專利名稱：增強型電泳檢測固相支持物上的分析物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及免疫檢測/核酸印跡領域，更具體地，涉及適于對一種或多種固 定化分析物進行電免疫檢測/電印跡的系統(tǒng)、試劑盒和方法。
背景技術：
對生物樣品中的蛋白進行分離和鑒別對于理解和學習如何控制健康和疾病的生 物化學是非常關鍵的。在生命科學中應用最廣泛的一種分析技術，蛋白質(zhì)印跡或“免疫印 跡”是一種用于檢測和鑒別抗原(例如蛋白、核酸和碳水化合物)的電泳后的技術。隨著電印跡方法例如由Margalit等(U. S. patent Appl. Publ. No. 2006/0272946) 描述的電印跡裝置和方法的應用，免疫檢測方法已經(jīng)獲得了很大進展。與傳統(tǒng)的電印跡相 比，應用這種干式印跡系統(tǒng)，蛋白、核酸和其它生物分子能被更有效和更迅速地從電泳分離 凝膠上轉(zhuǎn)移至印跡膜上，且該電印跡方法的實施者不需處理液體緩沖液。例如，使用該電印 跡系統(tǒng)，可在5-10分鐘的短時間內(nèi)進行電印跡轉(zhuǎn)移。在電泳和印跡方面所取得的進展使得樣品大小和靈敏性的缺陷成為了關注的限 制因素。在典型的蛋白質(zhì)印跡過程中，研究者進行了下述步驟(1)制備蛋白質(zhì)樣品并進 行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)應用電泳，將蛋白質(zhì)樣品中存在的抗 原通過相對位移分開；(2)將分開的蛋白質(zhì)從步驟(1)的SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至固相支持 物上(例如硝酸纖維素或PVDF膜)；C3)使用封閉劑(通常為蛋白質(zhì)混合物例如脫脂牛奶、 酪素、牛血清白蛋白等等)將步驟2的膜溫育約1小時以封閉膜表面上存在的任何非特異 性耦合位點；(4)在生理中性的緩沖液(例如，PBS (磷酸鹽緩沖液))或PBST (含有少量洗 滌劑的PBS，例如0. 吐溫-20)中用10分鐘洗滌封閉膜3次；(5)用在溶液中稀釋過的 初級檢測劑(primarydetection agent)(例如，和抗體)溫育步驟(4)的膜1小時至過夜。 該初級檢測劑與目標抗原耦合。(6)從初級檢測劑溶液中取出步驟( 的膜，且分別在PBS 或PBST中用10分鐘洗滌三次，以除去未特異性耦合的初級檢測劑；(7)用在溶液中稀釋過 的二級檢測劑(secondary detection agent)溫育步驟(6)的膜1小時。該二級檢測劑與 初級檢測劑耦合。所述二級檢測劑可為，但不限于，為與報道酶例如堿性磷酸酶(AP)或辣 根過氧化物酶(HRP)耦合(耦合)的檢測劑，可通過將顯色底物(色原)轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩恋?進行肉眼檢測，⑶從二級檢測劑溶液中取出步驟(7)的膜，且分別在PBS或PBST中用10 分鐘洗滌三次，以除去未特異性耦合的二級檢測劑；(9)應用檢測系統(tǒng)例如發(fā)光或顯色系統(tǒng)或其它方法檢測耦合的二級檢測劑步驟C3)到步驟(9)的持續(xù)時間通常為約4. 5小時(7 步)。在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡中，步驟C3)到步驟(9)是在回轉(zhuǎn)式振蕩器或搖動裝置中進 行的。比較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡包含三個溫育步驟第一步是用封閉液溫育，第二步是在膜和 初級檢測劑之間溫育；另一步是在膜和二級檢測劑之間溫育。每個溫育步驟通常持續(xù)約1 小時。核酸雜交事件的檢測在各種不同的生命科學研究、診斷、法學和相關申請中是一 項基本的測定。核酸雜交分析的一個共有特征是靶標和探針在雜交條件下耦合，且可檢測 到發(fā)生在互補靶標和探針核酸間的任何雜交事件。然后，應用對雜交事件，即靶標/探針復 合物得到有關目標核酸來源的信息，例如在細胞或組織中表達的基因等。在目前應用的雜交試驗中，必須用可檢測標記(其中該標記可被直接或間接檢 測)標記目標核酸，這樣可以檢測雜交后探針/靶標復合物的存在。目前應用的標記包括同 位素標記和熒光標記，其中熒光標記是最受歡迎的標記，特別是在基于雜交試驗的分析中。目前，雜交試驗(例如Southern印跡和northen印跡)耗費時間，需要數(shù)小時或 多達一天，且其在雜交中需多次變化和洗滌緩沖液。因此需要一個能進行分析物檢測試驗的系統(tǒng)，該系統(tǒng)耗時少于一天，并能最大程 度地減少試驗所需的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實施方案提供了適于對固定蛋白質(zhì)或核酸樣品進行干式或基本干式電 檢測或電核酸檢測(以下稱為電印跡)的系統(tǒng)、試劑盒和方法。根據(jù)本發(fā)明實施方案進行 的電印跡試驗可包括使對一種或多種固定蛋白質(zhì)或核酸的檢測電泳加速的步驟。對固定蛋 白質(zhì)或核酸進行電印跡檢測的方法可包括對在印跡或核酸印跡過程中通常使用的一種或 多種試劑施加電壓。在一些實施方案中，進行蛋白質(zhì)或核酸印跡試驗所需的某些試劑可被 吸附在合適的載體基質(zhì)上。根據(jù)本發(fā)明所述系統(tǒng)和方法進行的電印跡可在基本干燥的條件 下進行(即，含少量或不含水性緩沖液)。通常，使用20ml或更少的含水緩沖液，15ml或更 少的含水緩沖液，IOml或更少的含水緩沖液，5ml或更少的含水緩沖液，3ml或更少的含水 緩沖液，Iml或更少的含水緩沖液實施干燥或基本干燥的電印跡法。含水緩沖液可包括用于 稀釋封閉劑的稀釋劑、雜交試劑、一級抗體、二級抗體、核酸探針(RNA/DNA/PNA等)，以及任 何進一步處理所需的洗脫緩沖液。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和試劑盒進行的電印跡可在30分鐘 內(nèi)完成。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和試劑盒進行的電印跡可在15分鐘 內(nèi)完成。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和試劑盒進行的電印跡可在5分鐘內(nèi) 完成。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和試劑盒進行的電印跡可在3分鐘內(nèi)完 成。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)可包括第一凝膠基體、第二凝膠基體和一種或多種載體 基質(zhì)。第一和第二凝膠基體可包裹于密封的包裝中。此外，多陽極和/或陰極凝膠基質(zhì)離 子槽可一起包裹于包裝中。在一些實施方案中，一種或多種第一和第二凝膠基體可配有一 次性托盤，便于操作。所述托盤可為塑料托盤或任何其它合適的材料。載體基質(zhì)可由顯示能快速吸收含有大分子(例如，多肽、抗體、核酸等)的液體或水溶液的材料制成，但應能在合適的條件下自由釋放這些大分子，同時使這些大分子與載 體基質(zhì)之間的不可逆吸收或耦合最小化。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，適用作載體基質(zhì)的材料 包括在對載體基質(zhì)施加至少3伏電流時，能在10分鐘內(nèi)能釋放吸附在載體基質(zhì)上的電印跡 混合物中45% -約95%或更多生物分子樣品的任何材料。在一些實施方案中，可挑選具有基本平滑表面的的載體基質(zhì)，以使試驗結(jié)果中的 像素化條帶(pixelated ofbands)(即粒度)的形狀最小化。代表性的載體基質(zhì)可包括， 但不限于，聚酯纖維、聚碳酸酯纖維、親水纖維素纖維、醋酸纖維素纖維、羥基化聚酰胺纖維 (例如，L0PR0DYNE )、聚醚砜纖維、丙烯酸共聚物纖維、混合纖維素酯纖維、改性的聚(四 氟乙烯)(PTFE)、過濾紙、石棉布(felt)，或其組合。在一些實施方案中，載體基質(zhì)可包括一 張或多張印跡紙。在一個實施方案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張過濾紙。在一個實施方 案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張微纖維板。這張板中所用的合成微纖維可包括聚酯微纖 維、聚酰胺微纖維、或聚酯微纖維和聚酰胺微纖維兩者的組合。在一些實施方案中，載體基 質(zhì)可包括一張或多張含有約10% -約90%聚酯微纖維的微纖維板。在一些實施方案中，載 體基質(zhì)可包括一張或多張含有約10% -約90%聚酰胺微纖維的微纖維板。在一些實施方 案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張含有約10% -約90%聚酯微纖維和約10% -約90%聚 酰胺微纖維的微纖維板。在一些實施方案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張含有約80%聚酯 和約20%聚酰胺微纖維的微纖維板。另一方面，本發(fā)明還提供了用于進行電印跡的膜電極組件，其中所述電電極組件 包括具有離子源的凝膠基體；和與該凝膠基體相關的導電電極。在一些實施方案中，電極 與凝膠基體相連。在一些實施方案中，導電電極至少部分包埋在凝膠基體中。在一些實 施方案中，在電泳前或電泳轉(zhuǎn)移期間，凝膠基體與電極在塑料托盤中并列。可將電極組件 (electrode assembly)包裹于密封的包裝中。干式電印跡系統(tǒng)中所用的電極和本發(fā)明提供 的電極組件可為，例如，包括非金屬導電材料的層狀結(jié)構(gòu)，包括非金屬導電材料的網(wǎng)，金屬 薄片，金屬網(wǎng)，用導電金屬或非金屬涂覆的不導電聚合物，或其任意組合。用導電材料涂覆 的不導電材料的的電極可以是板、網(wǎng)或其它結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，電極組件的電極包含 電化學可離子化金屬，例如鉛、銅、銀或其組合。在一些實施方案中，電極組件的電極含有鋁 或鈀。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)可包括陽極組件(assembly)、陰極組件和可位于 兩者之間的載體基質(zhì)。在一個實施方案中，載體基質(zhì)可位于陽極和和陰極組件之間。陽極 組件可包括陽極凝膠基體和與之耦合的陽極。陰極組件可包括陰極凝膠基體和與之耦合的 陰極。具有電極和凝膠基體的電極組件可以預制形式、一次性形式提供，從而方便電極 組件的應用，并且提供一種有效的商業(yè)形式。電極可與凝膠基體并列，且放置于托盤或支持 物中。電極組件可包裹于密封的包裝中。在另一個實施方案中，提供了干式電印跡系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括載體基質(zhì)的印 跡層(blotting stack)，印跡膜、陽極、與陽極接觸且位于陽極和印跡層之間的陽極凝膠基 體、陰極、與陰極接觸且位于陰極和印跡層之間的陰極凝膠基體。在一個實施方案中，陽極凝膠基質(zhì)和陰極凝膠基質(zhì)各自包括適用電泳的離子源。 電印跡系統(tǒng)不需要在電印跡之前或期間(例如當組裝印跡層時)往系統(tǒng)中添加大量的液體緩沖液。在一些實施方案中，可如此組裝系統(tǒng)，使陽極凝膠基質(zhì)和陽極位于印跡層的膜一 側(cè)，且使陰極凝膠基質(zhì)和陰極位于印跡層的載體基質(zhì)一側(cè)。在一些實施方案中，陽極、陰極 或其兩者可為外殼(housing)的一部分。在一些實施方案中，陽極、陰極或其兩者可為電源 的一部分和/或與電源耦合。在一些實施方案中，陽極、陰極或其兩者可與電源分開。在一些實施方案中，電印跡系統(tǒng)可包括印跡與固相支持物耦合的抗原的裝置。根 據(jù)這些實施方案的裝置可包括在電印跡中，能支持印跡層的電源、陽極、與陽極并列的位 于陽極和印跡層之間的陽極凝膠基體、陰極、與陰極并列的位于陰極和印跡層之間的陰極 凝膠基體。在電印跡中，干式或基本干式的電印跡裝置不包括，支持物或不與含有電泳用的 液體緩沖液的任何槽連接。在一些實施方案中，裝置的陽極和陽極凝膠基質(zhì)以陽極組件的 形式提供，所述陽極組件可逆地定位在所述裝置的電觸頭上或與之相對或耦合。在一些實 施方案中，陽極或陰極中的一個或其兩者是裝置的一部分。在一個實施方案中，陽極可由銅制成。在一些示例性的實施方案中，陽極和陰極均 由銅制成。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)可任選包括第二載體基質(zhì)。該第二載體基質(zhì)與第 一載體基質(zhì)基本相同。第二載體基質(zhì)可由與第一載體基質(zhì)不同的材料制成。在一個實施方 案中，當進行電印跡程序時，第一載體基質(zhì)和第二載體基質(zhì)可同時使用。在一個替代實施方 案中，第二載體基質(zhì)可在第一載體基質(zhì)之后使用。在一個實施方案中，電印跡試劑盒包括，在至少第一個適當容器中，一個或多個陽 極組件，每個陽極組件包括陽極凝膠基體和與之相連的陽極，一種或多種第一載體基質(zhì)，和 任選的一種或多種第二載體基質(zhì)?？蓪⒁环N或多種凝膠基體配置在位于試劑盒的塑料托盤 里或托盤上。這中托盤可便于對應用期間的凝膠基體進行處理。在一個實施方案中，進行干式或基本干式電印跡所用的試劑盒可包括至少一種含 有電泳用離子源的凝膠基體和至少一種合適的載體基質(zhì)。在另一個實施方案中，試劑盒包 括至少一種陽極凝膠基體和至少一種陰極凝膠基體。陽極凝膠基體和陰極凝膠基體可包裹于密封的包裝中在試劑盒中提供。本發(fā)明設 計的電印跡凝膠基質(zhì)試劑盒可任選地包括至少一種印跡膜，至少一種過濾紙板，至少一種 海綿和/或至少一個電極。載體基質(zhì)可在與陽極和印跡凝膠基質(zhì)不同的包裝中提供。載體 基質(zhì)可被單獨包裝或與多種其它載體基質(zhì)一起包裝。試劑盒還包括一個或多個裝有合適稀釋液的瓶子。示例性的稀釋液包括，通過 非限制性實施例，磷酸鹽緩沖液(PBS)、三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)、Hank’ s緩沖液、 Tris-EDTA (TE), Tris-EDTA-NaCl(TEN) or WESTERN BREE^ 稀釋液，來自 BioFX 的合成 封閉緩沖液等。稀釋液可任選包括蛋白酶抑制劑、蛋白、洗滌劑、防腐劑、抗菌劑或其任意組
I=I ο試劑盒還包括進行印跡程序所必需的一種或多種試劑。這些其它試劑的非限制性 實例包括一級抗體、內(nèi)參抗體(loading controlantibodies)、二級抗體、封閉試劑盒顯色 試劑(例如比色顯色劑或化學發(fā)光顯色劑)。在一個實施方案中，，試劑盒可包括一個或多個一次性陽極組件和/或一個或多 個一次性陰極組件。在一些實施方案中，一個或多個陽極組件可包括含有離子源和與凝膠 基體并列的電極的凝膠體。在一些實施方案中，一個或多個陰極組件可包括含有離子源和與凝膠基體并列的電極的凝膠體。陽極組件、陰極組件或其兩者可在托盤例如一次性塑料 托盤中提供。陽極和/或陰極組件可單獨或一起包裹于密封包裝中。此外，多陽極和/或多陰 極組件可一起包裝。在某些方面，電印跡試劑盒可包括一個或多個一次性陽極組件和一個 或多個一次性陰極組件。在某些方面，電印跡試劑盒可包括一個或多個一次性陽極組件和 一個或多個一次性陰極組件。在一些方面，電印跡試劑盒包括一個或多個一次性陽極組件 和至少一種陰極凝膠基體。試劑盒可任選包括一個或多個印跡膜、過濾紙板、海綿或載體基 質(zhì)。在一個實施方案中，對蛋白質(zhì)樣品實施電印跡份方法可包括提供陽極組件和陰極 組件。陽極組件可包括陽極和電泳用離子源。陰極組件可包括陰極和電泳用離子源。在一 個實施方案中，離子源可為凝膠基質(zhì)的形式。凝膠基質(zhì)可與陽極或陰極電耦合。陽極和陰 極組件可與電源耦合，這樣電壓可從它們中間通過。進行電印跡的方法還包括提供載體基質(zhì)和使載體基質(zhì)與蛋白質(zhì)或雜交組合物接 觸。載體基質(zhì)可由顯示能快速吸收其中分散有或吸收有大分子(例如，多肽、抗體、核酸等) 的液體或水溶液的材料制成，但應能在合適的條件下自由釋放這些大分子，同時使這些大 分子與載體基質(zhì)之間的不可逆吸收或耦合最小化。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，適用作載體基 質(zhì)的材料包括那些釋放至少75%或更多，至少80%或更多，至少85%或更多，至少90% 或更多，至少95%或更多吸附在載體基質(zhì)上的蛋白混合物中的蛋白的材料。在一些實施 方案中，可選擇具有基本平滑表面的載體基質(zhì)，以使試驗結(jié)果中的像素化條帶(pixelated ofbands)(即粒度)的形狀最小化。代表性的載體基質(zhì)可包括，但不限于，聚酯纖維、聚碳酸 酯纖維、親水纖維素纖維、醋酸纖維素纖維、羥基化聚酰胺纖維(例如，L0PR0DYNE )、聚醚 砜纖維、丙烯酸共聚物纖維、混合纖維素酯纖維、改性的聚(四氟乙烯)(PTFE)、過濾紙、石 棉布(felt)，或其組合。在一些實施方案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張印跡紙。在一個實 施方案中，載體基質(zhì)可包括一張或多張合成微纖維板。這張板中所用的合成微纖維可包括 聚酯微纖維、聚酰胺微纖維/聚酯微纖維和聚酰胺微纖維。在一個實施方案中，載體基質(zhì)可 包括一張或多張過濾紙。在一個實施方案中，使蛋白或雜交組合物與載體基質(zhì)接觸可包括制備溶解有或分 散有一種或多種蛋白或核酸的水性緩沖液。在一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括 至少一種封閉劑。該封閉劑可為蛋白封閉劑或核酸封閉劑。在一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括至少一種一級抗體。該一級抗體可 為內(nèi)參抗體。該一級抗體可為用戶定義型抗體。該一級抗體可在試劑盒中提供或由最終用 戶提供。在一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括至少一種二級抗體。該二級抗體可 與辣根過氧化物酶、生物素、堿性磷酸酶、熒光染料或Qdot納米晶體耦合。在一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括至少一種核酸探針。該核酸探針可 為標記探針或未標記探針。該核酸探針可為DNA、RNA或PNA。該核酸探針可為合成的寡肽 或可從天然存在的或重組來源分離得到。在一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括至 少一種封閉劑和至少一種一級抗體。在另一個實施方案中，蛋白或雜交組合物可包括至少 一種封閉劑和至少一種二級抗體。在又一個實施方案中，蛋白或雜交組合物包括至少一種 封閉劑、至少一種一級抗體和至少一種二級抗體。
實施電印跡的方法可包括獲得具有與其表面耦合的一種或多種蛋白質(zhì)或核酸樣 品的蛋白質(zhì)印跡膜。該印跡膜可定位到陽極組件上，使得缺少蛋白質(zhì)或核酸樣品的膜與其 凝膠基體基本并列或電耦合，以及含有與其耦合的蛋白質(zhì)樣品的膜表面朝上。陽極組件可 定位于一次性塑料盤中。實施電印跡的方法還可以進一步包括制備蛋白或雜交組合物并將其至少一部分 吸收到載體基質(zhì)中。蛋白或雜交組合物可包括分散于適當緩沖水溶液中的適當?shù)姆忾]劑、 一級抗體、二級抗體、核酸探針或其任何組合。含有吸收的蛋白或雜交組合物的載體基質(zhì)可 定位于蛋白質(zhì)印跡膜的上方，使其與耦合到印跡膜表面的蛋白質(zhì)樣品基本并列。在一個實施方案中，上面吸收有蛋白或雜交組合物的第二載體基質(zhì)可定位到第一 載體基質(zhì)的頂部，使第二載體基質(zhì)與其基本并列。蛋白或雜交組合物可包括分散在適當水 性緩沖液中的適當?shù)姆忾]劑、一級抗體、二級抗體、核酸探針，或其任何組合。在一個替代性 實施方案中，在進行完下述的電印跡程序后，可用第二載體基質(zhì)替換第一載體基質(zhì)。在一個實施方案中，實施電印跡程序的方法可包括將陰極組件定位到第一和第二 載體基質(zhì)的上方，使陰極的凝膠基體與其并列并建立電通信，并使陰極能夠與一種或多種 其它部件例如外殼(housing)耦合。應當注意，上述任意步驟可包括脫泡步驟，從而除去任 何組裝部件之間的任何氣穴。在一個實施方案中，可將上述組件置于與AC/DC電源電耦合的適當?shù)耐鈿ぶ?，?置電源以向組件的部件施加壓力使電流從其中通過。引文的納入本申請說明書中提及的所有出版物、專利、和專利申請以參閱的方式并入本文，參 閱的程度為，每件出版物、專利或?qū)＠暾埍幻鞔_和單獨地指明作為引文納入本文。附圖簡述參照下述本發(fā)明優(yōu)選的示例性的實施方案的詳述并結(jié)合附圖，將更容易充分理解 本發(fā)明方法和裝置上述的簡要說明以及進一步的目的、特征和優(yōu)勢。圖IA為根據(jù)一個實施方案的電免疫檢測系統(tǒng)圖譜；圖IB為根據(jù)另一個實施方案的電免疫檢測系統(tǒng)圖譜；圖IC為根據(jù)又一個實施方案的電免疫檢測系統(tǒng)圖譜；圖2A為描述根據(jù)一個實施方案實施電印跡程序的方法的流程圖；圖2B為描述根據(jù)一個替代實施方案實施電印跡程序的方法的流程圖；圖3為顯示在根據(jù)一個實施方案的電免疫檢測系統(tǒng)使用的PH中性的各種試劑中 的固有負電荷圖像；在native 1. 2% E-GEL clear上分辨樣品，并用考馬斯染色凝膠以使 分辨的蛋白可視化。樣品如下泳道1，WESTERNBREEZE⑧封閉液；泳道2，小鼠抗肌動蛋白 單克隆抗體；泳道3，小鼠抗微管蛋白單克隆抗體；泳道4，與堿性磷酸酶耦合的羊抗兔二級 抗體；泳道5，與堿性磷酸酶耦合的羊抗小鼠二級抗體；圖4A示出了根據(jù)一個實施方案實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌 動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果；圖4B示出了根據(jù)現(xiàn)有技術通常使用的方法實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂 解物中的肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果；圖5A示出了根據(jù)一個實施方案實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果；圖5B示出了根據(jù)一個替代實施方案實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中 的肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，其中僅對系統(tǒng)施加電壓而不施加電流；圖6A示出了根據(jù)一個實施方案實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌 動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，根據(jù)一個實施方案使用過濾紙作為載體基質(zhì)；圖6B示出了根據(jù)一個實施方案實施印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌 動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，根據(jù)一個替代實施方案使用聚酯/聚酰胺微纖維板作為 載體基質(zhì)；圖7A示出了使用TOSTERBREEZE 方案實施常規(guī)印跡程序檢測在SW480全細胞裂 解物中的肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，使用化學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗 體和ECL試劑；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 試劑；下面板)檢測信號；圖7B示出了根據(jù)一個實施方案實施電印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的 肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，其中在施加電壓前將封閉試劑和一級和二級抗體應用 至載體基質(zhì)，并使用化學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL試劑；上面板)或顯 色方法(使用堿性磷酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 試劑；下面板)檢測信號；圖8A示出了實施常規(guī)的印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微 管蛋白后獲得的結(jié)果，其中使用IBLOT 設備將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并使用化 學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸 酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖8B示出了根據(jù)一個實施方案實施電印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的 肌動蛋白和微管蛋白后獲得的結(jié)果，其中使用IBLOT 設備將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜上，并使用化學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法 (使用堿性磷酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖9A示出了實施常規(guī)的印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微 管蛋白后獲得的結(jié)果，其中使用常規(guī)的濕轉(zhuǎn)移方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并 使用化學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿 性磷酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖9B示出了實施電印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微管蛋 白后獲得的結(jié)果，其中使用常規(guī)的濕轉(zhuǎn)移方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并使用 化學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷 酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖IOA示出了實施常規(guī)的印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微 管蛋白后獲得的結(jié)果，其中使用IBLOT @設備將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并使用化學發(fā) 光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸酶耦 合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖IOB示出了實施電印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微管蛋 白后獲得的結(jié)果，其中使用IBLOT @設備將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并使用化學發(fā)光方 法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖IlA示出了實施常規(guī)的印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微 管蛋白后獲得的結(jié)果，其中使用常規(guī)的濕轉(zhuǎn)移方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并使用化 學發(fā)光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸 酶耦合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；圖IlB示出了實施電印跡程序檢測在SW480全細胞裂解物中的肌動蛋白和微管蛋 白后獲得的結(jié)果，其中使用常規(guī)的濕轉(zhuǎn)移方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并使用化學發(fā) 光方法(使用HRP-耦合的二級抗體和ECL檢測；上面板)或顯色方法(使用堿性磷酸酶耦 合的二級抗體和WESTERNBREEZE 檢測試劑；下面板)檢測信號；

圖12A示出了使用TOSTERBREEZE 方案實施常規(guī)印跡程序檢測在大腸桿菌 細胞裂解物中的蛋白后獲得的結(jié)果，使用化學發(fā)光方法，采用AP-耦合的二級抗體和 WESTERNBREEZE CL試劑檢測信號；圖12B示出了使用TOSTERBREEZE 方案實施兩步印跡程序檢測在大腸桿菌 細胞裂解物中的蛋白后獲得的結(jié)果，使用化學發(fā)光方法，采用AP-耦合的二級抗體和 WESTERNBREEZE CL試劑檢測信號；圖13A示出了在單個步驟中對A341裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電 免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級(抗-EIF)和二級抗體(單克隆抗-小 鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖1 示出了在單個步驟中對HeLa細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與 電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級(抗-ERK)和二級抗體(單克隆抗-小 鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖14A示出了在兩個連續(xù)步驟中對純化的牛血清白蛋白(BSA)進行常規(guī)的免疫印 跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗-BSA)指示的 稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來，將二級抗體 (單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進 行電印跡。圖14B示出了在兩個連續(xù)步驟中對SW480細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面 板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗微管蛋白和抗肌動蛋 白)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來，將 二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單 個步驟中進行電印跡。圖14C示出了在兩個連續(xù)步驟中對HeLa細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面 板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗-P70)指示的稀釋液應 用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆 抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印 跡。圖14D示出了在兩個連續(xù)步驟中對SW480細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面 板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗-P53)指示的稀釋液應 用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖15A示出了在對電印跡方案中指明的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對HeLa細胞裂 解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級 抗體(抗-4E-BP1)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印 跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指 示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖15B示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對SW480細胞 裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一 級抗體(抗連環(huán)蛋白)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中 進行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基 質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖15C示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對兔HCG進行 常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(兔 抗-HCG)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下 來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件 在單個步驟中進行電印跡。圖15D示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對純化的 GST-標簽EGFR進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié) 果。將一級抗體(抗-EGFR)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中 進行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基 質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖15Ε示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對純化的HeLa 細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。 將一級抗體(抗-ΙΚΚ)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行 電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使 用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖16Α示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對從表達重組 組氨酸-標簽的Src蛋白的HeLa細胞中制備的細胞裂解物進行常規(guī)的免疫印跡(左面板) 與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗-His)指示的稀釋液應用到 載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小 鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖16B示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對重組 Positope進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將 一級抗體(抗指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印 跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指 示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖16C示出了在對電印跡方案中指示的抗原-抗體對進行優(yōu)化后，對重組 Positope進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。將一級抗體(抗-Myc)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電 印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用 指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖17A示出了使用SW480細胞裂解物對使用SNAPi. d.蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(微孔；中 心面板)進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。根 據(jù)制造商的指示，使用指示的抗體稀釋液進行SNAPi. d.。對電印跡而言，將一級抗體(抗胰 島素)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下來， 將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在 單個步驟中進行電印跡。圖17B示出了使用純化的GST-標簽EGFR對使用SNAPi. d.蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(微 孔；中心面板)進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié) 果。根據(jù)制造商的指示，使用指示的抗體稀釋液進行SNAPi. d.。對電印跡而言，將一級抗體 (抗EGFR)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。接下 來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件 在單個步驟中進行電印跡。圖17C示出了使用純化的SW480裂解物對使用SNAPi. d.蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(微孔； 中心面板)進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié)果。 根據(jù)制造商的指示，使用指示的抗體稀釋液進行SNAPi. d.。對電印跡而言，將一級抗體(抗 微管蛋白和抗肌動蛋白)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進 行電印跡。接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)， 使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。圖17D示出了使用純化的大腸桿菌裂解物對使用SNAPi. d.蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(微 孔；中心面板)進行常規(guī)的免疫印跡(左面板)與電免疫印跡(右面板)比較所獲得的結(jié) 果。根據(jù)制造商的指示，使用指示的抗體稀釋液進行SNAPi. d.。對電印跡而言，將一級抗體 (抗大腸桿菌)指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的條件在單個步驟中進行電印跡。 接下來，將二級抗體(單克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀釋液應用到載體基質(zhì)，使用指示的 條件在單個步驟中進行電印跡。圖18A示出了對比核酸印跡試驗；圖18B示出了根據(jù)一個實施方案，使用與固相支持物相耦合的標記核酸探針進行 的電印跡試驗；圖18C示出了根據(jù)一個替代實施方案，使用與固相支持物相耦合的標記核酸探針 進行的電印跡試驗。本發(fā)明易進行各種變化和具有各種替代形式。本發(fā)明具體的實施方案通過實施例 和附圖列出并將在本文中詳細描述。附圖不能縮放。應當理解附圖和詳述并非是將本發(fā)明 限制為特定的形式，相反，本發(fā)明意在涵蓋落在本發(fā)明所附權利要求書的精神和范圍之內(nèi) 的所有變化、等價物和替代物。發(fā)明詳述定義本說明書通篇使用的術語通常具有在本領域中一般的意義，如在本發(fā)明的上下文中和其中使用術語的具體的上下文中。以下或在說明書的其它地方對一些術語進行了討 論，以為實施者在描述本發(fā)明的裝置和方法以及如何使用他們提供附加指導。應理解相同 的事物可用一種以上方式表述。因此，可對本文討論的一個或多個術語應用替代性的語言 和同義詞，術語是否在本文中詳加闡述和討論并不重要。本文為某些術語提供了同義詞。對 一個或多個同義詞的詳述并不妨礙其它同義詞的使用。說明書中任何地方的實例，包括本 文討論的任何術語的實例的應用僅用于說明，絕非為了限制本文所述的任何實施方案或任 何示例性術語的范圍和意義。本文使用的術語“免疫印跡”與術語“蛋白質(zhì)印跡”同義。除非另外說明，為了本 發(fā)明的公開，這兩個術語可互換使用。術語“Southern印跡”是分子生物學中檢查DNA樣品中DNA序列存在的慣用方法。 Southern印跡將用于DNA大小分離的瓊脂凝膠電泳與轉(zhuǎn)移分離大小的DNA至過濾膜的方法 組合起來，用于探針(通常為核酸)雜交和隨后的檢測。術語“northern印跡”是一種與Southern印跡基本相同的方法，不同之處在于，檢 測的目標分子為RNA而非DNA。因此，盡管并不必要，要進行northern印跡的RNA樣品的電 泳通常在變性條件下進行。與目標RNA分子進行雜交的探針通常為核酸(即，DNA、RNA或 PNA)探針。術語“蛋白質(zhì)印跡”和“免疫印跡”可互換使用，是指用于檢測給定的組織均質(zhì)物 或提取物樣品中的特異蛋白的分析技術。它采用凝膠電泳通過多肽長度(變性條件)和蛋 白的3-D結(jié)構(gòu)(天然/非變性條件)分離天然或變性蛋白。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上(通常 為硝酸纖維素膜或PVDF)，使用目標蛋白的特異性抗體檢測這些蛋白。本文使用的術語“凝膠基質(zhì)”和“凝膠基體”等通常是指離散單位的膠體基質(zhì)，其 中膠體含有離子源、緩沖液和使該基體適用于電泳的其它成分。術語“基本并列”，當在上下文中使用兩個表面“基本并列”時，通常是指這兩個表 面基本連續(xù)的表面接觸。在本發(fā)明的上下文中，該術語是指兩個并列物體至少50%表面是 連續(xù)表面接觸的。本文使用的術語“基本干”是為了表明不需要其它水性緩沖液的槽來實施本發(fā)明 所述的實施方案。這并非是指不含液體，而是指應用的水性緩沖液為最小化且不需要容器 裝水。液體的應用是為了使檢測分子，例如抗體或核酸探針應用到載體基質(zhì)。同樣的，液體 被用來形成凝膠基質(zhì)層。本文使用的術語“電印跡”、“電增強印跡”、“電輔助印跡”等可互換使用，是指對檢 測分子(例如一級或二級抗體、核酸探針、寡核苷酸、適配子、低聚物、多肽或寡肽或任何前 述標記的類型)施加電場，使檢測分子與目標分析物(即，與具有高度特異性的檢測分子耦 合的分子)接近。術語“電印跡”可能是指這些實施方案中的一小類，其中，檢測分子或目 標分析物或其兩者為抗體或抗原/抗體對。電印跡系統(tǒng)本發(fā)明實施方案提供了一種基本干式的電印跡系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括其中定位有一種 或多種載體基質(zhì)的電印跡層(stack)。所述電印跡層包括陽極、陽極凝膠基體、陰極、定位 于陰極之間的陰極凝膠基體，其中陽極凝膠基質(zhì)和陰極凝膠基質(zhì)各自含有電泳轉(zhuǎn)移用離子 源。電印跡層還包括至少一種可定位于陽極凝膠基質(zhì)和陰極凝膠基質(zhì)間的載體基質(zhì)。載體基質(zhì)可為板狀形式。根據(jù)本發(fā)明實施方案的電印跡層被配置為能接受位于兩種凝膠體基質(zhì)間的蛋白 或核酸印跡膜(或更簡單的“印跡膜”)。所述印跡膜可為本領域中實施免疫或核酸印跡程 序所用的任何類型的膜。這些類型多樣的膜為本領域技術人員所熟知，且通過非限制性實 施例包括，硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。應用該系統(tǒng)之前，可由最終的用戶提供印跡膜。所述印跡膜通常具有與印跡膜耦 合的一種或多種生物分子樣品(例如多糖、蛋白、肽或核酸)。生物分子樣品能夠可逆或不 可逆地與這種印跡膜耦合。使生物分子樣品與印跡膜耦合的方法在本領域中廣為人知，且 可以包括，但不限于，濕式、半干式和干式電泳轉(zhuǎn)移方法。示例性的非限制的干式電泳轉(zhuǎn)移 方法描述于Margalit等的美國專利申請公開號2006/0278531和20060272946，這兩件申請 被本申請共同享有，并以參閱的方式明確地全文并入與此。=本領域技術人員熟知的其它 可使生物分子樣品耦連至固相膜支持物的方法包括，但不限于，斑點印跡、測定點位、真空 轉(zhuǎn)移和毛細血管轉(zhuǎn)移。在一些實施方案中，電印跡系統(tǒng)可不含任何外來緩沖液或在使用中用來容納液體 或水性緩沖液或為系統(tǒng)提供液體或水性緩沖液的槽。在這個意義上，本發(fā)明所述的電印跡 系統(tǒng)可描述為“干式”或“基本干式”。這樣的說法并非意味著該系統(tǒng)完全不含液體，而是指 不需要額外供應緩沖液以實施本發(fā)明的多個實施方案。例如使用術語“干式”或“基本干式” 并不是指將印跡緩沖液吸收到載體基質(zhì)上無需應用水性緩沖液即可實現(xiàn)。也不是指，例如 不適用緩沖液進行洗滌步驟。相反，該術語意在表示不需要外源的水性緩沖液或液體緩沖 液槽來為系統(tǒng)供應電泳用的離子源。相反，在一些實施方案中，電印跡系統(tǒng)的一個或多個組 件(Component)，例如印跡膜、載體基質(zhì)或置于印跡層的各層之間的一張或多種過濾紙可在 應用系統(tǒng)前進行潤濕。然而，在本發(fā)明設計的電印跡系統(tǒng)中，濕潤一個或多個系統(tǒng)部件，例 如含水的印跡膜或過濾紙板，洗滌劑溶液，溫育緩沖液，預雜交緩沖液或其它水溶液對于提 供驅(qū)動電泳轉(zhuǎn)移所需的離子而言并不必要。構(gòu)建系統(tǒng)，使當電流通過陽極和陰極之間時，電印跡程序中使用的吸附在載體基 質(zhì)上的分子(例如封閉劑、一級抗體、二級抗體、核酸探針等等)從載體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到與其并 列的印跡膜上，其中，這些分子與存在于與膜表面耦合的生物分子樣品中的適當抗原耦合。因此，組裝的系統(tǒng)提供了從陰極到陽極的電學連接，其中電流從陰極通過陰極凝 膠基體，一種或多種載體基質(zhì)，印跡膜和陽極凝膠基體通到陽極。因而在一些實施方案中， 陰極凝膠基體的一面與陰極接觸，陰極凝膠基體的另一面直接或間接與陰極層的載體基質(zhì) 電接觸。陽極凝膠基體的一面與陽極接觸，陽極凝膠基體的另一面直接或間接與陰極層的 載體基質(zhì)電接觸?，F(xiàn)在回到圖1，按照特定實施方案，使用之前或使用過程中對電印跡系統(tǒng)，包括對 其零件，和它們的組裝和結(jié)構(gòu)進行詳細的論述。在不脫離本發(fā)明精神和范圍前提下，這對本 領域技術人員來說當然是顯而易見的，即電印跡系統(tǒng)的各種可替換的實施方案還包括下文 中沒有提及的另外的零件，只要該零件沒有影響到上述的系統(tǒng)的功能。圖IA所示的是電印跡層的一個實施方案。電印跡層100可包括下層102和上層 104。下層102也可稱為陽極組件102。同樣地，上層104也可被稱為陰極組件104。在一個實施方案中，下層102可包括陽極105和陽極凝膠基質(zhì)(gel matrix) 106，上層104可包括陰極107和陰極凝膠基質(zhì)108。在一個實施方案中，陽極105可物理連接 到陽極凝膠基質(zhì)106。陽極105可電學連接到陽極凝膠基質(zhì)106。在一個實施方案中，陰極 107可物理連接到陰極凝膠基質(zhì)108。陰極107可電學連接到陰極凝膠基質(zhì)108。物理和電 學連接電極到凝膠基體不是互斥的。在一個實施方案中，陽極105的表面可并列至少一份 陽極凝膠基質(zhì)106的表面，如圖IA所示。同樣地，陰極107的表面可并列至少一份陰極凝 膠基質(zhì)108的表面。在一個可選的實施方案中，以至少一份陽極105屬于或嵌入到一份陽 極凝膠基質(zhì)106這樣的方式制備下層102。同樣地，以至少一份陰極107屬于或嵌入到一份 陰極凝膠基質(zhì)108這樣的方式制備上層104。在一個實施方案中，陽極和陰極凝膠基體的長度和寬度以置于其中的蛋白印跡膜 的上下表面與至少一個凝膠基體的表面接觸這樣的方法進行選擇。典型地，陽極凝膠基體 和陰極凝膠基體的尺寸基本相似。典型地，陽極凝膠基體和陰極凝膠基體的尺寸基本同與 其連接的電極的尺寸相似。在一個實施方案中，至少一面陽極凝膠基體的長度和至少一 面陰極凝膠基體的長度的范圍為約2 約25cm，約5 約20cm，約8 約15cm，約10 約12cm。同樣地，另一面陽極凝膠基體的長度和至少一面陰極凝膠基體的長度的范圍為約 2 約25cm，約5 約20cm，約8 約15cm，約10 約12cm。在一個實施方案中，每個凝膠 基體的厚度范圍為約1 約15mm，約2 約10mm，約3 約5mm。在一個實施方案中，陽極和陰極的尺寸與相應的凝膠基質(zhì)可基本相同。在一個可 選的實施方案中，電極尺寸可基本小于相應的凝膠基體。凝膠基體電印跡系統(tǒng)的陽極凝膠基體和陰極凝膠基體可含有相同或不同的組合物。例如， 電印跡系統(tǒng)的陽極凝膠基體和陰極凝膠基體可含有相同或不同的凝膠形成聚合物，或一種 或多種不同濃度的通用凝膠形成聚合物。電印跡系統(tǒng)的陽極凝膠基體和陰極凝膠基體可含 有相同或不同的緩沖液，或可含有不同濃度的通用緩沖液。陽極凝膠基質(zhì)可包括一種或多 種陰極凝膠基質(zhì)中不含有的其它化合物。陰極凝膠基質(zhì)可包括一種或多種陽極凝膠基質(zhì)中 不含有的其它化合物。凝膠基體(陽極凝膠基體或陰極凝膠基體)可包括瓊脂、丙烯酰胺、礬土、硅石、 淀粉或其它多糖，如殼聚糖、樹膠(如，黃原膠、結(jié)冷膠)、卡拉膠、果膠或能形成凝膠的聚 合物，或這些的任意組合。在一個實施方案中，陰極凝膠基體可包括如濃度為約2. 5 約 30%，或約5 約20%的丙烯酰胺。在一個實施方案中，陰極凝膠基體可包括如以濃度為約 0. 1 約5%，或約0. 5 約4%，或約1 約3%的瓊脂。在一個實施方案中，陰極凝膠基 體包括丙烯酰胺和瓊脂，例如，陰極凝膠基體可包括約2. 5 約30%的丙烯酰胺和約0. 1 約5%的瓊脂，約5 約20%的丙烯酰胺和約0. 2 約2. 5%的瓊脂。陽極凝膠基質(zhì)和陰極凝膠基質(zhì)的用于電泳轉(zhuǎn)移的離子源自如鹽、酸、堿或緩沖液 或其組合。在一個實施方案中，陰極凝膠基體可包括至少一種緩沖液，如有機緩沖液。陰 極凝膠基質(zhì)的緩沖液可為兩性離子緩沖液。在特定的實施方案中，載體基質(zhì)包括電印跡的 蛋白質(zhì)或多肽，陰極凝膠基體可包括PKa為約6. 5 約8. 5，或約7 約8的緩沖液。陰極 凝膠基質(zhì)中的緩沖液可以約IOmM 約IM的濃度存在，例如，濃度為約20 約500mM，為約 50 約300mM，或為約60 約150mM。在一個實施方案中，陰極凝膠基體可包括非限制性實例為2-(N_嗎啉)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-2-牛磺酸(ACES)、哌嗪-N，N' -2-乙磺酸(PIPES)、2_(N_ 嗎 啉)-2-羥基-丙磺酸(MOPSO)、N，N-雙-(羥乙基)-2-?；撬?BEQ、3_ (N-嗎啉)-丙磺酸 (MOPS)、N-2-羥基乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3_ (N-三-(羥甲基)甲基氨基)~2~羥 基丙磺酸(TAPSO)、3-(N，N-雙[2-羥乙基]氨基)-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N_ (2-羥乙基) 哌嗪-N' -(2-羥基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2_羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N_[雙(羥甲 基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-雙羥乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羥基-1，1-雙 (羥甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPQ、N-(1，1-二甲基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥 基丙磺酸(AMPS0)、三(羥甲基)氨基-甲烷(Tris)、或雙[2-羥乙基]亞氨基-三-[羥 甲基]甲烷(BisTris)?？蛇x地，陰極凝膠基質(zhì)、陽極凝膠基質(zhì)或兩者可包括離子交換基體。例如，陽極凝 膠基質(zhì)可選擇性的包括一個陽離子交換基體。陰極凝膠基質(zhì)可選擇性的包括一個陰離子交 換基體，例如DEAE纖維素。離子交換基體可裝載有離子，如緩沖離子，例如，DEAE離子交換 基體，可裝載有Tricine陰離子。陰極凝膠基體可進一步包括乙二醇、醇、一種或多種去污劑、一種或多種抗真菌劑 或者一種或多種抗蝕劑等。陽極凝膠基質(zhì)的用于電泳轉(zhuǎn)移的離子可源自鹽、酸、堿或緩沖液。在一個實施方案 中，陽極凝膠基體可包括至少一種緩沖液，如有機緩沖液。陽極凝膠基質(zhì)的緩沖液可為兩性 離子緩沖液。在特定的實施方案中，載體基質(zhì)包括電印跡的蛋白質(zhì)或多肽，陽極凝膠基體 可包括PKa為約6 約8，或約6. 2 約7. 2的緩沖液。陽極凝膠基質(zhì)中的緩沖液可以約 IOmM 約IM的濃度存在，例如，濃度為約20 約500mM，為約50 約300mM，或為約60 約 150mM。在一個實施方案中，陽極凝膠基體可包括2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰 胺基)-2-?；撬?ACES)、哌嗪-N，N' -2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-嗎啉)-2-羥基-丙磺酸 (MOPSO)、N，N-雙_(羥乙基)-2-牛磺酸(BES)、3_(N_嗎啉)_丙磺酸(MOPS)、N-2-羥基 乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3_ (N-三-(羥甲基)甲基氨基)_2_羥基丙磺酸(TAPSO)、 3-(N，N-雙[2-羥乙基]氨基)-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-羥乙基)哌嗪-N' _(2_羥 基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2_羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[雙(羥甲基)_甲基]甘氨 酸(Tricine)、N，N_雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羥基-1，1_雙(羥甲基)乙基) 氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-(1，1-二甲基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥基丙磺酸(AMPSO)、三 (羥甲基)氨基-甲烷(Tris)、或雙[2-羥乙基]亞氨基-三-[羥甲基]甲烷(BisTris)。不使本發(fā)明受任何特殊的機理的限制，預期為存在于電印跡系統(tǒng)中的陽極凝膠 基質(zhì)上的一種或多種陰離子可隨著迅速遷移到陽極，有助于遷移的大分子的電泳濃度，其 中，所述的陰離子在電泳轉(zhuǎn)移中當電場形成時移動相對較快，所述的大分子被吸收到下文 更為詳述的載體基質(zhì)上，同樣也是移動到陽極，但是在無快速移動的陰離子的部分電場中 移動。電場運動的上下文中，在快速移動的陰離子(即，它們更遠離陽極)后面遷移的大分 子可經(jīng)歷電泳濃度，隨著快速移動陰離子迅速移動到陽極，陽極凝膠基質(zhì)的快速移動離子 的消耗放大了這種電泳濃度。陽極凝膠基質(zhì)唯一提供的陰離子化合物的作用也適合于與在陽極凝膠基質(zhì)中相 比，以顯著降低的濃度存在于陰極凝膠基質(zhì)中的陰離子化合物。本申請中所述的“顯著降低的濃度”是指在電印跡系統(tǒng)或儀器的陰極凝膠基質(zhì)中的陰離子緩沖化合物的濃度是陰極凝 膠基質(zhì)中的陰離子緩沖化合物的濃度的0. 5倍或更小，0. 2倍或更小，或0. 1倍或更小。因 此，在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)的陰極層和陽極層可包括相同的陰離子化合物，其中， 陰極層和陽極層中化合物的濃度不同。電印跡儀器、設備或系統(tǒng)的陽極凝膠基質(zhì)含有，陰極凝膠基質(zhì)不含有或以顯著降 低的含量含有的化合物可為緩沖化合物，其在電泳轉(zhuǎn)移過程中，以陰離子的形式存在于電 印跡系統(tǒng)中，在本申請中被稱為“陰離子緩沖化合物”。陽極凝膠基質(zhì)含有，陰極凝膠基質(zhì) 不含有(或在陰極凝膠基質(zhì)中以顯著降低的含量存在)的陰離子緩沖化合物相對于一些其 它緩沖化合物，移動較快，包括如陰極凝膠基質(zhì)中含有的其它的陰離子緩沖化合物。因此， 在陽極凝膠基質(zhì)中優(yōu)選使用的陰離子緩沖化合物的選擇部分取決于陰極凝膠基質(zhì)中含有 的陰離子化合物(如緩沖液)、陽極和陰極凝膠基質(zhì)中的緩沖液PH值、陰離子緩沖化合物 的PKa值。例如，電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(于中性pH值附近進行電印跡)中的陽極凝膠基質(zhì)所含有 的陰離子緩沖化合物包括PKa為中性(pH為約6. 0 約7. 0)或在一些實施例為pH6. 0 8. 0，至少0. 51og單位以下，例如，陰極凝膠基質(zhì)含有的一種或多種緩沖化合物的pKa為約 Ilog單位以下。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)的陽極凝膠基質(zhì)可包括一種陰極凝膠基質(zhì)中不存 在的陰離子緩沖化合物，其中，陰離子化合物的PKa接近或低于中性或在中性或接近中性 PH時作為陰離子存在。在一個實施方案中，該化合物可為生物緩沖液，其pKa小于約7. 5，小 于約7. 2，在一些實施方案中，低于7. 0，其中，該生物緩沖化合物在電泳過程中在溶液中形 成離子。在特定的說明性方面，陰離子緩沖化合物的PKa小于7. 5,7. 4,7. 3,7. 2,7. 1,7. 0、 6. 9、6· 8、6· 7、6· 6 或 6. 5?？纱嬖谟陉枠O凝膠基質(zhì)但不存在陰極凝膠基質(zhì)中的陰離子化合物的非限制性實 例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸酯、檸檬酸、天冬氨酸、谷氨酸、馬來酸、甲次砷酸鹽、 N-三(羥甲基)-2-乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES) ,N-(2-乙酰胺基)亞氨基二 乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-?；撬?ACES)、哌嗪-N，N' -2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-嗎 啉)-2-羥基-丙磺酸(MOPSO)、N，N-雙-(羥乙基)-2-牛磺酸(BEQ或3- (N-嗎啉)-丙 磺酸(MOPS)。該陰離子緩沖化合物可在電印跡系統(tǒng)中使用，其中，陰極室中陰離子化合物 的PKa值大于陽極室中的陽離子化合物的pKa值。在這些實施方案中，系統(tǒng)的陰極室可包 括如，一種或多種甘氨酸、N-2-羥基乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEQ、3-(N-三-(羥甲 基)甲基氨基)-2-羥基丙磺酸(TAPS0)、3-(N，N-雙[2-羥乙基]氨基)_2_羥基丙磺酸 (DIPSO)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-羥基丙磺酸)(HEPPSO) ,4-(2-羥乙基)_1_哌嗪 丙磺酸(EPPS)、N-[雙(羥甲基)_甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸 (Bicine)、(2-羥基-1，1-雙(羥甲基)乙基)氨基]丙磺酸(TAPS)和N-(l，l-二甲 基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥基丙磺酸(AMPSO)。在一些實施方案中，陽極凝膠基質(zhì)中存在的，陰極凝膠基質(zhì)不存在(或在陰極凝 膠基質(zhì)中以顯著降低的含量存在)的陰離子化合物是一種兩性離子緩沖液，其PKa值接近 或低于中性，如MES、MOPOS, BES、MOPS或ACES。在陽極凝膠基質(zhì)中包括一種或多種這些緩 沖液電印跡系統(tǒng)可選的，在陰極室中包括一種兩性離子緩沖液，其PKa值接近或高于中性， 如 Tricine、Bicine、TAPS、TAPSO 或 AMPSO。
電印跡系統(tǒng)的陽極凝膠基質(zhì)中存在的，陰極凝膠基質(zhì)不存在(或在陰極凝膠基質(zhì) 中以顯著降低的含量存在)的陰離子形成緩沖化合物一任意濃度存在，但典型地，陽極凝 膠基質(zhì)中存在的濃度為至少10mM，濃度為約IOmM 約1M，濃度為約20mM 約500mM，在一 些實施方案中，濃度為50mM 300mM。如上所述，在一些電印跡系統(tǒng)的實施方案中，陽極凝膠基體與陽極接觸。在一些實 施方案中，陽極連接到或與陽極凝膠基體的第二面并列，其中，陽極凝膠基體的第二面與接 觸蛋白質(zhì)印跡膜的陽極凝膠基體的第一面相反。陽極可包括任何適合的導電材料，可為任意形狀，例如，陽極可為層狀，包括非金 屬導電材料、線圈結(jié)構(gòu)、包含非金屬導電材料的網(wǎng)、金屬箔、金屬網(wǎng)和/或其任意組合。在特 定實施方案中，電導電極可包括涂布有導電的金屬或非金屬的絕緣聚合物。涂布有導電材 料的絕緣材料電極可為層狀、網(wǎng)狀或其他結(jié)構(gòu)。電極還可包括一種或多種導電非金屬材料， 如石墨、碳、導電聚合物和或其任意組合。陽極可包括，例如導電聚合物、鉬、不銹鋼、碳、石 墨、鋁、銅、銀或鉛。使用電化學可電離的金屬陽極使電泳轉(zhuǎn)移發(fā)生在無氧排出的陽極，因為 金屬銅而不是水被優(yōu)先電離。在一些實施方案中，陽極可包括一次性的銅電極。在其它的 實施方案中，陽極可包括鋁。在一些實施方案中，陽極可包括一次性的鋁電極。還有可能根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，(使用各種不同的金屬沉淀方法)在導 電的基體上沉淀或涂布金屬銀(例如但不限于銅網(wǎng)或柵條或碳或基于石墨的織物、或者 甚至電導聚合物的薄層)。可用于將金屬銀涂布到該導電電極的方法可包括，如蒸汽淀積 (CVD)方法、將電極浸在熔化的銀中涂布銀、電鍍方法、用分散在適宜的粘度提高的組合物 或制劑的銀離子進行噴涂的方法、在水溶液或非水溶液中開展的化學沉淀法(如，將導電 電極浸沒于含有葡萄糖的含氨硝酸銀溶液中，這在鍍銀制備鏡子領域是公知的)等。因此， 可使用任何適合的銀涂布或沉淀或本領域公知的涂刷方法獲得本發(fā)明的金屬銀涂布的電 極。在一個實施方案中，陰極凝膠基體與陰極接觸。陰極可連接到或與陰極凝膠基體 的第二面并列，其中，陰極凝膠基體的第二面與接觸載體基質(zhì)的陰極凝膠基體的第一面相 反。陰極可包括任何適合的導電材料，可為任意形狀，例如，陰極可為層狀，包括非金屬導電 材料、包含非金屬導電材料的網(wǎng)、金屬箔、金屬網(wǎng)和/或其任意組合。在特定實施方案中，電 導電極可包括涂布有導電的金屬或非金屬的絕緣聚合物。涂布有導電材料的絕緣材料電極 可為層狀、網(wǎng)狀或其他結(jié)構(gòu)。電極還可包括一種或多種導電非金屬材料，如石墨、碳、導電聚 合物和或其任意組合。陰極可包括，例如導電聚合物、鉬、不銹鋼、碳、石墨、鋁、銅、銀或鉛。 在一些實施方案中，陰極可包括一次性的銅電極。在其它實施方案中，陰極可包括吸收電泳 轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生的氫氣的鈀。在一些實施方案中，陰極可包括一次性的鋁電極。在一些實施方案中，陽極和陰極分別可與陽極凝膠基體和陰極凝膠基體的長度和 寬度相同或相似。與凝膠基體并列或嵌入到凝膠基體的陽極或陰極的表面不需要連續(xù)；例 如，電極可為線網(wǎng)或線圈結(jié)構(gòu)。在該實施方案中，電極表面與凝膠基質(zhì)接觸或嵌入到凝膠基 質(zhì)可被認為是與凝膠基質(zhì)并列的電極結(jié)構(gòu)表面的外部尺寸定義。在一些實施方案中，與陽 極凝膠基體并列的陽極表面接觸至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %或至 少95%的與陽極凝膠基質(zhì)并列的陽極凝膠基質(zhì)的面。與陽極凝膠基體并列的陽極表面的面積和與陽極凝膠基質(zhì)并列的陽極凝膠基質(zhì)的面的表面積基本相同。例如，對于通常的矩 形、卵形或圓形電極和凝膠基體，陽極的長度和寬度為陽極凝膠基體的長度和寬度的20% 以內(nèi)，為陽極凝膠基體的長度和寬度的10%以內(nèi)，如陽極凝膠基體的長度和寬度的5%以 內(nèi)，如陽極凝膠基體的長度和寬度的2%以內(nèi)。在該實施方案中，陽極凝膠基體的長度和寬 度可有利地與載體基質(zhì)和電印跡的印跡膜的長度和寬度緊密符合或更大。在一些實施方案中，與陰極凝膠基體并列的陰極表面接觸至少50%，至少60%， 至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的與陰極凝膠基質(zhì)并列的陰極凝膠基質(zhì)的面。 與陰極凝膠基體并列的陰極表面的面積和與陰極凝膠基質(zhì)并列的陰極凝膠基質(zhì)的面的表 面積基本相同。例如，對于通常的矩形、卵形或圓形電極和凝膠基體，陰極的長度和寬度為 陰極凝膠基體的長度和寬度的20%以內(nèi)，為陰極凝膠基體的長度和寬度的10%以內(nèi)，如陰 極凝膠基體的長度和寬度的5%以內(nèi)，如陰極凝膠基體的長度和寬度的2%以內(nèi)。在該實施 方案中，陰極凝膠基體的長度和寬度可有利地與載體基質(zhì)和電印跡的印跡膜的長度和寬度 緊密符合或更大。因此，在特定的實施方案中，系統(tǒng)含有與陽極凝膠基體接觸的陽極和與陰極凝膠 基體接觸的陰極，其中陽極凝膠基質(zhì)與蛋白質(zhì)印跡膜的一面接觸，其中陰極凝膠基質(zhì)與載 體基質(zhì)的一面接觸，其中載體基質(zhì)的另一面與陽極凝膠基體和陽極上的蛋白質(zhì)印跡膜。在 一些實施方案中，陰極、陰極凝膠基體、陽極和陽極凝膠基體的長度和寬度相同或相近。在一些實施方案中，陽極、陰極或兩者作為電源或包含印跡層的設備不可或缺的 部分(意味著每次印跡過程后不能被使用者分開)。在另一個實施方案中，陽極和陰極可從 電源或設備中分離出來。例如，電極可為一次性電極，作為電極組件的一部分或從凝膠基體 中分離出來。從凝膠體積中分離的電極可連接到電印跡設備，之后可將凝膠基體裝入該設 備，這樣它接觸電極或電極和凝膠基體可置于電極夾內(nèi)，如托盤或保持架，其中，電極夾可 連接到或裝入電印跡設備。在一些實施方案中，陽極、陰極或兩者作為電極組件的一部分連接到凝膠基體，例 如，陽極或陰極可使用緊固件或電極夾連接，將電極置于凝膠基體的反方向。在特定的實施 方案中，陽極和陰極至少部分嵌入到陽極凝膠基質(zhì)中。例如，凝膠基質(zhì)可通過將未固化的凝 膠組分倒在電極上或通過使用凝膠擠壓技術制備凝膠基體，這樣電極的至少一面被凝膠基 質(zhì)部分涂布或嵌入。在特定的實施方案中，在電泳轉(zhuǎn)移之前或轉(zhuǎn)移過程中，將凝膠基體置于 塑料托盤中，方向與導電電極相反。至少塑料托盤的一個區(qū)域包含導電材料，用于電路連接 電極和電源或電力源頭的電接觸。重新回到圖1A，電印跡系統(tǒng)可包括電源109、接觸陽極105的第一個電接觸110和 接觸陰極107的第二個電接觸111。電源可具有在印跡過程中放置印跡層的基部。在一些 實施方案中，陽極、陰極或兩者與系統(tǒng)電源不可分割。在其它的實施方案中，陽極、陰極或兩 者可獨立于但通過電學連接連接到電源上。電源109和電學連接110和111可進行設置， 這樣電流在頂層和底部層之間流通。在一些實施方案中，印跡層100可包括置于如圖IA所示的陽極和陰極組件之間的 載體基質(zhì)112。在一個實施方案中，最接近陽極層的載體基質(zhì)112的表面可與陽極凝膠基 質(zhì)106并列，陽極凝膠基質(zhì)106與連接到陽極105的表面相反，由此，這種并列通過如下詳 述的將印跡膜裝入其中實現(xiàn)。同樣，最接近陰極層的載體基質(zhì)112的表面可與陰極凝膠基質(zhì)108并列，陰極凝膠基質(zhì)108與連接到陰極107的表面相反。這種構(gòu)造確保了使用過程 中電流在載體基質(zhì)中的流動。目前預期的載體基質(zhì)的尺寸可基本同上層和/或下層的尺寸 相似?？蛇x地，載體基質(zhì)的尺寸可小于上層和/或下層的尺寸。在一個實施方案中，載體基質(zhì)的長度和寬度以與其并列的蛋白印跡膜的一面與載 體基質(zhì)的表面接觸這樣的方法進行選擇。典型地，載體基質(zhì)和蛋白印跡膜和/或凝膠基體 的尺寸基本相似。在一個實施方案中，至少一面載體基質(zhì)的長度的范圍為約2 約25cm，約 5 約20cm，約8 約15cm，約10 約12cm。本申請所用的載體基質(zhì)為層狀，其厚度為約5mm，小于約3mm，小于約2mm，小于約 Imm或小于約0. 5mm。在一些非限制性實施方案中，載體基質(zhì)的至少一面或兩面可基本是光 滑的。使用時，光滑的的載體基質(zhì)表面與連接有生物分子樣品的蛋白印跡膜的表面并列。 這樣做，基本可增加蛋白質(zhì)從載體基質(zhì)向蛋白質(zhì)印跡膜的轉(zhuǎn)移，降低了實驗結(jié)果中獲得“粒 狀”條帶的像素化的可能性。在一個實施方案中，載體基質(zhì)層可由天然原料、合成原料或其組合的纖維或微纖 維制成。適合在電印跡系統(tǒng)中使用的載體基質(zhì)可由能吸收0. 2 5ml，0. 5 2. 5ml, 0. 75 1.5ml的蛋白質(zhì)或雜交水溶液或緩沖液的原料制成。在特定的非限制性實施方案中，載體 基質(zhì)可由具吸收性的原料制成，這種具吸收性的原料可以基本上可逆地吸收蛋白質(zhì)或雜交 水溶液，并且最小化內(nèi)在的蛋白質(zhì)耦合能力。任何具有這些特性的原料都可以不受限制地 在本發(fā)明的實施中使用。理想的是，合適的載體基質(zhì)有這種材料制成，當這種材料被浸沒在 大量的水溶液中時，在浸沒到水溶液內(nèi)的lmin、2min、;3min、5min或IOmin以內(nèi)，釋放至少 約20 %，至少約35 %，至少約45 %，至少約50 %，至少約55 %，至少約60 %，至少約65 %， 至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%或至少約95%的吸收的 蛋白質(zhì)或雜交組合物到水溶液中的。這種檢測對具有本領域的公知常識的從業(yè)人員為技術 水平之內(nèi)的，這樣的從業(yè)人員無需過多的試驗即可進行操作。例如，檢測受試的原料是否 適合用于本發(fā)明實施方案的的載體基質(zhì)，本領域技術人員可在受試原料上吸收公知量的蛋 白質(zhì)或雜交溶液(含有可理解測量的蛋白質(zhì)，如BSA、IgG、酪蛋白、肌動蛋白、GAPDH等)， 并且將受試原料浸沒于公知體積的緩沖水溶液(如PBS)。一段時間過后，收集緩沖水溶液 中的樣品，測定從受試原料中釋放出的蛋白質(zhì)的量(如ELISA、定量蛋白質(zhì)印跡或其他相似 的技術)?？蛇x的，適宜的載體基質(zhì)可由這樣的原料制成，這種原料可在浸沒到水溶液內(nèi)的 lmin、2min、3min、5min或IOmin以內(nèi)，在膜上通至少20V、至少15V、至少10V、至少5V或至少 3V,釋放至少約20 %，至少約35 %，至少約45 %，至少約50 %，至少約55 %，至少約60 %，至 少約65 %，至少約70 %，至少約75 %，至少約80 %，至少約85 %，至少約90 %或至少約95 % 的吸收的蛋白質(zhì)或雜交組合物。以非限制性的實例方式，適宜在制備本發(fā)明的載體基質(zhì)層中使用的原料的實例可 包括聚酯纖維、聚碳酸酯纖維、玻璃微纖維、親水纖維素纖維、醋酯纖維、羥基化的聚酰胺纖 維(例如，L0PR0DYNE )、聚醚砜纖維、丙烯酸的共聚物纖維、混合的纖維素酯纖維、改性四 氟乙烯(PTFE)、濾紙、毛氈或其組合物或混合物。在一些實施方案中，載體基質(zhì)可包括一層或多層印跡紙。在一個實施方案中，載體 基質(zhì)可包括一層或多層印濾紙(如WHATMAN 濾紙)。在一個實施方案中，載體基質(zhì)可包括 一層或多層合成微纖維。在這種層中使用的合成微纖維可包括聚酯微纖維、聚酰胺微纖維或聚酯微纖維和聚酰胺微纖維的混合物。適宜本發(fā)明目的典型的聚酯微纖維/聚酰胺微纖 維層可通過從 Sadovsky Houshold products, Ltd. Ashdod, Israel 市售獲得?；氐綀DIA中，印跡層的一個實施方案中可進一步包含一個可選的第二個載體基 質(zhì)113。第二個載體基質(zhì)113同載體基質(zhì)112的尺寸、性狀和組成基本相同。在一些實施 方案中，第二個載體基質(zhì)113可同時與載體基質(zhì)112組裝于印跡層110中。例如，載體基質(zhì) 112可最接近底部層，第二個載體基質(zhì)113可最接近所示的頂層。在可選的實施方案中，載體基質(zhì)112和第二個載體基質(zhì)113可連續(xù)地并入層110 內(nèi)。例如，載體基質(zhì)112可首先在層110中使用。通電流以后，在其上吸收電泳轉(zhuǎn)移的蛋白 質(zhì)(如封閉液和至少一種初級抗體)完成后，棄掉載體基質(zhì)112，并用其上吸收了不同蛋白 質(zhì)(如，可選的封閉液和二級抗體)的第二個載體基質(zhì)113替換?，F(xiàn)在來看圖1B，所示的是電印跡系統(tǒng)的可選的實施方案。在這個實施方案中，電印 跡系統(tǒng)可包括托盤115。將托盤115的尺寸做成能接受一個或多個層110組件，如底部層 102。托盤115可為一次性的塑料托盤。電印跡系統(tǒng)可包括蛋白質(zhì)印跡膜116，由電印跡系統(tǒng)的使用者提供。在一個實施方 案中，膜116可與載體基質(zhì)112和113的尺寸基本相同。在一個實施方案中，膜116的尺寸 可小于載體基質(zhì)112和113。在一個實施方案中，膜116可與凝膠基體106和108的尺寸基 本相同。在一個實施方案中，膜116的尺寸可小于凝膠基體106和108的尺寸。膜116可 有任意原料制成，這種原料可使生物分子樣品的分子組分固定在其上面。作為非限制性實 例，膜116可包括紙、基于纖維素的印跡膜(如，但不限于硝酸纖維素或醋酸纖維素)、基于 硝酸纖維素(NC)的膜、基于聚酰胺的膜、或基于聚偏二氟乙烯(PVDF)的膜或這些膜的激活 或衍生版本(表面帶電荷的衍生物)或其組合物或混合物。圖IB所示的膜116包括第一個面117和第二個面118。在一些實施方案中，膜116 可包括在使用本發(fā)明的電印跡系統(tǒng)前耦合到其一面(如面117)上的生物分子樣品119。樣 品119可包括蛋白質(zhì)、核酸(如DNA或RNA)、碳水化合物、脂類或其任意組合物或混合物。 樣品119可進行衍生，例如來自于細胞或組織裂解液或其他生物樣品，如血清，可為生物分 子的復雜的混合物，或可為純化后的或部分純化后的。在一些實施方案中，可在耦合到膜116之前，通過電泳(如SDS-PAGE、瓊脂凝膠電 泳等)將樣品119的組分進行分離?？墒褂萌我獗绢I域認可的技術將樣品119耦合到膜 116中。這種技術也可被本領域稱為“電泳轉(zhuǎn)移”或更為簡潔“轉(zhuǎn)移”。各種轉(zhuǎn)移技術，包括 濕法、干法或半干法轉(zhuǎn)移技術，都是本領域公知的。適合本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)移方法的實例，但 不限于如描述于題為 “Protein Blotting =Areview" by B. Τ. Kurien and R. H. Scofield published in J. of Immunological methods, Vol. 274, pp. 1-15 Q003)，，的綜述文章，在美 國專禾Ij 5，482，613,5, 445，723,5, 356，772,4, 889，606,4, 840，714,5, 013，420 和美國公開 的申請2002157953中描述各種蛋白質(zhì)印跡方法包括濕法、干法或半干法電印跡方法，在美 國公開的申請20060278531和20060272946中描述了用于印跡凝膠的干法電印跡系統(tǒng)和其 使用方法，其中，該系統(tǒng)包括電印跡轉(zhuǎn)移層。上面所列的參考文獻在此明確地以引文的形式 全部并入本申請，盡管在此充分公開。其它本領域技術人員公知的用于將生物分子樣品耦 合到固體膜支持物的方法包括但不限于斑點印跡、點樣、真空轉(zhuǎn)移和毛細管轉(zhuǎn)移?；氐綀D1B，膜116可置于上層102和載體基質(zhì)112/113之間，這樣其面118基本同凝膠基體106并列，并且其面117和樣品119基本同所示的載體基質(zhì)并列?，F(xiàn)在來看圖1C，所示的為本發(fā)明的電印跡提供的一個實施方案。這個實施方案合 并了圖IA和IB所示的實施方案的改進，除了去除了托盤115。在這個實施方案中，組裝包 含陽極105和底部層102的陽極凝膠基質(zhì)106、陰極107和頂層104的陰極凝膠基質(zhì)108、 載體基質(zhì)112和113和膜116的印跡層100，并且將其零件按照上面詳細描述的進行適當?shù)?并列，并且在此也一并納入。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)可包括具有頂部121和底部122的外殼120。在一 些實施方案中，頂部121可通過電偶聯(lián)111耦合到電源109，并且底部122可通過電偶聯(lián)110 耦合到電源109，因此，可使電流通過外殼的頂部和底部。任何適合的外殼可用于該實施方 案的實施。特別適宜實施本發(fā)明的外殼的實例為IBL0T 系統(tǒng)(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)，描述于美國公開的專利申請20060278531和20060272946。在一個實施方 案中，外殼120的尺寸為可使層100在組裝時位于頂部121和底部122之間。在一個實施 方案中，陰極107、陽極109或陰極107和陽極109分別與頂部121和底部122電路流通，這 樣，可使使用者在陽極和陰極之間通電。在一個實施方案中，電印跡系統(tǒng)可選地包括海綿123。海綿123可為一次性的或可 多次使用的。在一個可選的實施方案中，海綿123可被一張或多張紙?zhí)鎿Q。使本發(fā)明不受 任何特殊的理論或機理限制，海綿123可包括在系統(tǒng)內(nèi)用來吸收外來的液體，這種液體是 在外殼120組裝后，使用過程中給印跡層施加壓力130使產(chǎn)生的。另外，海綿123還可用來 在指示方向上增加壓力130，這樣有助于確保所有并列的表面在使用中保持恒定和/或甚 至接觸。在一個實施方案中，海綿123可包括夾子124。在一個非限制性實例中，夾子124 可與至少兩個與其相反的表面并列，并且通過中心部125連接。在另一個實施方案中，夾子 IM可通過整個海綿123的主體。夾子IM可全部或部分的由任意導電原料制成，如金、銅、 銀、鋁、其合金、不銹鋼或?qū)щ娋酆衔锘蚓酆衔飯D層，這樣可確保在外殼頂部、陰極、印跡層、 陽極和外殼底部在使用中是電路連通的。實施電增強的分析物檢測的方法現(xiàn)在已經(jīng)描述了電印跡系統(tǒng)的組分以及在使用中彼此之間是如何組裝的，現(xiàn)在將 根據(jù)各種實施方案來描述使用這個系統(tǒng)來實施印跡程序的方法。應當注意，盡管接下來對使用目前的電印跡系統(tǒng)的實施方案的描述會提及各個實 施過程中的步驟，一種或多種的替換方法或步驟同樣是可能的，這對于本領域技術人員應 當顯而易見的，這些替換方法或步驟都包括在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。應當注意，無法詳細描 述任意一種或多種替換方法并不排除落在本發(fā)明保護范圍內(nèi)的方法的包含物，只要這些方 法落在目前描述的方法的總體精神和范圍內(nèi)，并使用一種或多種本發(fā)明公開的系統(tǒng)、方法 或儀器，如對于本領域技術人員來說顯而易見的屬于本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或儀器。例如，盡 管沒有描述的步驟以確定的順序出現(xiàn)，但本領域技術人員可根據(jù)具體的上下文，可輕易的 識別那些步驟中的特定的步驟，不按照下面詳述的順序也可以完成。作為非限制性實例，某 些情況下，母液，稀釋的抗體，漂洗液等可在操作之前制備，在后面的步驟中使用。另外，還 可以增加另外的一個或多個漂洗步驟、消脫泡步驟、封閉步驟等，盡管下面沒有進行詳細的 論述，但這些都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)?；氐綀D2，根據(jù)一個實施方案，概述完成電印跡過程的方法。為完成電印跡過程，使用可取一張生物分子樣品已經(jīng)耦合其表面上的蛋白質(zhì)印跡膜。典型的，制備樣品并通過電 泳進行分離(如SDS-PAGE)，之后將分離的分子轉(zhuǎn)移或固定到合適的固體支持物上。合適的 膜如上所述。使用者還可取具有如上所述的陽極和陽極凝膠基體較低配置?？蓪⒌鞍踪|(zhì)膜 置于該較低配置上，這樣沒有生物分子樣品的膜的一面與陽極凝膠基體的表面并列，與陽 極相反，如圖IC所示?？蛇x的，去除氣泡的步驟可用于去除蛋白質(zhì)印跡膜和陽極凝膠基質(zhì) 之間的任何氣泡。在一個實施方案中，印跡緩沖液典型地包括稀釋劑。稀釋劑可由使用者在使用前 制備，通?？墒惺刍蜃鳛樵噭┖械囊徊糠峙c本發(fā)明系統(tǒng)的各種部件一起提供。稀釋劑可包 括一種生理上可接受的水溶液，PH值為約4 約9，或約5 約8，或約6 約7. 5，并且 通常還含有至少一種緩沖劑，如磷酸鹽緩沖液、重碳酸鹽、TAPS、Bicine、Tris、Bis_Tris、 Tricine、HEPES, TES, MOPS、PIPES、甲次砷酸鹽、MES、醋酸鹽、ADA、ACES、乙醇胺、BES,乙酰 胺基甘氨酸或glycinaide。適合用于稀釋的緩沖液的實例包括但不限于，如PBS、Hank’ s 溶液、TBS、TE、TEN等。可選地，稀釋劑可包括去垢劑。適合的去垢劑可包括非離子型、非 變性去垢劑，如 Triton X-100、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij_35、Brij 58、 Tween-20, Tween-80、辛基葡糖苷和辛基硫代葡糖苷。稀釋劑可含有約0. 01 約5ν01%， 約 0. 05vol% 約 2vol. %，約 0. Ivol % t 約 1. 5vol. %，或約 0. 5vol% 約 Ivol. %適 當?shù)南礈靹?。在通常的步驟中，使用者可制備足夠的印跡緩沖液以吸附到載體基質(zhì)上。足 量的印跡緩沖液能足以浸泡載體基質(zhì)。通常使用者應制備至少1ml，至少anl，至少5ml，至 少10ml，或至少20ml適當?shù)挠≯E緩沖液。這個體積可用于該程序中的一個或多個步驟?；氐綀D2A，印跡緩沖液可包括一種或多種封閉試劑。封閉試劑用于在使用一種或 多種一級抗體或一種或多種二級抗體檢測之前，封閉蛋白質(zhì)印跡膜上的非特異性位點。封 閉劑可分散或溶解于上述的稀釋液中。封閉劑可由使用者制備，并在電印跡系統(tǒng)應用之前 將其加入印跡緩沖液?；蛘叻忾]試劑的原劑(Stock preparation)可由使用者預先制備并 在使用之前立即加入到稀釋液或印跡緩沖液中。封閉試劑的原劑可為蛋白質(zhì)印跡程序中通 常所用濃度的，例如高達20X、高達10X、高達5X、高達2X或高達1. 5X。原液可由任何適合 的緩沖體系制備?；蛘?，封閉試劑可作為稀釋劑的一種組分提供并作為電印跡試劑盒的一 部分市售。任何適合的封閉試劑可以不受限制，用于本發(fā)明所述的電印跡系統(tǒng)。本領域已知 多種適合的封閉劑，其包括，但不限于，全血清、分離的血清(fractionated serum)、牛血清 白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、不含脂肪牛奶、明膠、魚血清、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、 小鼠免疫球蛋白、鼠免疫球蛋白、馬免疫球蛋白、人免疫球蛋白、豬免疫球蛋白、雞免疫球蛋 白、乳清蛋白，大米蛋白、海藻蛋白或合成封閉劑，例如那些來自例如BioFX Laboratories, Kem-En-Tec Diagnosticsor Geneffay Biotech.市售獲得的那些。在本領域中，可獲得許多 可市購獲得的預制備的封閉試劑，全部可用于本發(fā)明的系統(tǒng)和方法。這些商購的封閉劑包 括，但不限于，WesternBreeze，I-BLOCK，BlockIt，PerfectBlock，合成的封閉緩沖液(BioFX Labs) ,Gelantis BetterBlock, SeaBlock, Starting Block和無蛋白封閉緩沖液(Pierce)。 在一個實施方案中，印跡緩沖液中存在的封閉試劑的量可在約0. Iwt. % -約50wt. %，約 Iwt. % -約 40wt. %，約 2. 5wt. % -約 25wt. %，約 5wt. % -約 15wt. % 或約 IOwt %。在 一個實施方案中，印跡緩沖液中存在的封閉試劑的量可高達約75mg/ml，高達約50mg/ml，高達約40mg/ml，高達約30mg/ml，高達約20mg/ml，高達約15mg/ml，高達約10mg/ml高達 約5mg/ml，高達約2. 5mg/ml，高達約lmg/ml，高達約0. 5mg/ml，高達約0. 25mg/ml或高達約 0. lmg/ml。在一個實施方案中，適當?shù)姆忾]試劑可含有固有的負電荷。具有固有的負電荷可 確保應用過程中封閉劑從載體基質(zhì)遷移到蛋白質(zhì)印跡膜的表面。已知許多封閉試劑具有固 有的負電荷，本領域具有一般知識的實施者可以很好地確定這樣的封閉劑。有經(jīng)驗的實施 者可采用一種示例性但非限制性的方法確定一種特定的封閉劑是否具有適當足夠的固有 的負電荷，這樣可使封閉劑在膜上電泳，所使用的本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和試劑盒列于表3并 在下文進行了詳細討論。或者，可對蛋白封閉試劑進行改造使其帶上負電荷。這些可通過 實施例，通過將多個帶負電荷的氨基酸整合到蛋白的多肽序列中實現(xiàn)?？墒褂枚喾N重組DNA 技術將帶負電荷的氨基酸整合到特點蛋白中，這些技術均在本領域具有一般知識的實施者 的知識水平之內(nèi)。在一個實施方案中，印跡緩沖液可包括在適當稀釋液中的一級抗體。在一個實施 方案中，印跡緩沖液可包括上述的和整合得到的封閉試劑，和一級抗體。印跡緩沖液中的 的一級抗體的濃度當然可根據(jù)所用的特異性一級抗體、使用抗體的環(huán)境、抗體的各種其它 固有特性發(fā)生改變。通常，以及抗體的濃度為1 10-1 20,000,1 100-1 15，000， 1 1，000-1 10，000 或 1 1，500-1 5，000。一級抗體可為用戶定義型抗體。抗體可針對使用者限定的抗原?？贵w可商購獲 得或可由使用者制得?？贵w可為多克隆抗體或單克隆抗體。單克隆抗體可來自(raised) 小鼠或大鼠。多克隆抗體可為IgGdgGl, IgG2a，IgG2b, IgG3)，IgM，IgA, IgD和IgE亞類。 多克隆抗體可來自兔，小鼠，大鼠，倉鼠，綿羊，山羊，馬，驢，雞。在一個實施方案中，抗體可 來自于人人血清。人抗體可被至少部分或全部純化。制備和純化抗體的方法在本領域中 是公知的。制備和應用各種抗體制劑的一般性指導可在例如參考文獻Harlow等，1989， Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Harlow et al., 1999,Using Antibodies : A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, NY, and Harlow, et al.,1988, In : Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY中找到，這些文獻全部以參閱的方式并入本文。在一些實施方案中，一級抗體可為“內(nèi)參抗體”。該內(nèi)參抗體可由使用者提供或可 商購獲得，可作為本發(fā)明系統(tǒng)(即，例如下面詳述的試劑盒)的一部分?？捎玫幕蚬┍景l(fā)明 系統(tǒng)和方法使用的示例性但非限制性的內(nèi)參抗體可包括靶向肌動蛋白、微管蛋白、組蛋白、 波形蛋白、核纖層蛋白、GAPDH、VDACl、C0XIV、hsp-70、hsp-90或TBP的抗體。在一個實施方案中，印跡緩沖液可包括在適當稀釋液中的二級抗體。二級抗體可 與檢測工具耦合。當然，對本領域技術人員顯而易見地是，什么構(gòu)成了適當?shù)亩壙贵w取 決于上述步驟所用的一種或多種一級抗體的類別(identity)。可挑選二級抗體與至少部 分一級抗體耦合。選擇適合的抗體還取決于用來檢測后續(xù)步驟信號的方法。如果研究者使 用化學發(fā)光技術檢測分析物，則合適的二級抗體可與過氧化物酶或堿性磷酸酶耦合。如果 研究者使用顯色技術檢測分析物，則合適的二級抗體可與堿性磷酸酶或過氧化物酶稱合。 如果研究者使用熒光技術檢測分析物，則合適的二級抗體可與熒光團耦合。任選地，二級 抗體可與一種或多種生物素部分耦合，檢測分子(例如過氧化物酶、磷酸鹽、熒光團等)可與親和素耦合。采用生物素/生物素蛋白體系可在某些情況下增大弱檢測信號。通常，二 級抗體的濃度應為 1 10-1 20，000，1 100-1 15，000，1 1,000-1 10，000 或 1 1，500-1 5，000。適用于本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的二級抗體可來自于，例如兔，小鼠，大鼠，倉鼠，豬， 綿羊，山羊，馬，驢，火雞和雞。二級抗體通常來自于與一級抗體的來源不同的物種。產(chǎn)生的 二級抗體應能識別并與一部分一級抗體耦合。二級抗體可被至少部分親和純化。二級抗體 可靶向小鼠IgGdnIl IgAdnIl IgM，大鼠IgG，大鼠IgA，大鼠IgM，兔IgG，兔IgA，兔IgM，倉 鼠IgG，倉鼠IgA，倉鼠IgM,山羊IgG，山羊IgA,山羊IgM,馬IgG，馬IgA，馬IgM，綿羊IgG， 綿羊 IgA，綿羊 IgM，猴 IgG，猴 IgA，猴 IgM，雞 IgG，雞 IgA，雞 IgM，雞 IgY，人 IgG，人 IgA，或 人IgM。二級抗體可與一個或多個檢測分子例如，通過實施例，如上所述的堿性磷酸酶、過氧 化物酶、生物素、熒光團或Qdot納米晶體耦合。在一個實施方案中，印跡緩沖液可包括上述的并入本文的封閉試劑和一級抗體和 二級抗體。一級抗體和二級抗體的濃度可為1 10-1 20,000,1 100-1 15，000， 1 1,000-1 10，000或1 1，500-1 5，000，盡管可以使用的不同濃度取決于最終使 用者選定的用于本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的抗體的類別和性質(zhì)。在一個替代實施方案中，當使用的二級抗體為生物素化的抗體時，印跡緩沖液可 包括過氧化物酶或磷酸酶耦合的親和素/鏈霉親和素。通常，印跡緩沖液中的過氧化物酶 或磷酸酶耦合的親和素/鏈霉親和素的濃度為1 10-1 20,000,1 100-1 15，000， 1 1，000-1 10，000 或 1 1，500-1 5，000?，F(xiàn)在回到圖2A，含有封閉劑的印跡緩沖液、一級抗體、二級抗體，或一級抗體和二 級抗體可吸附到上述的載體基質(zhì)上。吸附到載體基質(zhì)上的適當體積的印跡緩沖液應為足夠 體積，以使載體基質(zhì)的整個基體基本浸沒在印跡緩沖液中，但不應過飽和，以致造成過量的 緩沖液從載體基質(zhì)中滲漏出去。構(gòu)成足夠體積印跡緩沖液實現(xiàn)這種效果的材料當然可根 據(jù)目標基質(zhì)的尺寸、厚度和容量進行變化。通常，這個體積為約1ml，高達約1. 5ml，高達約 anl，高達約2. 5ml，高達約細1，高達約6ml，高達約8ml，或高達約IOml印跡緩沖液。為了 實現(xiàn)該目的，可將載體基質(zhì)置于合適的容器中(例如適當形狀和大小的有蓋培養(yǎng)皿以容納 載體基質(zhì))，含有封閉劑的印跡緩沖液，一級抗體、二級抗體或其各種組合可直接吸附到基 質(zhì)上。然后將浸透的載體基質(zhì)放置于印跡膜頂部，使得耦合有生物分子樣品的印跡膜的表 面與浸透的載體基質(zhì)實質(zhì)接觸。任選地可進行上述的脫泡步驟。在一個實施方案中，置于印跡膜上的載體基質(zhì)可含有吸附于其上的封閉劑、一級 抗體和二級抗體。在一個替代的實施方案中，載體基質(zhì)可含有吸附于其上的封閉劑，可制備其上吸 附有一級抗體的第二載體基質(zhì)并置于第一載體基質(zhì)的上方。在另一個替代的實施方案中，載體基質(zhì)上可吸附有封閉試劑和一級抗體，可制備 其上吸附有二級抗體的第二載體基質(zhì)并置于第一載體基質(zhì)的上方。在又一個替代的實施方案中，載體基質(zhì)上可吸附有封閉試劑?？芍苽淦渖衔接?一級抗體的第二載體基質(zhì)并置于第一載體基質(zhì)的上方?？芍苽淦渖衔接卸壙贵w的第三 載體基質(zhì)并置于第二載體基質(zhì)的上方。當上述的說明提及“一級抗體”和“二級抗體”時，本領域的技術人員容易理解一種以上的一級抗體的應用和一種以上的二級抗體的應用也同樣包括在內(nèi)，且該應用也落在 本發(fā)明實施方案的實踐范疇內(nèi)。通過實施例，印跡緩沖液可被制得并可含有多種一級抗體。 一種或多種一級抗體可為內(nèi)參抗體，可全部靶向用戶確定的抗原。這些實施方案詳細說明 如下?；氐綀D2A，使用者可獲得具有印跡凝膠基體和與之耦合的電極的的上部組件。該 上部組件可置于一個或多個基質(zhì)之上，使得陰極凝膠基質(zhì)的表面與載體基質(zhì)的表面實質(zhì)接 觸。上部組件或其一部分可與外殼時一體的或與外殼分開。使用者根據(jù)圖IC的描繪，組裝 其余的部件并施加電流，使電流從陰極和陽極之間通過?？墒┘与娏鏖L達約20分鐘，長達 約15分鐘，長達約10分鐘，長達約5分鐘，或長達約3分鐘.施加的電流可為多達約25V, 多達約20V，多達約15V，多達約10V，多達約5V分鐘，或多達約3V分鐘。給系統(tǒng)施加電流可 導致至少部分蛋白質(zhì)或雜交組合物(例如封閉試劑、一級抗體和二級抗體)從一個或多個 載體基質(zhì)遷移至蛋白質(zhì)印跡膜，其中可能發(fā)生適當抗原-抗體的耦合反應。當終止電流時，可拆開系統(tǒng)，回收蛋白質(zhì)印跡膜并進行至少一個洗滌步驟。洗滌步 驟的進行通常是為了除去任何多余的二級抗體，從而提高下游采集數(shù)據(jù)的信噪比?？蓪⒛?浸在至少anl，至少5ml，至少10ml，或至少20ml適當?shù)木彌_液(例如上文所述的和本文納 入的緩沖體系之一)中，任選緩沖液中存在洗滌劑。每個洗滌步驟通常進行至少lmin，至少 2min，至少5min，或至少lOmin，但是或長或短的洗滌也是允許的。在通常的步驟中，進行三 次5分鐘洗滌。在洗滌步驟之后，是蛋白印跡膜檢測步驟。當然適合的檢測方法取決于所用二抗 的類別和性質(zhì)，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。例如，如果將二抗與過氧化物酶耦 合，增強的化學發(fā)光(ECL)可用于檢測測試抗原的存在。ECL是一種生物學中用于各種檢測 試驗的人工識別技術。辣根過氧化物酶(HRP)連接在目標分子上(通常通過標記特異識別 該分子的免疫球蛋白)。然后該酶復合物將靠近該目標分子的ECL底物轉(zhuǎn)化為致敏試劑，其 被氫過氧化物酶進一步氧化，生成三(激發(fā)態(tài)的)羰基，當其衰變?yōu)閱昔驶鶗r發(fā)光。ECL能 夠檢測到微量抗原。能夠檢測到飛克量以下的蛋白，低于大部分檢測系統(tǒng)的檢測限。在圖2B中，描述了根據(jù)另一個實施方案進行電印跡的方法。該實施方案不同于圖 2A中所示的實施方案，如上所述，不同之處在于之前的實施方案是在一個步驟中進行的， 即，一抗和二抗都使用一個或多個載體基質(zhì)，然后組裝成上述系統(tǒng)。給系統(tǒng)施加電流，使一 抗和二抗從載體基質(zhì)遷移至蛋白印跡膜上，如果印跡膜的表面上存在有抗原至少一抗與靶 抗原耦合，二抗與一抗耦合。根據(jù)下述的另一個實施方案，進行的電印跡程序至少為兩個步 驟。例如，將一抗用于載體基質(zhì)，然后組裝成上述系統(tǒng)。施加電壓，一抗與蛋白印跡膜表面 上的靶標耦合。然后，去掉載體基質(zhì)，將二抗用于第二載體基質(zhì)，其組裝成系統(tǒng)，施加電壓， 使二抗遷移至蛋白印跡膜的表面上，與相應的一抗耦合。需注意的是，在該實施方案中，所 有的試劑、溶液、成分、體積和濃度與單一步驟中具體提及的相一致，所不同的是所述成分 的使用順序以及完成程序所采用步驟的數(shù)量。進行兩步電印跡程序時，使用者需獲得表面耦合有生物分子樣品的蛋白印跡膜。 一般地，獲得樣品并用電泳分解(例如，SDS-PAGE)，然后將分解的分子轉(zhuǎn)移至或固定于適 合的固體支持物上。適合的膜如上所述。使用者還能夠獲得具有上述陽極和陽極凝膠基體 (anodic gelmatrix body)的下部組件(lower assembly)。蛋白印跡膜可置于該下部組件上，使不含生物分子樣品的膜表面與相反于陽極的陽極凝膠基體表面并列放置，如圖IC所 示。采用任意的脫泡步驟，去掉蛋白印跡膜和陽極凝膠基體之間的氣泡。在一個實施方案中，使用者需制備第一印跡緩沖液。第一印跡緩沖液可包括適合 的稀釋劑、封閉劑和一抗。第一印跡緩沖液可被吸收至上述第一載體基質(zhì)上，然后將載體基質(zhì)置于蛋白印跡 膜上，使耦合有生物分子樣品的膜表面與浸泡的第一載體基質(zhì)并列放置。采用任意的脫泡 步驟，去掉浸泡的載體基質(zhì)和蛋白印跡膜之間的氣泡。在圖2B中，使用者可獲得帶有陰極凝膠基體(cathodic gel matrixbody)及其所 耦合的電極的上部組件(upper assembly) 0將所述上部組件置于第一載體基質(zhì)上，使陰極 凝膠基質(zhì)的表面基本上與載體基質(zhì)的表面接觸。使用者組裝如圖IC中所示的系統(tǒng)的其余 成分并施加電流，使電流通過陰極和陽極?？墒┘与妷焊哌_約20分鐘，高達約15分鐘，高 達約10分鐘，高達約5分鐘或高達約3分鐘。施加的電壓可高達約25V,高達約15V，高達 約10V，高達約5V或高達約3V。施加電流可引起至少一部分蛋白的或雜交組合物(例如， 封閉劑和一抗或核酸探針)從第一載體基質(zhì)遷移至蛋白印跡膜上，發(fā)生正確的抗原-抗體 耦合反應。當通電結(jié)束時，至少部分地拆卸系統(tǒng)，回收并去掉至少部分用盡的第一載體基質(zhì)。 保留剩余成分，用于下一輪電印跡。在這一點上，使用者需獲得第二載體基質(zhì)。第二載體基 質(zhì)的性質(zhì)、組成和大小應與上述相一致并參考于此。在一個實施方案中，使用者需制備第二印跡緩沖液。第二印跡緩沖液可包括適合 的稀釋劑、二抗和任選的封閉劑。第二印跡緩沖液可被吸收至上述第二載體基質(zhì)上，然后將 第二載體基質(zhì)置于蛋白印跡膜上，使耦合有生物分子樣品的膜表面與浸泡的第二載體基質(zhì) 并列放置。采用任意的脫泡步驟，去掉浸泡的第二載體基質(zhì)和蛋白印跡膜之間的氣泡。在一個實施方案中，將帶有陰極凝膠基體和耦合有電極的上部組件置于第二載體 基質(zhì)上，使陰極凝膠基質(zhì)的表面基本上與第二載體基質(zhì)的表面接觸。。使用者組裝如圖IC 中所示的系統(tǒng)的其余成分并施加電壓，使電流通過陰極和陽極?？墒┘与妷焊哌_約20分 鐘，高達約15分鐘，高達約10分鐘，高達約5分鐘或高達約3分鐘。施加的電壓可高達約 25V，高達約15V，高達約10V，高達約5V或高達約3V。施加電流可引起至少一部分蛋白的或 雜交組合物(例如，二抗或核酸探針和任選的封閉劑)從第二載體基質(zhì)遷移至蛋白印跡膜 上，使二抗與耦合了抗原的一抗相耦合。當通電結(jié)束時，拆卸系統(tǒng)，回收蛋白印跡膜并進行至少一步洗滌步驟。一般進行 洗滌步驟是為了去掉未耦合的二抗，由此提高下游采集數(shù)據(jù)的信噪比(signalto-noise ratio)。在任選的去污劑存在的條件下，將膜浸于至少anl，至少IOml或至少20ml的適合 的緩沖液(例如，上述的一種緩沖液系統(tǒng)并參考于此)中。一般每步洗滌至少1分鐘，至少 2分鐘，至少5分鐘或至少10分鐘，洗滌更長或更短的時間是允許的。在一般的第二步程序 中，采用三次5分鐘洗滌。洗滌步驟之后，進行上述檢測步驟并參考于此。用于電印跡的試劑盒在另一方面，本文提供用于電印跡的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒可包括至 少第一適合的容器(container)，至少包括一種含有用于電泳的離子源的凝膠基體和至少 一種印跡膜。凝膠基體可含有上述組合物，優(yōu)選含有離子源緩沖液。試劑盒中提供的凝膠基體和印跡膜的長度和寬度相同或幾乎相同，如其長度和寬度是另一個的< 10%，<5% 或< 2%。在另一個實施方案中，試劑盒中可包括至少第一適合的容器，至少一種陽極凝膠 基體和至少一種陰極凝膠基體，其中陽極凝膠基質(zhì)包括至少一種不存在于陰極凝膠基質(zhì)中 或以極少的量存在于陰極凝膠基質(zhì)中的陽極緩沖液化合物。如前面部分所述，陽極緩沖液 化合物優(yōu)選PKa為中性或接近中性的緩沖液化合物。優(yōu)選地，陽極凝膠基質(zhì)和陰極凝膠基 質(zhì)都含有緩沖液離子源，陰極室(compartment)含有不存在于(或以極少量存在于)陽極 室中的緩沖液化合物，其中陰極緩沖液化合物具有比陽極室中的緩沖液高至少約0. 51og 單位，如高約Ilog單位的pKa，其中，陽極室緩沖液形成高于中性pH的陽極。在另一個實施方案中，試劑盒可包括至少第一適合的容器，至少一種陽極凝膠基 體和至少一種陰極凝膠基體，其中，陰極凝膠基質(zhì)或陽極凝膠基質(zhì)之一可含有離子交換基 質(zhì)。陽極凝膠基體和陰極凝膠基體可由密封包裝試劑盒提供。電印跡凝膠基質(zhì)試劑盒 還可任選進一步包括至少一種印跡膜，至少一層濾紙，至少一種海綿體(例如，一次性海綿 和/或至少一個電極)。印跡膜可與凝膠基體一起提供或分別提供。在一個實施方案中，試劑盒可包括至少第一適合的容器，多種陽極凝膠基體和陰 極凝膠基體。在一些實施方案中，試劑盒可含有約1 約50種陽極凝膠基體和陰極凝膠基 體。在一些實施方案中，試劑盒可含有約5 約20種陽極凝膠基體和陰極凝膠基體。在一 些實施方案中，試劑盒可含有約8 約15種陽極凝膠基體和陰極凝膠基體。在一些實施方 案中，試劑盒可含有約10 約12種陽極凝膠基體和陰極凝膠基體。在另一方面，本發(fā)明試劑盒提供一種或多種一次性陽極組件和/或一種或多種一 次性陰極組件。在一些實施方案中，一種或多種陽極組件可包括含有離子源的膠體和膠基 質(zhì)帶有的電極。在一些實施方案中，一種或多種陰極組件可包括含有離子源的膠體和膠基 質(zhì)帶有的電極。在一些實施方案中，試劑盒中提供的陰極組件，其與陰極凝膠基體并列的表面，與 并列的陰極凝膠基質(zhì)一側(cè)接觸至少50 %、至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，至少80 %或至少 90~%。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒中提供的陰極組件，其與陰極凝膠基體并列的表面，與 并列的陰極凝膠基體一側(cè)的長度和寬度在< 20%，< 10%, < 5%或< 2%。在示例實施方 案中，陰極和陰極凝膠基體一般為直角(rectangular)。在一個實施方案中，試劑盒可含有許多陽極組件和陰極組件。在一些實施方案中， 試劑盒可含有1 約50個陽極和陰極組件。在一些實施方案中，試劑盒可含有約5 約20 個陽極和陰極組件。在一些實施方案中，試劑盒可含有約8 約15個陽極和陰極組件。在 一些實施方案中，試劑盒可含有約10 約12個陽極和陰極組件。在一個實施方案中，每個陽極組件和/或陰極組件可由托盤提供，如下述塑料托
ο陽極和/或陰極凝膠基體，陽極和/或陰極組件或陽極和/或陰極可一起包含于 密封的包裝中，或分別包裝。此外，多個陽極和/或陰極可一起包含于包裝中。在特定的實 施方案中，許多陽極組件或陽極凝膠基質(zhì)可參考一起作為底部消耗品，許多陰極組件或陰 極凝膠基質(zhì)可參考一起作為頂部消耗品。
在一些方面，電印跡試劑盒包括一種或多種一次性陽極組件和一種或多種一次性 陰極組件。在一些方面，電印跡試劑盒包括一種或多種一次性陽極組件和至少一種陰極凝 膠基體。試劑盒可任意包括一種或多種載體基質(zhì)、濾紙層或海綿體。在一個實施方案中，試劑盒可含有一種或多種載體基質(zhì)。所述載體基質(zhì)可以是層 的形式，所述層與陽極組件、陰極組件或陽極和陰極組件并列。本發(fā)明提供的適于試劑盒中 載體層的性質(zhì)和組成如上所述并參考于此。在一個實施方案中，試劑盒提供的載體基質(zhì)層的大小至少與陽極組件和陰極組件 一樣大，或比它們小。在一個實施方案中，載體基質(zhì)層的一側(cè)可以是約Icm 約50cm，約 5cm 約20cm，約8cm 約15cm或約IOcm 約12cm。根據(jù)一些實施方案提供的載體基質(zhì)層 的厚度，可以是彡約5mm，彡約4mm，彡約3mm，彡約2mm，彡約1mm，彡約0. 5mm或彡約0. 25mm。在一個實施方案中，每個試劑盒可供給終端使用者至少一種載體基質(zhì)。一般地，試 劑盒中可供給本發(fā)明所述的許多載體基質(zhì)。在一些實施方案中，試劑盒可含有1 約50個 載體基質(zhì)層。在一些實施方案中，試劑盒可含有約5 約25個載體基質(zhì)層。在一些實施方 案中，試劑盒可含有約10 約15個載體基質(zhì)層。在一些實施方案中，試劑盒可含有約10 約12個載體基質(zhì)層。在一些實施方案中，載體基質(zhì)層可由陽極組件和陰極組件分別包裝。一組載體基 質(zhì)可作為單元一起包裝于單一包裝中。在一個實施方案中，每個載體基質(zhì)可分別包裝，進一 步地，每個分別包裝的載體基質(zhì)與許多其它分別包裝的載體基質(zhì)作為一個單元包裝。在一 個實施方案中，一種或多種載體基質(zhì)可與陽極組件一起包裝。在一個實施方案中，一種或多 種載體基質(zhì)可與陰極組件一起包裝。在一些實施方案中，試劑盒還可分別提供一種或多種電極。電極可由密封的容器 中提供，在特定的實施方案中，還含有干燥劑或抗腐蝕劑。電極可包裝于液體或凝膠中，如 含有一種或多種防腐劑、還原劑或抗腐蝕劑的醇或溶液或凝膠。提供電極，如一次性電極的 試劑盒，還可含有一種或多種凝膠基質(zhì)，一種或多種印跡膜或一種或多種濾紙層。任意包括一種或多種載體基質(zhì)的試劑盒的陽極和/或陰極組件，可分別包裝于本 領域已知的適合的不透氣和水的包裝紙(或任何其它適合的容器類型)中，使電極組件的 保藏期延長，不至干燥。例如，包裝紙或容器可由基于層或箔片的適合的薄的，不透氣和水 的塑料或聚合物制成，在其中包裝電極后，采用本領域已知的(如，但不限于粘合或解除熱 封等)任意適合的包裝紙密封方法進行密封。試劑盒中提供的印跡膜可單獨包裝或包裝于 含有電極組件的包裝中。因此，應理解本領域技術人員可耦合本發(fā)明的各種不同電極組件的不同組合和亞 組合(sub-combinations)，形成許多不同類型的試劑盒。根據(jù)用途，吸試劑盒可含有或不含 本領域已知的不同染劑和/或染色釋放金屬(例如，含上述電極組件的陽極銀)。近似的凝 膠濃度和組成以及交聯(lián)度可根據(jù)印跡的種類而不同。此外，各種可行的試劑盒部位的大小，如不同類型的電極組件和/或印跡膜，可被 改良或改進用于待印跡凝膠的特定大小，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。包含于包裝紙內(nèi)的還可以是適合的淺的由塑料或其它適合的材料制成的無蓋托 盤(open tray)(未示出)。該托盤大小適于盛放其中的載體基質(zhì)或電極組件以保護所述成 分在處理過程中免受機械損壞，使用時打開包裝之后，易于處理和操作所述成分。另外，當施用印跡緩沖液時，托盤可用于盛放所述載體基質(zhì)，如上面詳細的描述并參考于此。托盤上 方還可用防滲(fluid-impermeable)塑料或箔片(或箔片支持的塑料)密封，可去掉上方 的塑料或箔層，露出電極供使用。電極組件(例如，陰極組件)可從托盤中移出使用，或電 極組件可在電印跡過程中保持原位。支持托盤可以是符合電極組件或載體基質(zhì)形狀的矩形托盤。然而，支持托盤可制 成其它適合的形狀，主要取決于電極組件的形狀(形狀的不同主要取決于用途)。優(yōu)選支持 托盤由廉價硬質(zhì)的或半硬質(zhì)的塑料或聚合物制成，如，但不限于聚氯乙烯(PVC)。然而，應知 道任何其它材料可用于形成支持托盤。支持托盤在進行電印跡轉(zhuǎn)移前，形成印跡組裝的過程中還起到固定的作用。在一個實施方案中，試劑盒可包括一種或多種適用于上述系統(tǒng)的稀釋劑容器。稀 釋劑可用于制備上述蛋白組合物或雜交組合物。稀釋劑可含有生理上可接受的水溶液， 其pH為約4 約9，或約5 約8，或約6 約7. 5，一般其中含有至少一種緩沖試劑，例 如磷酸緩沖液、碳酸氫鹽、TAPS、N- 二甘氨酸(Bicine)、Tris, Bis-Tris, Tricine, HEPES, TES、MOPS、PIPES、二甲碘酸鹽、MES、醋酸鹽、ADA、ACES、乙醇胺、BES、乙酰氨基甘氨酸 (acetamidoglycine)或甘氨酰胺(glycinaide)。適于作為稀釋劑的示例緩沖液可包括，但 不限于，例如PBS、Hank’ s液、TBS、TE、TEN等。任選地，稀釋劑可含有去污劑。適合的去污 劑可包括非離子型、非變性去污劑，例如iTritonX-100、Triton X-114、NP_40、Bri j_35、Bri j 58、Tween-20、Tween-80、辛基葡萄糖苷和辛基硫代苷(octylthio glucoside)。稀釋劑可 含有約0. 01體積% 約5體積％，約0. 05體積% 約2體積％，約0. 1體積% 約1. 5體 積％或約0. 5體積％ 約1體積％的非離子型的非變性去污劑。在一些實施方式中，稀釋劑可施以全強度(full strength)(即，IX強度)或以易 于儲藏及裝運(shipping)的濃溶液施用。濃稀釋劑可由使用者進行稀釋。濃稀釋劑可以 高達約50X，高達約25X，高達約20X，高達約10X或高達約5X或高達約2X強度施用。在一些實施方案中，稀釋劑可由試劑盒提供的盛有稀釋劑的一個或多個塑料、PVC 或玻璃瓶供給使用者。每個試劑盒可含有1 10瓶稀釋劑，1 5瓶稀釋劑或1 2瓶稀 釋劑。每瓶稀釋劑可含5L、4L、3L、2L、lL、500mL或IOOmL稀釋劑。在一些實施方式中，試劑盒可含有適合的封閉劑。可提供溶于或分散于所述稀釋 劑中的封閉劑，或提供獨立于所述稀釋劑的封閉劑。封閉劑可含有，但不限于，全血清、分餾 血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、脫脂牛奶、明膠、魚血清、山羊免疫球蛋白、兔免疫 球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、馬免疫球蛋白、人免疫球蛋白、豬免疫球蛋白、 雞免疫球蛋白或合成的封閉劑，如可市售獲得的，例如BioFX Laboratories、Kem-En-Tec Diagnostics或GeneWayBiotech。許多市售可獲得的已制備的封閉劑是本領域可獲得的， 所有這些封閉劑可與上述試劑盒一并提供。這類市售可獲得的封閉劑包括，但不限于，例如 WesternBreeze^ I—BLOCK、Blocklt、PerfectBlock、合成封閉緩沖液(Synthetic Blocking Buffer) (BioFX Labs)、GelantisBetterBlock、SeaBlock、起始封閉(Starting Block)和 不含蛋白的封閉緩沖液(Protein-Free Blocking Buffer) (Pierce)。在一些實施方案中， 提供的封閉劑溶于或分散于所述稀釋劑中，封閉劑的量為約0. 1重量％ 約50重量％，約 1重量％ 約40重量％，約2. 5重量％ 約25重量％，約5重量％ 約15重量％或約10 重量％。在一個實施方案中，印跡緩沖液中封閉劑的量可高達約75mg/mL，高達約50mg/mL，高達約40mg/mL，高達約30mg/mL，高達約20mg/mL，高達約15mg/mL，高達約10mg/mL，高達 約5mg/mL，高達約2. 5mg/mL,高達約lmg/mL，高達約0. 5mg/mL,高達約0. 25mg/mL或高達約 0.lmg/mL。在一些實施方式中，試劑盒可含有雜交試劑或在進行核酸雜交試驗中適用的雜交 緩沖液，或更通俗的“預雜交緩沖液”可與“雜交試劑”或“雜交緩沖液”互換使用。許多預 雜交緩沖液是本領域技術人員熟知的，可毫無限制地使用任何的預雜交緩沖液。在一些實施方式中，試劑盒還含有一種或多種洗滌緩沖液容器。可將本領域技術 人員已知的任何適合的洗滌緩沖液與根據(jù)本發(fā)明所述實施方案的試劑盒一并提供。在一些 實施方式中，適合的洗滌緩沖液可與稀釋劑相同。在一些實施方式中，洗滌緩沖液可以是缺 少一種或多種成分的稀釋劑。但不限于，洗滌緩沖液可包括任何下述的液體緩沖液磷酸鹽 緩沖液(PBQ、碳酸氫鹽、Bis-Tris、麥黃酮(Tricine)、HEPES, TES、MOPS、PIPES、二 甲碘酸 鹽、MES、醋酸鹽、ADA、ACES、乙醇胺、BES、乙酰氨基甘氨酸(acetamidoglycine)或甘氨酰胺 (glycinaide)。適于作為洗滌緩沖液的示例緩沖液可包括，但不限于，例如PBS、Hank’ s液、 TBS、TE、TEN等。任選地，洗滌緩沖液可含有去污劑。適合的去污劑可包括非離子型、非變性 去污劑，例如 Triton X-100,Triton X-114、NP_40、Brij_35、Brij 58、Tween-20、Tween_80、 辛基葡萄糖苷和辛基硫代苷(octylthio glucoside)。稀釋劑可含有約0. 01體積％ 約5 體積％，約0. 05體積％ 約2體積％，約0. 1體積％ 約1. 5體積％或約0. 5體積％ 約 1體積％的非離子型的非變性去污劑。在一些實施方式中，洗滌緩沖液可施以全強度(full strength)(即，IX強度)或 以易于儲藏及航運(shipping)的濃溶液施用。濃洗滌緩沖液可由使用者進行稀釋。濃洗 滌緩沖液可以高達約50X，高達約25X，高達約20X，高達約10X或高達約5X或高達約2X強 度施用。在一些實施方案中，洗滌緩沖液可由試劑盒提供的盛有洗滌緩沖液的一個或多個 塑料、PVC或玻璃瓶供給使用者。每個試劑盒可含有1 10瓶洗滌緩沖液，1 5瓶洗滌緩 沖液或1 2瓶洗滌緩沖液。每瓶稀釋劑可含5L、4L、3L、2L、lL、500mL或IOOmL稀釋劑。在一些實施方案中，試劑盒還含有一種或多種由適合的容器提供的一抗。試劑盒 可含有高達lmL，高達750 μ L,高達500 μ L,高達250 μ L,高達200 μ L,高達150 μ L,高達 100 μ L或高達50 μ L的一抗。一抗可分散于適合的液體貯藏培養(yǎng)基中。一抗適于貯存于室 溫，在冷藏環(huán)境或冰箱中。在特定的實施方案中，試劑盒提供的一抗可以是多克隆抗體或單克隆抗體。單克 隆抗體可由小鼠或大鼠產(chǎn)生。單克隆抗體可以是IgG(IgGl、IgGh、IgG^、IgG3)、IgM、IgA、 IgD和IgE亞類。多克隆抗體可由兔、小鼠、大鼠、大白鼠、綿羊、山羊、馬、驢或小雞產(chǎn)生。在 一個實施方案中，抗體可來自于人血清。人源抗體可至少部分或全部純化。制備和純化抗體 的方法是本領域廣泛知曉的。各種抗體制劑的生產(chǎn)和應用的一般說明可參考，例如Harlow 等，1989，Antibodies ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，Harlow 等， 1999，Using Antibodies : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress， NY，and Harlow，等，1988，In : Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor， NY，全部作為參考引入于此。在一些實施方案中，試劑盒所含的一級抗體可為內(nèi)參抗體。供本發(fā)明系統(tǒng)和方法使用的示例性的非限制內(nèi)參抗體可包括靶向肌動蛋白、微管蛋白、組蛋白、波形蛋白、核纖 層蛋白、GAPDH、VDACl、C0XIV、hsp-70、hsp-90或TBP的抗體。本發(fā)明還可以包含其它內(nèi)參 抗體，這對本領域普通技術人員而言是顯而易見的。在一些實施方案中，試劑盒可以包括在適當容器中提供的一個或多個二級抗 體。試劑盒可包括高達1ml、高達750 μ 1、高達500 μ 1、高達250 μ 1的、高達200 μ 1、高達 150 μ 1、高達100 μ L或高達50 μ 1的二級抗體。該二級抗體可適合在室溫下、在冷藏環(huán)境 中或冰箱中儲存。二級抗體可作為試劑盒的一個組分提供，可產(chǎn)生于兔、小鼠、大鼠、倉鼠、 豬、綿羊、山羊、馬、驢、火雞或雞。二級抗體可能至少部分經(jīng)親和純化。二級抗體可以直接 抗小鼠IgG、小鼠IgA、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgA、大鼠IgM、兔IgG、兔IgA、兔IgM、倉鼠 IgG、倉鼠IgA、倉鼠IgM、山羊IgG、山羊IgA、山羊IgM、馬IgG、馬IgA、馬IgM、綿羊IgG、綿 羊 IgA、綿羊 IgM、驢 IgG、驢 IgA、驢 IgM、雞 IgG、雞 IgA、雞 IgM、雞 IgY、人 IgG、人 IgA 或人 IgM。二級抗體可以與一個或多個檢測分子耦合，諸如，通過舉例，堿性磷酸酶、過氧化物酶、 生物素、熒光團或Qdot納米晶體。在一些實施方案中，提供的試劑盒可能有一個或多個底部消耗品、一個或多個頂 部消耗品和一個或多個載體陣列，一起包裝在第一試劑盒容器內(nèi)。第一試劑盒容器可以儲 存在室溫下或在冷藏環(huán)境中。提供的試劑盒還可以具有一個或多個稀釋劑容器、一個或多 個洗滌緩沖液容器、一個或多個初級抗體容器、一個或多個二級抗體容器，或者一個或多個 顯影劑容器，一起包裝在至少一個第二試劑盒容器中。第二試劑盒容器可以儲存在室溫下 或在冷藏環(huán)境中。在一些實施方案中，第二試劑盒容器的至少一個子部分(例如，初級抗體 或二級抗體)可以儲存在一個冰箱中。在一些實施方案中，試劑盒可以包括一個或多個核酸探針。這些核酸探針可以是 全部或部分長度cDNAs的寡核苷酸，或可以是單鏈或雙鏈。在一個實施方案中，核酸探針可 以是標記的或未標記的。在一些實施方案中，試劑盒可以包括一種或多種用于標記核酸探 針的試劑。提供的一些核酸探針可能會給內(nèi)部實驗提供對照試劑。這類探針可以包括，例 如，微管蛋白、肌動蛋白、波形蛋白、GAPDH等的DNA或RNA探針。在一些實施方案中，試劑盒可進一步包括關于試劑盒每個組成部分的使用和/或 儲存的說明書。這些說明書可直接或指導用戶如何實施電印跡程序的一個或多個方面。說 明書作為硬拷貝在其交付給客戶時與試劑盒一并提供。另外，說明書可能會通過一種或多 種電子通訊方式(如電子郵件或提供的試劑盒的公司網(wǎng)站)提供給最終用戶。下面的實施例用于證明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領域技術人員應當理解實施例 中公開的技術代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術，在本發(fā)明的實施中起到很好的作用，因此可以被 視為構(gòu)成其實施的優(yōu)選模式。然而，在本發(fā)明公開的基礎上，本領域的技術人員應當理解， 在不脫離本文實施方案的精神和范圍下，可以對公開的特定實施方案做出一種或多種變 化，并獲得相似或類似的效果。實施例1具備固有負電荷幾種印跡試劑在不受特定的作用機制和理論的約束下，因為目前描述的系統(tǒng)和方法部分依賴于 印跡試劑從載體基質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移至在固相支持物上固化的分子、試劑(諸如，例如，初級抗 體、二級抗體、封閉劑，等等)，因此進行試驗以證明這種試劑能夠在非變性(即，在SDS存在情況下)的條件接受電泳轉(zhuǎn)移。圖3的圖像表明在中性PH值下各種試劑(使用本實施 方案的電印跡檢測系統(tǒng))的固有負電荷。將樣品用原生1.2% E-GEL clear (Invitrogen Corp,Carlsbad,CA)處理，并且將凝膠用古瑪西染色以使處理的蛋白質(zhì)可視化。樣品如下 泳道1，WESTERNBREEZE 封閉液；泳道2，小鼠抗肌動蛋白單克隆抗體；泳道3，小鼠抗微管 蛋白單克隆抗體；泳道4，與堿性磷酸酶耦合的羊抗兔二級抗體；泳道5，羊抗鼠二級抗體耦 合堿性磷酸酶。這些結(jié)果表明，印跡試劑具有固有負電荷示例。實施例2常規(guī)對比電印跡方法的比較圖4A及4B表明根據(jù)本實施方案的電印跡系統(tǒng)和方法(圖4A)或使用印跡技術 (圖4B)，在進行SW480細胞裂解液上的印跡方法以檢測后微管蛋白和肌動蛋白所獲得的結(jié)果。SW-480細胞裂解液為ftOsci incorporated, CA.銷售。將連續(xù)兩倍稀釋的裂解液 (2 μ g-62ng,圖如和4b泳道2-7)用標記體積的MAGICMARK 分子量蛋白標記(泳道9_12) 分解，其按照制造商說明使用 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen Corp.) 進行。分解的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)蛋白印跡膜，其在P3上使用IBL0T 干式印 跡系統(tǒng) Gnvitrogen Corporation, Carl sbad, CA) 7 分鐘，或者在 30V 下使用 NOVEX 濕印 跡模塊1小時。在室溫下用旋轉(zhuǎn)振動篩使用WESTERNBREE^ 試劑盒封閉液將該膜封閉30 分鐘并使用WESTERNBREE^ 洗滌洗兩次各5分鐘。在圖4B中，按照TOSTERNBREE^⑧顯 色檢測試劑盒的說明顯影膜用于印跡。印跡分別用1 5000和1 10，000的抗肌動蛋白 和抗微管蛋白的單克隆抗體進行，其在室溫下在用旋轉(zhuǎn)振動篩在WESTERNBREE^ 稀釋劑 進行1小時。去除該印跡溶液并洗滌該膜三次各5分鐘。然后，用抗鼠二級抗體堿性磷酸 酶(AP)培養(yǎng)膜30分鐘，其在旋轉(zhuǎn)振動篩上與TOSTERNBREE^ 試劑盒共軛。去除該二級 印跡溶劑并將洗膜3次各5分鐘并按照制造商說明每顯色處理。
在圖4A中，使用小鼠抗微管蛋白和抗肌動蛋白抗體進行在NC膜上固定 的SW480細胞裂解液的電印跡，操作如下在轉(zhuǎn)移后，將上述膜封閉并使用IBL0T 系統(tǒng)進 行點免疫印跡處理。將膜放在小型IBL0T 底部堆棧(stack)。使用吸管將含有初級抗體 (1 2500)和二級抗體(抗小鼠耦合的AP，1 5000)3. 5mL溶液施加于Whatman濾紙載體 基質(zhì)。然后將基質(zhì)放置在膜頂端和并使用印跡輥來去除空氣泡沫。然后將頂堆棧放置在基 質(zhì)頂部并將IBL0T 儀器的蓋子關閉。IBL0T 被設置為P5程序7分鐘。當程序運行后，將 膜去除，用WESTERNBREE^⑧清洗液洗3次并按照如上處理。實施例3圖5A-B實驗結(jié)果表明，電場對電印跡進程影響很大，但壓力也有一些累加效應。 圖5A表明在執(zhí)行電印跡程序后所得到的結(jié)果。電印跡程序按照在上述實施例2中所描述 的進行。圖4A圖5B表示當該程序在IBL0T 設備上不運行P5所重復獲得的結(jié)果。實施例4濾紙對比聚酯/聚酰胺超細纖維載體基質(zhì)的比較圖6A-B表明在使用不同的載體基質(zhì)所獲得的結(jié)果之間的比較。蛋白質(zhì)分子量標 準(泳道1)和SW480系列2倍稀釋的細胞裂解液(泳道3-10)被SDS-PAGE分解并轉(zhuǎn)移到 上述實施例2所述的NC膜。在圖6A中，電印跡實驗基本上按照圖4A進行。在圖6B中，電印跡實驗基本上按照圖4A進行，除了濾紙載體基質(zhì)用聚酯/聚酰胺超細纖維(從Mdovsky Houshold products, Ltd. Ashdod, Israel 銷售獲得)替代。使用不同的綴合物、檢測方法、轉(zhuǎn)移方法和膜的常規(guī)印跡對比電印跡(例如5-8)實施例5圖8A-B表明使用用于印跡試驗的化學發(fā)光或發(fā)光檢測法以及使用常規(guī)方法(圖 8A)或電印跡法(圖8B)所得到的結(jié)果之間的比較。SW480細胞裂解液的系列2倍稀釋的細 胞裂解液(泳道1-8)用SDS-PAGE分解并轉(zhuǎn)移到上述實施例2所述的NC膜。在圖8A中， 常規(guī)步驟，阻止和印跡演出基本上如上所述。在圖8B中，電印跡基本上按照上述2實施例 進行，除了濾紙載體基質(zhì)用在實施例4中所述的聚酯/聚酰胺超細纖維更換，并設置IBL0T 5V的5分鐘的程序以內(nèi)的。當程序運行完，取出膜，用WESTERNBREE^ 洗滌液洗三次，按 照制造商說明和上述處理。在圖8A及8B中表明包括用ECL(上版面)處理的HRP耦合的 二級抗體抗鼠和使用顯色方法處理的AP耦合的二級抗體抗鼠的結(jié)果。實施例6圖9A-B表明使用基本上按照實施例5中的電印跡方法得到的結(jié)果，除了使用常規(guī) 的“濕”的轉(zhuǎn)移方法從電泳凝膠向NC膜的蛋白轉(zhuǎn)移。實施例7圖IOA-B表明使用基本上如實施例5中所述電印跡方法獲得的結(jié)果，除了 NC蛋白 質(zhì)印跡膜由PVDF蛋白質(zhì)印跡膜取代。實施例8圖IlA-B表明使用基本上如實施例6中所述電印跡方法獲得的結(jié)果，除了 NC蛋白 質(zhì)印跡膜由PVDF蛋白質(zhì)印跡膜取代。對比常規(guī)印跡步電印跡實施例9該實施例公開了簡化方法，其中封閉劑、初級抗體、二級抗體都包含到免疫印跡 膜，其使用SW480細胞裂解液和抗微管蛋白和抗肌動蛋白抗體。SW-480細胞裂解液樣品(1 μ g_62. 5ng兩倍稀釋)被裝上NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel。將凝膠運行37分鐘以分離蛋白質(zhì)樣品且分離的蛋白被轉(zhuǎn)移到NC膜，其使 用IBL0T ，20V，7分鐘，如實施例2所述。按照實施例2的常規(guī)方法來處理并顯影對照膜。按照對本發(fā)明如下的方法處理未封閉膜。未封閉膜置于IBL0T 底部堆棧。在本 示例性過程中，初級和二級抗體被稀釋在25%合成封閉緩沖液(產(chǎn)品編號STSB-0100-01，
來自 BioFX, Owings Mills, MD.)中-酪蛋白、200nM 和 IOnM Bis-Tris。含初級抗體
(1 2500)和二級抗體(抗鼠綴合HRP或AP，1 5000)的3. 5mL稀釋液適用于聚酯/聚 酰胺超細纖維基質(zhì)，如實施例4所述。在這種情況下IBL0T 被設置為3分鐘5V的方案。 當程序運行完，去除膜，用WESTERNBREE^ 洗滌液洗三次，如實施例2中所顯影。相較于 對照膜，按照實施例2的方法處理和顯影的結(jié)果分別在圖7B及7A中表示。常規(guī)印跡對比兩步電印跡(實施例10-11)實施例10將大腸桿菌裂解液細胞樣品購自ft~0mega(1.25yg-78.5雙倍稀釋)裝在 NUPAGE NoveX 4-12% Bis-1Tris凝膠。運行凝膠37分鐘以分離蛋白樣品且分離的蛋白轉(zhuǎn)移到使用IBL0T 的NC膜，20V下為7分鐘。隨后封閉膜，在旋轉(zhuǎn)振動篩上使用 WESTERNBREEZE 試劑盒封閉液30分鐘，使用TOSTERNBREE^ 清洗溶液洗滌兩次，每次5 分鐘。按照TOSTERNBREE^ 化學發(fā)光檢測試劑盒的說明處理該膜用于印跡。用
1 5000稀釋的兔抗大腸桿菌多克隆抗體，在TOSTERNBREE^ 稀釋劑中，用旋轉(zhuǎn)振動篩處 理印跡1小時。該分解的溶液是去除和印跡膜洗三次5分鐘。然后，用抗兔二級抗體堿性 磷酸酶(用在旋轉(zhuǎn)振動篩基于WESTRNBREE^ 試劑盒的綴合溶液)培養(yǎng)該膜30分鐘。去 除二級印跡溶液，將各個膜洗3次，每次5分鐘并化學發(fā)光檢測顯影。實施例11該實施例公開了簡化方法，其中封閉劑和初級抗體在包括免疫印跡膜的一步中， 然后二級抗體(在封閉液)也包括在免疫細胞膜上，在不同步驟中使用大腸桿菌細胞裂解 液和抗大腸桿菌抗體。大腸桿菌細胞裂解液樣品購于!Iomega公司(1. 25 μ g_78. 5 二倍稀 釋)，將其裝于NUPAGE Novex 4-12% ,Bis-Tris凝膠。凝膠運行37分鐘以分離蛋白質(zhì)樣 品，分離的蛋白被被轉(zhuǎn)移至NC膜，在20V下7分鐘，使用IBL0T ，如實施例10所述。按照本 發(fā)明的如下方法處理未封閉膜。未封閉膜放置在小型IBL0T 底部堆棧。分離溶液，通過將 初級抗體或二級抗體稀釋在30%的合成阻斷緩沖區(qū)的封閉液(產(chǎn)品編號STSB-0100-01，購 自 BioFX, Owings Mills，MD，0. 3%大豆分離，200nM 禾口 IOnM Bis-Tris) 稀釋溶液(3. 5mL, 含初級(1 2500)抗體應)用于聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)，如實施例4描述的。在這種 情況下，IBL0T 被設置為5V 3分鐘的程序。當程序運行完，載體基質(zhì)被去除，并用第二載 體基質(zhì)替代，其中3. 5mL的上述稀釋液含有二級抗體(羊抗兔綴合的AP，1 1000)。在這 種情況下IBL0T 被設置為5V的程序3分鐘。當程序運行完，去除膜，用WesternBreeze 洗滌液洗三次并如實施例10所述顯影。比較對照膜，以實施例10所述，結(jié)果分別見圖12B 及12A所示。實施例12圖13A中表示的結(jié)果基本上按照實施例2中所述獲得，具有以下實施例
2μ g-62ng的A431細胞裂解液載于二個相同的NUPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris凝膠 anvitrogen公司)且按照制造商說明分解蛋白。分解的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝化纖維(NC)蛋 白印跡膜，其使用IBL0T 干式印跡系統(tǒng)(Invitrogen公司，Carlsbad, CA)，運行P3程序7 分鐘。使用WesternBreeze⑧試劑盒封閉液在室溫下使用旋轉(zhuǎn)振動篩將膜被封閉30分鐘， 使用WesternBreeze⑧洗滌液洗兩次，每次5分鐘。將其中一張膜(圖13A所述的左手版面)進行常規(guī)的Western印跡。用1 10，000 倍稀釋液的單克隆抗Elf抗體(在TOSTERNBREE^ #釋液中)在室溫下用旋轉(zhuǎn)振動篩進 行印跡1小時。去除印跡溶液并將該膜洗三次，每次5分鐘。然后，用TOSTERNBREE^⑧試 劑盒的抗鼠二級抗體綴合過氧化物酶在旋轉(zhuǎn)振動篩上將該膜培養(yǎng)30分鐘。去除該二級印 跡溶液并洗膜3次，每次5分鐘，并按照制造商說明用ECL試劑顯影。將另外的膜(在圖13A的右邊版面的描述)進行如下電印跡在A431細胞裂解 液轉(zhuǎn)移到NC膜后，膜被如上所述封閉，并使用IBL0T 系統(tǒng)進行電免疫處理。將膜放置在 小型IBL0T 底部堆棧。3.5mL含有初級(1 5，000小鼠抗Elf)和二級抗體(抗鼠綴合 HRP, 1 5，000)的溶液被應用于聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)(購于MdovskyHousholdproducts, Ltd. Ashdod, Israel).然后將基質(zhì)放置在膜頂部并用印跡輥是去除氣泡。然后 將頂部堆棧放置在基質(zhì)頂部并關閉IBL0T 儀器的蓋子。將IBL0T 設置為3分鐘的P7程 序。當程序運行完，膜被去除，用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并使用如上所述的增強化學
發(fā)光顯影。圖13B中表明的得到的結(jié)果基本上如圖13A所描述的，但下列情況除外A431細 胞裂解液被HeLa細胞裂解液替換。對于常規(guī)免疫印跡(在左側(cè)版面中表明)，初級抗體被鼠 抗ERKWl 5，000稀釋液取代。二級抗體，及其所使用的稀釋液維持不變。對于電免疫印 跡(在右側(cè)版面表明)，初級抗體的稀釋度為1 2. 500，以及二級抗體稀釋度為1 5.000。實施例13圖14A至14D所示的實驗基本上按照實施例12所述的進行，下列情況除外在圖 14A中，純化牛血清白蛋白(BSA)在NUPAGE Novex 4-12%，Bis-Tris凝膠中分解。在常規(guī) 免疫印跡(在圖14A左邊的版面中表明)中，鼠標抗BSA初級抗體的稀釋度為1 5，000。對于電免疫印跡，在圖14A中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREEZE 稀釋 劑中抗體中鼠抗BSA的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為3分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋 劑中HRP抗體綴合的抗鼠1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收， 其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行3分鐘。當程序完成運行，去除膜， 使用TOSTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖14B 中，SW480 細胞裂解液分解在 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠 中。在常規(guī)免疫印跡(在圖14B左邊的版面中表明)中，兔抗微管蛋白抗體的稀釋度為 1 5，000。對于二級抗體，使用TOSTERNBREE^ 稀釋液中抗兔綴合HRP抗體的1 5,000 稀釋液。對于電免疫印跡，在圖14B中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中兔抗微管蛋白的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為3分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行3分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖14C中，HeLa細胞裂解液分解在NUPAGE No vex 4-12% Bi s_Tr is凝膠中。在 常規(guī)免疫印跡(在圖14C左邊的版面中表明)中，鼠抗p70油k抗體的稀釋度為1 1，000。 對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖14C中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREEZE 稀釋 劑中抗體中鼠抗p70油k的稀釋度為1 500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖14D中，SW480細胞裂解液分解在NUPAGE Novex4_12% Bis-Tris凝膠中。 在常規(guī)免疫印跡(在圖14C左邊的版面中表明)中，兔抗p53抗體的稀釋度為1 5，000。 對于二級抗體，使用WESTERNBREE^⑧稀釋液中鼠抗兔綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。
對于電免疫印跡，在圖14D中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋 劑中抗體中鼠抗P53的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖15A中，HeLa細胞裂解液分解在NUPAGE No vex 4-12% Bis-iTris凝膠中。在 常規(guī)免疫印跡(在圖15A左邊的版面中表明)中，兔抗4E-BP1抗體的稀釋度為1 2，500。 對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖15A中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗4E-BP1的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖15B 中，SW480 細胞裂解液分解在 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠 中。在常規(guī)免疫印跡(在圖15B左邊的版面中表明)中，兔抗-連環(huán)蛋白抗體的稀釋度 為1 2，500。對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的 1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖15B中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗-連環(huán)蛋白抗體的稀釋度為1 500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收。IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被 吸收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去 除膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖15C中，HCG裂解液分解在NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠中。在常規(guī) 免疫印跡(在圖15C左邊的版面中表明)中，兔抗-連環(huán)蛋白抗體的稀釋度為1 2，500。 對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖15C中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中兔抗HCG抗體的稀釋度為1 1，250，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P6程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖IOT 中，純化的 EGFR-GST 融合蛋白分解在 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠中。在常規(guī)免疫印跡(在圖15D左邊的版面中表明)中，兔抗GST抗體的稀釋度 為1 2，500。對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的 1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖15D中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中抗體中兔抗HCG抗體的稀釋度為1 625，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖15E中，HeLa細胞裂解物分解在NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠中。 在常規(guī)免疫印跡(在圖15E左邊的版面中表明)中，鼠抗ΙΚΚα抗體的稀釋度為1 2，500。 對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖15E中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗IKK α抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收。IBL0T 裝置設置為3分鐘Ρ7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被 吸收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去 除膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖16A中，表達HIS標記的Src的HeLa細胞裂解物分解在NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠中。在常規(guī)免疫印跡(在圖16A左邊的版面中表明)中，鼠抗HIS抗 體的稀釋度為1 5，000。對于二級抗體，使用WESTERNBREE^ 稀釋液中兔抗鼠綴合HRP 抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖16A中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗HIS抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖16B 中，P0SIT0PE 對照蛋白 Qnvitrogen 公司，Carlsl^ad，CA)分解在 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠中。在常規(guī)免疫印跡(在圖16B左邊的版面中表明) 中，鼠抗V5抗體的稀釋度為1 10，000。對于二級抗體，使用TOSTERNBREE^⑧稀釋液中 兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖16B中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗V5抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。在圖16C 中，P0SIT0PE 對照蛋白 Qnvitrogen 公司，Carlsl^ad，CA)分解在 NUPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠中。在常規(guī)免疫印跡(在圖16B左邊的版面中表明) 中，鼠抗MYC抗體的稀釋度為1 10，000。對于二級抗體，使用TOSTERNBREE^⑧稀釋液中 兔抗鼠綴合HRP抗體的1 5，000稀釋液。對于電免疫印跡，在圖16C中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中抗體中鼠抗MYC抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。 IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^⑧稀 釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去除 膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。實施例14電印跡與另外的市售免疫檢測替代系統(tǒng)的比較進行在圖17A-D所示的實驗以比較使用三種不同的免疫檢測方法獲得的結(jié)果，即 常規(guī)蛋白質(zhì)印跡(在圖17A-17D左側(cè)版面表明)、SNAP ID 蛋白檢測系統(tǒng)(Millipore公 司，Billerica，MA，在圖17A-17D中間版面所示)和電免疫印跡(圖17A-17D右側(cè)版面所示 的)。在圖17A中，純化的重組胰島素單獨在三個NUPAGE Novex4_12%，Bis-Tris凝膠中 分解。使用如上所述的IBL0T 儀器將分解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。對對照膜(在圖17A左邊版面中表明)進行如上所述的常規(guī)印跡處理，使用在 TOSTERNBREEZE 稀釋劑中稀釋的兔抗胰島素抗體的1 5000稀釋液，在室溫下進行1 小時。遺棄抗體溶液，在WESTERNBREEZE 稀釋劑中洗膜三次，每次5分鐘。在室外下在 WESTERNBREEZE 稀釋劑中將鼠抗兔HRP綴合的抗體的1 5000稀釋液施加至該膜30分 鐘。反復洗滌步驟，并采用如上所述的增強化學發(fā)光法(ECL)來對印跡進行顯影。將ECL 處理的印跡暴露于膜5分鐘并顯影(見左側(cè)版面)。按照制造商說明使用SNAP ID 蛋白檢測系統(tǒng)將二級膜(在圖17A中間版面所示) 進行印跡。在本實驗中使用的抗胰島素抗體和抗兔HRP抗體的稀釋度為1 1650。使用如 上所述的增強化學發(fā)光(ECL)使印跡顯影。將ECL處理的印跡暴露膜5分鐘并顯影(見中 間版面)。對于電免疫印跡，在圖17A中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗胰島素抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收。IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被 吸收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去 除膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。使用如上所 述的增強化學發(fā)光(ECL)顯影印跡。將ECL處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見右側(cè)版 面)°在圖17B中，純化的重組GST標記的EGFR融合蛋白單獨在三個NUPAGE Novex 4-12%，BiS-TriS凝膠中分解。使用如上所述的IBL0T 儀器將分解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。對對照膜(在圖17B左邊版面中表明)進行如上所述的常規(guī)印跡處理，使用在 TOSTERNBREEZE 稀釋劑中稀釋的鼠抗GST抗體的1 2，500稀釋液，在室溫下進行1小 時。遺棄抗體溶液，在WESTERNBREEZE 稀釋劑中洗膜三次，每次5分鐘。在室外下在 WESTERNBREEZE 稀釋劑中將兔抗鼠HRP綴合的抗體的1 5000稀釋液施加至該膜30分 鐘。反復洗滌步驟，并采用如上所述的增強化學發(fā)光法(ECL)來對印跡進行顯影。將ECL 處理的印跡暴露于膜5分鐘并顯影(見左側(cè)版面)。按照制造商說明使用SNAP ID 蛋白檢測系統(tǒng)將二級膜(在圖17B中間版面所示)進行印跡。在本實驗中使用的抗GST抗體和抗鼠HRP抗體的稀釋度分別為1 850和 1 1650。使用如上所述的增強化學發(fā)光(ECL)使印跡顯影。將ECL處理的印跡暴露膜1 分鐘并顯影(見中間版面)。對于電免疫印跡，在圖17B中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗胰島素抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收。IBL0T 裝置設置為5分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔1 2，500稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被 吸收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行2分鐘。當程序完成運行，去 除膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。使用如上所 述的增強化學發(fā)光(ECL)顯影印跡。將ECL處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見右側(cè)版 面)。在圖17C中，SW480細胞裂解液單獨在三個NUPAGE Novex4-12%，Bis-Tris凝膠中 分解。使用如上所述的IBL0T 儀器將分解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。對對照膜(在圖17C左邊版面中表明)進行如上所述的常規(guī)印跡處理，使用在 TOSTERNBREEZE 稀釋劑中稀釋的鼠抗微管蛋白抗體的1 2，500稀釋液和鼠抗肌動蛋白抗 體的1 5，000稀釋液，在室溫下進行1小時。遺棄抗體溶液，在TOSTERNBREEZE 稀釋劑 中洗膜三次，每次5分鐘。在室外下在TOSTERNBREEZE 稀釋劑中將兔抗鼠HRP綴合的抗體 的1 5000稀釋液施加至該膜30分鐘。反復洗滌步驟，并采用如上所述的增強化學發(fā)光 法(ECL)來對印跡進行顯影。將ECL處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見左側(cè)版面)。按照制造商說明使用SNAP ID 蛋白檢測系統(tǒng)將二級膜(在圖17C中間版面所示) 進行印跡。在本實驗中使用的抗微管蛋白抗體和抗肌動蛋白抗體的稀釋度為1 1，650，且 抗鼠HRP抗體的稀釋度為1 2，500。使用如上所述的增強化學發(fā)光(ECL)使印跡顯影。 將ECL處理的印跡暴露膜1分鐘并顯影(見中間版面)。對于電免疫印跡，在圖17C中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREEZE 稀釋 劑中抗體中鼠抗微管蛋白抗體的稀釋度為1 2，500且鼠抗肌動蛋白抗體的稀釋度為 1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收。IBL0T 裝置設置為3分鐘P7程 序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ @稀釋劑中HRP抗體綴合的鼠抗兔 1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸收，其被放置在NC膜上。關閉 IBL0T 儀器，并在P7再運行3分鐘。當程序完成運行，去除膜，使用TOSTERNBREE^⑧浲 液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。使用如上所述的增強化學發(fā)光(ECL)顯影印 跡。將ECL處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見右側(cè)版面)。在圖17D中，大腸桿菌裂解液單獨在三個NUPAGE Novex4_12%，Bis-Tris凝膠 中分解。使用如上所述的IBL0T 儀器將分解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。對對照膜(在圖17D左邊版面中表明)進行如上所述的常規(guī)印跡處理，使用在 TOSTERNBREEZE 稀釋劑中稀釋的鼠抗大腸桿菌抗體的1 2，500稀釋液，在室溫下進行 1小時。遺棄抗體溶液，在WESTERNBREEZE 稀釋劑中洗膜三次，每次5分鐘。在室外下在 WESTERNBREEZE 稀釋劑中將兔抗鼠HRP綴合的抗體的1 5000稀釋液施加至該膜30分 鐘。反復洗滌步驟，并采用如上所述的增強化學發(fā)光法(ECL)來對印跡進行顯影。將ECL 處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見左側(cè)版面)。按照制造商說明使用SNAP ID 蛋白檢測系統(tǒng)將二級膜(在圖17D中間版面所示)進行印跡。在本實驗中使用的抗大腸桿菌抗體的稀釋度為1 1，650，且抗兔HRP抗體的稀 釋度為1 3，000。使用如上所述的增強化學發(fā)光(ECL)使印跡顯影。將ECL處理的印跡 暴露膜1分鐘并顯影(見中間版面)。對于電免疫印跡，在圖17D中右側(cè)版面中表明，3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑 中抗體中鼠抗大腸桿菌抗體的稀釋度為1 2，500，其在聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被吸 收。IBL0T 裝置設置為3分鐘P7程序。從儀器去除基質(zhì)，并有3. 5mL的TOSTERNBREE^ 稀釋劑中HRP抗體綴合的兔抗鼠1 5，000稀釋度在二級聚酯/聚酰胺超細纖維基質(zhì)上被 吸收，其被放置在NC膜上。關閉IBL0T 儀器，并在P7再運行3分鐘。當程序完成運行，去 除膜，使用WESTERNBREE^ 滌液洗三次并用如上所述的增強化學發(fā)光顯影。使用如上所 述的增強化學發(fā)光(ECL)顯影印跡。將ECL處理的印跡暴露于膜1分鐘并顯影(見右側(cè)版 面)°用于檢測核酸的電印跡實施例15在該實施例中，調(diào)整上述電印跡系統(tǒng)和方法適于用于進行核酸印跡實驗(S卩，印 跡法)。 Lambda DNA (12. 5-0. 6ng/孔)樣品100V下在3個相同的0. 8%瓊脂平板凝膠上 運行2小時。將該凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜，使用IBL0T 設備(P8，7分鐘)以及使用IBLOTtmNAT 的堆棧anvitrogen公司，Carload，CA)。在分解的核酸轉(zhuǎn)移至尼龍膜后，通過將尼龍膜浸 泡在0.4N NaOH水溶液中10分鐘，使固化的核酸變性。然后用紫外線照射尼龍膜，使核酸 交聯(lián)在膜上。然后在55°C下在雜交緩沖液中將處理后的膜進行預雜交處理，該緩沖液按 照AMERSHAM ALKPHOS DIRECT 標記和檢測試劑盒所提供的指示制備(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)。在55°C下用含有62. 5ng的DNA探針的12. 5mL預雜交緩沖液培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)來培養(yǎng)其中 一張膜(如圖18A所示對照膜)(用按照制造商說明的堿性磷酸酶來標記Lambda DNA)。將其余兩個測試膜分別放置在iBlot底部堆棧上并將5mL的含有187ng的制備 的DNA探針預雜交緩沖液吸附在基質(zhì)上。將頂端堆疊分別放置在探針浸透的基質(zhì)上并按照 制造商指示將該裝置插入到IBL0T 設備中。將該裝置在P7下分別運行5分鐘(如圖18B 所示)或3分鐘(見圖18C)。在印跡后(無論是常規(guī)方法或電印跡方法)，按照AMERSHAM ALKPHOS DIRECT 標記和檢測試劑盒的指示洗膜，并隨后然后使用⑶P-STAR 試劑(NEB， Ipswich, ΜΑ)電發(fā)光地顯影為基質(zhì)。將所有這三個膜暴露于X射線膠片1小時，并將膠片 顯影。結(jié)果在圖18A-C表明。盡管本文已經(jīng)表明且描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，但對于本領域的技術人員 來時這些實施方案僅作為實施力的方式提供。本領域的技術人員在不偏離本發(fā)明下將聯(lián)想 到多種許多變型、變化和替代?？梢岳斫獾氖牵瑢Ρ景l(fā)明的實施方案做出的各種變化將在本 發(fā)明的實施中應用。如下的權利要求將限定本發(fā)明的保護范圍以及此所涵蓋的在該權利要 求及其等同的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。
權利要求
1.一種系統(tǒng)，其包括第一凝膠基體；第二凝膠基體；和 至少第一載體基質(zhì)；第一凝膠基體和第二凝膠基體包括用于電泳的離子源，且其中載體基質(zhì)包括能夠大體 上可逆吸引蛋白質(zhì)或雜交組合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)位于在第一凝膠基體和第二凝膠基 體之間。
3.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)的表面大體上與第一凝膠基體的表 面并列。
4.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括吸引在其上面的蛋白質(zhì)組合物。
5.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其中載體基質(zhì)包括約0.1 μ g-約IOmg的蛋白質(zhì)組合物。
6.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其中至少一部分蛋白質(zhì)或雜交組合物為至少部分帶負 電荷。
7.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一阻斷劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的系統(tǒng)，其中阻斷劑包括蛋白質(zhì)或雜交組合物。
9.根據(jù)權利要求7所述的系統(tǒng)，其中阻斷劑包括至少一選自下組的蛋白質(zhì)組分凝膠、 無脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白質(zhì)、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球 蛋白、大鼠免疫球蛋白、馬免疫球蛋白、人免疫球蛋白、豬免疫球蛋白、雞免疫球蛋白、合成 肽、水稻蛋白、乳清蛋白、魚蛋白、藻蛋白或其任意組合。
10.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一合成的阻斷劑。
11.根據(jù)權利要求10所述的系統(tǒng)，其中合成的阻斷劑包括約-約50%的合成的阻 斷劑。
12.根據(jù)權利要求10所述的系統(tǒng)，其中進一步包括0.25%-10%的阻斷蛋白。
13.根據(jù)權利要求1-12任一項所述的系統(tǒng)，進一步包括蛋白印跡膜。
14.根據(jù)權利要求13所述的系統(tǒng)，其中蛋白印跡膜位于在第一載體基質(zhì)和第二凝膠基 體之間。
15.根據(jù)權利要求所述13的系統(tǒng)，其中蛋白印跡膜的表面大體上與第一載體基質(zhì)的表 面并列，且其中蛋白印跡膜的相對表面與第二凝膠基體并列。
16.根據(jù)權利要求13所述的系統(tǒng)，其中蛋白印跡膜包括至少一個在其表面上的蛋白樣
17.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括至少一個初級抗體。
18.根據(jù)權利要求17所述的系統(tǒng)，其中初級抗體直接抗使用者確定的測試抗原。
19.根據(jù)權利要求18所述的系統(tǒng)，其中直接抗使用者確定的測試抗原的抗體在系統(tǒng)應 用前由使用者添加至第一載體基質(zhì)上。
20.根據(jù)權利要求17所述的系統(tǒng)，其中初級抗體在系統(tǒng)應用前由使用者添加至第一載 體基質(zhì)上。
21.根據(jù)權利要求17所述的系統(tǒng)，其中初級抗體為加載的對照抗體。
22.根據(jù)權利要求21所述的系統(tǒng)，其中初級抗體選自肌動蛋白、微管蛋白、組蛋白、波
23.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括第一初級抗體和第二初級抗體。
24.根據(jù)權利要求23所述的系統(tǒng)，其中初級抗體為直接抗使用者確定的測試抗原的抗體。
25.根據(jù)權利要求M所述的系統(tǒng)，其中初級抗體在系統(tǒng)應用前由使用者添加至第一載 體基質(zhì)上。
26.根據(jù)權利要求23所述的系統(tǒng)，其中第二初級抗體為加載的對照抗體。
27.根據(jù)權利要求沈所述的系統(tǒng)，其中加載控制器抗體選自肌動蛋白、微管蛋白、組蛋 白、波形蛋白、核纖層蛋白、GAPDH、VDACl、COXIV、hsp-70、hsp-90 或 TBP。
28.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括一第二抗體。
29.根據(jù)權利要求觀所述的系統(tǒng)，其中第二抗體偶合于辣根過氧化酶、生物素、堿性磷 酸酶、熒光染料或Qdot納米晶體。
30.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括至少一個初級抗體和至少一 第二抗體。
31.根據(jù)權利要求30所述的系統(tǒng)，其中至少一初級抗體為加載的對照抗體。
32.根據(jù)權利要求30所述的系統(tǒng)，其中至少一初級抗體為直接抗使用者確定的測試抗 原的抗體。
33.根據(jù)權利要求32所述的系統(tǒng)，其中直接抗使用者確定的測試抗原的抗體在系統(tǒng)應 用前由使用者添加至第一載體基質(zhì)上。
34.根據(jù)權利要求30所述的系統(tǒng)，其中第二抗體偶合于辣根過氧化酶、生物素、堿性磷 酸酶、熒光染料或Qdot納米晶體。
35.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，進一步包括第二載體基質(zhì)。
36.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)位于第一凝膠基體和第一載體基 質(zhì)之間。
37.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)的表面大體上與第一載體基質(zhì)的 表面并列。
38.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)的表面大體上與第二凝膠體的表 面并列。
39.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)包括吸附在其上的蛋白質(zhì)或雜交 組合物。
40.根據(jù)權利要求39所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一阻斷劑。
41.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)包括至少一個初級抗體。
42.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)包括至少一個第二抗體。
43.根據(jù)權利要求35所述的系統(tǒng)，其中第二載體基質(zhì)包括至少一個初級抗體和至少一第二抗體。
44.根據(jù)權利要求1-43任一項所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)或第二載體基質(zhì)包括一 或多個濾紙、一或多個織物、一或多個微纖維片或其任意組合。
45.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括聚酯/聚酰胺微纖維。
46.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，進一步包括第一電極。
47.根據(jù)權利要求46所述的系統(tǒng)，其中第一電極為陰極。
48.根據(jù)權利要求46所述的系統(tǒng)，其中第一電極被電耦合于至少第一凝膠基體。
49.根據(jù)權利要求46所述的系統(tǒng)，其中至少一部分第一電極與第一凝膠基體的表面并列。
50.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，進一步包括第二電極。
51.根據(jù)權利要求50所述的系統(tǒng)，其中第二電極為陽極。
52.根據(jù)權利要求50所述的系統(tǒng)，其中第二電極被電耦合于第二凝膠基體。
53.根據(jù)權利要求50所述的系統(tǒng)，其中至少一部分第二電極與第二凝膠基體的表面并列。
54.根據(jù)權利要求46-53任一項所述的系統(tǒng)，其中第一電極和第二電極包括銅、銀、鉛、 鋁、不銹鋼、石墨、鉬、金或其組合。
55.根據(jù)權利要求46-53所述的系統(tǒng)，其中第一電極和第二電極包括銅。
56.根據(jù)權利要求46-53所述的系統(tǒng)，其中第一電極和第二電極與電源連接。
57.根據(jù)權利要求46-53任一項所述的系統(tǒng)，其中第一電極、第二電極或第一和第二電 極網(wǎng)格設置。
58.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一和第二凝膠基體包括至少一種選自下述的材料瓊脂、丙烯酰胺、礬土、硅石、淀粉、多糖、 殼聚糖、黃原膠、潔冷膠、角叉菜膠或果膠。
59.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一凝膠基體、第二凝膠基體或第一凝膠基體和 第二凝膠基體兩者包括礬土。
60.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括丙烯酰胺。
61.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括約-約30%的丙烯酰胺。
62.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括約5% -約20%的丙烯酰胺。
63.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括瓊脂。
64.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括約0. 5% -約10%的瓊脂。
65.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括約-約5%的瓊脂。
66.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括丙烯酰胺。
67.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括丙烯酰胺和瓊脂。
68.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第一凝膠基體和第二凝膠基體包括約-約30%的丙烯酰胺和約0. -約10%的瓊脂。
69.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一凝膠基體和第二凝膠基體包括包含約 l-3wt. %瓊脂和約5-30wt. %礬土的至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第一和第二凝膠基體。
70.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中包括至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至 少第一和第二凝膠基體的用于電泳的離子源包括一或多種鹽、一或多種酸、一或多種緩沖 液或其任意組合。
71.根據(jù)權利要求70所述的系統(tǒng)，其中至少一種鹽、酸或緩沖液的濃度在約IOmM-IM的 范圍內(nèi)。
72.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括有機緩沖液。
73.根據(jù)權利要求72所述的系統(tǒng)，其中有機緩沖液具有約6-約8.5的pKa。
74.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中至少第一凝膠基體、至少第二凝膠基體或至少第 一凝膠基體和第二凝膠基體包括離子交換基質(zhì)。
75.根據(jù)權利要求74所述的系統(tǒng)，其中離子交換作用基質(zhì)為陰離子交換基質(zhì)或陽離子 交換基質(zhì)。
76.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)，其中第一凝膠基體的組合物與第二凝膠基體的組合 物不同。
77.—種系統(tǒng)，其包括一裝配下述物質(zhì)的陽極陽極凝膠基體；耦合于陽極凝膠基體 的陽電極；一裝配下述物質(zhì)的陰極陰極凝膠基體；耦合于陰極凝膠基體的陰電極；和至少 位于陽極和陰極凝膠基體之間的第一載體基質(zhì)。
78.根據(jù)權利要求所述77的系統(tǒng)，進一步包括第二載體基質(zhì)。
79.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中陽極凝膠基體電耦合于陰極凝膠基體。
80.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中陽極凝膠基體和陰極凝膠基體包括用于電泳的 離子源。
81.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中載體基質(zhì)包括能夠大體上可逆吸附蛋白質(zhì)或雜 交組合物。
82.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中載體基質(zhì)包括一或多種濾紙、一或多種織物、一 或多種微纖維片或其組合。
83.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中第一載體基質(zhì)包括聚酯/聚酰胺微纖維。
84.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，進一步包括蛋白質(zhì)或雜交組合物，其中所述蛋白質(zhì) 或雜交組合物能夠被吸引在第一載體基質(zhì)上。
85.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中至少一部分蛋白質(zhì)或雜交組合物為至少是部分 帶負電荷。
86.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括阻斷劑。
87.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括至少一種初級抗體。
88.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括至少一種第二抗體。
89.根據(jù)權利要求77所述的系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括至少一種初級抗體和一種第二抗體。
90.一種試劑盒，其至少包括第一適當?shù)娜萜?；陽極部件；陰極部件；和第一載體基質(zhì)。
91.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，其中陽極部件包括一陽極凝膠基體。
92.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，其中陽極部件包括一陽極。
93.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，其中陰極部件包括一陰極凝膠基質(zhì)。
94.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，其中陽極部件包括一負電極。
95.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，進一步包括一任選的第二載體基質(zhì)。
96.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，進一步包括一耦合于陽極凝膠基體的陽極。
97.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，進一步包括一耦合于陰極凝膠基體的陰極。
98.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，其中陽極部件和陰極部件被分別包裝。
99.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，進一步包括至少一尺寸可容納陽極部件或陰極部 件的托盤。
100.根據(jù)權利要求90所述的試劑盒，進一步包括至少一含水緩沖液。
101.根據(jù)權利要求100所述的試劑盒，其中含水緩沖液為一阻斷緩沖液。
102.根據(jù)權利要求100所述的試劑盒，其中含水緩沖液包括至少一種阻斷劑。
103.根據(jù)權利要求100所述的試劑盒，其中含水緩沖液包括至少一種合成的阻斷劑。
104.根據(jù)權利要求10303所述的試劑盒，其中合成的阻斷劑包括約-約50%的合 成的阻斷劑。
105.根據(jù)權利要求1022所述的試劑盒，其中阻斷劑包括蛋白質(zhì)或雜交組合物。
106.根據(jù)權利要求1022所述的試劑盒，其中阻斷劑包括至少一種選自下組的蛋白質(zhì) 組分凝膠、無脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白質(zhì)、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、 小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、馬免疫球蛋白、人免疫球蛋白、豬免疫球蛋白、雞免疫球 蛋白、合成肽、水稻蛋白、乳清蛋白、魚蛋白、藻蛋白或其任意組合。
107.根據(jù)權利要求10606所述的試劑盒，其中阻斷劑包括0.25wt. %-10wt%的至少一 種選自下組的蛋白質(zhì)組分凝膠、無脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白質(zhì)、山羊免疫球 蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、馬免疫球蛋白、人免疫球蛋白、豬 免疫球蛋白、雞免疫球蛋白、合成肽、水稻蛋白、乳清蛋白、魚蛋白、藻蛋白或其任意組合。
108.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，進--步包括--含水緩沖液。
109.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，其中陽極部件電耦合于陰極部件。
110.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，進--步包括--或多種初級抗體。
111.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，進--步包括--或多種第二抗體。
112.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，進--步包括--或多種泡沫材料。
113.根據(jù)權利要求90所述的試劑 ，進--步包括--或多片濾紙。
114.一種方法，其包括提供包括陽極和用于電泳的離子源的陽極部件極和用于電泳的離子源的陰極部件；提供包括吸附在上的蛋白質(zhì)或雜交組合物的第一載體 基質(zhì)；提供包括偶合在其上的蛋白樣品的蛋白印跡膜；將蛋白印跡膜和第一載體基質(zhì)放置在陽極部件和陰極部件之間使得第一載體基質(zhì)臨近陰極組件，蛋白印跡膜臨近陽極部件， 且具有偶合的蛋白樣品的蛋白印跡膜的表面大體上與第一載體基質(zhì)的表面并列；以及在陽 極部件和陰極部件之間施加電壓。
115.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中陽極部件包括一陽極凝膠基體。
116.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中陰極部件包括一陰極凝膠基體。
117.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一阻斷劑。
118.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一初級抗體。
119.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一第二抗體。
120.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物包括一核酸探針。
121.根據(jù)權利要求113所述的方法，其中蛋白質(zhì)或雜交組合物在放置步驟前被吸附在 第一載體基質(zhì)上。
122.根據(jù)權利要求121所述的方法，其中吸附步驟包括將第一載體基質(zhì)與包括蛋白質(zhì) 或雜交組合物的水溶液接觸。
123.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓高達約50V。
124.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓高達約25V。
125.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓高達約15V。
126.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓高達約5V。
127.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約15分鐘。
128.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約10分鐘。
129.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約5分鐘。
130.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約1-約5分鐘。
131.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約1-約3分鐘。
132.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中電壓施加至約3分鐘。
133.根據(jù)權利要求114所述的方法，其中在陽極部件和陰極部件之間施加電壓后，用 第二載體基質(zhì)替換第一載體基質(zhì)，所述第二載體基質(zhì)包括吸附在其上的蛋白質(zhì)或雜交組合 物。
134.根據(jù)權利要求133所述的方法，其中用第二載體基質(zhì)替換第一載體基質(zhì)后在陽極 部件和陰極部件之間施加電壓。
135.根據(jù)權利要求113-134任一項所述的方法，進一步包括將蛋白印跡膜用于一或多 個洗滌步驟。
136.根據(jù)權利要求135所述的方法，其中蛋白印跡膜至少洗滌三次。
137.根據(jù)權利要求135所述的方法，其中至少一個沖洗步驟為約1-5分鐘。
138.根據(jù)權利要求113，135或137任一項所述的方法，進一步包括將蛋白印跡膜用于 檢測步驟。
139.根據(jù)權利要求138所述的方法，其中檢測步驟包括化學發(fā)光檢測步驟。
140.根據(jù)權利要求138所述的方法，其中檢測步驟包括比色分析檢測步驟。
141.根據(jù)權利要求138所述的方法，其中檢測步驟包括瑩光檢測步驟。
142.—種系統(tǒng)，其包括陽極部件、陰極部件和第一載體基質(zhì)，，其中第一載體基質(zhì)包括 聚酯/聚酰胺微纖維。
全文摘要
本發(fā)明提供了適于對固定化的蛋白質(zhì)或核酸樣品進行干式或大體上干式電-印跡分析的系統(tǒng)、試劑盒和方法。本發(fā)明的電印跡可包括增強電泳檢測一或多種固定化蛋白或核酸的步驟。固定化蛋白或核酸電印跡的方法可包括對一或多種典型地用于蛋白或核酸印跡方法的試劑施加電壓的步驟。一或多種試劑可吸附在適當?shù)妮d體基質(zhì)上。用于在這里描述的系統(tǒng)和方法的電印跡可在大體上干燥的條件下(即，有少許或無含水緩沖液)實施。
文檔編號G01N33/559GK102150045SQ200980135227
公開日2011年8月10日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權日2008年7月11日
發(fā)明者G·菲爾德曼, I·馬加里特, S·利夫希茨 申請人:生命技術公司