小、吸光度、光 反射、熒光性、光散射、極化、電特性、磁性、形態(tài)特性、細(xì)胞膜滲透性、細(xì)胞膜流動(dòng)性和氧化 還原態(tài)。在所述方法及裝置中可設(shè)想將用于檢測(cè)液流中的細(xì)胞特性的任何能量源、檢測(cè)器 或聚焦元件與液流同軸設(shè)置。例如，在包括檢測(cè)器和可控能量源的流式細(xì)胞儀中，檢測(cè)器或 可控能量源其中之一或二者與液流同軸設(shè)置。在相關(guān)的實(shí)施例中，用于檢測(cè)液流中的細(xì)胞 特性的任何檢測(cè)裝置和或光學(xué)元件與液流同軸設(shè)置。在另一實(shí)施例中，使用科勒和/或頂置式照射光學(xué)器件傳遞用于檢測(cè)所需特性的 光或能量。在相關(guān)的實(shí)施例中，當(dāng)所述方法使用流式細(xì)胞儀時(shí)，該流式細(xì)胞儀是頂置式照射 細(xì)胞儀。進(jìn)一步設(shè)想將適用于所述方法中的頂置式照射細(xì)胞儀與修飾所關(guān)注的細(xì)胞的裝置相結(jié)合，這將在本文中進(jìn)一步描述。當(dāng)流式細(xì)胞儀用于所述方法時(shí)，流式細(xì)胞儀具有一個(gè)或多個(gè)樣本流并結(jié)合具有物 鏡的光學(xué)器件，所述物鏡與一個(gè)或多個(gè)樣本流的流動(dòng)同軸，用于傳遞檢測(cè)所需特性所用的 光或能量、用于檢測(cè)細(xì)胞的所需特性和/或用于傳遞修飾所需或非所需細(xì)胞所用的光或能量。在另一實(shí)施例中，能量源修飾具有所需特性的所關(guān)注的細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施例中， 能量源修飾缺乏所需特性的所關(guān)注的細(xì)胞。在又一實(shí)施例中，所關(guān)注的細(xì)胞是選自攜帶X染色體的精子和攜帶Y染色體的精 子的精細(xì)胞。在一些實(shí)施例中設(shè)想的是，攜帶X染色體的精子與攜帶Y染色體的精子之間 存在著DNA含量的差異，基于這一所需特性將精細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞。所述方法及裝置進(jìn)一步提供的是，在收集室中收集細(xì)胞群供進(jìn)一步使用。在一些 實(shí)施例中，收集室中包含已被可控能量源修飾的所關(guān)注的細(xì)胞和沒有被可控能量源修飾的 細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施例中，收集之后，所關(guān)注的細(xì)胞可用于后續(xù)處理或程序。還在另外的實(shí) 施例中，設(shè)想在收集之后丟棄所關(guān)注的細(xì)胞，細(xì)胞群的剩余部分用于后續(xù)處理或程序。所述方法及裝置還提供修飾細(xì)胞群中所關(guān)注的細(xì)胞的裝置，所述裝置包括可控能 量源，經(jīng)將細(xì)胞識(shí)別為細(xì)胞群中所關(guān)注的細(xì)胞，所述可控能量源對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞進(jìn)行修飾， 不用在經(jīng)能量源修飾后從細(xì)胞群中分離所關(guān)注的細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施例中，設(shè)想所述方法及裝置使用流式細(xì)胞儀從細(xì)胞群中識(shí)別所關(guān)注 的細(xì)胞亞群，所述流式細(xì)胞儀包括修飾所關(guān)注的細(xì)胞亞群的可控能量源，其中在樣本流經(jīng) 流式細(xì)胞儀的樣本管期間，在首次細(xì)胞分析后進(jìn)行接觸，且通常是在細(xì)胞分析后的一秒鐘 內(nèi)進(jìn)行，這時(shí)細(xì)胞仍保持在裝置的樣本液流內(nèi)，其中首次分析將細(xì)胞識(shí)別為所關(guān)注的細(xì)胞， 且其中在樣本流經(jīng)流式細(xì)胞儀期間，可控能量源修飾所關(guān)注的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述方法的一步或多步以機(jī)器可讀指令的形式存儲(chǔ)在控制器內(nèi) 的有形存儲(chǔ)介質(zhì)上。控制器的處理器執(zhí)行指令以全方位地監(jiān)視和/或控制分選流式細(xì)胞 儀。所述指令可實(shí)施為與細(xì)胞儀內(nèi)的各項(xiàng)任務(wù)相適應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)程序。在一些另外的實(shí)施例中，分選流式細(xì)胞儀的光學(xué)池、比色皿、視窗、液流管、壁、邊 界或其它部件由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成。在這些及其它實(shí)施例中，可以調(diào)節(jié) 攜帶分析物的溶液，使溶液的折射率接近分選流式細(xì)胞儀的光學(xué)池、比色皿、視窗、液流管 或其它部件的折射率，特別是折射率相差為0. 02或更小。


圖IA示出分選流式細(xì)胞儀中采用的液滴分選法；圖IB示出分選流式細(xì)胞儀中采用的流動(dòng)壓差法；圖IC描述流式細(xì)胞系統(tǒng)中采用的鞘-流裝置；圖ID描述采用斜面尖頭在液流內(nèi)定向的鞘-流裝置；圖IE描述使用與液流同軸定向的物鏡檢測(cè)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀；圖IF示出使用拋物面反射鏡均勻照射細(xì)胞并從細(xì)胞徑向集光的系統(tǒng)；圖2描述分選流式細(xì)胞儀的流徑的設(shè)想實(shí)施例；圖3描述分選流式細(xì)胞儀的設(shè)想實(shí)施例；
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圖4描述分選流式細(xì)胞儀的設(shè)想的替代實(shí)施例；圖5描述分選流式細(xì)胞儀的另一設(shè)想的替代實(shí)施例；圖6A描述分選流式細(xì)胞儀的一部分的設(shè)想替代實(shí)施例。圖6B描述分選流式細(xì)胞儀的一部分的另一設(shè)想替代實(shí)施例；圖7示出可使用設(shè)想的分選流式細(xì)胞儀的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例為系統(tǒng)內(nèi)的能量產(chǎn) 生兩個(gè)不同焦點(diǎn)的方法；圖8A描述在本發(fā)明所述的方法及裝置的設(shè)想實(shí)施例的流徑內(nèi)的物鏡及相關(guān)的焦點(diǎn)。圖8B示出在標(biāo)稱焦點(diǎn)與物鏡之間形成的通常是錐形的體積的實(shí)施例；圖9描述在本發(fā)明所述的方法及裝置的實(shí)施例的流徑內(nèi)的水浸物鏡及相關(guān)焦點(diǎn)；圖10描述根據(jù)本發(fā)明所述的方法及裝置的實(shí)施例在其中可形成分選流式細(xì)胞儀 的一部分流徑的主體；圖11描述圖9中所示主體的替代實(shí)施例；圖12描述圖9中所示主體的另一替代實(shí)施例；圖13描述圖9中所示主體的又一替代實(shí)施例；圖14描述圖9中所示主體的再一替代實(shí)施例；及圖15描述顯示根據(jù)本發(fā)明所述方法及裝置的方法步驟的流程圖。
具體實(shí)施例方式本說明書描述基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分離方法、系統(tǒng)和裝置。除另有定義外，本文 中所使用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同。這里需要注意的是，用在本說明書和所附權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一”、“一個(gè) (種)”和“所述(該)”包括復(fù)數(shù)個(gè)指代物，除非上下文中明確指出另外的情況。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的是，除因?qū)斫馑龇椒把b置有重要性而另指 出外，所包括的附圖沒有按比例繪制。除另有規(guī)定外，用在本文中的以下術(shù)語具有它們本來的含義。術(shù)語“細(xì)胞”指所述方法及裝置中的分析物，這種物質(zhì)包括但不限于細(xì)胞、病毒、小 體或微粒。術(shù)語“所關(guān)注的細(xì)胞”指具有所需特性的細(xì)胞，在細(xì)胞流過流式細(xì)胞裝置的過程 中可以檢測(cè)該所需特性。“所需特性”指使具有所需特性的細(xì)胞與不具有所述特征的細(xì)胞 區(qū)別開來的某種特征。具有所需特性的細(xì)胞在細(xì)胞的“所需亞群”內(nèi)。在所關(guān)注的細(xì)胞中 的示例性可測(cè)量或可檢測(cè)的細(xì)胞特征包括但不限于蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)含量、DNA組成、DNA 含量、細(xì)胞表面標(biāo)記物、分子大小、吸光度、光反射、熒光性、光散射、極化、細(xì)胞的電特性、磁 性、形態(tài)學(xué)特性、細(xì)胞膜滲透性、細(xì)胞膜流動(dòng)性和氧化還原態(tài)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理 解的是，細(xì)胞儀可以測(cè)量或檢測(cè)所關(guān)注的細(xì)胞的多種選擇性特征中的任一種，并且這些選 擇性特征可以很容易地在所述方法及裝置中利用。在一方面，所述方法或裝置利用所關(guān)注 的細(xì)胞的“所需特性”識(shí)別具有此特性的細(xì)胞。術(shù)語“首次分析”指當(dāng)細(xì)胞通過流式細(xì)胞裝置行進(jìn)時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的初始分析，用以 確定所述細(xì)胞是否是所關(guān)注的細(xì)胞，所述流式細(xì)胞裝置可以是管、比色皿、區(qū)域、槽、室等。 在一些實(shí)施例的一方面，流式細(xì)胞儀中的檢測(cè)器執(zhí)行首次分析。
用在本文中的術(shù)語“二次分析”指在通過液流管進(jìn)行首次分析后，對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞 進(jìn)行表征以確定是否使用能量源改變所關(guān)注的細(xì)胞。在一些實(shí)施例的一方面，通常在首次 分析之后不到一秒鐘之內(nèi)進(jìn)行二次分析。用在本文中的術(shù)語“修飾(modify，modification)”禾Π “改變(alter, alteration) ”指使用能量源引起細(xì)胞發(fā)生變化。修飾包括但不限于對(duì)細(xì)胞的直接作用，包 括但不限于修飾細(xì)胞組分或化學(xué)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、DNA和涉及細(xì)胞代謝的物質(zhì)；在細(xì)胞內(nèi) 或細(xì)胞附近進(jìn)行的分裂、加熱、空化或爆破；細(xì)胞的透化或穿孔；以及對(duì)細(xì)胞的破壞、破碎 或形態(tài)改變。在其它方面，修飾也包括或作為另外的選擇而包括能量源的間接作用，這種間 接作用受能量源或其它因素的介導(dǎo)，包括細(xì)胞或一種或多種細(xì)胞組分的化學(xué)活化和/或去 活化、化學(xué)交聯(lián)或化學(xué)衍化；細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞附近的一種或多種化學(xué)試劑的活化和/或去活 化，這使這種試劑或其衍化物與細(xì)胞或其組分結(jié)合或關(guān)聯(lián)；或誘導(dǎo)細(xì)胞功能的改變。在某些 方面，在細(xì)胞被照射的情況下，通常存在于細(xì)胞內(nèi)或另外施加于細(xì)胞的化學(xué)試劑與細(xì)胞相 互作用。所述方法及裝置可通過檢測(cè)任何數(shù)量的特征(例如所需特性)或參數(shù)的存在與否 來實(shí)現(xiàn)對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞的識(shí)別，所述特征或參數(shù)可以在與流式細(xì)胞技術(shù)相容的測(cè)量中得到 確定、估計(jì)或反映。在各方面，用于確定所關(guān)注的細(xì)胞或細(xì)胞群的細(xì)胞測(cè)量包括本文中討論 的和另外在本領(lǐng)域中已知的細(xì)胞測(cè)量以及可引進(jìn)到或可使之應(yīng)用于流式細(xì)胞分析的新測(cè) 量方法、手段和/或裝置。通過本發(fā)明所述方法及裝置的實(shí)踐進(jìn)行細(xì)胞分析的細(xì)胞可以是 標(biāo)記的或未標(biāo)記的，或者另外是利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)和試劑修飾或未修飾的。用在本文中的術(shù)語“標(biāo)記物”是指可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué) 手段檢測(cè)的成分。例如，有用的標(biāo)記物包括抗血清或單克隆抗體可用的熒光染料、高電子密 度試劑、酶、生物素-鏈霉親和素、地高辛(dioxigenin)、半抗原、蛋白質(zhì)，或核酸特異性染 料。因此，在本發(fā)明所述的方法及裝置中，就任何物質(zhì)或參數(shù)而言的細(xì)胞組成、特性和/或 特征(以任何方式直接或間接測(cè)量的)是為選擇或排除而進(jìn)行的細(xì)胞和細(xì)胞群的識(shí)別的基 石出?？蓹z測(cè)的細(xì)胞組成、特性和/或特征的例子包括但不限于與細(xì)胞相互作用或自 細(xì)胞發(fā)出的光的特性的測(cè)量，如吸光度、光散射、發(fā)光性、熒光性、磷光性、光的極化或去極 化或其它特性；電特性，包括但不限于細(xì)胞或周圍介質(zhì)的電感、電容、電位、電流或電阻；電 磁特性，包括磁性、順磁性、磁共振和/或細(xì)胞與電磁力和/或波的相互作用或電磁力和/ 或波的發(fā)射；成像、圖像特性、形態(tài)學(xué)特性或由細(xì)胞的圖像或圖像樣特性的收集和/或分析 得到的相關(guān)特性。在某些方面，測(cè)量的是細(xì)胞的固有數(shù)量或質(zhì)量特性，或者在另外的方面， 測(cè)量的是間接反映、表現(xiàn)或大致估計(jì)細(xì)胞的數(shù)量或質(zhì)量特性的值。還在另外的方面，測(cè)量的 既是細(xì)胞的固有數(shù)量或質(zhì)量特性，也是細(xì)胞的數(shù)量或質(zhì)量特性的間接反映、表現(xiàn)或大致估 計(jì)。作為例子而非限制，測(cè)量細(xì)胞的熒光性可反映細(xì)胞的固有熒光性，或者測(cè)量細(xì)胞的熒光 性可反映與細(xì)胞結(jié)合或關(guān)聯(lián)的熒光色素或熒光微粒的存在和/或數(shù)量，或者間接地反映細(xì) 胞的一些特性，或兼而有之。在所述方法及裝置的一些方面，分選細(xì)胞儀采用可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞群的物理和空 間分離的技術(shù)。在所述方法及裝置的其它方面，分選細(xì)胞儀利用在物理上和/或功能上修 飾細(xì)胞群中選定細(xì)胞的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)它們的功能性和/或物理性分離和/或區(qū)分，任選供后續(xù)使用。在所述方法及裝置的一些方面，分選細(xì)胞儀不依靠按位置、定位、容器或時(shí)間對(duì)細(xì) 胞進(jìn)行即時(shí)分離，而是提供就一些所需特性而言是失活、鈍化、分裂、分離、破碎或以其它方 式改變(即，“修飾”)的細(xì)胞，這可任選能在制劑中實(shí)現(xiàn)亞群的分離和區(qū)分。修飾的類型 完全或部分地取決于識(shí)別的細(xì)胞的預(yù)期應(yīng)用或用途，并因此取決于識(shí)別的細(xì)胞在應(yīng)用中的 相關(guān)特征。例如，僅旨在說明或解釋而言，在制備正常體細(xì)胞的情況下，如果細(xì)胞的繁殖能 力受到負(fù)面影響或細(xì)胞被殺死，則惡性或以其它方式毫無節(jié)制或快速生長的細(xì)胞可視為在 機(jī)能上失活。在另一實(shí)例中，也僅旨在說明或解釋而言，在要求從細(xì)胞群中去除產(chǎn)生不良蛋 白質(zhì)或其它物質(zhì)的細(xì)胞亞群的應(yīng)用中，分選細(xì)胞儀可以通過以下的方式實(shí)現(xiàn)這一效果停 止在這些細(xì)胞中產(chǎn)生所述物質(zhì)、殺死細(xì)胞和/或修飾細(xì)胞以允許將其從細(xì)胞群中物理地去 除。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述的方法及裝置利用能量源修飾細(xì)胞或者誘導(dǎo)或引發(fā) 諸如化學(xué)活化的過程，所述化學(xué)活化可修飾細(xì)胞。能量源誘導(dǎo)的修飾包括在各方面對(duì)細(xì)胞 的直接影響，包括但不限于修飾細(xì)胞的組分或化學(xué)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、DNA和涉及細(xì)胞代謝 的物質(zhì)；在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞附近進(jìn)行的分裂、加熱、空化或爆破；細(xì)胞的透化或穿孔；以及對(duì) 細(xì)胞的破壞、破碎或形態(tài)改變，包括細(xì)胞、病毒、小體或微粒。在其它實(shí)施例中，修飾也包括 或作為另外的選擇而包括能量源的間接作用，這種間接作用受能量源或其它因素的介導(dǎo)， 包括細(xì)胞或一種或多種細(xì)胞組分的化學(xué)活化和/或去活化、化學(xué)交聯(lián)或化學(xué)衍化，細(xì)胞內(nèi) 或細(xì)胞附近的一種或多種化學(xué)試劑的活化和/或去活化，這使這種試劑或其衍化物與細(xì)胞 或其組分結(jié)合或關(guān)聯(lián)，或誘導(dǎo)細(xì)胞功能的改變。在某些實(shí)施例中，經(jīng)照射與細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的 化學(xué)試劑通常存在于細(xì)胞內(nèi)或應(yīng)用中，或作為所述方法的一部分進(jìn)行添加。在一些實(shí)施例中，所述方法及裝置結(jié)合使用光活化型化合物，所述光活化型化合 物經(jīng)用適當(dāng)強(qiáng)度或能量的光照射而受誘導(dǎo)與細(xì)胞或細(xì)胞組分結(jié)合或關(guān)聯(lián)。這種化合物在某 些方面誘導(dǎo)能影響所關(guān)注的細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)程或代謝的一種或多種細(xì)胞組分發(fā)生充分的交 聯(lián)或變性?；蛘?，這種化合物在某些方面誘導(dǎo)能殺死所關(guān)注的細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞組分 發(fā)生充分的交聯(lián)或變性。在另一種可供選擇的方案中，在所述方法及裝置中使用的光活化 型化合物與選定的細(xì)胞結(jié)合，并以這樣的方式改變所關(guān)注的細(xì)胞的一種或多種特性，即，使 所關(guān)注的細(xì)胞在后續(xù)過程中適于識(shí)別和/或富集和/或消耗。對(duì)于通過化學(xué)衍化(例如添 加化學(xué)物質(zhì))改變的所關(guān)注的細(xì)胞來說，在某些方面，在后續(xù)的步驟中通過利用這種物質(zhì) 的特性或相互作用的方法對(duì)其進(jìn)行去除、富集或純化。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一 方面，通過添加隨后由抗體結(jié)合的物質(zhì)對(duì)所關(guān)注的細(xì)胞進(jìn)行衍化，所述抗體可通過各種方 式實(shí)現(xiàn)對(duì)所關(guān)注的衍化細(xì)胞的捕集或截留。設(shè)想了許多這類物質(zhì)，并且在一方面，這種物質(zhì) 包括含2，4_ 二硝基苯基(DNP)或與之相關(guān)的一類化合物，這類化合物在一方面由識(shí)別DNP 的抗體識(shí)別并專門地結(jié)合。因此，在一方面，DNP或相關(guān)化合物的光活化型衍化物用于在 這種類型的應(yīng)用中衍化所關(guān)注的細(xì)胞。或者，利用使所關(guān)注的衍化細(xì)胞優(yōu)先與某些底物結(jié) 合的策略捕集或去除所關(guān)注的衍化細(xì)胞。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一方面，使用含 生物素或與之相關(guān)的化合物衍化的所關(guān)注的細(xì)胞被捕集或截留在與生物素結(jié)合或經(jīng)修飾 (例如通過存在親和素、鏈霉親和素、生物素結(jié)合抗體或其它生物素結(jié)合分子)與生物素結(jié) 合的底物、表面、物質(zhì)、介質(zhì)、化合物或微粒上。在涉及本方面的另一可供選擇的方案中，生 物素或相關(guān)化合物的光活化型衍化物用于在這種應(yīng)用中衍化所關(guān)注的細(xì)胞?；蛘咴谄渌矫嬷?，所關(guān)注的細(xì)胞在經(jīng)受選擇和修飾之前通過化學(xué)物質(zhì)或化合物的添加或結(jié)合被改變。 因此在這種情況下，本文中所述方法及裝置的實(shí)施例利用添加物質(zhì)對(duì)選定細(xì)胞的改變來實(shí) 現(xiàn)這種細(xì)胞與細(xì)胞群中其它細(xì)胞的區(qū)分。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一方面，在分析 前通過添加光不穩(wěn)定的化學(xué)化合物對(duì)群中的所有細(xì)胞進(jìn)行衍化，在一方面，針對(duì)特定的細(xì) 胞進(jìn)行修飾，方式是使用裝置的能量源修飾這些細(xì)胞上的光不穩(wěn)定的化學(xué)化合物。在細(xì)胞儀的一些實(shí)施例中(見圖1)，細(xì)胞以本領(lǐng)域中熟悉的常見方式進(jìn)入詢問或 分析室、比色皿、液流或其它分析位置或區(qū)域供流式細(xì)胞分析和/或分選。細(xì)胞儀通過如上 所述測(cè)量細(xì)胞的特性將其識(shí)別為在最終制劑中具有所需特性或不具有所需特性，所述細(xì)胞 的特性包括但不限于諸如熒光和/或光散射之類的特性。液體的流動(dòng)攜帶細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞儀 的區(qū)域，并且在一方面，通過一個(gè)或多個(gè)激光束、檢測(cè)器和/或檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量特性的 其它裝置。在一個(gè)這樣的方面中，液體的流動(dòng)使細(xì)胞向著具有通常與液流同軸對(duì)準(zhǔn)的軸的 光學(xué)元件移動(dòng)。作為例子而非限制，光學(xué)元件可以包括諸如物鏡的透鏡，和/或可以包括一 個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器、激光束和/或其它能量源。通過細(xì)胞與檢測(cè)器、激光束和或其它能量源之 間的光和/或能量可以穿過光學(xué)元件(例如，物鏡)，所述光學(xué)元件通常與細(xì)胞通過細(xì)胞儀 的相關(guān)部分的流動(dòng)同軸對(duì)準(zhǔn)。在一方面，由細(xì)胞或流體經(jīng)過儀器的相關(guān)部分的速度直接或 間接地確定和/或估計(jì)在任意時(shí)間點(diǎn)時(shí)每個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞儀中的位置。在一方面，將已經(jīng)通 過區(qū)域中的一些或所有分析位置的細(xì)胞識(shí)別為在最終制劑中具有所需特性或不具有所需 特性。在一方面，由計(jì)算機(jī)和/或模擬和/或數(shù)字電氣和/或電子和/或軟件和/或計(jì)算 計(jì)硬件數(shù)據(jù)分析設(shè)備完成這種測(cè)定。這種設(shè)備將每個(gè)細(xì)胞的單個(gè)或多個(gè)特性、測(cè)量結(jié)果和 /或特征與由裝置的操作員確定的一個(gè)或一套或一組特性、測(cè)量結(jié)果和/或特征進(jìn)行比較。 或者，在一方面，使用細(xì)胞儀所包括或帶有的算法或程序自動(dòng)地確定要與測(cè)量的特性進(jìn)行 比較的特性。在一方面，在細(xì)胞儀中測(cè)定的細(xì)胞與之進(jìn)行比較的特性集合確定在細(xì)胞制劑中具 有所需特性或不具有所需特性的一個(gè)或多個(gè)所關(guān)注的細(xì)胞亞群。在一方面，迅速完成對(duì)經(jīng) 過儀器的分析區(qū)的細(xì)胞是否屬于所關(guān)注的特定細(xì)胞亞群的確定，使得當(dāng)細(xì)胞在儀器的流動(dòng) 系統(tǒng)中的位置得到確定之時(shí)將細(xì)胞的狀態(tài)確定為在細(xì)胞制劑中具有所需特性或不具有所 需特性，在某些方面，通常在進(jìn)入儀器的分析區(qū)后不到一秒內(nèi)確定。一旦完成所述確定，在 一方面使細(xì)胞受選擇性地施與滿足或不滿足選擇標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞的能量或力的作用。就與任 選的后續(xù)應(yīng)用相關(guān)的所需特性而言，所述力或能量在各方面使所關(guān)注的細(xì)胞失活、鈍化、分 裂、分離、破碎或以其它方式改變所關(guān)注的細(xì)胞，或者所述力或能量在另外的方面修飾和/ 或衍化所關(guān)注的細(xì)胞，或使所關(guān)注的細(xì)胞以這樣的一種方式衍化，即，可實(shí)現(xiàn)在制劑中隨后 分離或區(qū)分一個(gè)或多個(gè)所關(guān)注的細(xì)胞亞群。在各方面，這種力或能量是由導(dǎo)向流動(dòng)液流中的細(xì)胞位置的一個(gè)或多個(gè)激光器或 其它光和/或電磁源以這樣的方式施與的，即，使能量源能夠進(jìn)行快速轉(zhuǎn)向、散焦或關(guān)閉以 允許未選擇進(jìn)行修飾的細(xì)胞通過。例如，僅旨在說明或解釋而言，能夠快速脈沖或開閉的高 能量和/或高強(qiáng)度激光將選定的細(xì)胞暴露于使它們?cè)谌魏嗡栌猛局袉适Чδ艿钠茐男?輻射。在一些方面，所述力或能量穿過光學(xué)元件，所述光學(xué)元件通常與在細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞儀的 相關(guān)區(qū)域時(shí)的細(xì)胞流動(dòng)同軸對(duì)準(zhǔn)。無論如何，所有細(xì)胞，不論是選定并受修飾力或能量作用 的細(xì)胞還是未選擇且不受所述力或能量作用的細(xì)胞，均繼續(xù)隨細(xì)胞流遷移，并離開裝置中
17進(jìn)行細(xì)胞特性測(cè)量和選定細(xì)胞修飾的區(qū)域。收集流出液，其含有修飾和未修飾的細(xì)胞，以及 在某些方面含有細(xì)胞的碎片或殘留物以及所述過程中使用的流體、溶液和/或緩沖液。在 各方面，以這種形式進(jìn)一步使用流出液，或者在其它方面中對(duì)其進(jìn)行濃縮、分級(jí)或以另外的 方式進(jìn)一步處理以獲得所需特性和/或組成。圖2至5描述根據(jù)所述方法及裝置的分選流式細(xì)胞儀的各種實(shí)施例。圖2特別地 描述這種細(xì)胞儀的基本流徑110的實(shí)施例。鞘液輸入管112容許加壓鞘液在鞘液輸入端114 進(jìn)入流徑110，產(chǎn)生經(jīng)過流徑110的鞘液流116。在鞘液輸入端114的下游、優(yōu)選在鞘液的 平穩(wěn)層流區(qū)，分析物流體輸入管118容許分析物液流120(即，懸浮、攜帶分析物的流體等) 經(jīng)分析物輸入端122進(jìn)入流徑110。在一些實(shí)施例中，分析物輸入端122設(shè)置在鞘液流116 內(nèi)的中心處和/或流徑110內(nèi)的中心處，并定向成在分析物流體進(jìn)入流徑110時(shí)，分析物液 流120平行于鞘液流116。當(dāng)然，分析物輸入端122不必在鞘液流116或流徑110的中心， 并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以設(shè)想出在分析物液流120進(jìn)入流徑110時(shí)分析物液流120 不與鞘液流116平行的實(shí)施例。鞘液流116相對(duì)于分析物液流120的流速和壓力壓縮分析 物液流120并使之收縮而相對(duì)于鞘液流116變窄。鞘液流116與分析物液流120合并形成 樣本流123。流徑110可以在區(qū)域124改變方向，但優(yōu)選此后包括沒有障礙和流動(dòng)方向陡變的 區(qū)域，用來在樣本流123到達(dá)詢問區(qū)128(即，觀察區(qū)、分析區(qū)、標(biāo)稱焦點(diǎn)等)之前穩(wěn)定樣本 流123。樣本流123經(jīng)過流徑110的路徑限定了流動(dòng)軸130。在一些實(shí)施例中，分析物液流 120，特別是分析物液流120內(nèi)的分析物(即，細(xì)胞)，通常沿著流動(dòng)軸130經(jīng)過流徑110移動(dòng)。在到達(dá)和/或經(jīng)過詢問區(qū)1 后，樣本流123轉(zhuǎn)向。在一些實(shí)施例中，流徑110在 轉(zhuǎn)角132(圖2中以虛線標(biāo)示)改變方向。在其它實(shí)施例中，樣本流123在其到達(dá)區(qū)域126 的端部136時(shí)遇到橫流134。橫流134使樣本流123改變方向。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)角132 或橫流Π4使樣本流123的方向改變90度。然而在可供選擇的實(shí)施例中，樣本流123的改 變可以超過或不到90度。在任何情況下，樣本流123在改變方向后可以流向收集容器138， 并且在到達(dá)收集容器138之前可以經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)流徑元件140(例如，流量調(diào)節(jié)器、過濾 器等)ο通常設(shè)置在轉(zhuǎn)角132或其附近或者設(shè)置在樣本流123與橫流134的交點(diǎn)或其附近 的物鏡142起到在詢問區(qū)128內(nèi)產(chǎn)生焦點(diǎn)(未示出)的作用。在流徑110經(jīng)過詢問區(qū)1 時(shí)，物鏡142的光軸144通常與流徑110的流動(dòng)軸130同軸對(duì)準(zhǔn)。當(dāng)然，光軸144與流動(dòng)軸 130不必完全同軸，可有所不同，如光軸144平行且偏離流動(dòng)軸130，如光軸144相對(duì)于流動(dòng) 軸130呈斜角，等等。圖3示出包括所述方法及裝置的各種特征的示例性分選流式細(xì)胞儀151。類似于 圖2中所示的流徑110的實(shí)施例，圖3描述鞘流輸入管112和樣本流輸入管118，它們分別 通過鞘液輸入端114和分析物流體輸入端122引入鞘液流116和分析物液流120。特別地， 圖3中所示的分析物流體包含哺乳動(dòng)物精細(xì)胞150和攜帶哺乳動(dòng)物精細(xì)胞150的緩沖液 152。由于鞘液流116與分析物液流120并成樣本流123，各自的流速使細(xì)胞150形成單行 流并使它們的縱軸(即，沿著細(xì)胞尾的長度方向)對(duì)準(zhǔn)樣本流123的方向。仍參照?qǐng)D3，分選流式細(xì)胞儀的一個(gè)實(shí)施例包括首次分析和二次分析。當(dāng)細(xì)胞150隨著樣本流123經(jīng)過流徑110行進(jìn)時(shí)，首次分析可以確定細(xì)胞是否是所關(guān)注的細(xì)胞，可以確 定細(xì)胞經(jīng)過流徑110的移動(dòng)速度，可以確定在樣本流123中的給定點(diǎn)處，對(duì)于一種或多種稍 后的分析來說，細(xì)胞150是否過于密集，細(xì)胞150是尾部朝前還是頭部朝前定向等。在圖3 所示的實(shí)施例中，在細(xì)胞150到達(dá)流徑110中的點(diǎn)IM時(shí)進(jìn)行首次分析。首次分析照射源 156將能量158導(dǎo)向點(diǎn)154。能量158可以與每個(gè)細(xì)胞150相互作用以分散能量158，或者 以其它的方式與細(xì)胞150、細(xì)胞150的相關(guān)抗體、細(xì)胞150的相關(guān)熒光色素(例如，熒光素) 等相互作用。檢測(cè)器160可以檢測(cè)所產(chǎn)生的能量162(例如，分散的能量、所產(chǎn)生的熒光信 號(hào)等)并通過接線164向控制器166發(fā)送相應(yīng)的信號(hào)。檢測(cè)器160可以設(shè)置在適于檢測(cè)能 量162的任何位置，包括與點(diǎn)154(相對(duì)于照射能量源156)成斜角，或者與點(diǎn)IM成一直線。 首次分析照射源156優(yōu)選為488nm激光器，但也可以包括設(shè)想適合在首次分析中進(jìn)行測(cè)量 的任何能量源。首次分析照射源156可以定向成使能量158垂直于樣本流123移動(dòng)，或者 作為另外的選擇，可以定向成使能量158以相對(duì)于樣本流123的方向成斜角的方式入射到 細(xì)胞150上。此外，能量158和/或能量162可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個(gè)或多個(gè)光 學(xué)元件(未示出)，這樣可允許如本領(lǐng)域中通常已知的那樣，通過建立不同的光路以不同于 所描述的方式設(shè)置照射能量源156和檢測(cè)器160中的任一者或兩者。一些實(shí)施例可以省略首次分析。例如，從二次分析(下文進(jìn)行詳述)收集的信息 經(jīng)證實(shí)可足以確定哪些細(xì)胞是所關(guān)注的細(xì)胞并區(qū)別在所需和非所需亞群中的細(xì)胞。因此在 一些實(shí)施例中可以省略元件154-164?；蛘?，一些實(shí)施例可以包括兩個(gè)或多個(gè)首次分析，并 相應(yīng)地包括兩組或多組元件154-164。作為例子而非限制，樣本流123可以包括一個(gè)或多個(gè) 標(biāo)記物(例如，包括于鞘流116中、附著于或以其它的方式與樣本流120中的一些細(xì)胞150 結(jié)合等)。主要的首次分析可以在第一點(diǎn)檢測(cè)標(biāo)記物之一，次要的首次分析可以在第二點(diǎn)檢 測(cè)該標(biāo)記物以確定樣本流123中的細(xì)胞流速。在任何情況下，首次分析后樣本流123繼續(xù)行進(jìn)，沿著流徑110攜帶細(xì)胞150。在 細(xì)胞150經(jīng)過點(diǎn)170時(shí)，如下文所述，二次分析對(duì)細(xì)胞150進(jìn)行表征，用以確定是否對(duì)每個(gè) 細(xì)胞150進(jìn)行修飾。在每個(gè)細(xì)胞150到達(dá)點(diǎn)170時(shí)，二次分析照射源172將能量174導(dǎo)向 點(diǎn)170。能量174可以與細(xì)胞150、細(xì)胞150的相關(guān)抗體、細(xì)胞150或細(xì)胞150內(nèi)的DNA的 相關(guān)熒光色素(例如，Hoechst染色劑)等相互作用。如本領(lǐng)域中通常已知的那樣，在一些 實(shí)施例中，二次分析照射源172是以紫外輻射的形式發(fā)射能量174的紫外激光器，所述紫外 輻射與附著于細(xì)胞150內(nèi)部的DNA上的Hoechst染色劑微粒相互作用，從而產(chǎn)生正比于細(xì) 胞150的DNA含量的熒光。如圖3所示，二次分析照射源172可定向成使射束174垂直于 樣本流123。然而，二次分析照射源172的位置也可以相對(duì)于樣本流123成斜角。此外，能 量174可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件(未示出)，這樣可允許通過建 立不直的光路以不同于所描述的方式設(shè)置二次分析照射源172。能量174與細(xì)胞150或與細(xì)胞150的內(nèi)部成分的相互作用使所產(chǎn)生的能量176自 細(xì)胞150發(fā)散出來。將物鏡142設(shè)置成使物鏡142的光軸144通常與樣本流123同軸，這 樣的作用是聚焦能量176。物鏡142的焦點(diǎn)178通常位于點(diǎn)170，但可以設(shè)置成便于在能量 174照射細(xì)胞150的稍后檢測(cè)自細(xì)胞150的所產(chǎn)生的能量176( S卩，焦點(diǎn)178可以稍微比點(diǎn) 170更靠近物鏡14 。設(shè)置成便于接收由物鏡142聚焦的能量182的檢測(cè)器180檢測(cè)自細(xì) 胞150的聚焦能量182，并通過接線184向控制器166發(fā)送相應(yīng)的信號(hào)。當(dāng)然，諸如濾光器186的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件可起到改動(dòng)或改變物鏡142與檢測(cè)器180之間的能量182的方 向的作用。在一些實(shí)施例中，物鏡142在轉(zhuǎn)角132之前或者在橫流134與樣本流123匯合 之前產(chǎn)生焦點(diǎn)178。在其它實(shí)施例中，物鏡142在轉(zhuǎn)角132或橫流134與樣本流123的匯合 點(diǎn)或其附近產(chǎn)生焦點(diǎn)(未示出)。控制器166可以包括一個(gè)或多個(gè)微處理器188、一個(gè)或多個(gè)晶體振蕩器190、存儲(chǔ) 一個(gè)或多個(gè)程序194的一個(gè)或多個(gè)存儲(chǔ)器192等，它對(duì)接收自檢測(cè)器160和/或檢測(cè)器180 的信號(hào)進(jìn)行解析，用以針對(duì)每個(gè)細(xì)胞150確定細(xì)胞150是否屬于所需的細(xì)胞亞群。例如在一 些實(shí)施例中，細(xì)胞150是哺乳動(dòng)物精細(xì)胞，控制器166解析接收自檢測(cè)器180的信號(hào)，用以 確定每個(gè)細(xì)胞150攜帶X染色體還是Y染色體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常已知的是，在 哺乳動(dòng)物的精細(xì)胞中，Y染色體所含的DNA通常比X染色體所含的要少。因此，通過分析由 細(xì)胞150中的染色劑經(jīng)二次分析照射源172的照射而發(fā)射的熒光(即，產(chǎn)生的能量176)，控 制器166通?？梢源_定細(xì)胞150攜帶X染色體還是攜帶Y染色體。在一些實(shí)施例中，程序 194之一連續(xù)地監(jiān)測(cè)檢測(cè)熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分布，以便隨著時(shí)間的推移提高測(cè)定的精確度。仍參照?qǐng)D3，在一些實(shí)施例中，控制器166根據(jù)對(duì)細(xì)胞150是否屬于所需亞群的確 定，通過接線198向可控能量源196輸出信號(hào)?？煽啬芰吭?96可以發(fā)出導(dǎo)向樣本流123 中的點(diǎn)199的能量197。在一些實(shí)施例中，操作控制器166使信號(hào)與可控能量源196協(xié)調(diào)， 和/或根據(jù)細(xì)胞150經(jīng)過流徑110的移動(dòng)速度選擇點(diǎn)199(例如，通過瞄準(zhǔn)、通過一個(gè)或多 個(gè)透鏡、鏡子等)。在一些實(shí)施例中，點(diǎn)199可以位于轉(zhuǎn)角132或橫流134與樣本流123的 匯合點(diǎn)之前，從而簡化對(duì)沿流徑110移動(dòng)的細(xì)胞150的位置確定。在其它實(shí)施例中，點(diǎn)199 可以位于轉(zhuǎn)角132之后，或者可以位于橫流134與樣本流123的匯合點(diǎn)或其后。在上述實(shí) 例中，控制器166可以輸出信號(hào)，使可控能量源196響應(yīng)對(duì)細(xì)胞150具有X染色體的確定或 響應(yīng)對(duì)細(xì)胞150具有Y染色體的確定而發(fā)出能量197?；蛘?，控制器166可以輸出信號(hào)，使 可控能量源196響應(yīng)對(duì)細(xì)胞150具有X染色體的確定或響應(yīng)對(duì)細(xì)胞150具有Y染色體的確 定而停止發(fā)出能量197。由能量源196發(fā)出的能量197的作用可以是使細(xì)胞150喪失機(jī)能 或使細(xì)胞150不能存活(例如，通過修飾細(xì)胞的組分或化學(xué)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、DNA和涉及 細(xì)胞代謝的物質(zhì)；通過在細(xì)胞150中或其附近造成分裂、加熱、空化或爆破；通過造成細(xì)胞 150的透化或穿孔；和/或通過造成對(duì)細(xì)胞的破壞、破碎或形態(tài)改變)，可以是改變(例如， 通過與細(xì)胞組分中或附著于細(xì)胞組分的化學(xué)物質(zhì)的相互作用)細(xì)胞，使之隨后可以被識(shí)別 和/或從所需細(xì)胞亞群150中被去除，或者可以是有利地影響細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可控 能量源196是激光器，并且特別地，可以是輸出光譜的可見光或紅外部分能量的激光器。在 一些實(shí)施例中，激光器輸出具有690nm波長的能量。在其它實(shí)施例中，可控能量源196可以 輸出其它類型或波長的輻射，如X射線、微波、可見光、紅外光、紫外光或?qū)?xì)胞150具有所 需效果的任何其它類型的能量。當(dāng)然，響應(yīng)于對(duì)細(xì)胞是否屬于所需亞群的確定，控制器166 可以(1)發(fā)出能量197以不利地影響確定不屬于所需亞群的細(xì)胞150 (而留下確定屬于所 需亞群的細(xì)胞150) ； (2)可以發(fā)出能量197以有利地影響確定屬于所需亞群的細(xì)胞150(而 留下確定不屬于所需亞群的細(xì)胞150) ； (3)可以停止發(fā)出能量197以避免有利地影響確定 不屬于所需亞群的細(xì)胞150(而繼續(xù)發(fā)出能量197以有利地影響確定屬于所需亞群的細(xì)胞 150)；或(4)可以停止發(fā)出能量197以避免不利地影響確定屬于所需亞群的細(xì)胞150(而繼 續(xù)發(fā)出能量197以不利地影響確定不屬于所需亞群的細(xì)胞150)。此外，在一些實(shí)施例中，控制器166可以按與控制器166處理確定不在所需亞群中的細(xì)胞相同的方式處理不確定的細(xì) 胞150(例如，控制器166不能進(jìn)行確定的細(xì)胞150、過于密集的細(xì)胞150等)。圖4示出包括所述方法及裝置的各種特征的示例性分選流式細(xì)胞儀200，特別地， 圖4中所示的分選流式細(xì)胞儀200省略了首次分析，因此沒有元件154-164。然而，雖然未 示出，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，如有必要，圖4示出的實(shí)施例可以包括首次 分析。如在圖3中所示的實(shí)施例中的那樣，樣本流123沿流徑110攜帶細(xì)胞150。在細(xì)胞 150經(jīng)過點(diǎn)170時(shí)，如上所述，二次分析(在圖4的描述中并不是在任何首次分析之后)對(duì) 細(xì)胞150進(jìn)行表征，用以確定是否修飾每個(gè)細(xì)胞150。也就是說，在每個(gè)細(xì)胞150到達(dá)點(diǎn)170 時(shí)，如上所述，二次分析照射源172將能量174導(dǎo)向點(diǎn)170，能量174與細(xì)胞150相互作用。 當(dāng)然，二次分析照射源172可以是紫外激光器，并且能量174可以與附著于細(xì)胞150內(nèi)部的 DNA上的Hoechst 33342染色劑的分子相互作用。如圖4所示，二次分析照射源172可以定 向成使射束174與樣本流123垂直。然而，二次分析照射源172也可以相對(duì)于樣本流123 成斜角。此外，能量174可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件(未示出)，這 樣可允許通過建立不直的光路以不同于所描述的方式設(shè)置二次分析照射源172。從細(xì)胞150發(fā)出的所產(chǎn)生的能量176向著物鏡142傳播，所述物鏡142設(shè)置成使 物鏡142的光軸144(見圖幻通常與樣本流123同軸，并且作用是聚焦能量176。物鏡142 的焦點(diǎn)178通常位于點(diǎn)170，但作為另外的選擇，可設(shè)置成便于在能量174照射細(xì)胞150的 稍后檢測(cè)自細(xì)胞150的所產(chǎn)生的能量176。一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件可以將由物鏡142聚焦的 能量182導(dǎo)向檢測(cè)器180。例如，在圖4所示的實(shí)施例中，聚焦的能量182在到達(dá)檢測(cè)器180 之前經(jīng)過分束器202和濾光器186。其它光學(xué)元件(例如，透鏡、鏡子、濾光器等)也可影 響聚焦的能量在物鏡142與檢測(cè)器180之間的路徑。如在圖3所示的實(shí)施例中的那樣，在 一些實(shí)施例中，物鏡142在轉(zhuǎn)角132或橫流134與樣本流123的匯合點(diǎn)之前建立焦點(diǎn)178。 在其它實(shí)施例中，物鏡142在轉(zhuǎn)角132或橫流134與樣本流123的匯合點(diǎn)處或其附近建立 焦點(diǎn)(未示出)。如上文參照?qǐng)D3所述，控制器166的作用是解析(通過接線184)接收自檢測(cè)器 180(以及檢測(cè)器160，如果細(xì)胞儀200包括首次分析的話)的信號(hào)以對(duì)每個(gè)細(xì)胞150確定 細(xì)胞150是否屬于所需細(xì)胞亞群(例如，帶有X染色體的精細(xì)胞)?？刂破?66通過接線 206向可控能量源204輸出信號(hào)?？煽啬芰吭?04以與可控能量源196(圖幻相同的方式 進(jìn)行操作。然而，在圖4所示的實(shí)施例中，由可控能量源204發(fā)出的能量208在一些實(shí)施例 中穿過諸如濾光器216的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件之后穿過物鏡142。物鏡142的作用是在焦 點(diǎn)210聚焦能量208。在一些實(shí)施例中，物鏡142可以聚焦來自可控能量源204的能量208， 使聚焦的能量212通常與樣本流123同軸，并且使點(diǎn)210位于比點(diǎn)170更靠近物鏡142的 位置。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，使用相同的透鏡建立焦點(diǎn)210和焦點(diǎn)178 有多種方法。圖7描述細(xì)胞儀200可用來為能量176建立焦點(diǎn)178和為能量212建立焦點(diǎn) 210的一種方法。圖7描述在能量176 (圖7中以實(shí)線標(biāo)示)從焦點(diǎn)178 (即，從點(diǎn)170處的 細(xì)胞150)經(jīng)過物鏡142(圖7中未示出)的透鏡214時(shí)，透鏡214作用于能量176，使能量 176的射線在其離開透鏡214時(shí)是平行的。相比之下，能量208的射線在其落射在透鏡214 上的時(shí)候略微收斂，并因此在經(jīng)過透鏡214后匯合于焦點(diǎn)210。當(dāng)然建立焦點(diǎn)178和焦點(diǎn)210有其它方法，包括利用不同波長的能量通過相同材料時(shí)的折射不同的事實(shí)，或者采用多 焦點(diǎn)透鏡，作為例子而非限制，如美國專利No. 6，010, 647中所述的方法。為說明的目的，圖5描述分選流式細(xì)胞儀220的另一示例性實(shí)施例。分選流式細(xì) 胞儀220包括通常參照?qǐng)D3和4所描述的流徑110。類似于圖4中所示的分選流式細(xì)胞儀 200，分選流式細(xì)胞儀220省略了首次分析(以及首次分析的相關(guān)設(shè)備)。樣本流123，特 別是細(xì)胞150，向著物鏡142流動(dòng)。如在前述實(shí)施例中的那樣，物鏡142在流徑110中的點(diǎn) 170處建立焦點(diǎn)178。在細(xì)胞150到達(dá)點(diǎn)170時(shí)，來自細(xì)胞150的能量176穿過物鏡142，物 鏡142設(shè)置成使物鏡142的光軸144通常與樣本流123同軸，且作用是聚焦能量176。物 鏡142的焦點(diǎn)178通常位于點(diǎn)170，但作為另外的選擇，可設(shè)置成便于在能量174照射細(xì)胞 150的稍后檢測(cè)自細(xì)胞150的所產(chǎn)生的能量176。一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件(如分束器202、濾 光器186等)可以將自物鏡142聚焦的能量182導(dǎo)向檢測(cè)器180。仍參照?qǐng)D5，所示的分選流式細(xì)胞儀220包括二次分析照射源222。二次分析照射 源222發(fā)出能量224，能量2M可以是紫外能量174。由二次分析照射源222發(fā)出的能量 2M經(jīng)光路移動(dòng)至物鏡142。物鏡142可以將能量2M聚焦到焦點(diǎn)178，按照這種方式，能量 176和能量224的光路可以在一定程度上重疊。諸如分束器202和濾光器226的其它光學(xué) 元件的各種配置的作用可以是將能量2M從二次分析照射源222導(dǎo)向物鏡，并將(來自細(xì) 胞150)的能量176從物鏡142導(dǎo)向檢測(cè)器180。如上文參照?qǐng)D3和4所述，控制器166的作用是解析(通過接線184)接收自檢測(cè) 器180 (和檢測(cè)器160，如果細(xì)胞儀200包括首次分析的話)的信號(hào)，用以對(duì)每個(gè)細(xì)胞150確 定細(xì)胞150是否屬于所需細(xì)胞亞群。控制器166通過接線230向可控能量源2 輸出信號(hào)。 可控能量源228以與可控能量源196(圖幻相同的方式進(jìn)行操作，輸出導(dǎo)向點(diǎn)234的能量 232。圖6A和6B分別描述根據(jù)設(shè)想方法及裝置的流式細(xì)胞儀的其它實(shí)施例的部分235A 和235B。如參照?qǐng)D2所述的那樣，在各圖6A和6B中，細(xì)胞236經(jīng)流徑238在液流237中 移動(dòng)，流徑238在點(diǎn)239或其附近改變軌跡。流徑238和/或經(jīng)過流徑238的細(xì)胞236的 液流237的流體建模和/或精確形成和/或?yàn)楸O(jiān)測(cè)細(xì)胞236的位置而并入附加元件(未示 出)可以改善不然由在點(diǎn)239或其附近改變軌跡所導(dǎo)致的不確定性。按照這種方式可以在 改變軌跡后仍能確定個(gè)體細(xì)胞的位置和本體。圖6A描述一個(gè)實(shí)施例，其中將按與上文參照 圖3、4和5所述(分別是196、204和228)相同的方式操作的可控能量源240設(shè)置成使細(xì) 胞236移過流徑238中的點(diǎn)239后，所發(fā)出的能量241落射到細(xì)胞236上。圖6A描述垂直 于細(xì)胞236經(jīng)流徑238的流動(dòng)方向移動(dòng)的能量Ml。當(dāng)然，可以理解的是，作為另外的選擇， 可以將可控能量源240設(shè)置成使發(fā)出的能量241通常與細(xì)胞236經(jīng)流徑238的流動(dòng)方向同 軸地移動(dòng)(例如，通過再次改變流動(dòng)方向，并將可控能量源240設(shè)置成使流徑238中的細(xì)胞 236向著可控能量源240移動(dòng))。應(yīng)當(dāng)理解的是，作為另外的選擇，根據(jù)設(shè)想方法及裝置的分選流式細(xì)胞儀可以采 取如圖6B所示的“空氣中的射流(jet-in-air)”配置。圖6B描述了發(fā)射由液滴244組成 的液流243的噴嘴M2?？煽啬芰吭?未示出)通過對(duì)一個(gè)或多個(gè)液滴244施予電荷而選 擇性地改變液滴。此后，作為例子而非限制，如上所述，一對(duì)帶電板245可以根據(jù)檢測(cè)器(未 示出)的確定將由液滴244組成的液流243分選到容器246當(dāng)中。
圖8A描述物鏡142和包括詢問區(qū)128在內(nèi)的部分流徑110。本領(lǐng)域中通常已知的 是，一個(gè)或多個(gè)透鏡元件250(例如，半球前透鏡、彎月透鏡等)的作用是建立標(biāo)稱焦點(diǎn)252。 在上文參照?qǐng)D3-5所述的實(shí)施例中，標(biāo)稱焦點(diǎn)252在樣本流123內(nèi)，特別是在細(xì)胞150經(jīng)過 流徑110的路徑內(nèi)。標(biāo)稱焦點(diǎn)252限定通常為錐形體254的頂點(diǎn)，所述錐形體254在標(biāo)稱 焦點(diǎn)252與物鏡142的外部元件256 (形成錐形體254的基部253)之間。錐形體254可以 是正圓錐體，但也可以是斜錐形體。在錐形體254是正圓錐體的實(shí)施例中，錐軸258通常與 物鏡142的軸260同軸。在這種實(shí)施例中，軸258和260進(jìn)一步與流徑110內(nèi)的流動(dòng)軸262 同軸，流動(dòng)軸262通常限定細(xì)胞150在流徑110內(nèi)移動(dòng)的路徑。在一些實(shí)施例中，物鏡142的焦點(diǎn)252使錐形體254的側(cè)面264穿過的界面數(shù)最小 化。例如，參照?qǐng)D8A，流徑壁268A形成通常為圓柱形的橫流徑270A，流徑壁268B形成通常 為圓柱形的流徑270B，所述流徑270B通常與錐形體254的軸同軸。圖8A中的錐形體254 在進(jìn)入和離開包括壁268A的材料時(shí)僅穿過兩個(gè)界面。錐形體254穿過在空氣276與包括 壁268A的材料之間的界面272，并穿過在包括壁268A的材料與流徑110中的流體278之間 的界面274。此外，在一些實(shí)施例中，側(cè)面264經(jīng)過的流徑110的壁268A通?？善叫杏阱F形 體254的基部253。這樣簡化了由物鏡142聚焦的能量必須穿過的界面(S卩，能量不穿過任 何曲面)，每個(gè)所述界面可通過折射作用影響物鏡142的焦點(diǎn)252。此外，如圖8B所示，錐 形體254可以由多個(gè)錐體257、259和261的255A、255B和255C部分連在一起形成，例如由 具有不同折射率的材料形成一個(gè)或多個(gè)界面(如界面272和274)的情況。一般來說，錐形體254必須穿過至少兩個(gè)界面272和274。在所述方法及裝置的 一些實(shí)施例中，物鏡142例如可根據(jù)形成界面(例如，壁268A)的材料的厚度和折射率情況 而考慮一個(gè)或多個(gè)界面。此外，在一些實(shí)施例中，物鏡142可以是使用折射率類似于形成界 面(例如，壁268A)的材料的浸泡介質(zhì)(例如，水或油)的水蘸透鏡、水浸透鏡或油浸透鏡。 因此，如圖9所示，一些實(shí)施例通過使錐形體254穿過的材料的各折射率之差最小化而進(jìn)一 步減少焦點(diǎn)252的變形。例如在圖9中，錐形體254可以穿過水280、壁268A和流徑110中 的流體278。物鏡142可以是水浸物鏡，其中例如壁268A由玻璃制成?；蛘?，在不必要校正 由壁268A造成的折射的情況下，例如當(dāng)壁268A由折射率與流體278的折射率類似或相同 的材料形成時(shí)，物鏡142可以是水蘸透鏡。還在另外的實(shí)施例中，如在同時(shí)提交的專利申請(qǐng)(律師文案號(hào)30752/44821)中充 分描述的那樣，流徑110的壁268A和268B可以由折射率接近于流體278的折射率的材料 形成(即，使錐形體254穿過的材料的折射率之差最小化的材料)。例如，折射率接近于水 的材料包括折射率范圍在1.30-1. 40(含)的材料。無定形全氟聚合物、無定形氟聚合物和 全氟烷氧基聚合物系列的若干固體材料的折射率在該范圍內(nèi)。作為例子而非限制，Asahi Glass Co.，Ltd.制造的 Cytop 以及 DuPont 制造的 Teflon AF 和 Teflon PFA 是三種 此類材料。在一些實(shí)施例中，所述方法或裝置也可以調(diào)節(jié)流體278的折射率，使流體278的折 射率更接近于形成流徑Iio的壁268A和/或268B的材料的折射率。特別地，所述方法或 裝置可以將流體278的折射率調(diào)節(jié)成與形成流徑110的壁268A和/或268B的材料的折射 率相差在0.02以內(nèi)。在一些細(xì)胞儀中，在主體280中形成包括詢問區(qū)128在內(nèi)的部分流徑110，例如圖
2310所示的主體280。圖10描述的主體280為矩形立方體，其內(nèi)有鉆成或以其它方式形成的 流徑110的部分281。所述部分281包括第一流徑部分282 (通常垂直于表面284，物鏡142 可以通過表面284進(jìn)行觀察)和第二流徑部分286 (通常平行于表面284，并與最靠近表面 284的第一流徑部分282的端部288交叉)。主體280例如可以是比色皿，可以由拋光的石 英、玻璃、塑料或本領(lǐng)域中通常已知的其它材料形成。在一些實(shí)施例中，主體280可以完全 或部分地由折射率范圍在1. 30-1. 40 (含)的材料形成，如Cytop 或Teflon AF。在如圖11示出的另一實(shí)施例中，主體280包括流徑的部分281。所述部分281包 括通常垂直于表面284 (物鏡142可以通過表面284進(jìn)行觀察)的第一流徑部分282。然 而，在圖11所示的實(shí)施例中，第二流徑部分286形成具有上邊緣290的槽，通常與表面284 共面。在一些實(shí)施例中，設(shè)置在表面284頂部上的蓋玻片292可允許使用為與這種蓋玻片 292使用而校正的物鏡，用以消除不同折射率材料之間的界面的折射影響或使這種影響最 小化。還在其它實(shí)施例中，如圖12所示，主體280包括在第一流徑部分282與第二流徑 部分286的交叉處形成的儲(chǔ)池294。例如，第一流徑部分282可以與儲(chǔ)池294交叉在通常平 的底表面296處，底表面296通常與表面284平行。流徑部分286的兩部分286A和286B可 在通?？梢詾楸馄綀A筒形狀的儲(chǔ)池294的相對(duì)表面上與儲(chǔ)池294連接。當(dāng)調(diào)節(jié)焦點(diǎn)252(圖 8和9)時(shí)，這種布置可例如通過防止錐形體254穿過通常是圓柱形橫流徑270A(圖8和9) 的壁268A而提供進(jìn)一步的靈活性。圖13描述了一個(gè)類似的實(shí)施例，其中儲(chǔ)池294的上邊緣298與主體280的表面 284共面。水蘸物鏡(未顯示)可延伸到儲(chǔ)池294當(dāng)中，并且如此一來可以與流經(jīng)流徑110 的流體接觸，這樣可以消除不同折射率材料之間的任何界面。圖14描述又一實(shí)施例，其中蓋玻片299放置在圖13的實(shí)施例中所示的暴露儲(chǔ)池 之上。圖15示出從細(xì)胞樣本中選擇所需細(xì)胞亞群的方法300。在一些實(shí)施例中，方法 300或其部分方法以構(gòu)成一個(gè)或多個(gè)相關(guān)裝置的控制程序的一組機(jī)器可讀指令的形式存儲(chǔ) 在存儲(chǔ)器中。處理器可以從存儲(chǔ)器中讀取指令和執(zhí)行指令以實(shí)施方法300。在另一實(shí)施例 中，方法300包括若干程序，所述程序可以單獨(dú)控制一個(gè)或多個(gè)裝置，可以對(duì)由一個(gè)或多個(gè) 裝置收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以根據(jù)分析的數(shù)據(jù)做出一種或多種確定，等等。通常已知的 是，技術(shù)員或裝置可以標(biāo)記(例如，通過應(yīng)用Hoechst染色劑)用于分析的樣本(例如，精 細(xì)胞集)(方塊305)。標(biāo)記細(xì)胞可以在分選流式細(xì)胞儀內(nèi)完成，或者在分選流式細(xì)胞儀以外 的單獨(dú)過程或程序中完成。此外，應(yīng)用于細(xì)胞的具體標(biāo)記物可取決于細(xì)胞儀的應(yīng)用。在任何情況下，標(biāo)記細(xì)胞后，分選流式細(xì)胞儀可以在流徑中產(chǎn)生鞘液流(方塊 310)。分選流式細(xì)胞儀可以通過單獨(dú)的輸入端將樣本(即，標(biāo)記的細(xì)胞)注入流徑(方塊 315)，優(yōu)選在鞘液流的中心或其附近。還優(yōu)選的是，樣本相對(duì)于鞘液流以緩慢的方式進(jìn)入鞘 液流，使樣本內(nèi)的單細(xì)胞(例如精細(xì)胞)與平行于鞘液流的長軸對(duì)準(zhǔn)，并且使細(xì)胞以通常單 行的模式流動(dòng)。在細(xì)胞經(jīng)流徑移動(dòng)時(shí)，諸如UV激光器的激發(fā)能量源照射樣本(方塊320)。激發(fā)能 量源可以不斷地照射流徑，或者在處理器上執(zhí)行的程序可以控制激發(fā)能量源選擇性地照射 流徑(例如，只有當(dāng)樣本存在于流徑中的時(shí)候)。
物鏡或其它聚焦裝置的作用是在與液流同軸的方向上聚焦由每個(gè)細(xì)胞發(fā)出、傳輸 或反射的能量(例如由標(biāo)記物發(fā)出的熒光)(方塊325)。也就是說，在流徑內(nèi)合并的鞘流和 樣本通常向著具有光軸的物鏡移動(dòng)，所述光軸通常與液流同軸，并且名義上而言，樣本內(nèi)的 每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過物鏡的焦點(diǎn)。檢測(cè)器接收由物鏡聚焦的能量(方塊330)，并對(duì)控制器發(fā)送代 表檢測(cè)能量的信號(hào)。在一些實(shí)施例中，檢測(cè)器每秒可以單獨(dú)檢測(cè)從超過40，000個(gè)細(xì)胞聚焦 的能量、每秒可以單獨(dú)檢測(cè)從超過75，000個(gè)細(xì)胞聚焦的能量或者每秒可以單獨(dú)檢測(cè)從超 過100，000個(gè)細(xì)胞聚焦的能量。控制器接收代表檢測(cè)能量的信號(hào)并分析數(shù)據(jù)(方塊335)以確定(方塊340)數(shù)據(jù) 所代表的是所需亞群內(nèi)的細(xì)胞、不是所需亞群內(nèi)的細(xì)胞，還是既不能確定在所需亞群也不 能確定不在所需亞群的不確定的細(xì)胞。在后一種情況下，控制器可以如同檢測(cè)器已確定細(xì) 胞不在所需亞群的那樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。如果控制器確定細(xì)胞不在所需亞群或者是不確定 的，控制器可以對(duì)諸如紅外激光器的可控能量源發(fā)送信號(hào)以照射細(xì)胞(例如，改變細(xì)胞、破 壞細(xì)胞、使細(xì)胞無法存活等)(方塊345)。或者，如果控制器確定細(xì)胞在所需的亞群，控制器 可以對(duì)可控能量源發(fā)送信號(hào)(或不再發(fā)送信號(hào))，使可控能量源不照射細(xì)胞(方塊350)。所述裝置可用于收集細(xì)胞供過程末期使用和/或進(jìn)一步處理(例如，分離細(xì)胞)。 在可以包括圖15所示實(shí)施例的一些實(shí)施例中，控制器對(duì)可控能量源發(fā)送信號(hào)，對(duì)確定在所 需亞群的細(xì)胞不進(jìn)行改變(即，不照射)，所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞集具有的所需細(xì)胞亞群中 的細(xì)胞與未被改變的細(xì)胞總數(shù)之比大于或等于60%。此外，在可以包括圖15所示實(shí)施例的 一些實(shí)施例中，控制器對(duì)可控能量源發(fā)送信號(hào)，對(duì)確定在所需亞群的細(xì)胞不進(jìn)行改變(即， 不照射)，所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞集具有的所需亞群中被改變的細(xì)胞與所需亞群中的細(xì)胞 總數(shù)之比小于或等于50%。當(dāng)然，上述方法反映的是本發(fā)明所述方法的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例，但也可以包括一 個(gè)或多個(gè)附加的步驟或程序，如在整個(gè)本說明書中參照各實(shí)施例描述的那樣。此外，一些實(shí) 施例可以省略參照方法300描述的一個(gè)或多個(gè)步驟或程序。作為例子而非限制，在一些實(shí) 施例中，標(biāo)記物可自動(dòng)發(fā)出熒光，從而不再需要用照射能量源照射樣本。此外，在一些實(shí)施 例中(如上所述)，所述方法可以顛倒方塊345和350，不用可控能量源進(jìn)行照射而允許確 定不在所需亞群的細(xì)胞通過，而使可控能量源照射確定在所需亞群的細(xì)胞。所述方法及裝置提供的許多重要的優(yōu)點(diǎn)都優(yōu)于目前已實(shí)施的分選流式細(xì)胞儀。作 為一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所述的方法及裝置不使分析物細(xì)胞(在一些實(shí)施例中為哺乳動(dòng)物精細(xì) 胞)受限于分選流式細(xì)胞儀中通常采用的空氣中射流的配置。其結(jié)果是，根據(jù)本發(fā)明所述 實(shí)施例的細(xì)胞儀不將分析物細(xì)胞暴露于細(xì)胞儀外部的環(huán)境或分選液滴與容器所產(chǎn)生的碰 撞，并且不會(huì)經(jīng)歷與空氣中的射流配置的噴嘴相關(guān)的壓力和壓力變化。這允許在實(shí)施嚴(yán)格 的空氣質(zhì)量條件和溫度控制的環(huán)境以外使用細(xì)胞儀(例如，在“無塵室”環(huán)境以外)。實(shí)際 上，細(xì)胞儀本身可以實(shí)施溫度控制，從而擴(kuò)充分析物細(xì)胞的存活能力。此外，本發(fā)明所述方 法及裝置可以更快和/或更精確地檢測(cè)和改變分析物細(xì)胞，這部分是因?yàn)橥ǔＮ镧R與分析 物通過詢問區(qū)的流動(dòng)同軸對(duì)準(zhǔn)緩解和/或消除了與由分析物各向異性地發(fā)出能量相關(guān)的 問題，特別是在用來分選許多類型哺乳動(dòng)物精細(xì)胞的實(shí)施例中。在閱讀本文中公開的方法 及裝置的說明書之后，本發(fā)明所述的方法及裝置的其它優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言 將是顯而易見的。
雖然前文給出了對(duì)許多不同實(shí)施例的詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解的是，保護(hù)范圍由隨 后的權(quán)利要求的文字所限定。詳細(xì)描述僅可視為是示例性的，并不描述全部可能的實(shí)施例， 因?yàn)槊枋鋈靠赡艿膶?shí)施例即使并非不可能，也是不切實(shí)際的?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術(shù)或本專 利提交日之后開發(fā)的技術(shù)實(shí)施許多替代性實(shí)施例，這也在所述權(quán)利要求的范圍以內(nèi)。因此，在不偏離本權(quán)利要求書的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下可以對(duì)本文中所描述和說明 的技術(shù)和結(jié)構(gòu)做出許多修改和變化。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中所述的方法及裝置僅是示 例性的，并不限制權(quán)利要求的范圍。上述說明書描述至少以下各方面1. 一種從包括第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞的細(xì)胞群中選擇第一組細(xì)胞的方法，該方 法包括對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行標(biāo)記，以便可以區(qū)分第一組細(xì)胞與第二組細(xì)胞；提供具有遠(yuǎn)端、近端、設(shè)置在近端與遠(yuǎn)端之間的詢問區(qū)、和流動(dòng)軸的第一流徑；產(chǎn)生通過第一流徑的鞘液的鞘流，鞘流以第一流速朝近端移動(dòng)；在近端上游點(diǎn)處將包括細(xì)胞群的樣本流注入鞘流，該樣本流具有低于第一流速的 初始第二流速；提供激發(fā)能量源，當(dāng)個(gè)體細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)，由激發(fā)能量源發(fā)出的能量作用于個(gè) 體細(xì)胞，并引起自細(xì)胞發(fā)出或傳輸二次輻射；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)，使用具有通常與流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)的光軸的物鏡聚焦自個(gè)體 細(xì)胞的二次輻射；檢測(cè)自個(gè)體細(xì)胞的聚焦二次輻射；由檢測(cè)的二次輻射確定個(gè)體細(xì)胞是在第一組還是在第二組；以及選擇確定在第一組的細(xì)胞。2.根據(jù)第1方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細(xì)胞包括對(duì)不是確定在第 一組的細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎中的一種處理。3.根據(jù)第1方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細(xì)胞包括由噴嘴噴射細(xì)胞 流，由該流產(chǎn)生許多液滴，對(duì)液滴選擇性地施加電荷，以及根據(jù)每個(gè)液滴的電荷對(duì)液滴進(jìn)行 分選。4.根據(jù)第1至3中任一方面所述的方法，其中標(biāo)記細(xì)胞群包括對(duì)細(xì)胞染色。5.根據(jù)第1至4中任一方面所述的方法，其中引起發(fā)出二次輻射包括引起發(fā)出熒光。6.根據(jù)第1至5中任一方面所述的方法，其中由激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過物鏡。7.根據(jù)第1至6中任一方面所述的方法，其中的細(xì)胞是精細(xì)胞，并且進(jìn)一步地，其 中第一組細(xì)胞包括帶有X染色體的細(xì)胞或帶有Y染色體的細(xì)胞任一者。8.根據(jù)第1至7中任一方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細(xì)胞包括使用 區(qū)別能量源照射不是確定在第一組的細(xì)胞。9.根據(jù)第8方面所述的方法，其中的區(qū)別能量源是近紅外激光器。10.根據(jù)第8方面或第9方面所述的方法，其中由區(qū)別能量源發(fā)出的能量穿過物
^Mi ο11.根據(jù)第1至10中任一方面所述的方法，其中提供激發(fā)能量源包括提供紫外激光器。
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12.根據(jù)第10方面所述的方法，進(jìn)一步包括選擇區(qū)別能量源的波長、第一流速、第二流速和物鏡的組合，使得物鏡的標(biāo)稱焦點(diǎn) 與區(qū)別能量源的標(biāo)稱焦點(diǎn)隔開一定的距離，該距離是在檢測(cè)聚焦二次輻射與使用區(qū)別能量 源照射不是確定不在第一組的細(xì)胞的過程之間個(gè)體細(xì)胞所經(jīng)過的流徑的距離。13.根據(jù)第8方面或第10方面所述的方法，其中提供激發(fā)能量源包括提供從區(qū)別 能量源中衰減的輸出。14.根據(jù)第1至13中任一方面所述的方法，進(jìn)一步包括提供垂直于流動(dòng)軸并設(shè)置 在第一流徑的近端的第二流徑，使得細(xì)胞在經(jīng)過詢問區(qū)并到達(dá)第一流徑的近端后進(jìn)入第二 流徑并遠(yuǎn)離詢問區(qū)。15.根據(jù)第1至14中任一方面所述的方法，其中提供流徑進(jìn)一步包括提供由折射 率范圍在1. 30-1. 40 (含)的材料形成的流徑。16.根據(jù)第1至15中任一方面所述的方法，進(jìn)一步包括調(diào)整含細(xì)胞群的溶液的折 射率，使得溶液的折射率與形成流徑的材料的折射率相差在0. 02以內(nèi)。17. 一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的裝置，該裝置 包括流體流徑，具有具有流動(dòng)軸的第一流動(dòng)部分，和第二流動(dòng)部分，第一與第二流動(dòng)部分在第一流動(dòng)部分的測(cè)量端相交；設(shè)置在第一流動(dòng)部分的測(cè)量端或其附近的詢問區(qū)；以流體流動(dòng)的方式與流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動(dòng)的方式與流體流徑連通的樣本輸入端；具有標(biāo)稱焦點(diǎn)和光軸并設(shè)置在第一流動(dòng)部分的測(cè)量端的物鏡，該物鏡對(duì)準(zhǔn)第一流 動(dòng)部分，使標(biāo)稱焦點(diǎn)沿著流動(dòng)軸且在詢問區(qū)，并且使光軸通常與流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)；設(shè)置檢測(cè)由物鏡聚焦的光的檢測(cè)器；與檢測(cè)器通信連接的邏輯程序，可操作該邏輯程序以確定樣本細(xì)胞群中的細(xì)胞是 否屬于所需細(xì)胞亞群，并且可進(jìn)一步操作該邏輯程序以根據(jù)對(duì)細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群 的確定來輸出信號(hào)；和可控能量源，該可控能量源與邏輯程序通信連接，并且可操作該可控能量源以 根據(jù)至少由邏輯程序輸出的信號(hào)選擇性地改變所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞或不在所需細(xì)胞亞 群中的細(xì)胞。18.根據(jù)第17方面所述的裝置，其中可控能量源通過對(duì)不是確定在所需亞群中的 一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來選擇性地改變細(xì)胞。19.根據(jù)第17方面或第18方面所述的裝置，還包括激發(fā)能量源。20.根據(jù)第19方面所述的裝置，其中由激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過物鏡。21.根據(jù)第19方面或第20方面所述的裝置，其中激發(fā)能量源包括具有作為輸入端 的可控能量源的衰減器。 22.根據(jù)第17至21中任一方面所述的裝置，其中由可控能量源發(fā)出的能量穿過物
23.根據(jù)第17至22中任一方面所述的裝置，其中可控能量源包括激光器。24.根據(jù)第17至23中任一方面所述的裝置，其中可控能量源包括近紅外激光器。25.根據(jù)第17至24中任一方面所述的裝置，還包括在其中形成流徑的主體。26.根據(jù)第25方面所述的裝置，還包括在主體的第一表面形成第二流動(dòng)部分的 槽，其中第一流動(dòng)部分的測(cè)量端與該槽相交于該第一表面。27.根據(jù)第25方面所述的裝置，還包括通過主體的第一內(nèi)部通道，其從主體的第一表面延伸至主體內(nèi)的一點(diǎn)并形成第一 流動(dòng)部分；和通過主體的第二內(nèi)部通道，其從主體內(nèi)的所述點(diǎn)延伸至主體的第二表面。28.根據(jù)第25至27中任一方面所述的裝置，其中主體由折射率為1. 30-1. 40 (含) 的材料形成。29.根據(jù)第28方面所述的裝置，其中該材料包括無定形全氟聚合物、無定形氟聚 合物或全氟烷氧基聚合物。30.根據(jù)第17至29中任一方面所述的裝置，其中物鏡是水浸透鏡或者是水蘸透
^Mi ο31.根據(jù)第17至30中任一方面所述的裝置，其中樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞。32.根據(jù)第31方面所述的裝置，其中所需細(xì)胞群包括帶有X染色體的細(xì)胞或帶有 Y染色體的細(xì)胞。33. 一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的系統(tǒng)，該系統(tǒng) 包括具有流動(dòng)軸的流體流徑；設(shè)置在流體流徑內(nèi)的詢問區(qū)；以流體流動(dòng)的方式與流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動(dòng)的方式與鞘液輸入端連通的第一泵；以流體流動(dòng)的方式與流體流徑連通的樣本流體輸入端；以流體流動(dòng)的方式與樣本流體輸入端連通的第二泵；物鏡，具有標(biāo)稱焦點(diǎn)和光軸，并設(shè)置成使標(biāo)稱焦點(diǎn)沿著流動(dòng)軸并在詢問區(qū)，且使光 軸通常在詢問區(qū)與流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)；設(shè)置檢測(cè)由物鏡聚焦的光的檢測(cè)器；可控能量源；與計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)、檢測(cè)器和可控能量源通信連接的處理器；以及其中處理器和可控能量源配合，根據(jù)處理器的輸出選擇性地改變所需細(xì)胞亞群中 的細(xì)胞或不在所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞。34.根據(jù)第33方面所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步地，其中處理器和可控能量源合作，通過對(duì) 不是確定在所需細(xì)胞亞群中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來 選擇性地改變所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞。35.根據(jù)第33方面或第34方面所述的系統(tǒng)，其中由可控能量源發(fā)出的能量穿過物

36.根據(jù)第33至35中任一方面所述的系統(tǒng)，其中可控能量源包括近紅外激光器。
37.根據(jù)第33至35中任一方面所述的系統(tǒng)，還包括由折射率為1. 30-1. 40 (含) 的材料形成的主體。38.根據(jù)第33至37中任一方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞。39.根據(jù)第38方面所述的系統(tǒng)，其中所需的亞群是帶有X染色體的細(xì)胞或帶有Y 染色體的細(xì)胞。40. 一種檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的方法，該方法具體 實(shí)施為在處理器上執(zhí)行并儲(chǔ)存在有形介質(zhì)上的一套機(jī)器可讀的指令，該方法包括控制樣本細(xì)胞群通過具有流動(dòng)軸的流徑的流動(dòng)；控制照射源以對(duì)樣本細(xì)胞群中的細(xì)胞經(jīng)過的詢問區(qū)進(jìn)行照射；接收來自具有物鏡的光路上的檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，該物鏡具有光軸和標(biāo)稱焦點(diǎn)，光軸 通常與流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)，標(biāo)稱焦點(diǎn)在詢問區(qū)內(nèi)；由接收到的數(shù)據(jù)確定樣本細(xì)胞群中的一個(gè)細(xì)胞在詢問區(qū)中的存在；由接收到的數(shù)據(jù)確定該一個(gè)樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群；以及根據(jù)至少對(duì)該一個(gè)樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群的確定來控制細(xì)胞選擇能量 源。41.根據(jù)第40方面所述的方法，其中控制細(xì)胞選擇能量源包括確定該一個(gè)樣本細(xì)胞通過詢問區(qū)的流速；以及根據(jù)確定的該一個(gè)樣本細(xì)胞通過流徑的流速來控制細(xì)胞選擇能量源，由此選擇性 地照射該一個(gè)細(xì)胞。42.根據(jù)第40方面所述的方法，其中控制細(xì)胞選擇能量源包括對(duì)包含一個(gè)細(xì)胞的 液滴選擇性地施加電荷。43. 一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的系統(tǒng)，該系統(tǒng) 包括具有詢問區(qū)和詢問區(qū)中的流動(dòng)軸的流徑；控制樣本細(xì)胞群通過流徑的流動(dòng)的控制裝置；當(dāng)樣本細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)對(duì)它們進(jìn)行照射的照射裝置；具有光軸和標(biāo)稱焦點(diǎn)的物鏡，該光軸通常與流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)，該標(biāo)稱焦點(diǎn)在詢問 區(qū)內(nèi)；檢測(cè)由物鏡聚焦的能量并提供有關(guān)檢測(cè)能量數(shù)據(jù)的檢測(cè)裝置；接收有關(guān)檢測(cè)能量數(shù)據(jù)并確定經(jīng)過詢問區(qū)的個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群的 處理裝置；選擇性地照射樣本細(xì)胞的細(xì)胞選擇裝置；和根據(jù)至少對(duì)個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群的確定來控制細(xì)胞選擇裝置的細(xì)胞 選擇控制裝置。44.根據(jù)第43方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞群，且其中所需的細(xì) 胞亞群包括帶有X染色體的精細(xì)胞。45.根據(jù)第43方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞群，且其中所需的細(xì) 胞亞群包括帶有Y染色體的精細(xì)胞。46.根據(jù)第43至45中任一方面所述的系統(tǒng)，其中由細(xì)胞選擇裝置發(fā)出的能量在到達(dá)樣本細(xì)胞前穿過物鏡。47.根據(jù)第43至46中任一方面所述的系統(tǒng)，其中至少部分流徑由折射率為 1·30-1·40(含)的材料形成。48. 一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的方法，該方法 包括產(chǎn)生攜帶通常為單行前進(jìn)的樣本細(xì)胞通過流徑的流動(dòng)；當(dāng)樣本細(xì)胞在流徑中經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)照射樣本細(xì)胞；定位物鏡，使得物鏡的光軸通常與流徑同軸，
流束通過流徑向物鏡移動(dòng)，且物鏡具有在詢問區(qū)中的標(biāo)稱焦點(diǎn)；當(dāng)樣本細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)；解釋檢測(cè)到的個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)以確定個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群；根據(jù)對(duì)個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群的確定對(duì)一個(gè)或多個(gè)樣本細(xì)胞群進(jìn) 行選擇性的衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎；以及收集所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群。49.根據(jù)第48方面所述的方法其中樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞；其中所需細(xì)胞亞群包括具有X染色體的細(xì)胞或具有Y染色體的細(xì)胞；且其中當(dāng)樣本細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)包括當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū) 時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過40，000個(gè)樣本細(xì)胞的參數(shù)。50.根據(jù)第48方面所述的方法，其中當(dāng)樣本細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)個(gè)體樣本細(xì)胞 的參數(shù)包括當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過75，000個(gè)樣本細(xì)胞的參數(shù)。51.根據(jù)第48方面所述的方法，其中當(dāng)樣本細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)個(gè)體樣本細(xì)胞 的參數(shù)包括當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過100，000個(gè)樣本細(xì)胞的參數(shù)。52.根據(jù)第48至51中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細(xì)胞并不改變確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有 的所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞與未被改變的細(xì)胞總數(shù)之比大于或等于60%。53.根據(jù)第48至51中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細(xì)胞改變了確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的 所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞與被改變的細(xì)胞總數(shù)之比大于或等于60%。54.根據(jù)第48至53中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細(xì)胞并不改變確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有 的所需亞群中被改變的細(xì)胞與所需亞群中的細(xì)胞總數(shù)之比小于或等于50%。55.根據(jù)第48至53中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細(xì)胞改變了確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的 所需亞群中未被改變的細(xì)胞與所需亞群中的細(xì)胞總數(shù)之比小于或等于50%。
權(quán)利要求
1.一種從包括第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞的細(xì)胞群中選擇第一組細(xì)胞的方法，所述方法 包括對(duì)所述細(xì)胞群進(jìn)行標(biāo)記，以便可以區(qū)分所述第一組細(xì)胞與所述第二組細(xì)胞； 提供具有遠(yuǎn)端、近端、設(shè)置在所述近端與所述遠(yuǎn)端之間的詢問區(qū)、和流動(dòng)軸的第一流徑；產(chǎn)生通過所述第一流徑的鞘液的鞘流，所述鞘流以第一流速朝所述近端移動(dòng)； 在所述近端上游點(diǎn)處將包括細(xì)胞群的樣本流注入所述鞘流，所述樣本流具有低于所述 第一流速的初始第二流速；提供激發(fā)能量源，當(dāng)個(gè)體細(xì)胞經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)，由所述激發(fā)能量源發(fā)出的能量作用于個(gè) 體細(xì)胞，并引起自所述細(xì)胞發(fā)出或傳輸二次輻射；當(dāng)所述細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)，使用具有通常與所述流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)的光軸的物鏡聚 焦自所述個(gè)體細(xì)胞的二次輻射；檢測(cè)自所述個(gè)體細(xì)胞的聚焦二次輻射；由檢測(cè)的二次輻射確定所述個(gè)體細(xì)胞是在所述第一組還是在所述第二組；以及 選擇確定在所述第一組的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細(xì)胞包括對(duì)不是確定在 所述第一組的細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細(xì)胞包括 由噴嘴噴射細(xì)胞流；由所述流產(chǎn)生許多液滴；對(duì)所述液滴選擇性地施加電荷；以及根據(jù)每個(gè)液滴的電荷對(duì)所述液滴進(jìn)行分選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中由所述激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是精細(xì)胞，且進(jìn)一步地，其中所述第一組 細(xì)胞包括帶有X染色體的細(xì)胞或帶有Y染色體的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細(xì)胞包括使用區(qū)別能量 源照射不是確定在所述第一組的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中由所述區(qū)別能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括選擇所述區(qū)別能量源的波長、所述第一流速、所述第二流速和所述物鏡的組合，使得所 述物鏡的標(biāo)稱焦點(diǎn)與所述區(qū)別能量源的標(biāo)稱焦點(diǎn)隔開一定的距離，所述距離是在檢測(cè)所述 聚焦二次輻射與使用所述區(qū)別能量源照射不是確定不在所述第一組的細(xì)胞的過程之間所 述個(gè)體細(xì)胞所經(jīng)過的所述流徑的距離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括提供垂直于所述流動(dòng)軸并設(shè)置在所述第一 流徑的近端的第二流徑，使得所述細(xì)胞在經(jīng)過所述詢問區(qū)并到達(dá)所述第一流徑的近端后進(jìn) 入所述第二流徑并遠(yuǎn)離所述詢問區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中提供流徑進(jìn)一步包括提供由折射率范圍在 1. 30-1. 40 (含)的材料形成的流徑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括調(diào)整含所述細(xì)胞群的溶液的折射率，使得所述溶液的折射率與形成所述流徑的材料的折射率相差在0. 02以內(nèi)。
12.一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的裝置，所述裝置包括流體流徑，具有具有流動(dòng)軸的第一流動(dòng)部分，和第二流動(dòng)部分，所述第一與所述第二流動(dòng)部分在所述第一流動(dòng)部分的測(cè)量端相交； 設(shè)置在所述第一流動(dòng)部分的測(cè)量端或其附近的詢問區(qū)； 以流體流動(dòng)的方式與所述流體流徑連通的鞘液輸入端； 以流體流動(dòng)的方式與所述流體流徑連通的樣本輸入端；具有標(biāo)稱焦點(diǎn)和光軸并設(shè)置在所述第一流動(dòng)部分的測(cè)量端的物鏡，所述物鏡對(duì)準(zhǔn)所述 第一流動(dòng)部分，使所述標(biāo)稱焦點(diǎn)沿著所述流動(dòng)軸且在所述詢問區(qū)，并且使所述光軸通常與 所述流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)；設(shè)置檢測(cè)由所述物鏡聚焦的光的檢測(cè)器；與所述檢測(cè)器通信連接的邏輯程序，可操作所述邏輯程序以確定所述樣本細(xì)胞群中的 細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群，并且可進(jìn)一步操作所述邏輯程序以根據(jù)對(duì)所述細(xì)胞是否屬于 所需細(xì)胞亞群的確定來輸出信號(hào)；和可控能量源，所述可控能量源與所述邏輯程序通信連接，并且可操作所述可控能量源 以根據(jù)至少由所述邏輯程序輸出的信號(hào)選擇性地改變所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞或不在所需 細(xì)胞亞群中的細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述可控能量源通過對(duì)不是確定在所需亞群中 的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來選擇性地改變細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，還包括激發(fā)能量源，且其中由所述激發(fā)源發(fā)出的能 量穿過所述物鏡。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述激發(fā)能量源包括具有作為輸入端的可控能 量源的衰減器。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中由所述可控能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，還包括在其中形成所述流徑的主體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，還包括在所述主體的第一表面形成所述第二流動(dòng)部 分的槽，其中所述第一流動(dòng)部分的測(cè)量端與所述槽相交于所述第一表面。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，還包括通過所述主體的第一內(nèi)部通道，其從所述主體的第一表面延伸至所述主體內(nèi)的一點(diǎn)并 形成所述第一流動(dòng)部分；和通過所述主體的第二內(nèi)部通道，其從所述主體內(nèi)的所述點(diǎn)延伸至所述主體的第二表
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述主體由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其中所述材料包括無定形全氟聚合物、無定形氟聚 合物或全氟烷氧基聚合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述物鏡是水浸透鏡或者是水蘸透鏡。
23.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞，且其中所需細(xì)胞 群包括帶有X染色體的細(xì)胞或帶有Y染色體的細(xì)胞。
24.一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括具有流動(dòng)軸的流體流徑；設(shè)置在所述流體流徑內(nèi)的詢問區(qū)；以流體流動(dòng)的方式與所述流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動(dòng)的方式與所述鞘液輸入端連通的第一泵；以流體流動(dòng)的方式與所述流體流徑連通的樣本流體輸入端；以流體流動(dòng)的方式與所述樣本流體輸入端連通的第二泵；物鏡，具有標(biāo)稱焦點(diǎn)和光軸，并設(shè)置成使所述標(biāo)稱焦點(diǎn)沿著所述流動(dòng)軸并在所述詢問 區(qū)，且使所述光軸通常在所述詢問區(qū)與所述流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)； 設(shè)置檢測(cè)由所述物鏡聚焦的光的檢測(cè)器； 可控能量源；與計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)、所述檢測(cè)器和所述可控能量源通信連接的處理器；且 其中所述處理器和所述可控能量源配合，根據(jù)所述處理器的輸出選擇性地改變所需細(xì) 胞亞群中的細(xì)胞或不在所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步地，其中所述處理器和所述可控能量源合作， 通過對(duì)不是確定在所需細(xì)胞亞群中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或 破碎來選擇性地改變所需細(xì)胞亞群中的細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的系統(tǒng)，其中由所述可控能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的系統(tǒng)，還包括由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成的主體。
28.根據(jù)權(quán)利要求M所述的系統(tǒng)，其中所述樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞，且其中所需亞群 是帶有X染色體的細(xì)胞或帶有Y染色體的細(xì)胞。
29.一種檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的方法，所述方法具體實(shí) 施為在處理器上執(zhí)行并儲(chǔ)存在有形介質(zhì)上的一套機(jī)器可讀的指令，所述方法包括控制樣本細(xì)胞群通過具有流動(dòng)軸的流徑的流動(dòng)； 控制照射源以對(duì)樣本細(xì)胞群中的細(xì)胞經(jīng)過的詢問區(qū)進(jìn)行照射； 接收來自具有物鏡的光路上的檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，所述物鏡具有光軸和標(biāo)稱焦點(diǎn)，所述光 軸通常與所述流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)，所述標(biāo)稱焦點(diǎn)在所述詢問區(qū)內(nèi)；由接收到的數(shù)據(jù)確定所述樣本細(xì)胞群中的一個(gè)細(xì)胞在所述詢問區(qū)中的存在； 由接收到的數(shù)據(jù)確定所述一個(gè)樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群；以及 根據(jù)至少對(duì)所述一個(gè)樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群的確定來控制細(xì)胞選擇能量源。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中控制所述細(xì)胞選擇能量源包括 確定所述一個(gè)樣本細(xì)胞通過所述詢問區(qū)的流速；以及根據(jù)確定的所述一個(gè)樣本細(xì)胞通過所述流徑的流速來控制所述細(xì)胞選擇能量源，由此 選擇性地照射所述一個(gè)細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中控制所述細(xì)胞選擇能量源包括對(duì)包含一個(gè)細(xì)胞 的液滴選擇性地施加電荷。
32.一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括具有詢問區(qū)和所述詢問區(qū)中的流動(dòng)軸的流徑； 控制所述樣本細(xì)胞群通過所述流徑的流動(dòng)的控制裝置； 當(dāng)所述樣本細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)對(duì)它們進(jìn)行照射的照射裝置； 具有光軸和標(biāo)稱焦點(diǎn)的物鏡，所述光軸通常與所述流動(dòng)軸同軸對(duì)準(zhǔn)，所述標(biāo)稱焦點(diǎn)在 所述詢問區(qū)內(nèi)；檢測(cè)由所述物鏡聚焦的能量并提供有關(guān)檢測(cè)能量數(shù)據(jù)的檢測(cè)裝置； 接收有關(guān)檢測(cè)能量數(shù)據(jù)并確定經(jīng)過所述詢問區(qū)的個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群的 處理裝置；選擇性地照射所述樣本細(xì)胞的細(xì)胞選擇裝置；和根據(jù)至少對(duì)所述個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群的確定來控制所述細(xì)胞選擇裝置的 細(xì)胞選擇控制裝置。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其中所述樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞群，且其中所需的 細(xì)胞亞群包括帶有X染色體的精細(xì)胞；或 帶有Y染色體的精細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其中由所述細(xì)胞選擇裝置發(fā)出的能量在到達(dá)所述樣 本細(xì)胞前穿過所述物鏡。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其中至少部分所述流徑由折射率為1.30-1.40(含) 的材料形成。
36.一種用于檢測(cè)和選擇性地改變樣本細(xì)胞群中的所需細(xì)胞亞群的方法，所述方法包括產(chǎn)生攜帶通常為單行前進(jìn)的樣本細(xì)胞通過流徑的流動(dòng)； 當(dāng)所述樣本細(xì)胞在所述流徑中經(jīng)過詢問區(qū)時(shí)照射所述樣本細(xì)胞； 定位物鏡，使得所述物鏡的光軸通常與所述流徑同軸，流束通過所述流徑向所述物鏡移動(dòng)，且所述物 鏡具有在所述詢問區(qū)中的標(biāo)稱焦點(diǎn)；當(dāng)所述樣本細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)；解釋檢測(cè)到的所述個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)以確定所述個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需亞群；根據(jù)對(duì)所述個(gè)體樣本細(xì)胞是否屬于所需細(xì)胞亞群的確定對(duì)一個(gè)或多個(gè)所述樣本細(xì)胞 群進(jìn)行選擇性的衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎；以及 收集所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法 其中所述樣本細(xì)胞群包括精細(xì)胞；其中所需細(xì)胞亞群包括具有X染色體的細(xì)胞或具有Y染色體的細(xì)胞；且其中當(dāng)所述樣本細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)所述個(gè)體樣本細(xì)胞的參數(shù)包括當(dāng)所述細(xì) 胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過40，000個(gè)樣本細(xì)胞的參數(shù)。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中當(dāng)所述樣本細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)所述個(gè) 體樣本細(xì)胞的參數(shù)包括當(dāng)所述細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過75，000個(gè)樣本細(xì)胞 的參數(shù)。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中當(dāng)所述樣本細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)檢測(cè)所述個(gè) 體樣本細(xì)胞的參數(shù)包括當(dāng)所述細(xì)胞經(jīng)過所述詢問區(qū)時(shí)每秒鐘檢測(cè)超過100，000個(gè)樣本細(xì) 胞的參數(shù)。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細(xì)胞并不改變確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的所需細(xì) 胞亞群中的細(xì)胞與未被改變的細(xì)胞總數(shù)之比大于或等于60%。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細(xì)胞改變了確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的所需細(xì)胞 亞群中的細(xì)胞與被改變的細(xì)胞總數(shù)之比大于或等于60%。
42.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細(xì)胞并不改變確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的所需亞 群中被改變的細(xì)胞與所需亞群中的細(xì)胞總數(shù)之比小于或等于50%。
43.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細(xì)胞改變了確定在所需亞群中的細(xì)胞，且其中所得到的經(jīng)處理的細(xì)胞群具有的所需亞群 中未被改變的細(xì)胞與所需亞群中的細(xì)胞總數(shù)之比小于或等于50%。
全文摘要
用于分選流式細(xì)胞儀的方法、裝置和系統(tǒng)，包括物鏡，所述物鏡具有在焦點(diǎn)處與流徑同軸對(duì)準(zhǔn)的光軸。可控能量源根據(jù)對(duì)分析物是否在所需亞群的確定選擇性地改變分析物。在各實(shí)施例中，由可控能量源發(fā)出的光和/或由照射能量源發(fā)出的光中之一或二者穿過物鏡。在由可控能量源發(fā)出的光穿過物鏡的一些實(shí)施例中，物鏡可以在與分析物的檢測(cè)信號(hào)的焦點(diǎn)不同的點(diǎn)、特別是在靠近物鏡的點(diǎn)處聚焦由可控能量源發(fā)出的光。
文檔編號(hào)G01N33/483GK102119212SQ200980131133
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者M·盧舍爾 申請(qǐng)人:邁克必斯生物系統(tǒng)公司