專利名稱：抗水解的聚丙烯酰胺凝膠的制作方法
抗水解的聚丙烯酰胺凝膠相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年9月2日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/093，622之權(quán)利，且 將其納入本文作參考。
背景技術(shù)：
聚丙烯酰胺凝膠電泳(“PAGE”)在研究、診斷和生化實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用主要是因 為聚丙烯酰胺凝膠的光透明性和電中性，以及聚丙烯酰胺凝膠對于其中分離的多種大范圍 分子量的物質(zhì)的靈活性和適應(yīng)性。這種靈活性來源于廠商通過改變丙烯酰胺單體的濃度， 以及交聯(lián)劑通常是雙丙烯酰胺相對于單體的比例能夠控制凝膠的孔隙度。當(dāng)十二烷基硫酸 鈉(SDQ與合適的緩沖液摻入凝膠時，PAGE對于蛋白質(zhì)分離尤其有用。常用的緩沖液是三 (羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)和雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷(“雙Tris”)。 最初由Laemmli，U.K.，Nature227 =680(1970)描述了一種著名的用于蛋白分離的聚丙烯酰 胺凝膠，其中包含pH8. 8的Tris-HCl作為緩沖液。然而，高pH導(dǎo)致這些凝膠即便冷藏也會 隨時間水解。水解減少了每種蛋白質(zhì)的遷移距離，降低了蛋白質(zhì)條帶的分辨率。如果降低 PH避免水解，凝膠分離蛋白質(zhì)的清晰度降低，無法獲得對于蛋白質(zhì)混合物的有用分析。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)使用三乙醇胺替代Tris和雙Tris，可使聚丙烯酰胺凝膠抗水解，即便是 經(jīng)過長期存儲，仍能夠在電泳條件下分離和解析蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式 中，相對于現(xiàn)有技術(shù)凝膠Tris、雙Tris或兩者的水平得以相當(dāng)程度的降低，而另一些則完 全沒有Tris和雙Tris。如下文所述，其它類型的試劑，如兩性電解質(zhì)、共軛兩性電解質(zhì)、穩(wěn) 定劑、PH值調(diào)節(jié)劑、條帶銳化劑以及其它緩沖劑可作為本發(fā)明的某些實(shí)施方式中的可選成 分。在制備當(dāng)日使用凝膠，或者長期儲存凝膠的過程中，通常使用三乙醇胺可提高條帶的分 辨率。包含三乙醇胺還可以允許凝膠在高電壓下電泳而不降低條帶分辨率，這是現(xiàn)有技術(shù) 凝膠則相反。使用三乙醇胺的另一優(yōu)勢是在凝膠溶液緩沖至中性時仍能有效工作。另一優(yōu) 勢是本發(fā)明中含有三乙醇胺的凝膠可在廣泛的電泳緩沖液，包括含有不同于凝膠中陽離子 的電泳緩沖液中使用，而不引起分辨率的顯著下降。因此可以在Tris-甘氨酸電泳緩沖液 中使用該凝膠。本說明書中所用“長期儲存中抗水解”的表述意思是在常用預(yù)制電泳凝膠存儲條 件下，儲存超過ι天，優(yōu)選超過3天，更優(yōu)選7天或更久，更優(yōu)選1個月或更久，更優(yōu)選6個 月或更久的時間后，凝膠仍具有分析有用的蛋白質(zhì)電泳分離的能力。本發(fā)明可用于任何尺 寸和形狀的凝膠，包括管狀膠和平板凝膠，以及濃縮膠和分離膠的組合。本發(fā)明還可用于微 流體裝置中的凝膠。附圖簡要說明

圖1是比較本發(fā)明范圍內(nèi)含有不同水平天冬酰胺的兩塊凝膠與含有10摩爾％ Tris-HCl的凝膠的電泳性能的拉姆力(Laemmli)圖。
圖2是比較本發(fā)明范圍內(nèi)含有不同弱酸緩沖劑的四塊凝膠與含有10摩爾％ Tris-HCl的凝膠的電泳性能的拉姆力圖。發(fā)明詳述和優(yōu)選實(shí)施方式根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法，在聚合催化劑的存在下，聚丙烯酰胺凝膠通過丙烯酰胺單 體聚合并且以雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑形成，本發(fā)明可應(yīng)用于大范圍孔隙度的聚丙烯酰胺凝 膠。本領(lǐng)域還已知，孔隙度還可通過改變丙烯酰胺總濃度以及雙丙烯酰胺和總丙烯酰胺的 比例進(jìn)行控制。根據(jù)本領(lǐng)域的一般用途，總丙烯酰胺(即總的單體，包括交聯(lián)劑)濃度以重 量百分比表示，記做符號T，而交聯(lián)劑與總單體的比例同樣以重量百分比表示，記做符號C。 T或C值對于本發(fā)明不重要，但是在多數(shù)應(yīng)用中，T的范圍約4% -25%，優(yōu)選約8% -15%, C的范圍約2% -10%，優(yōu)選約2. 5% -5%。本領(lǐng)域已知促進(jìn)聚合的催化劑的例子包括過硫 酸銨、N，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、核黃素以及β-二甲基氨基丙腈，均以本領(lǐng)域熟練技 術(shù)人員所知催化量使用。根據(jù)本發(fā)明，將三乙醇胺摻入單體溶液，因此所形成的膠中包含三乙醇胺。電泳緩 沖液中也可包含三乙醇胺，但這對于本發(fā)明的目的-在數(shù)日、數(shù)周或數(shù)個月的存儲中保持 凝膠的穩(wěn)定性-而言并非關(guān)鍵。在單體溶液中，三乙醇胺的濃度不同，但是大多數(shù)情況下， 濃度范圍約O.Olmol/La.5%重量)-0. 25mol/L(37. 3%重量)可得到最佳結(jié)果。優(yōu)選范圍 約0. 05摩爾/L (50mM) -0. 2摩爾/L (200mM)，更優(yōu)選的范圍約0. 075摩爾/L (75mM)-約0. 15 摩爾/L(150mM)。(在本說明書及權(quán)利要求書中，凝膠中三乙醇胺和其它成分的濃度多次以 凝膠中mM表示。應(yīng)理解為相當(dāng)于制膠所用單體溶液的mM。)出現(xiàn)于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中的其它凝膠成分是一種或多種兩性電解質(zhì)，其明顯 的例子是甘氨酸，以及一種或多種共軛兩性電解質(zhì)。合適的共軛兩性電解質(zhì)的PKa范圍在 8.3-9.6之內(nèi)，并且通常是氨基酸。例如天冬酰胺、牛磺酸、蘇氨酸、絲氨酸和組氨酸。當(dāng)包 含甘氨酸時，其濃度范圍約0. 05摩爾/L(50mM)-0. 5摩爾/L(500mM)，并且優(yōu)選共軛兩性電 解質(zhì)與兩性電解質(zhì)(如甘氨酸)的比值約0.1摩爾百分比-65摩爾百分比，優(yōu)選約20摩爾 百分?jǐn)?shù)-60摩爾百分?jǐn)?shù)。(本文使用代表共軛兩性電解質(zhì)相對兩性電解質(zhì)的比例的摩爾百 分?jǐn)?shù)指共軛兩性電解質(zhì)的摩爾數(shù)除以兩性電解質(zhì)和共軛兩性電解質(zhì)的總摩爾數(shù)乘以100)。 在某些實(shí)施方式中還包含弱酸或兩種或多種弱酸的組合。例如檸檬酸、乙醇酸、馬來酸、磷 酸、乙酸和硼酸。存在時，弱酸或酸的濃度范圍優(yōu)選為約0. 01摩爾/L(IOmM)-O. 50摩爾/ L(500mM)之內(nèi)，最優(yōu)選約0.03摩爾/L(30mM)-0. 10摩爾/L(IOOmM)。優(yōu)選檸檬酸、馬來酸 和乙醇酸，最優(yōu)選乙醇酸。中性鹽可作為另一種可選添加劑用于實(shí)現(xiàn)更好的條帶分辨率，尤 其是在長期儲存中。合適的鹽例如是氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀和磷酸鉀。存在時，中 性鹽的濃度范圍優(yōu)選約為0. 01摩爾/L(IOmM)-O. 50摩爾/L(500mM)之內(nèi)，最優(yōu)選約0. 03 摩爾/L(30mM)-0. 10摩爾/L(IOOmM)。在現(xiàn)有技術(shù)的典型聚丙烯酰胺凝膠制備物中，可利用 合適酸將單體溶液的PH調(diào)節(jié)至所需范圍，這些酸例如是鹽酸、硫酸、乙酸、硼酸和磷酸。根 據(jù)需要可將PH調(diào)節(jié)至6. 4-9. 0的范圍內(nèi)。優(yōu)選pH范圍6. 4-7. 0。如上所述，本發(fā)明的凝膠含有少量或不含Tris或雙"Tris。存在時，Tris或雙1Tris 占凝膠的0. 3mM或更少，優(yōu)選約0. 03mM-0. 3mM。在某些實(shí)施方式中，完全沒有或者至少基本 沒有這兩種緩沖劑中的一種或兩種，即存在不多于痕量的緩沖劑，并且存在的任何量足夠 小，對凝膠儲存穩(wěn)定性不產(chǎn)生可檢測到的影響。
本文所述凝膠中進(jìn)行的電泳分離在常規(guī)溫度、電壓和時間條件下進(jìn)行，可使用各 種樣品緩沖液和電泳緩沖液，以及其它與凝膠相關(guān)的材料。優(yōu)選在平板凝膠上進(jìn)行電泳，并 且以任何常規(guī)方式在凝膠上上樣。然而本發(fā)明凝膠允許使用高于常規(guī)的電壓進(jìn)行分離，以 便在不降低分辨率的前提下縮短分離時間。常用的凝膠長度范圍約6cm-30cm，電壓范圍約 50V-600V。當(dāng)使用高電壓時，范圍可以是約350伏特或更高，優(yōu)選約400伏特-600伏特。以 每厘米伏特計，范圍可以是lV/cm-lOOV/cm，或更高的電壓，優(yōu)選50V/Cm-100V/Cm。盡管實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)在平板凝膠中進(jìn)行，本發(fā)明凝膠也可位于微流體裝置中，并 且表現(xiàn)本文所述優(yōu)勢。在微流體裝置中，凝膠位于直徑(或最長的通道截面尺寸)為500 微米或更小，優(yōu)選100微米或更小的微通道中。在下列實(shí)施例中，在存儲時間不同、組分不同的凝膠中對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行 電泳分離。實(shí)施例1-8中，蛋白質(zhì)混合物包含肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、 卵清蛋白、碳酸酐酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、溶酶體和抑肽酶。每一例子中的樣品緩沖液由 62. 5mM Tris-HCl，2%十二烷基硫酸鈉，25%甘油和0.01%溴酚藍(lán)組成，pH 6.8。每一例子 中的電泳緩沖液由25mM Tris、192mM甘氨酸和0. 十二烷基硫酸鈉組成，pH 8.3。200V 恒壓電泳30-50分鐘進(jìn)行分離。除非另有說明，所有百分?jǐn)?shù)為重量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1本實(shí)施例對本發(fā)明范圍內(nèi)使用三乙醇胺制備的聚丙烯酰胺凝膠與不在本發(fā)明范 圍內(nèi)的Tris-HCl制備的聚丙烯酰胺凝膠在電泳分離中的性能進(jìn)行比較。在凝膠制備的當(dāng) 天進(jìn)行分離。在平板凝膠電泳槽中制備一系列的聚丙烯酰胺凝膠，使用10%丙烯酰胺/雙丙 烯酰胺水溶液(T= 10%)，其中雙丙烯酰胺占單體混合物的2.6% (C = 2.6%)0制膠 溶液中還包含5%甘油和足夠的HCl將pH調(diào)節(jié)至6. 4-6. 5。對照溶液還包含10摩爾％ Tris-HCl，而測試溶液包含75mM三乙醇胺加上82. 6mM天冬酰胺、82. 6mM甘氨酰甘氨酸、或 者82. 6mM甘氨酰甘氨酸和IOOmM MES的組合。測試溶液中不含Tris_HCl。使用即用型凝 膠(Ready Gel)槽在一塊對照凝膠和兩塊測試凝膠(一塊含有甘氨酰甘氨酸，另一塊含有 天冬酰胺)上對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行電泳，在小型普羅提(Mini-Protean)III型電泳槽 中進(jìn)行兩外兩塊測試凝膠的電泳(一塊包含甘氨酰甘氨酸和MES的組合，另一塊包含天冬 酰胺)。電泳槽和室是美國加州赫爾庫斯的伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, California, USA)所售標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。對所得電泳圖進(jìn)行比較，顯示利用三乙醇胺制備的凝膠與Tris-HCl制備的凝膠 產(chǎn)生的條帶分辨率和分離時間相似。結(jié)果還顯示含有三乙醇胺和天冬酰胺的凝膠與含 Tris-HCl的凝膠產(chǎn)生條帶分布最相似。實(shí)施例2本實(shí)施例顯示本發(fā)明范圍內(nèi)含有不同濃度天冬酰胺和甘氨酸的聚丙烯酰胺凝膠 的性能。在凝膠制備的當(dāng)天進(jìn)行電泳分離。凝膠溶液的單體組成是T = 10%和C = 2. 6%，與實(shí)施例1中相同，溶液中其它組 分如下，其中TEA為三乙醇胺，ASN為天冬酰胺并且GLY為甘氨酸
權(quán)利要求
1.一種在含有三乙醇胺的緩沖溶液中包含交聯(lián)的聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠，所述 凝膠不含或含有約0. 3mM或更少的三(羥甲基)氨基甲烷，以及不含或含有約0. 3mM或更 少的g/L雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷。
2.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述三乙醇胺在所述凝膠中的 濃度約為10mM-250mM。
3.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述三乙醇胺在所述凝膠中的 濃度約為75mM-150mM。
4.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述凝膠不含三(羥甲基)氨基 甲烷以及不含雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷。
5.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述三(羥甲基)氨基甲烷在所 述凝膠中的濃度約為0. 03mM-0. 3mM，且所述凝膠不含雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基) 甲烷。
6.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述雙(2-羥乙基)-氨基-三 (羥甲基)甲烷在所述凝膠中的濃度約為0.03mM-0.3mM，且所述凝膠不含三(羥甲基)氨基甲烷。
7.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述三(羥甲基)氨基甲烷在所 述凝膠中的濃度約為0.03mM-0.3mM，且所述雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷在所 述凝膠中的濃度約為0. 03mM-0. 3mM。
8.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，還包含兩性電解質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述兩性電解質(zhì)是濃度約 50mM-500mM的甘氨酸。
10.如權(quán)利要求9所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，還包含共軛兩性電解質(zhì)，該共 軛兩性電解質(zhì)與所述甘氨酸的比例約為0. 1摩爾％ -65摩爾％。
11.如權(quán)利要求10所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述共軛兩性電解質(zhì)與所述 甘氨酸的比例約為20摩爾％ -60摩爾％。
12.如權(quán)利要求10所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述共軛兩性電解質(zhì)選自天 冬酰胺、?；撬?、蘇氨酸、絲氨酸或組氨酸。
13.如權(quán)利要求10所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述共軛兩性電解質(zhì)是?；?酸，且與所述甘氨酸的比例約為20摩爾％ -60摩爾％。
14.如權(quán)利要求9所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，還包含濃度約10mM-500mM的弱酸。
15.如權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺凝膠，其特征在于，所述凝膠的聚丙烯酰胺濃度按 照重量計算約為4% -25%，其交聯(lián)劑比例按照重量計算約為2% -10%。
16.一種通過電泳分離蛋白質(zhì)混合物的方法，所述方法包括(i)將所述混合物樣品上 樣于凝膠上，其中所述凝膠包含用含有三乙醇胺的緩沖溶液配制的交聯(lián)的聚丙烯酰胺，所 述凝膠不含或含有約0. 3mM或更少的三(羥甲基)氨基甲烷，且不含或含有約0. 3mM或更 少的g/L雙O-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷，并且(ii)在所述凝膠上施加電壓，使 所述蛋白質(zhì)在所述凝膠中以不同速率遷移，直到在所述凝膠中分離成多個條帶。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述三乙醇胺在所述凝膠中的濃度約為10mM-250mM。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述凝膠不含三(羥甲基)氨基甲烷以及 不含雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述三(羥甲基)氨基甲烷在所述凝膠中 的濃度約為0.03mM-0.3mM，且所述雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷在所述凝膠中 的濃度約為0. 03mM-0. 3mM。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述凝膠還包含濃度約50mM-500mM的甘 氨酸。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述凝膠還包含濃度約50mM-500mM的甘 氨酸，以及相對所述甘氨酸比例約20摩爾％ -60摩爾％的共軛兩性電解質(zhì)。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述三乙醇胺在所述凝膠中的濃度約為 10mM-250mM,并且所述凝膠還包含濃度約50mM-500mM的甘氨酸，相對所述甘氨酸比例約為 20摩爾％ -60摩爾％的共軛兩性電解質(zhì)，以及濃度約10mM-500mM的弱酸。
23.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述電壓為至少約350伏。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述電壓為約400-600伏。
全文摘要
摻入三乙醇胺替換大部分或全部Tris或Tris-Bis得到在蛋白質(zhì)分離中提供高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠，相對于依賴Tris或Tris-Bis作為緩沖劑的常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠，這種聚丙烯酰胺凝膠對水解更加穩(wěn)定。
文檔編號G01N33/561GK102138073SQ200980134871
公開日2011年7月27日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日
發(fā)明者C·勞維爾, C·帕納托尼, L·奧列奇, S·凱特, S·彼得森, T·R·伯克曼, 楊雪梅 申請人:生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司