專利名稱：用于篩選抑制神經(jīng)變性的化合物的方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及篩選抑制神經(jīng)元變性的化合物的方法。更具體的說，該方法涉及 篩選在神經(jīng)元變性的觸發(fā)性事件后抑制APP自神經(jīng)元脫落的化合物。
背景技術：
本領域已經(jīng)鑒定了屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多種配體和受體。在這些配 體中有腫瘤壞死因子-α ( “ TNF-α ”)、腫瘤壞死因子-β ( “ TNF-β ”或“淋巴毒素-α，，)、 淋巴毒素- β ("LT-β ”)、CD30 配體、CD27 配體、CD40 配體、0X-40 配體、4-1BB 配體、LIGHT、 Apo-I配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL)、Apo-3 配體(也稱作TTOAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)和TALL-I (也 稱作 BlyS, BAFF 或 THANK)(參見例如 Ashkenazi, Nature Review, 2 :420-430(2002)； Ashkenaziand Dixit, Science,281 1305-1308 (1998) ；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. CellBiol. ,11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr. Biol.，7 :750-753(1997) ；ffallach, Cytokine Reference, Academic Press,2000, pages 377-411 ；Locksley 等，Cell,104 487-501(2001) ；Gruss and Dower, Blood, 85 :3378-3404(1995) ；Schmid 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 1881 (1986) ；Dealtry 等，Eur. J. Immunol.，17 :689 (1987) ；Pitti 等， J. Biol. Chem. ,271 :12687-12690(1996) ；Wiley 等，Immunity，3 :673-682(1995) ；Browning 等，Cell, 72 :847-856(1993) ；Armitage 等，Nature, 357 :80-82(1992) ；WO 97/01633，公開 于 1997 年 1 月 16 日；W097/25428,公開于 1997 年 7 月 17 日；Marsters 等，Curr. 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Opin.Cell Biol. ，11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr.Biol. ,7 :750-753 (1997)； ffallach, Cytokine Reference, Academic Press,2000, pages 377-411 ；Locksley 等， Cell,104 :487-501(2001) ；Gruss and Dower, Blood,85 :3378-3404(1995) ；Hohman 等， J. Biol. Chem. ,264 :14927-14934(1989) ；Brockhaus 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :3127-3131 (1990) ；EP 417，563，公開于 1991 年 3 月 20 日；Loetscher 等，Cell,61 351(1990) ；Schall 等，Cell, 61 :361(1990) ；Smith 等，Science，248 1019-1023 (1990)； Lewis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :2830-2834 (1991) ；Goodwin 等，Mol. Cell. Biol., 11 :3020-3026(1991) ；Stamenkovic 等，EMBO J.，8 :1403-1410(1989) ；Mallett 等，EMBO J.，9 :1063-1068(1990) ；Anderson 等，Nature, 390 :175-179(1997) ；Chicheportiche 等， J. Biol. Chem.，272 :32401-32410(1997) ；Pan 等，Science，276 :111-113 (1997) ；Pan 等， Science,277 :815-818(1997) ；Sheridan 等，Science,277 :818-821(1997) ；Degli-Esposti 等，J. Exp. Med.，186 :1165-1170(1997) ；Marsters 等，Curr. 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Exp. Med. , 194 1441-1448 (2001)) 0 還報道了在體外對DR6的靶向破壞導致增強的T輔助細胞2( 分化(aiao等，見上文)。 DR6拮抗劑或拮抗劑在調(diào)控B細胞介導的疾患中的各種用途記載于2005年3月31日公布 的US 2005/0069540. DR6受體可能在調(diào)節(jié)OVA誘導的小鼠哮喘模型中的氣道炎癥中發(fā)揮 作用(Venkataraman 等，Immunol. Lett.，106 :42-47 (2006))。使用髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(M0G(35-55))誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓 炎模型，發(fā)現(xiàn)與野生型(WT)同窩出生者相比，DR6-/-小鼠對CNS疾病的發(fā)作和進展二者高度有抗性。如此，DR6可能涉及調(diào)節(jié)實驗性自身免疫性腦脊髓炎的誘導和進展中的白細胞 浸潤和功能(Schmidt 等，J. Immunol.，175 :2286_2四2 (2005))。雖然已經(jīng)鑒定了多個TNF配體和受體家族成員具有各式各樣的生物學活性和特 性，但是很少的此類配體和受體有報道涉及神經(jīng)學相關功能。例如，2004年8月沈日公布 的102004/0715 記載了在鼠模型中抑制⑶95 (Fas)配體/受體復合物來治療脊髓損傷。發(fā)明概述在本發(fā)明的實施方案中，提供了分離的死亡受體6( “DR6”)拮抗劑。本文中所公 開的拮抗劑的某些實施方案抑制或阻斷DR6與一種或多種其關聯(lián)配體之間的相互作用。在 優(yōu)選的實施方案中，本文中所公開的DR6拮抗劑抑制或阻斷DR6與其關聯(lián)配體淀粉狀蛋白 前體蛋白(amyloid precursor protein，“APP”)之間的相互作用。DR6拮抗劑的實施方 案可包括抗體，諸如DR6或APP抗體。此類DR6拮抗性抗體可以是例如單克隆抗體、嵌合 抗體、人源化抗體、或人抗體。在本發(fā)明的某些實施方案中，DR6拮抗劑可包括抗DR6抗體， 其結(jié)合DR6胞外結(jié)構(gòu)域多肽或其片段，且任選可結(jié)合包含圖IA氨基酸1-349或42-349的 DR6多肽。或者，DR6拮抗劑可包括抗APP抗體，其結(jié)合APP多肽，且任選的是可結(jié)合包含圖 IB (SEQ ID NO 6)氨基酸 66-81 的 APP 多肽。DR6拮抗劑還包括DR6免疫粘附素、DR6變體、DR6片段、其共價修飾形式、或其融合 蛋白，以及小分子拮抗劑。舉例而言，DR6拮抗劑可包括PEG化DR6或融合至異源序列(諸 如表位標簽、抗體片段(諸如人Fe)、或亮氨酸拉鏈)的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域形式DR6。本發(fā)明的例示性實施方案還包括抑制或阻斷DR6對APP的結(jié)合的方法，包括在DR6 對APP的結(jié)合受到抑制的條件下將DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6拮抗劑。 在此類方法中所使用的典型DR6拮抗劑包括結(jié)合DR6或APP的抗體，以及可溶性DR6多肽。 任選的是，通過觀察抑制DR6與APP之間的結(jié)合的能力來選擇這些方法中所使用的DR6拮 抗劑。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用此類方法來例如在體外組織培養(yǎng)中抑制神經(jīng)元細 胞的凋亡和/或增強神經(jīng)元細胞的生長和/或存活。所述方法涵蓋使用單一類型的DR6拮 抗劑分子或兩種或更多類型的DR6拮抗劑的組合。本發(fā)明的實施方案還提供了用于增強哺乳動物中的神經(jīng)元細胞或組織的生長或 再生或存活的方法，包括對哺乳動物施用有效量的DR6拮抗劑。在任選的實施方案中，DR6 拮抗劑的施用在所述哺乳動物中增強神經(jīng)元細胞或組織的生長并阻斷神經(jīng)元細胞或組織 的細胞死亡和變性(degeneration)。神經(jīng)元細胞或組織可包括例如運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng) 元、連合神經(jīng)元(commissuralneuron)、軸突、小膠質(zhì)、和/或少突膠質(zhì)細胞。在本發(fā)明的有 些實施方案中，此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力 的抗體。在本發(fā)明的其它實施方案中，此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合DR6并 抑制其結(jié)合APP的能力的抗體?；蛘撸珼R6拮抗劑可包括DR6免疫粘附素、連接至非蛋白質(zhì) 性質(zhì)聚合物(其選自下組聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯(polyoxyalkylene))的DR6多 肽、或DR6多肽變體。所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū) 的可溶性DR6受體。另外，本發(fā)明的DR6拮抗劑可包括小分子。本發(fā)明的實施方案還提供了用于治療神經(jīng)學病癥的方法，包括對哺乳動物施用有 效量的DR6拮抗劑。在任選的實施方案中，所述方法包括治療哺乳動物中的阿耳茨海默氏 病。此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力的抗體。DR6拮抗劑還可包括DR6抗體?；蛘?，DR6拮抗劑可包括DR6免疫粘附素、連接至非蛋白質(zhì)性質(zhì) 聚合物(其選自下組聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、DR6抗體或DR6變體。 所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū)的可溶性DR6受體。所 述方法中所采用的抗DR6抗體可結(jié)合包含圖IA氨基酸1-349或42-349的DR6受體。本發(fā)明的實施方案還包括用于診斷患有神經(jīng)學病癥的或?qū)ι窠?jīng)學病癥易感的患 者的方法，包括自所述患者獲取樣品并對所述樣品測試具有與SEQID NO :1之DR6多肽序列 不同的多肽序列的DR6多肽變體的存在。典型的是，在此類方法中，所述多肽變體被鑒定為 具有與對SEQ ID NO 1之DR6多肽序列觀察到的親和力不同的對APP多肽的親和力。本發(fā)明的實施方案還提供了用于鑒定抑制DR6對APP的結(jié)合的感興趣分子的方 法。此類方法可包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP ；然后檢測在存 在所述感興趣分子的情況中對DR6結(jié)合APP的抑制。任選的是，使用在細胞表面上表達DR6 的哺乳動物細胞實施此類方法；并進一步包括檢測對DR6活化或信號傳導的抑制。本發(fā)明 的實施方案進一步包括通過此類方法鑒定的分子。任選的是，感興趣分子是結(jié)合APP的抗 體、結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽。本發(fā)明的實施方案還提供了能夠特異性結(jié)合APP配體、DR6受體和/或能夠調(diào)控與 DR6和/或其配體和/或共受體(co-receptor)有關的生物學活性、且在各種神經(jīng)學病癥 的治療中有用的抗體。在具體的實施方案中，提供了特異性結(jié)合DR6多肽的胞外結(jié)構(gòu)域序 列的抗體(在下文實施例中有進一步描述)。典型的抗體是那些結(jié)合APP或DR6且對抑制 DR6與APP之間的結(jié)合的能力進行了進一步選擇的。任選的是，所述抗體是單克隆抗體。任 選的是，所述單克隆抗體包括由分別以編號PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC 的雜交瘤分泌的3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或1Ε5. 5. 7抗體。還提供了結(jié)合與分別以ATCC編號PTA-8095、ΡΤΑ-8094、或ΡΤΑ-8096保藏的雜交 瘤細胞系生成的3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7單克隆抗體所結(jié)合表位相同的表位的抗體。 一方面，本發(fā)明關注顯示至少具有與抗體3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7相同的對DR6的親 和力和/或展現(xiàn)出至少具有與抗體3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7相同的生物學活性和/或 效力的抗DR6抗體，包括3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或1Ε5. 5. 7抗體。在其它具體的實施方案中，提供了生成單克隆抗體3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7 且分別以編號PTA-8095、ΡΤΑ-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的雜交瘤細胞系，及由分別以 編號PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的雜交瘤分泌的單克隆抗體3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7、或 1E5. 5. 7。還提供了分離的抗DR6單克隆抗體，包括結(jié)合DR6多肽且競爭性抑制由分別以 ATCC編號PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤生成的單克隆抗體結(jié)合所述DR6 多肽的抗體。還提供了嵌合的或人源化的抗DR6抗體，其特異性結(jié)合DR6多肽且包含(a) 自由分另U以編號PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC雜交瘤分泌的3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7、或1E5. 5. 7抗體衍生的序列。任選的是，此類抗體可包含自3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或 1Ε5. 5. 7抗體衍生的重鏈、輕鏈或可變區(qū)。又一方面，本發(fā)明關注編碼本文抗DR6抗體或抗體片段的分離的核酸分子、包含 此類核酸分子的載體、包含此類核酸分子的宿主細胞、和用于生產(chǎn)本文抗體和抗體片段的 方法。
7
本發(fā)明進一步涉及包含本文中所定義的DR6拮抗劑和載體的組合物。所述載體可 以是藥學可接受載體，而且組合物可進一步包含別的藥劑。另一方面，本發(fā)明關注制品，其包括容器和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其中所述組 合物包含本發(fā)明的DR6拮抗劑。所述制品可進一步包括關于在體外或在體內(nèi)使用DR6拮抗 劑的說明。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述說明關注神經(jīng)學病癥的治療。在一個相關方面，本發(fā)明的實施方案包括試劑盒，其包括第一容器、所述容器上的 標簽、和裝在所述容器內(nèi)的組合物。在此類試劑盒中，所述組合物包含有效抑制至少一種類 型的哺乳動物神經(jīng)元細胞中的凋亡的DR6拮抗劑，所述容器上的所述標簽或包括在所述容 器中的包裝插頁指示所述組合物可用于抑制至少一種類型的哺乳動物神經(jīng)元細胞中的凋 亡。任選的是，所述試劑盒還包括別的部件(element)，諸如裝有藥學可接受緩沖劑的第二 容器；和/或關于使用所述DR6拮抗劑來抑制至少一種類型的哺乳動物神經(jīng)元細胞中的凋 亡的說明。本發(fā)明進一步提供了本文所述DR6拮抗劑和組合物用于制備或制造藥物的用途， 所述藥物用于治療哺乳動物中的神經(jīng)學病癥，包括用于治療阿耳茨海默氏病。本發(fā)明還提供一種用于篩選抑制神經(jīng)元變性的化合物的方法，其中將候選化合物 添加至基于細胞的測定法，其中存在神經(jīng)元變性的觸發(fā)性事件，其在正常情況中會導致APP 自神經(jīng)元表面脫落。如果在候選化合物存在下沒有觀察到脫落，那么該候選化合物是神經(jīng) 元變性的抑制劑，而且可用作神經(jīng)學疾病和病癥諸如但不限于阿爾茨海默氏病及與損傷有 關的變性(degeneration，退化)的療法。附圖簡述圖IA顯示了人DR6 cDNA的核苷酸序列(

圖1A_1，SEQ ID NO 2)、其推導氨基酸序 列(圖1A-2，SEQ ID NO 1)以及其結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)的示意圖(圖1A-3)。在DR6示意圖中， 指示了結(jié)構(gòu)域邊界，包括推定的信號肽、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基序、跨膜結(jié)構(gòu)域和死亡結(jié) 構(gòu)域。在此示意圖中，指示了推定的信號肽、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基序、跨膜結(jié)構(gòu)域、和死 亡結(jié)構(gòu)域的推定結(jié)構(gòu)域邊界。圖IB顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的695同等型的 cDNA的核苷酸序列(圖IB-I，SEQ ID NO 5)及其推導氨基酸序列(圖1B-2，SEQ ID NO 6)。圖IC顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白的751同等型的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。圖 ID顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的770同等型的cDNA的核苷酸序列(圖1D_1，SEQ ID NO 8)及其推導氨基酸序列(圖 1D-2，SEQ ID NO 9)。參見例如 UniProtKB/Swiss-prot 條目P05067及相關公開內(nèi)容，包括分別涉及同等型ID P05067-1、同等型ID P05067-4和同 等型 IDP05067-8 的(http //expasy. org/uniprot/P05067)。圖2A顯示了在發(fā)育階段E10. 5-E12. 5，DR6在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中強表達，包 括脊髓的運動和連合神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。圖2B顯示了在軸突和細胞主體上表達 的DR6蛋白。圖2C顯示了在分化中的神經(jīng)元中表達的DR6 mRNA。圖3顯示了背側(cè)脊髓外植體存活測定法中軸突變性和神經(jīng)元細胞死亡的示意圖； 指示了通過電穿孔將RNA干擾siRNA劑與表達GFP的質(zhì)粒一起導入胚胎連合神經(jīng)元中。圖4A圖示了在背側(cè)脊髓存活測定法中小干擾RNA對DR6表達的抑制阻斷連合軸 突變性(commissural axon degeneration)并阻止神經(jīng)元細胞死亡。圖4B顯示了 RNAi抗 性DR6 cDNA挽救被DR6 siRNA所阻斷的變性表型。
圖5顯示了在背側(cè)脊髓存活測定法中拮抗性DR6抗體幫助阻斷軸突變性和神經(jīng)元 細胞死亡。圖6提供了神經(jīng)元的機制示意圖和照片，顯示了在外植體存活測定法中由c-Jim N-末端激酶(JNK)的藥理學抑制作用引起的DR6下游胞內(nèi)信號傳導的下調(diào)阻止軸突變性和 神經(jīng)元細胞死亡。圖7顯示了在離體(ex vivo)全胚胎培養(yǎng)物中拮抗性DR6抗體對脊髓運動和中間 神經(jīng)元(interneuron)的存活的神經(jīng)保護性效果。圖8提供了用經(jīng)過切割的胱天蛋白酶-3抗體免疫染色的E15. 5脊髓頸段切片的 照片，以顯示DR6的丟失導致DR6缺無胚胎的脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元細胞死亡的降低。圖9A顯示了來自表達經(jīng)過切割的胱天蛋白酶-3的E15. 5 DR6 KO胚胎的神經(jīng)元 細胞的定量，其展示DR6缺無胚胎中的神經(jīng)元細胞死亡與DR6+/-同窩出生者對照(DR6雜 合)相比降低大約50%。圖9B提供了細胞的照片，顯示了 DR6是運動軸突變性所需要的， 正如在存在和不存在神經(jīng)營養(yǎng)性生長因子的情況中正常和DR6敲除小鼠的比較所證實的。 圖9C提供了細胞的照片，顯示了損傷誘發(fā)的軸突變性在DR6敲除小鼠中被延遲了。圖IOA提供了神經(jīng)元的照片，顯示了抗DR6抗體抑制各種營養(yǎng)因子被剝奪的神經(jīng) 元中由于神經(jīng)因子(NGF)供應斷絕所導致的軸突變性。圖IOB提供了來自連合、感覺和運 動神經(jīng)元中凋亡細胞主體的TUNEL染色顯像的進一步照片數(shù)據(jù)，其顯示了抗DR6抗體抑制 各式各樣的營養(yǎng)因子被剝奪的神經(jīng)元的變性。圖IlA提供了連合神經(jīng)元的照片，顯示了 DR6-FC能延遲連合軸突變性。圖IlB提 供了感覺神經(jīng)元的照片，顯示了 DR6-Fc能延遲由NGF供應斷絕誘發(fā)的感覺軸突變性。圖12A提供了神經(jīng)元的照片，使用DR6-AP顯示了軸突上的DR6結(jié)合位點。圖12B 提供了在存在和不存在NGF的情況中的神經(jīng)元的照片，顯示了在NGF剝奪后DR6配體結(jié)合 位點自軸突丟失。圖12C提供了處于發(fā)育階段E12. 5的BAX缺無感覺軸突的研究的照片， 顯示了 分泌酶(BACE)抑制劑能阻斷NGF供應斷絕后DR6-AP結(jié)合位點自感覺軸突的消 失。圖13Α提供了自多種Western印跡規(guī)程得到的數(shù)據(jù)的照片，其中用DR6-AP (左上) 或抗N-APP抗體(右上)探查來自神經(jīng)元細胞的多肽，以及如下的多肽(1)因其結(jié)合DR6 的能力而選擇的；和然后的( 用抗N-APP抗體探查的(下面的，“DR6-ECD下拉”)。此數(shù)據(jù) 將淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)鑒定為DR6胞外域結(jié)合配體。圖1 提供了自多種印跡實驗 得到的數(shù)據(jù)的照片，其容許顯現(xiàn)用DR6-AP探查的軸突條件培養(yǎng)基中的DR6配體(包括APP 多肽)。此印跡數(shù)據(jù)鑒定了許多APP多肽，包括位于35kDa的N-末端APP以及C99-APP和 C83/C89APP 多肽。圖14A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了 APP胞外域在NGF剝奪后不久脫落。圖14B 提供了細胞的照片，顯示了 DR6胞外域結(jié)合培養(yǎng)細胞所生成的APP。圖14C提供了細胞的照 片，顯示了 DR6是感覺軸突上的N-APP主要受體，而且APP結(jié)合位點在DR6缺無小鼠的神經(jīng) 元細胞中被顯著消減。圖14D提供了細胞的照片，顯示了 DR6功能阻斷性抗體破壞DR6胞 外域與N-APP之間的相互作用。圖15A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了在連合軸突測定法中針對N-末端APP的多克 隆抗體阻斷軸突變性。圖15B提供了神經(jīng)元的照片，顯示了診斷N-末端APP的多克隆抗體以及22C11抗APP單克隆抗體抑制由NGF消除誘導的局部軸突變性。圖15C提供了神經(jīng)元 的照片，顯示了添加N-APP能挽救被β-分泌酶(BACE)活性的抑制作用所阻斷的軸突變 性。圖15D提供了神經(jīng)元的照片，顯示了通過RNAi實現(xiàn)的APP消除使神經(jīng)元細胞對N-APP 誘導的死亡敏感化。圖16Α提供了神經(jīng)元的照片，顯示了 DR6功能是N-APP誘導的軸突變性所需要的， 但不是Αβ (Abeta)觸發(fā)的變性所需要的。圖16Β提供了神經(jīng)元的照片，顯示了功能阻斷性 01 6抗體未能阻斷4 0觸發(fā)的軸突變性。圖17Α提供了神經(jīng)元的照片，顯示了對JNK和上游胱天蛋白酶-8的抑制延遲了軸 突變性，但是下游胱天蛋白酶-3則不然。圖17Β提供了來自Ε12.5外植體培養(yǎng)物的運動神 經(jīng)元的照片，顯示了胱天蛋白酶-3在細胞主體中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮 功能。圖17C提供了感覺神經(jīng)元的照片，顯示了雖然胱天蛋白酶-3不是軸突變性所需要的， 但是BAX是所需要的。圖17D提供了連合神經(jīng)元的照片，顯示了胱天蛋白酶-3在細胞主體 中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮功能。發(fā)明詳述本文中描述或提到的技術和規(guī)程一般得到了本領域技術人員的充分理解，而且通 常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如廣泛應用的分子克隆方法，記載于Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual第 2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y0適當時，涉及使用市售試劑盒和試劑的規(guī)程一般依照制 造商規(guī)定的方案和/或參數(shù)進行，除非另有說明。在描述本發(fā)明的方法和測定法之前，應當理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、 方案、細胞系、動物種或?qū)?、?gòu)建物和試劑，因為它們當然可以有所變化。還應當理解本文中 所使用的術語只是為了描述具體實施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，只有所附權(quán)利要 求才對本發(fā)明范圍進行了限制。必須注意的是，在用于本文及所附權(quán)利要求時，單數(shù)形式“一個/種”、“該”和“所 述”等包括復數(shù)所指物，除非另有明確規(guī)定。如此，例如，提到“一處遺傳改變”包括多處此 類改變，提到“一種探針”包括一種或多種探針及其本領域技術人員知道的等效物，諸如此 類。說明書和相關權(quán)利要求中所述所有數(shù)值(例如氨基酸22-81、1-3Μ等)理解為以術語 “約”修飾。將本文中提到的所有出版物收入本文作為參考，以披露和描述與所引用出版物有 關的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因為它們是在本申請的提交日之前公 開的。本文中的任何文字都不應解釋為承認本發(fā)明的發(fā)明人沒有資格憑借更早的優(yōu)先權(quán)日 或在先發(fā)明日而早于所述出版物。此外，實際發(fā)表日可能與所顯示的有所不同，需要獨立查 證。I.定義術語“淀粉狀蛋白前體蛋白”或“APP”包括由APP前mRNA所編碼的多種多肽同等 型(isoform)，例如圖1B-1D分別顯示APP695、APP751和App770同等型(自APP前mRNA的 可變剪接轉(zhuǎn)錄物翻譯得到的同等型)，以及APP同等型的翻譯后加工部分。正如本領域已知 的，自APP基因轉(zhuǎn)錄得到的APP前mRNA經(jīng)歷外顯子可變剪接以產(chǎn)生多種同等型(參見例如 Sandbrink 等，AnnNY Acad. Sci. 777 :281-287(1996)；及與 PubMed NCBI 蛋白編號 P05067有關的信息)。此可變外顯子剪接產(chǎn)生695、751、和770個氨基酸的三種主要同等型(參 見例如 Kang 等，Nature 325:733-736(1987) ；Kitaguchi 等，Nature 331:530-532(1988)； Ponte 等，Nature 331 :525-527(1988)；及 Tanzi 等，Nature 331 :528-532 (1988)) 這些 同等型中的兩種(App751和APP77tl)包含56個殘基的插入物，其與Kunitz家族的絲氨酸蛋白 酶抑制物(KPI)高度同源且遍在表達。相反，缺乏KPI基序的較短同等型APP695主要在神 經(jīng)系統(tǒng)中(例如在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中)表達，而且為此常常稱作“神經(jīng)元APP”(參 見例如 Tanzi 等，Science 235 :880-884(1988) ；Neve 等，Neuron 1 :669-677(1988)；及 Haas 等，J. Neurosci. 11 :3783-3793(1991))。APP 各同等型(包括 695、751 和 770)經(jīng)歷 重大翻譯后加工事件(參見例如Esch等，1990 Science 248 :1122-1124 ;Sisodia等，1990 Science 248 :492-495)。例如，每一種這些同等型受到多種分泌酶和/或分泌酶復合物的 切割，該事件產(chǎn)生APP片段，包括包含APP胞外域的N-末端分泌多肽(sAPP α和SAPP β )。 由α -分泌酶或β -分泌酶進行的切割分別導致可溶性N-末端APP多肽sAPP α和sAPP β 的產(chǎn)生和胞外釋放，及相應膜錨定的C-末端片段C83和C99的保留。γ -分泌酶對C83的 后續(xù)加工產(chǎn)生Ρ3多肽。這是主要的分泌途徑，而且是不產(chǎn)生淀粉狀蛋白的。或者，早老蛋 白/呆蛋白(presenilin/nicastrin)介導的Y -分泌酶對C99的加工釋放淀粉狀蛋白β 多肽、淀粉狀蛋白-β 40(Αβ 40)和淀粉狀蛋白-β 42(Αβ 42)，即淀粉狀蛋白斑塊的主要成 分，及細胞毒性C-末端片段γ-CTF (50)、γ-CTF (57)和Y-CTF (59)。有證據(jù)提示每種切割 事件的相對重要性取決于細胞類型。例如，非神經(jīng)元細胞優(yōu)先由α-分泌酶途徑加工ΑΡΡ， 其在Αβ序列內(nèi)切割ΑΡΡ，由此排除Αβ的形成(參見例如hch等，1990 Science 248 1122-1124 ;Sisodia 等，1990 Science 248:492-495)。相反，神經(jīng)元細胞由 β -分泌酶途 徑加工APP695的大得多的部分，這通過至少兩種酶類別的聯(lián)合活性產(chǎn)生完整A β。在神經(jīng) 元細胞中，β-分泌酶在Αβ結(jié)構(gòu)域的氨基末端切割APP695，釋放一種不同的N-末端片段 (sAPP β ) 0另外，Y-分泌酶在羧基末端的另一位點切割ΑΡΡ，產(chǎn)生長40個(Α β 40)或42 個(Αβ 42)氨基酸的 A β 種類(參見例如 Seubert 等，1993 Nature 361 :260-263 ；Suzuki 等，1994 Science 264:1336-1340 ；及 Turner 等，1996 J. Biol. Chem. 271 :8966-8970)。術語“APP”、“APP蛋白”和“APP多肽”在用于本文時涵蓋天然APP序列和APP變 體及其加工片段。這些術語涵蓋在多種哺乳動物(包括人)中表達APP。APP可以是內(nèi)源表 達的，正如在多種人組織譜系中所天然發(fā)生的，或者可以是通過重組或合成方法而表達的。 “天然序列APP”包括與衍生自自然界的APP具有相同氨基酸序列的多肽(例如695、751和 770同等型及其加工部分)。如此，天然序列APP可具有來自任何哺乳動物(包括人)的天 然存在APP的氨基酸序列。此類天然序列APP可以從自然界分離，或者可通過重組或合成 手段生成。術語“天然序列APP”明確涵蓋天然存在的加工和/或分泌形式的(例如包含例 如胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶形式)、天然存在變體形式(例如可變剪接和/或蛋白水解加工形 式)和天然存在等位變體。APP變體可包括天然序列APP的片段或刪除突變體。在本發(fā)明的實施方案中有用的APP多肽包括那些上文和如下非限制性例子中所 描述的?？梢赃x擇這些例示形式，用于本發(fā)明的各個實施方案。在本發(fā)明的有些實施方案 中，APP多肽包含全長APP同等型，諸如圖1B-1D所示APP695和/或APP751和/或APP77tl同等 型。在本發(fā)明的其它實施方案中，APP多肽包含APP的翻譯后加工形式，例如經(jīng)歷了分泌酶 (諸如α -分泌酶、β -分泌酶或 -分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，諸如sAPPa或sAPPii)。在本發(fā)明的相關實施方案中，可以選擇APP多肽，以包含一個或多 個特定結(jié)構(gòu)域，諸如N-末端胞外域(參見例如Quast等，F(xiàn)ASEB J. 2003 ；17(12) :1739-41), 肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見例如 Rossjohn 等，Nat. Struct. Biol. 1999Apr ；6 (4) :327-31)、銅 II 型(參見例如 Hesse 等，F(xiàn)EBS Letters 349(1) :109-116(1994))或 Kunitz 蛋白酶抑制劑 結(jié)構(gòu)域(參見例如Ponte等，Nature ；331 (6156) :525-7 (1988))。在本發(fā)明的有些實施方 案中，APP多肽包含觀察到包含受到本文中所公開的DR6拮抗劑(諸如抗體或DR6免疫粘 附素)識別的表位的序列，例如APP695的氨基酸22-81，一種包含單克隆抗體22C11所結(jié)合 的表位的序列(參見例如 Hilbich 等，J. Biol. Chem. 268(35) :26571-26577 (1993))。在本發(fā)明的某些實施方案中，APP多肽不包含一種或多種特定結(jié)構(gòu)域或序列，例如 不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如實施例12中公開的人重組N-APP 多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的APP多肽(例如APP695)、或不包含阿耳茨海 默氏病β淀粉狀蛋白(Abeta (Α β ))序列的APP多肽(例如sAPP β，一種不包含A β 4。禾口 / 或 Αβ42 序列的多肽)(參見例如 Bond 等，J. Struct Biol. 2003 Feb ； 141 (2) :156-70)。 在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明的實施方案中所使用的APP多肽包含一種或多種結(jié)構(gòu) 域或序列但不包含其它結(jié)構(gòu)域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其觀察到受到DR6 拮抗劑(諸如單克隆抗體22C11)結(jié)合的部分)但不包含一個或多個分泌酶切割位點C端 的結(jié)構(gòu)域或序列(諸如β淀粉狀蛋白(Α β，Abeta)序列)的APP多肽(例如sAPP α或 sAPPβ)。術語“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外域”或“ECD”指APP基本上不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu) 域的形式?？扇苄訣CD通常將具有少于的所述跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選將具有少 于0.5%的所述結(jié)構(gòu)域?？梢岳斫?，為本發(fā)明多肽鑒定的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是依照本領域常規(guī) 用于鑒定該種類型疏水結(jié)構(gòu)域的標準而鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變化，但最有 可能的是最初鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端不超過約5個氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，ECD將 由多肽不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的(而且不是膜結(jié)合的)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序 列組成。術語“ APP變體”意指如下文所定義的、與具有圖1B-1D所示氨基酸序列的人APP具 有至少約80%，優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%，更優(yōu)選至少約90%、91%、92%、 93%、94%，最優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的APP多肽，或 其可溶性片段，或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。此類變體包括例如在圖1B-1D全長或成熟序列的 N-或C-末端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基的APP多肽或者在多肽的內(nèi)部序列或結(jié)構(gòu) 域中插入或刪除一個或多個氨基酸殘基的APP多肽，包括來自其它物種的變體，但排除天 然序列APP多肽?！癉R6”或“DR6受體”包括本領域所指的其多核苷酸和多肽序列如圖1Α_1至1Α_2 所示的受體。Pan等人記載了稱作“DR6”或“TR9”的TNF受體家族成員的多核苷酸和多肽 序列(Pan等，F(xiàn)EBS Lett.，431 :351-356(1998)；還可參見美國專利6，；358，508 ；6，667，390 ； 6，919，078 ；6, 949，358)。人DR6受體是655個氨基酸的蛋白質(zhì)(見圖1A-2)，其具有推定的 信號序列(氨基酸1-41)、胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸42-349)、跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸350-369)、接 著是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸370-65 。術語“DR6受體”在用于本文時涵蓋天然序列受體和 受體變體。這些術語涵蓋在多種哺乳動物(包括人)中表達的DR6受體。DR6受體可以是內(nèi)源表達的，正如在多種人組織譜系中天然存在的，或者可以是通過重組或合成方法而表 達的?！疤烊恍蛄蠨R6受體”包括與衍生自自然界的DR6受體具有相同氨基酸序列的多肽。 如此，天然序列DR6受體可具有來自任何哺乳動物(包括人)的天然存在DR6受體的氨基 酸序列。此類天然序列DR6受體可以從自然界分離，或者可通過重組或合成手段生成。術 語“天然序列DR6受體”明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如包含例如胞外 結(jié)構(gòu)域序列的可溶形式)、天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。 受體變體可包括天然序列DR6受體的片段或刪除突變體。術語“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外域”或“ECD”指DR6受體基本上不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì) 結(jié)構(gòu)域的形式。可溶性ECD通常將具有少于的所述跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選 將具有少于0.5%的所述結(jié)構(gòu)域?？梢岳斫?，為本發(fā)明多肽鑒定的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是依照 本領域常規(guī)用于鑒定該種類型疏水結(jié)構(gòu)域的標準而鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變 化，但最有可能的是最初鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端不超過約5個氨基酸。在優(yōu)選的實施方案 中，ECD將由多肽不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的(而且不是膜結(jié)合的)可溶性胞 外結(jié)構(gòu)域序列組成。術語“DR6變體”意指如下文所定義的，與具有圖IA所示推導氨基酸序列的人 DR6具有至少約80 %，優(yōu)選至少約85%、86 %、87%、88 %、89%，更優(yōu)選至少約90 %、91 %、 92%,93%,94%,最優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的DR6多 肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。此類變體包括例如在圖IA全長或成熟序列 的N-或C-末端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基的DR6多肽或者在多肽的內(nèi)部序列或結(jié) 構(gòu)域中插入或刪除一個或多個氨基酸殘基的DR6多肽，包括來自其它物種的變體，但排除 天然序列DR6多肽。任選的是，DR6變體包括包含圖IA氨基酸1-349或42-349及至多10 處保守氨基酸替代的可溶形式DR6受體。優(yōu)選的是，此類變體起DR6拮抗劑的作用，如下文 所定義的。術語“DR6拮抗劑”以最廣義使用，包括任何在體外、原位、在體內(nèi)或回體(ex vivo) 部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6受體結(jié)合其關聯(lián)配體(優(yōu)選其關聯(lián)配體APP)，或者激 活神經(jīng)元細胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號或胞內(nèi)信號傳導途徑之能力的分子。舉例 而言，DR6拮抗劑可部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6受體激活導致神經(jīng)元細胞或組織中 凋亡或細胞死亡的神經(jīng)元細胞或組織中一種或多種胞內(nèi)信號或胞內(nèi)信號傳導途徑的能力。 DR6拮抗劑可通過多種機制來起部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6的作用，包括但不限于 通過阻斷、抑制、或中和關聯(lián)配體對DR6的結(jié)合、DR6與其關聯(lián)配體(例如APP)間復合物的 形成、DR6受體的寡聚化、DR6受體與異源共同受體間復合物的形成、關聯(lián)配體對DR6受體 /異源共同受體復合物的結(jié)合、或DR6受體、異源共同受體、及其關聯(lián)配體間復合物的形成。 DR6拮抗劑可以以直接或間接方式發(fā)揮功能。本發(fā)明所涵蓋的DR6拮抗劑包括但不限于APP 抗體、DR6抗體、免疫粘附素、DR6免疫粘附素、DR6融合蛋白、共價修飾形式DR6、DR6變體及 其融合蛋白、或高級寡聚物形式DR6 ( 二聚體、聚集體)、或同聚物或異聚物形式DR6、小分子 (諸如JNK信號傳導級聯(lián)的藥理學抑制物，包括Jim N-末端激酶JNK活性的小分子和肽抑 制物)、在信號轉(zhuǎn)導途徑中在JNK上游發(fā)揮功能的蛋白激酶MLK和MKK活性的藥理學抑制 物、JNK結(jié)合支架蛋白JIP-I的藥理學抑制物、JNK結(jié)合其底物(諸如c-Jim或AP-I轉(zhuǎn)錄 因子復合物)的藥理學抑制物、JNK介導的其底物(諸如JNK結(jié)合域(JBD)肽)和/或JNK的底物結(jié)合域的磷酸化的藥理學抑制物和/或包含JNK底物磷酸化位點的肽抑制物、阻斷 ATP結(jié)合JNK的小分子、和阻斷底物結(jié)合JNK的小分子。為了測定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體激活神經(jīng)元細胞 或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號或胞內(nèi)信號傳導途徑的能力，可實施測定法來評估DR6拮 抗劑對例如各種神經(jīng)元細胞或組織的影響(如實施例中所述)，以及在中風/腦缺血的體 內(nèi)模型、神經(jīng)變性性疾病的體內(nèi)模型(諸如帕金森氏病的小鼠模型、阿耳茨海默氏病的小 鼠模型、肌萎縮性側(cè)索硬化ALS的小鼠模型、脊髓性肌萎縮SMA的小鼠模型、局灶性和整體 性腦缺血的小鼠/大鼠模型(例如常見的頸動脈閉塞模型或大腦中動脈閉塞模型)中、或 在離體(ex vivo)全胚胎培養(yǎng)物中?？梢砸砸阎捏w外或體內(nèi)測定格式來實施各種測定 法，諸如下文描述的或如本領域已知的和文獻中記載的(參見例如McGowan等，Trends in Genetics, 22 :281-289(2006) ；Fleming 等，NeuroRx,2 :495-503(2005) ；Wong 等，Nature Neuroscience,5 =633-639 (2002)) 0用于測定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和 DR6受體激活神經(jīng)元細胞或組織中一種或多種胞內(nèi)信號或胞內(nèi)信號傳導途徑的能力的測定 法的一個實施方案包括在存在或不存在DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑(即感興趣分子)的 情況中將DR6和APP組合，然后在存在此DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑的情況中檢測對DR6 結(jié)合APP的抑制?！昂怂帷币鈭D包括任何DNA或RNA，例如組織樣品中存在的染色體、線粒體、病毒和 /或細菌核酸。術語“核酸”涵蓋雙鏈核酸分子的兩條鏈或其中之一，包括完整核酸分子的 任何片段或部分?！盎颉币庵冈诰幋a或轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)或調(diào)控其它基因表達方面具有功能性作用的任 何核酸序列或其部分?；蚩梢酝耆韶撠熅幋a功能性蛋白質(zhì)的核酸組成，或者只有部分 核酸負責編碼或表達蛋白質(zhì)。核酸序列可以在基因的外顯子、內(nèi)含子、起始或終止區(qū)、啟動 子序列、其它調(diào)控序列或獨特鄰近區(qū)中包含遺傳異常。術語“氨基酸”指所有天然存在的L-α -氨基酸。此定義意圖包括正亮氨酸、鳥氨 酸和高半胱氨酸。氨基酸通過單字母或三字母標示鑒別AspD天冬氨酸IleI異亮氨酸
ThrT蘇氨酸LeuL亮氨酸
SerS絲氨酸TyrY酪氨酸
GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸
ProP脯氨酸HisH組氨酸
GlyG甘氨酸LysK賴氨酸
AlaA丙氨酸ArgR精氨酸
CysC半胱氨酸TrpW色氨酸
ValV纈氨酸GlnQ谷氨酰胺
MetM甲硫氨酸AsnN天冬酰胺在附圖中，可采用某些其它單字母或三字母標示來指向和鑒定序列中給定位置處 的兩種或多種氨基酸或核苷酸?！胺蛛x的”，在用于描述本文中所公開的各種肽或蛋白質(zhì)時，意指已經(jīng)鑒定且與/由 其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的肽或蛋白質(zhì)。肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的污染性成分指通常會干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì) 性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將肽或蛋白質(zhì)純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀 獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或( 根據(jù)使用考馬斯藍或優(yōu)選 銀染色的非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE，達到同質(zhì)，或C3)根據(jù)質(zhì)譜或肽作圖技術， 達到同質(zhì)。既然肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的物質(zhì)包括重 組細胞內(nèi)的原位肽或蛋白質(zhì)。然而，分離的肽或蛋白質(zhì)通常通過至少一個純化步驟來制備。關于本文中所鑒定的序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定義為對比序列 并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一 性的一部分，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率?？梢砸?本領域技術范圍內(nèi)的多種方式進行序列對比以測定百分比氨基酸序列同一性。本領域技術 人員可決定測量序列對比的適宜參數(shù)，包括指派對所比較的全長序列獲得最大對比所需的 算法。為了本發(fā)明，可使用序列比較計算機程序ALIGN-2來獲得百分比氨基酸序列同一性 值，ALIGN-2程序由Genentech公司編寫，其源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán) 局(US Copyright Office，Washington，DC，20559)，并以美國版權(quán)注冊號 TXU510087 注冊。 公眾可通過Genentech公司(South San Francisco, CA)得到ALIGN-2程序。所有序列比 較參數(shù)由ALIGN-2程序設定且不變。雜交反應的“嚴格性”可以由本領域普通技術人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針 長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火， 而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中 時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同一性程度越高，可使用的相 對溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應條件更為嚴格，而較低溫度也 就較不嚴格。關于雜交反應嚴格性的其它細節(jié)和解釋，參見Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)。“高嚴格性條件”，如本文中所定義的，通過如下各項定義(1)采用低離子強度和 高溫進行清洗；0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 十二烷基硫酸鈉，于50°C ； (2)在 雜交過程中采用變性劑；50% (ν/ν)甲酰胺及0. 牛血清清蛋白/0. l%Ficoll/0. 聚 乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42°C ；或(3) 采用 50% 甲酰胺，5x SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 檸檬酸鈉)，50mM 磷酸鈉(pH 6. 8)，0.1%焦 磷酸鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA (50 μ g/ml)，0. SDSjP 10%硫酸右 旋糖苷，于42 °C，及于42 °C在0. h SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50 %甲酰胺中于55 °C清洗， 接著于55°C在含EDTA的0. Ix SSC中進行高嚴格性清洗。“中等嚴格條件，，可以如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A LaboratoryManual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989)中所述鑒定，包括于 37°C在含 20% 甲酰胺， 5x SSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(pH 7. 6)，5x Denhardt 氏溶液，10% 硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著于約37_50°C在 Ix SSC中清洗濾膜。技術人員將認識到如何在必要時調(diào)整溫度、離子強度等以適應諸如探 針長度等因素。術語“引物”指與互補RNA或DNA靶多核苷酸雜交并充當通過核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作 用從單核苷酸逐步合成多核苷酸的起點(如例如聚合酶鏈反應中所發(fā)生的)的寡核苷酸序列。術語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位 點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關系中，則它是“可操作連接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分 泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編 碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則它 與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且 在分泌前導的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核 苷酸銜接頭或接頭。術語“標記物”在用于本文時指與試劑諸如核酸探針或抗體直接或間接偶聯(lián)或融 合，以便于檢測它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標記物可以是自身可檢測的 (例如放射性同位素標記物或熒光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化可檢測的底 物化合物或組合物的化學改變。在用于本文時，術語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與 免疫球蛋白恒定域的效應器功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同 于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即是“異源”的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免 疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配 體的結(jié)合位點的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫 球蛋白獲得，諸如 IgG-l、IgG-2、IgG-3 或 IgG_4 亞型、IgA (包括 IgA-I 和 IgA_2)、IgE、IgD 或1#。"DR6受體抗體”、“DR6抗體”、或“抗DR6抗體”以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式 DR6受體(優(yōu)選人DR6受體，諸如圖IA所示DR6序列)或其胞外結(jié)構(gòu)域序列的抗體。任選 的是，DR6抗體與異源序列或分子融合或連接。優(yōu)選的是，異源序列允許或幫助抗體形成更 高等級或寡聚復合物。術語“抗DR6抗體”及其語法等同物具體涵蓋下文實施例部分中所 描述的DR6單克隆抗體。任選的是，DR6抗體結(jié)合DR6受體但不與任何其它腫瘤壞死因子家 族受體Ufi^nDR4、DR5、TNFRl、TNFR2、Fas)結(jié)合或發(fā)生交叉反應。任選的是，根據(jù)BIAcore 結(jié)合測定法的測量，本發(fā)明的DR6抗體在約0. 067 μ M到約0. 033 μ M的濃度范圍內(nèi)結(jié)合DR6 受體。術語“抗APP抗體”、“ΑΡΡ抗體”及語法等同物以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式 APP (優(yōu)選人ΑΡΡ，諸如本文具體所述APP多肽同等型)的抗體。優(yōu)選的是，APP抗體是DR6 拮抗性抗體。例如，在本文中所公開的用于生成和/或鑒定DR6拮抗劑的方法中，可以使用 APP和/或其一部分的一種或多種同等型作為免疫原來免疫動物(例如小鼠，作為生成單克 隆抗體的過程的一部分)和/或作為探針來篩選化合物文庫(例如重組抗體庫)。在本發(fā) 明的實施方案中有用的典型APP多肽包括如下非限制性例子?？梢赃x擇這些例示形式，用 于本發(fā)明的各個實施方案。在本發(fā)明的有些實施方案中，APP多肽包含全長APP同等型，諸 如圖1所示APP695和/或APP751和/或APP77tl同等型。在本發(fā)明的其它實施方案中，APP多肽包含APP的翻譯后加工形式，例如經(jīng)歷了分泌酶(諸如α-分泌酶、β-分泌酶或Y-分 泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，諸如sAPP α或sAPP β )。在本發(fā)明的相 關實施方案中，可以選擇APP多肽，以包含一個或多個特定結(jié)構(gòu)域，諸如N-末端胞外域(參 見例如Quast等，F(xiàn)ASEB J. 2003 ；17(12) :1739-41)、肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見例如Rossjohn 等，Nat. Struct. Biol. 1999 Apr ；6 (4) :327-31)、銅 II 型(參見例如 Hesse 等，F(xiàn)EBSLetters 349(1) :109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(參見例如Ponte等，Nature ； 331 (6156) :525-7(1988))。在本發(fā)明的有些實施方案中，APP多肽包含觀察到包含受到本 文中所公開的DR6拮抗劑(諸如抗體或DR6免疫粘附素)識別的表位的序列，例如APP695 的氨基酸22-81，一種包含單克隆抗體22C11所結(jié)合的表位的序列(參見例如Hilbich等， J.Biol. Chem. 268(35) :26571-26577 (1993))。在本發(fā)明的某些實施方案中，APP多肽不包 含一種或多種特定結(jié)構(gòu)域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例 如實施例12中公開的人重組N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的APP多 肽(例如APP695)、或不包含阿耳茨海默氏病β淀粉狀蛋白(Abeta，Αβ)序列的APP多肽 (例如sAPP β，一種不包含A β 40禾口 /或A β 42序列的多肽)(參見例如Bond等，J. Struct Biol.2003Feb ； 141 (2) :156_70)。在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明的實施方案中所使 用的APP多肽包含一種或多種結(jié)構(gòu)域或序列但不包含其它結(jié)構(gòu)域或序列，例如包含N-末端 胞外域(或至少其觀察到受到DR6拮抗劑(諸如單克隆抗體22C11)結(jié)合的部分)但不包 含一個或多個分泌酶切割位點C端的結(jié)構(gòu)域或序列(諸如β淀粉狀蛋白(Αβ)序列)的 APP多肽(例如sAPP α或sAPP β )。任選的是，抗APP抗體會抑制APP多肽對DR6的結(jié)合， 而且會在10 μ g/ml至50 μ g/ml的濃度結(jié)合至APP多肽，如本文中所描述的和/或如定量 的基于細胞的結(jié)合測定法中所測量的。術語“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由 至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn) 出期望的生物學活性?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由 抗體片段形成的多特異性抗體?！疤烊豢贵w”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約 150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的 數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二 硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh)，接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一 個可變域(VJ，而另一端是一個恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而 輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之 間形成界面。術語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定 抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可 變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)或互補決定區(qū)的三個區(qū)段。可變域中更 加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大 多采取折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的 高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效 應器功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有 一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶 處理產(chǎn)生一個F (ab' )2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共 價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個可變 域的三個高變區(qū)相互作用而在Vh-Vl 二聚體表面上限定了一個抗原結(jié)合位點。六個高變區(qū) 一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的 三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段 的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個 或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇 基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在成對Fab‘片段之間有鉸鏈半胱氨酸 的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯(lián)形式。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體可歸入不同的類。完整抗體有五大類IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl和IgA2。將與不同類的抗體對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類 的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于 一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh與\結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得scFv 能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關于scFv的綜述參見PlUckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 第 269-315 頁，1994。術語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域。通過使用過短的接頭使得同一條 鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn) 生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體 是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不 同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它 們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們是由雜交瘤培養(yǎng)物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應解釋為 要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首 次由Kohler等(197 Nature 256 :495記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA 方法來制備(參見例如美國專利No. 4，816，567)?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如Clackson 等(1991)Nature352 :624-6 及 Marks 等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581-597 中記載的技術 從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的 一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而 鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或 同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ； Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗 體包括包含衍生自非人靈長類動物(例如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、 恒河猴或獼猴)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體(美國專利 No. 5，693, 780)。非人(例如鼠)抗體的“人源化式指以最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘 基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈 長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR) 殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有 找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含 至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人 免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任 選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參 見 Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988)；禾口 Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。術語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包 含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重鏈可變域中的殘基 31-35 (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3)； Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些來自“高 變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基^-32(L1)、50-52(I^)和91-96 (U)及重鏈可變 域中的殘基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基指可變域中那些除此處定義的高變區(qū)殘基以外的 殘基?！敖Y(jié)合”目的抗原的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結(jié)合該抗原，使得該抗 體可作為治療劑或診斷劑用于靶向表達該抗原的細胞的抗體。為了本發(fā)明，“免疫療法”指用抗體治療哺乳動物(優(yōu)選人類患者)的方法，其中抗 體可以是未偶聯(lián)的或“裸露的”抗體，或者抗體可以偶聯(lián)或融合有異源分子或試劑，諸如一 種或多種細胞毒劑，由此產(chǎn)生“免疫偶聯(lián)物”。
“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其 它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry 法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得 至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)根據(jù)還原性或非還原性條件下 的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成 分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至 少一個純化步驟來制備。術語“帶標簽的”在用于本文時指包含抗體或多肽且其與“標簽多肽”融合的嵌合 分子。標簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體或者提供一些其它功能諸 如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的肽所發(fā)生的)，但又足夠短使得其不干擾所 述抗體或多肽的活性。標簽多肽優(yōu)選還是相當獨特的，使得標簽特異性抗體基本上不與其 它表位發(fā)生交叉反應。合適的標簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常約8個到約50 個氨基酸殘基之間(優(yōu)選約10個到約20個殘基之間)。術語“Fe受體”或“FcR”用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然 序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是能結(jié)合IgG抗體的FcR (γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII、 和Fc γ RIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括 Fc y RIIA ( “活化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別 主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體Fc y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸 的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的 抑制基序(ITIM)(參見Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997))。FcR 的綜述參 見 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492(1991) ；Capel 等，Immunomethods 4 :25-34(1994)；及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-341 (1995)。術語“FcR” 在本 文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑒定的。該術語還包括新生兒受體，F(xiàn)cto，其負責 將母體 IgG 轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer 等，J. Immunol. 117 :587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249 (1994) )。FcR在本文中包括多態(tài)性，諸如編碼Fc γ RIIIa的基因中導致位于受體 能結(jié)合IgGl的區(qū)域中第158位氨基酸或為苯丙氨酸(F)或為纈氨酸(V)的遺傳二態(tài) 性。純合纈氨酸FCYRIIIa(FCYlIIa-158V)已經(jīng)在體外顯示出相對于純合苯丙氨酸 FcyRIIIa(FcyRIIIa-158F)或雜合(Fe y IIIa-158F/V)受體具有更高的對人IgGl的親和 力且介導升高的ADCC。術語“多元醇”在用于本文時泛指多羥基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶 性聚(亞烷基氧化物)聚合物，而且可具有線性鏈或分支鏈。優(yōu)選的多元醇包括那些在一 個或多個羥基位置用化學基團諸如具有1至4個碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元 醇是聚(亞烷基二醇)，優(yōu)選聚(乙二醇)(PEG)。然而，本領域技術人員認識到，其它多元 醇諸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中關于PEG描述的偶聯(lián)技術得 以采用。多元醇包括本領域眾所周知的那些類型以及可公開獲得的那些類型，諸如從商業(yè) 來源獲得，諸如Nektar 公司。術語“偶聯(lián)”(conjugate)在本文中依照其最廣泛的定義使用，指接合或連接到一 起。若分子像接合在一起時那樣起作用或運作，則它們是“偶聯(lián)”的。
表述“有效量”指藥劑(例如DR6拮抗劑等)有效預防、緩解或治療所討論病癥或 疾患的量。本發(fā)明的DR6拮抗劑在減緩或終止變性性神經(jīng)學病癥的進展中或者在增強受損 神經(jīng)元細胞或組織的修復和幫助恢復正確神經(jīng)功能中會是有用的。術語“處理”、“治療”和“療法”在用于本文時指治療性處理、預防性處理、和防范 性處理。連續(xù)治療或施用指以至少每天一次為基礎、期間沒有中斷一天或多天的處理。間 歇治療或施用或者間歇方式的治療或施用指本質(zhì)上并非連續(xù)而是循環(huán)的處理。在用于本文時，術語“病癥”一般指任何會受益于本文所述DR6拮抗劑治療的疾 患。這包括慢性和急性病癥，以及那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況?！吧窠?jīng)元細胞或組織”一般指運動神經(jīng)元、中間神經(jīng)元(包括但不限于連合神經(jīng) 元)、感覺神經(jīng)元(包括但不限于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)、黑質(zhì)的多巴胺(DA)神經(jīng)元、紋狀體 DA神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、腦干神經(jīng)元、脊髓中間神經(jīng)元和運動神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元(包括但 不限于海馬的CAl錐體神經(jīng)元)、和前腦神經(jīng)元。術語神經(jīng)元細胞或組織在本文中意圖指由 細胞體、軸突和樹突組成的神經(jīng)元細胞，以及指可形成此類神經(jīng)元細胞一部分的軸突或樹 突。“神經(jīng)學病癥”在本文中用于指包括神經(jīng)變性性疾患、以中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的 功能障礙或以神經(jīng)元細胞或組織的壞死和/或凋亡為特征的神經(jīng)元細胞或組織損害損 傷、及與營養(yǎng)因子剝奪有關的神經(jīng)元細胞或組織損傷在內(nèi)的疾患。神經(jīng)變性性疾病的例 子包括家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALQ、家族性和散發(fā)性帕金 森氏病、亨庭頓氏病(亨廷頓舞蹈癥)、家族性和散發(fā)性阿耳茨海默氏病、脊髓性肌萎縮 (SMA)、視神經(jīng)病(opticalneuropathies)(諸如青光眼或涉及視網(wǎng)膜變性、糖尿病神經(jīng)病 變、或黃斑變性的伴生疾病(associated disease))、由于內(nèi)耳感覺細胞或神經(jīng)元變性引 起的聽力損失、癲癇、貝耳氏麻痹(Bell’ s palsy)、與染色體17連鎖的伴有帕金森綜合征 (parkinsonism)的額顳癡呆(FTDP-17)、多發(fā)性硬化、彌漫性大腦皮層萎縮、Lewy小體癡 呆、皮克病(Pick disease)、三核苷酸重復病(trinucleotide!·印eat disease)、朊病毒病 癥(prion disorder)、和夏德二氏綜合征(Shy-Dragersyndrome)。神經(jīng)元細胞或組織損傷 可源自危及神經(jīng)元細胞或組織的存活或正確功能的多種不同原因，包括但不限于源自例 如限制(暫時地或永久地)血流的缺血狀況的急性和非急性損傷，就像在整體性和局灶性 腦缺血(中風)中那樣；對例如大腦組織或脊髓的切口或切傷；神經(jīng)元組織中的損害或斑 塊(placques)；對細胞的生長和存活所需要的營養(yǎng)因子的剝奪；暴露于神經(jīng)毒素，諸如化 療劑；以及偶發(fā)的其它疾病狀態(tài)(incidental to other disease states)諸如慢性代謝病 諸如糖尿病或腎功能不全?！笆茉囌摺被颉盎颊摺敝感枰委煹娜魏螁蝹€受試者，包括人。還意圖作為受試者包 括的有參加臨床研究試驗而沒有顯示出任何疾病臨床征候的任何受試者、參加流行病學研 究的受試者、或作為對照的受試者。術語“哺乳動物”在用于本文時指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人、牛、馬、犬、 和貓。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，哺乳動物指人。II.本發(fā)明的例示性方法和材料先前的研究檢驗了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的細胞死亡現(xiàn)象(Hamburger等， J.Neurosci.，1 :60-71 (1981) ；Oppenheim, Ann.Rev. Neurosci.，14 :453-501 (1991)；0' Leary 等，T. Neurosci. , 6 3692-3705 (1986) ；Henderson 等，Nature, 363 266-270(1993) Yuen 等，Brain Dev. ,18 :362-368 (1996))。認為神經(jīng)元細胞的死亡在多種 神經(jīng)學病癥(諸如家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALQ、家族性和散發(fā) 性帕金森氏病、亨庭頓氏病、家族性和散發(fā)性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎縮(SMA))的形 成和 / 或進展中發(fā)揮作用(Price 等，Science, 282 1079-1083 (1998))。申請人:出人意料地發(fā)現(xiàn)DR6 (TNFR家族的一個成員)在胚胎和成人中樞神經(jīng)系統(tǒng) (包括大腦皮層、海馬、運動神經(jīng)元和脊髓的中間神經(jīng)元)中高度表達。如下文實施例中所 述，申請人進行了多種實驗測定法來檢驗DR6作為神經(jīng)元細胞存活或死亡的調(diào)節(jié)物可能發(fā) 揮的作用。連合神經(jīng)元的存活依賴來自其中間靶物之一(脊髓的底板)的營養(yǎng)支持。在體外 外植體培養(yǎng)物中，申請人發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾來抑制DR6表達阻斷連合神經(jīng)元的軸突變性。還 在背側(cè)脊髓存活測定法中測試了抗DR6單克隆抗體，確定了通過DR6特異性抗體3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7和1E5. 5. 7抑制DR6受體信號傳導阻止體外外植體培養(yǎng)物中連合神經(jīng)元的軸突變 性。已經(jīng)在文獻中報道了 DR6經(jīng)JNK的活化來發(fā)信號(Pan等，見上文1998 Jhao等，見上 文2001)。因而，為了調(diào)查DR6-JNK信號傳導在軸突變性中的作用，進行了背側(cè)脊髓存活測 定法，其中用肽抑制劑L-JNK-I阻斷連合神經(jīng)元中的JNK信號傳導途徑。此JNK信號傳導 抑制部分阻斷背側(cè)脊髓存活測定法中的軸突變性。如此，認為DR6至少部分經(jīng)JNK途徑發(fā) 出軸突變性過程信號。為了更好地理解發(fā)育過程中DR6在神經(jīng)元細胞死亡的調(diào)節(jié)中的生理 作用，在全胚培養(yǎng)系統(tǒng)中用抗DR6抗體阻斷DR6信號傳導。驚人的是，某些DR6特異性抗體 對DR6信號傳導的抑制在此系統(tǒng)中針對天然發(fā)生的發(fā)育性細胞死亡保護脊髓神經(jīng)元。因 此，DR6拮抗劑(諸如DR6拮抗性抗體)可用于降低神經(jīng)學病癥(諸如神經(jīng)變性性病癥，例 如ALS、SMA、阿耳茨海默氏病、和帕金森氏病、FTDP-17、亨庭頓氏病)和中風中發(fā)生的神經(jīng) 元細胞死亡。為了檢驗DR6在體內(nèi)是否真正地發(fā)揮促凋亡受體的功能，申請人分析了處于 發(fā)育階段E15. 5的DR6敲除胚的表型。與DR6作為神經(jīng)元細胞存活的負調(diào)節(jié)物的作用一致， 在DR6缺失脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中檢測到與DR6雜合同窩出生者對照相比神經(jīng)元細胞死亡降 低大約40%至50%。申請人:還出人意料地發(fā)現(xiàn)淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)是DR6受體的關聯(lián)配體， 而且APP發(fā)揮經(jīng)DR6受體觸發(fā)軸突變性的功能。先前假設淀粉狀蛋白前體蛋白在阿耳茨 海默氏病中發(fā)揮一些盡管沒有完全了解的作用(Selkoe, J.Biol. Chem. 271 :18295(1996)； Scheuner ；等，Nature Med. 2 :864(1996) ；Goate，等，Nature 349 :704(1991))。認為DR6拮抗劑在治療各種神經(jīng)學病癥中會是尤其有用的。本發(fā)明因而提供了 DR6拮抗劑組合物和用于在哺乳動物中抑制、阻斷和中和DR6活性的方法，包括施用有效量 的DR6拮抗劑。優(yōu)選的是，所采用的DR6拮抗劑量會是有效阻斷軸突變性和神經(jīng)元細胞死 亡的量。這可以依照例如下文和實施例中所描述的方法來實現(xiàn)。所述方法中可采用的DR6拮抗劑包括但不限于DR6和/或APP免疫粘附素、包含 DR6和/或APP的融合蛋白、DR6和/或APP的共價修飾形式、DR6和/或APP變體、其融合 蛋白、及DR6和/或APP抗體。本文中描述了可用于生成拮抗劑的多種技術。例如，描述了 用于制備DR6和APP多肽的方法和技術。還描述了 DR6和APP多肽的進一步修飾、及針對 DR6和APP的抗體。本文中所公開的方法具有許多實施方案。本發(fā)明提供了抑制DR6結(jié)合APP的方法，包括在DR6對APP的結(jié)合受到抑制的條件下將DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種 DR6拮抗劑。本發(fā)明的相關實施方案提供了抑制對包含SEQ ID NO 1氨基酸1-655的DR6 多肽和包含SEQ ID NO 6氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPP β )的結(jié)合的方法，該方法 包括將DR6多肽和APP多肽與結(jié)合DR6或APP的分離的拮抗劑組合，其中所述分離的拮抗 劑選自結(jié)合APP的抗體、結(jié)合DR6的抗體和包含SEQ ID NO 1氨基酸1-354的可溶性DR6 多肽中的至少一種；且所述分離的拮抗劑是根據(jù)其抑制DR6和APP結(jié)合的能力選擇的；使 得DR6對APP的結(jié)合受到抑制。任選的是，在此類方法中，一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體(例如競爭 性抑制由分別以ATCC編號ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094、或ΡΤΑ-8096保藏的雜交瘤細胞系生成的 3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7單克隆抗體的結(jié)合的結(jié)合DR6的抗體)、包含SEQ ID Ν0:1氨 基酸1-354的可溶性DR6多肽(例如DR6免疫粘附素)、或結(jié)合APP的抗體(例如單克隆抗 體22C11)。在本發(fā)明的某些實施方案中，DR6拮抗劑是連接至一種或多種選自下組的非蛋 白質(zhì)性質(zhì)聚合物的結(jié)合DR6的抗體、結(jié)合APP的抗體或可溶性DR6多肽聚乙二醇、聚丙二 醇、和聚氧化烯。在這些方法的任選實施方案中，DR6多肽是在一種或多種哺乳動物細胞(例如連 合神經(jīng)元細胞、感覺神經(jīng)元細胞或運動神經(jīng)元細胞)的細胞表面上表達的，而且所述一種 或多種DR6拮抗劑的結(jié)合抑制DR6活化或信號傳導。在本發(fā)明的一個此類實施方案中，所 述方法是在體外實施的，用以抑制一種或多種表達DR6的哺乳動物細胞中的凋亡，從而增 強組織培養(yǎng)物中神經(jīng)元細胞的生長和/或再生和/或存活。舉例而言，此類DR6拮抗劑作為 組織培養(yǎng)基(例如那些設計用于繁殖神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的)的體外添加劑是有用的。具體 而言，正如本領域已知的，某些神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的繁殖可能由于此類細胞經(jīng)歷凋亡的傾 向而成問題。例如，有些神經(jīng)元培養(yǎng)物在缺乏外源因子(諸如神經(jīng)生長因子)時死亡。本文 中所提供的公開內(nèi)容顯示了 DR6拮抗劑可用于此類神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物以增強細胞生長和/ 或再生和/或存活，例如以與此類培養(yǎng)物中神經(jīng)生長因子的使用類似的方式進行。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以在患有神經(jīng)學疾患或病癥的哺乳動物中體內(nèi)實 施抑制DR6結(jié)合APP的方法。任選的是，神經(jīng)學疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏 病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病?；蛘撸窠?jīng)學疾患或病癥包括源自中風、對大腦或脊髓 組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害的神經(jīng)元細胞或組織損傷。本發(fā)明的其它實施方案提供了治療患有神經(jīng)學疾患或病癥的哺乳動物的方法，包 括對所述哺乳動物施用有效量的一種或多種DR6拮抗劑。典型的是，在此類方法中，一種或 多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含SEQ IDNO 1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、 和結(jié)合APP的抗體。在本發(fā)明的任選實施方案中，神經(jīng)學疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、 帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病?；蛘?，神經(jīng)學疾患或病癥包括源自中風、對大 腦或脊髓組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害的神經(jīng)元細胞或組織損傷。在本發(fā)明的各種 實施方案中，對所述哺乳動物施用一種或多種別的治療劑。在本發(fā)明的某些例示性實施方 案中，所述一種或多種別的治療劑選自NGF、凋亡抑制劑、EGFR抑制劑、β -分泌酶抑制劑、 Y-分泌酶抑制劑、膽堿酯酶抑制劑、抗Αβ (Abeta)抗體和NMDA受體拮抗劑。任選的是，所 述一種或多種DR6拮抗劑和/或別的治療劑是經(jīng)注射、輸注或灌注施用于哺乳動物的。 本發(fā)明的其它實施方案提供了鑒定抑制DR6結(jié)合APP的感興趣分子的方法，該方法包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP，然后檢測在存在所述感興趣 分子的情況中對DR6結(jié)合APP的抑制。本發(fā)明的相關實施方案提供了確定某組合物是否調(diào) 控包含SEQ ID NO :1氨基酸1-655(和任選的SEQ ID NO :1氨基酸1-354)的DR6多肽和包 含SEQ ID NO 6氨基酸66-81的APP多肽(例如APP695、sAPP α或SAPP β )之間結(jié)合的方 法，該方法包括將組合物與DR6和APP組合，然后將存在該組合物時的DR6和APP之間的結(jié) 合與不存在該組合物時的DR6和APP之間的結(jié)合進行比較，由此確定該組合物是否調(diào)控DR6 和APP之間的結(jié)合。任選的是，此類方法中的結(jié)合差異通過表面等離振子共振(SPR)技術 (例如可自Biacore Life kiences獲得的)來測量。本發(fā)明的實施方案進一步包括依照 這些方法鑒定的感興趣分子。本發(fā)明的其它實施方案包括診斷患有神經(jīng)學病癥的或?qū)ι窠?jīng)學病癥易感的患者 的方法，包括自所述患者獲取樣品并對所述樣品測試具有與SEQ IDNO :1之DR6多肽序列不 同的多肽序列的DR6多肽變體的存在。任選的是，該方法進一步包括鑒定所述多肽變體是 否具有與對SEQ ID NO :1之DR6多肽序列觀察到的親和力不同的對APP多肽的親和力。本 發(fā)明的相關實施方案包括確定哺乳動物中是否存在包含SEQ ID N0:1氨基酸1-655的DR6 多肽變體的方法，該方法包括將哺乳動物中所表達的DR6多肽的序列與SEQ ID N0:1進行 比較，由此確定該哺乳動物中是否存在DR6多肽變體。這些方法的某些實施方案可包括進 一步的步驟，即鑒定觀察到在哺乳動物中存在的多肽變體是否是APP結(jié)合變體，其中APP結(jié) 合變體表征為所具有的對包含SEQ ID NO :6氨基酸66-81的淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)多 肽(例如APP695、sAPP α或sAPP β )的結(jié)合親和力不同于包含SEQ ID NO 1的DR6多肽對 包含SEQ IDNO :6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合親和力。任選的是，此類方法中結(jié)合親和 力的差異是通過表面等離振子共振(SPR)技術(例如可自Biacore Lif必ciences獲得的) 測量的。這些方法的有些實施方案可包括選擇具有在肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭 頓氏病或阿耳茨海默氏病中觀察到的癥狀或疾患的患者個體的步驟。在本文所述全長天然序列DR6和APP多肽之外，可制備DR6和/或APP多肽變體。 DR6和/或APP變體可通過將適宜核苷酸變化引入編碼DNA和/或通過期望多肽的合成來 制備。本領域技術人員會領會，氨基酸變化可能改變DR6和/或APP多肽的翻譯后加工，諸 如改變糖基化位點的數(shù)目或位置或者改變膜錨定特征。本文所述DR6和/或APP多肽中的變異可以例如使用關于保守和非保守突變的任 何技術和指導方針來產(chǎn)生，例如美國專利No. 5，364，934中所提出的。變異可以是一個或多 個編碼多肽的密碼子的替代、刪除或插入，其導致與天然序列多肽相比氨基酸序列中的變 化。任選地，變異是通過在DR6和/或APP多肽的一個或多個結(jié)構(gòu)域中用任何其它氨基酸 替代至少一個氨基酸實現(xiàn)的。確定哪個氨基酸殘基可以被插入、替代或刪除而不會不利地 影響期望活性的指導可以通過比較DR6多肽的序列與同源的已知蛋白質(zhì)分子的序列，并使 高度同源性的區(qū)域中產(chǎn)生的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化而發(fā)現(xiàn)。氨基酸替代可以是用另 一個具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學性質(zhì)的氨基酸替代一個氨基酸的結(jié)果，諸如用絲氨酸替代亮 氨酸，即保守氨基酸替代。任選地，插入或刪除可以在大約1至5個氨基酸的范圍中?？梢?如下確定容許的變異，即在序列中系統(tǒng)地產(chǎn)生氨基酸的插入、刪除或替代，并對所得的變體 測試DR6和/或APP拮抗活性。本文中提供了 DR6和/或APP多肽片段。此類片段可以是在N端或C端截短的，或者可以缺少內(nèi)部殘基，例如在與全長天然蛋白相比時。某些片段缺少對于DR6多肽的期 望生物學活性不是至關重要的氨基酸殘基。DR6和/或APP多肽可以通過許多常規(guī)技術中的任一種來制備。可以化學合成期 望的肽片段。備選的方法涉及通過酶促消化生成多肽片段，例如通過用已知在由特定氨基 酸殘基限定的位點處切割蛋白質(zhì)的酶處理蛋白質(zhì)，或通過用合適的限制酶消化DNA并分離 期望片段來實現(xiàn)。另一種合適的技術涉及分離并擴增編碼期望多肽片段的DNA片段，其通 過聚合酶鏈式反應(PCR)實現(xiàn)。在PCR中的5’和3’引物上采用限定DNA片段的期望端的 寡核苷酸。在具體的實施方案中，下表中優(yōu)選替代的標題下顯示了感興趣的保守替代。如果 此類替代導致生物學活性變化，那么可導入表中稱為“例示替代”的更實質(zhì)變化，或如下文 參照氨基酸分類進一步所述，并篩選產(chǎn)物。表
權(quán)利要求
1.一種用于篩選抑制神經(jīng)變性的化合物的方法，包括(a)培養(yǎng)在它們的表面上表達APP的神經(jīng)元；并(b)在候選化合物存在或缺失下刺激所述神經(jīng)元中的APP脫落；其中在所述候選化合物存在下的觀察APP脫落與在所述候選化合物缺失下的觀察APP 脫落相比降低指示所述候選化合物是神經(jīng)變性的抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中脫落是通過營養(yǎng)因子剝奪來刺激的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述營養(yǎng)因子是NGF。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)元是感覺神經(jīng)元。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)元是運動神經(jīng)元。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述脫落是通過對所述神經(jīng)元的機械損傷來刺激的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的脫落相比所述候選化合 物將觀察脫落降低10-30%。
8.權(quán)利要求1的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的脫落相比所述候選化合 物將觀察脫落降低30-50%。
9.權(quán)利要求1的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的脫落相比所述候選化合 物將觀察脫落降低50-70%。
10.權(quán)利要求1的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的脫落相比所述候選化 合物將觀察脫落降低70-90%。
11.權(quán)利要求1的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的脫落相比所述候選化 合物將觀察脫落降低90-100%。
12.一種用于篩選抑制神經(jīng)變性的化合物的方法，包括(a)培養(yǎng)在它們的表面上表達APP的神經(jīng)元；并(b)在候選化合物存在或缺失下刺激所述神經(jīng)元的神經(jīng)變性；其中在所述候選化合物存在下的觀察神經(jīng)變性與在所述候選化合物缺失下的觀察神 經(jīng)變性相比降低指示所述候選化合物是神經(jīng)變性的抑制劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中神經(jīng)變性是通過營養(yǎng)因子剝奪來刺激的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述營養(yǎng)因子是NGF。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)元是感覺神經(jīng)元。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)元是運動神經(jīng)元。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述脫落是通過對所述神經(jīng)元的機械損傷來刺激的。
18.權(quán)利要求12的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的神經(jīng)變性相比所述候 選化合物將觀察神經(jīng)變性降低10-30%。
19.權(quán)利要求12的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的神經(jīng)變性相比所述候 選化合物將觀察神經(jīng)變性降低30-50%。
20.權(quán)利要求12的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的神經(jīng)變性相比所述候 選化合物將觀察神經(jīng)變性降低50-70%。
21.權(quán)利要求12的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的神經(jīng)變性相比所述候 選化合物將觀察神經(jīng)變性降低70-90%。
22.權(quán)利要求12的方法，其中與所述候選化合物缺失下觀察到的神經(jīng)變性相比所述候選化合物將觀察神經(jīng)變性降低90-100%。
全文摘要
呈現(xiàn)了用于篩選抑制神經(jīng)變性的化合物的方法。APP脫落可作為神經(jīng)變性的有用標志，而抑制APP脫落的化合物可用作神經(jīng)變性的抑制劑。此類化合物可用于治療和/或預防各種神經(jīng)學疾病、病癥和神經(jīng)元損傷，而且可增強哺乳動物神經(jīng)元細胞或組織的生長、再生或存活。
文檔編號G01N33/50GK102124336SQ200980131368
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者安納托利·尼古萊夫, 馬克·特西爾-拉維格尼 申請人:健泰科生物技術公司