專利名稱：含有熒光分子的聚合物顆粒及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有熒光分子的聚合物顆粒，更詳細而言，涉及分散性優(yōu)異、在其聚合 物層中以高含有率包含熒光分子的聚合物顆粒及其制造方法。
背景技術(shù)：
近年來，作為生物傳感領(lǐng)域中的標記材料，對磁性顆粒的應(yīng)用擴展進行了各種研 究。關(guān)于這一點，本申請人先前提交申請的日本特開2006-88131號公報(專利文獻1)公 開了通過用聚合物對磁性顆粒進行覆膜而在維持磁性顆粒的磁響應(yīng)性的同時實現(xiàn)了標記 物所要求的高分散性的聚合物磁性顆粒。進而，作為其發(fā)展形式，本申請人先前提交申請的 日本特開2008-127454號公報(專利文獻2)公開了通過使包覆磁性顆粒的聚合物層中包 含熒光分子而兼具作為熒光標記的功能和磁響應(yīng)性的多功能型聚合物磁性顆粒。在此，對 于含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，為了實現(xiàn)能通過現(xiàn)有熒光檢測器來檢測到的熒光亮度 而要求其包覆聚合物層中弓I入更多的熒光分子?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2006-88131號公報專利文獻2 日本特開2008-127454號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)而進行的，本發(fā)明的目的在于提供在聚合物層中以高 含有率含有熒光分子的聚合物顆粒及其制造方法。用于解決問題的方案本發(fā)明人等對使聚合物顆粒的聚合物層中含有更多的熒光分子的方法進行了深 入研究，結(jié)果，通過對日本特開2008-1274M號公報(專利文獻2)中公開的在包覆聚合物 層中引入熒光分子的方法加以局部改良而成功地使熒光分子的含量大幅增加。即，本發(fā)明 人等發(fā)現(xiàn)，通過使聚合物顆粒在除去了水的非水性溶劑中溶脹，不僅可適宜地促進聚合物 層溶脹，而且熒光分子向該聚合物層的移動不會被水分子阻礙，因此可使更多的熒光分子 被引入聚合物層的內(nèi)部，進而發(fā)現(xiàn)，通過在蒸發(fā)除去非水性溶劑之前在反應(yīng)體系中添加水， 在蒸發(fā)除去非水性溶劑之后殘留在反應(yīng)體系中的水會防止聚合物顆粒干燥，并且還發(fā)現(xiàn)， 通過上述步驟，可以以適宜地維持其高分散性的狀態(tài)得到以高含有率含有熒光分子的含有 熒光分子的聚合物顆粒，從而完成了本發(fā)明。S卩，根據(jù)本發(fā)明，提供一種含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的制造方法，該方法包 括下述工序?qū)⒕酆衔锎判灶w粒分散在溶解有熒光分子的非水性溶劑中來使包覆聚合物層 溶脹，并使該溶脹的包覆聚合物層吸收熒光分子的工序；在分散有吸收了前述熒光分子的 前述聚合物磁性顆粒的前述非水性溶劑中添加水的工序；蒸發(fā)除去前述非水性溶劑的工序。在本發(fā)明中，前述非水性溶劑可以為與水具有親和性、沸點低于水且蒸氣壓高于水的有 機溶劑。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，其特征在于，其在 包覆聚合物層的內(nèi)部引入了熒光分子，且每mg前述含有熒光分子的聚合物磁性顆粒含有 至少IOOnmol的熒光分子。在本發(fā)明中，前述包覆聚合物層可以通過由包含苯乙烯的單體 成分制成的聚合物來形成。另外，在本發(fā)明中，前述熒光分子可以為稀土金屬螯合物，構(gòu)成 前述稀土金屬螯合物的稀土金屬可以為選自由銪、釤、鋱和鏑組成的組中的金屬。進而，根據(jù)本發(fā)明，提供一種含有熒光分子的聚合物顆粒的制造方法，該方法包括 下述工序?qū)⒕酆衔镱w粒分散在溶解有熒光分子的非水性溶劑中來使聚合物層溶脹，并使 該溶脹的聚合物層吸收熒光分子的工序；在分散有吸收了前述熒光分子的前述聚合物顆粒 的前述非水性溶劑中添加水的工序；蒸發(fā)除去前述非水性溶劑的工序。提供含有熒光分子 的聚合物磁性顆粒，其特征在于，其在聚合物層中引入了熒光分子，且每mg前述含有熒光 分子的聚合物顆粒含有至少IOOnmol的熒光分子。發(fā)明的效果如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可提供分散性優(yōu)異、在聚合物層中以高含有率含有熒光分 子的聚合物顆粒及其制造方法。


圖1為示出本實施方式的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的制造工序的流程圖。圖2為示出實施例1的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測 定結(jié)果的圖。圖3為示出比較例1的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測 定結(jié)果的圖。圖4為示出引入熒光分子之前的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測定結(jié) 果的圖。圖5為示出對銪單質(zhì)分散液進行熒光強度測定的結(jié)果的圖。圖6為示出對熒光聚合物磁性顆粒分散液進行熒光強度測定的結(jié)果的圖。圖7為示出熒光聚合物磁性顆粒分散液和銪單質(zhì)分散液各自的熒光強度與乙二 胺四乙酸(EDTA)濃度的關(guān)系的圖。圖8為示出由實施例1的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒得到的免疫染色的圖。
具體實施例方式下面以附圖所示的實施方式來說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于附圖所示的實施方式。下面以在具有磁響應(yīng)性的聚合物磁性顆粒的包覆聚合物層中引入熒光分子的實 施方式為例來說明本發(fā)明。圖1為示出本實施方式的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的制 造工序的流程圖。在本實施方式中，首先，在工序100中制備聚合物磁性顆粒的水懸浮液。 工序100例如可以通過本申請人先前提交申請的日本特開2006-88131號公報(專利文獻 1)中公開的下述方法來進行。
首先，使表面活性物質(zhì)吸附于鐵氧體(ferrite)等親水性的磁性顆粒來使其疏水 化，然后對該強磁性顆粒添加苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯等可自由基加聚的單體液和 具有親水基的非離子性表面活性劑，進一步添加適量的水并進行混合，進行超聲波處理等 來乳化。將這樣制備的乳液加熱至60 80°C，然后添加親水性的引發(fā)劑，通過乳液聚合來 使單體聚合。最后，從結(jié)束了聚合的乳化顆粒上洗滌除去表面活性劑，由此得到聚合物包覆 磁性顆粒而成的聚合物磁性顆粒的水懸浮液。在接下來的工序101中，用非水性溶劑置換工序100中得到的聚合物磁性顆粒的 水懸浮液的溶劑(即水)，然后進行固相分離。工序101例如可以按下述步驟進行。首先， 使用離心分離機對聚合物磁性顆粒的水懸浮液進行固液分離來除去水，對殘留的粒料加入 甲醇等醇，進一步將固液分離的操作反復(fù)數(shù)次，可以由此來進行。通過該醇洗滌，可除去附 著于包覆聚合物層的親水性物質(zhì)，促進包覆聚合物層溶脹。在接下來的工序102中，在工序101中固液分離得到的聚合物磁性顆粒的粒料中 添加將熒光分子溶解在非水性溶劑中而成的溶液(以下稱為熒光分子溶液)并進行振蕩。 在工序102中，聚合物磁性顆粒的包覆聚合物層由于熒光分子溶液的非水性溶劑而溶脹， 熒光分子與非水性溶劑一起被吸收至該溶脹的聚合物的內(nèi)部。此外，在本實施方式中，作為引入包覆聚合物層的熒光分子，可以使用稀土金屬螯 合物。作為構(gòu)成稀土金屬螯合物的稀土金屬，在銪的基礎(chǔ)上，還可列舉出釤、鋱和鏑。在本實施方式中，由于在前面的工序101中進行了溶劑置換，因此在工序102的反 應(yīng)體系中水已經(jīng)被除去。其結(jié)果是，可適宜地促進包覆聚合物層溶脹，并且熒光分子向包覆 聚合物層的內(nèi)部的移動不會被水分子阻礙，因此可以將更多的熒光分子引入包覆聚合物層 的內(nèi)部。在本實施方式中，對于發(fā)揮作為熒光分子溶液的溶劑、以及作為用于使包覆聚合物 層溶脹的溶劑的作用的上述非水性溶劑，優(yōu)選使用與水具有親和性、沸點低于水且蒸氣壓 高于水的有機溶劑。例如，在本實施方式中，作為上述非水性溶劑，可以使用具有親水性基 團、沸點為56. 5°C的丙酮。在工序102中，優(yōu)選的是，在熒光分子向包覆聚合物層的移動達到飽和狀態(tài)之后， 在工序103中向上述反應(yīng)體系中添加水。所添加的水優(yōu)選為純水，可以使用蒸餾水、超純水 (MilliQ水)。另外，所添加的水量優(yōu)選與上述反應(yīng)體系的非水性溶劑為大致等量的程度。最后，在工序104中，從工序103的反應(yīng)體系中蒸發(fā)除去非水性溶劑。該非水性溶 劑的蒸發(fā)除去可以在只有沸點低于水的非水性溶劑發(fā)生氣化的條件下通過例如減壓處理、 加熱處理、或者邊減壓邊加熱的處理等方法來進行。其結(jié)果是，包覆聚合物層所吸收的非水 性溶劑被除去，只有熒光分子殘留在包覆聚合物層內(nèi)。此時，由于在工序103中添加的水會 殘留在反應(yīng)體系中，因此可防止引入了熒光分子的聚合物磁性顆粒干燥，其結(jié)果是，可適宜 地維持聚合物磁性顆粒的高分散性。最終，在工序105中得到以高含有率含有熒光分子的 聚合物磁性顆粒的水懸浮液。根據(jù)上面說明的步驟，對于每mg含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，可以引入至 少IOOnmol的熒光分子，優(yōu)選引入150nmol以上，更優(yōu)選引入200nmol以上，理想的是引入 250nmol以上。換言之，在本實施方式中，對于每個含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，可以引 入至少4. OX IO5個以上的熒光分子，優(yōu)選引入6. OX IO5個以上，更優(yōu)選引入8. OX IO5個以 上，理想的是引入1. OX IO6個以上，因此可實現(xiàn)作為標記物的充分的熒光亮度。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，可以以維持其高分散性的狀態(tài)提供含有熒光 分子的聚合物磁性顆粒。這即可保證優(yōu)異的定量性。另外，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠?qū)?更多的熒光分子以完全密封在聚合物的內(nèi)部的形式引入，因此本發(fā)明的含有熒光分子的聚 合物磁性顆?？梢栽诩毎?、生物體中等多樣的環(huán)境下不受外部環(huán)境的影響地、穩(wěn)定地供 給高亮度的熒光。此外，本實施方式的聚合物磁性顆?？梢詾榱烁纳婆c生理活性物質(zhì)的結(jié)合性而使 乙二醇二縮水甘油醚(E⑶E)、丁二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇(PEG)等間隔分子(spacer molecule)結(jié)合于包覆聚合物層的表面，上述熒光分子的引入方法可以同樣地適用于為結(jié) 合有間隔分子的狀態(tài)的聚合物磁性顆粒。上面用在以鐵氧體等親水性的磁性顆粒為核而形成的聚合物磁性顆粒的包覆聚 合物層中引入熒光分子的實施方式來說明了本發(fā)明，希望注意的是，本申請的技術(shù)構(gòu)思涉 及用于在粒狀的聚合物中引入熒光分子的通用方法，不應(yīng)將熒光分子的引入對象限定性解 釋為聚合物磁性顆粒。即，根據(jù)本發(fā)明，通過對經(jīng)由乳液聚合、懸浮聚合等已知的方法制備 的、不含磁性顆粒的已知聚合物顆粒的水懸浮液實施上述工序102及其之后的工序，能夠 以與上述同樣的高含有率來使熒光分子被包含在該聚合物顆粒的內(nèi)部，對此，如果是本領(lǐng) 域技術(shù)人員，則應(yīng)該能容易地理解。實施例下面用實施例來更具體地說明本發(fā)明的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，但本發(fā) 明并不限于后述實施例。<E⑶E修飾的聚合物磁性顆粒的制備>在NaOH水溶液(IM)中添加!^eCl2水溶液，通過NaNO3來進行氧化處理。保持恒溫， 使平均粒徑40nm的鐵氧體顆粒析出。通過在該鐵氧體顆粒150mg的懸浮液中添加10- i^一 碳烯酸的NaOH水溶液來使十一碳烯酸吸附于強磁性顆粒，洗滌除去殘留的10-十一碳烯酸 的NaOH水溶液，由此得到疏水化強磁性顆粒。對該疏水化強磁性顆粒添加溶解有0.3g具有PEO鏈的非離子性表面活性劑 Emulgen 1150S-70 (花王株式會社制造)的水溶液來進行超聲波處理，從而使該非離子性 表面活性劑吸附于疏水化強磁性顆粒的表面，使顆粒重新親水化并將其分散于水中。接著，在該重新親水化的鐵氧體顆粒的膠體溶液中添加含有2. 7g苯乙烯(單體)、 0. 3gGMA(甲基丙烯酸縮水甘油酯，單體)、0. 025g AIBN(偶氮二異丁腈，引發(fā)劑)、0. 08g DVB ( 二乙烯基苯，交聯(lián)劑)和2. 5g 二乙醚的單體混合物，進行超聲波處理來得到乳化液。接著，在該乳化液中添加水以使其總量為125g，進行超聲波處理，然后在350rpm 下邊持續(xù)攪拌邊加熱，在20 30分鐘之后達到70°C時添加將50mg水溶性引發(fā)劑V_50 (和 光純藥工業(yè)(株)制造)溶解在5ml純水中而成的水溶液來進行12小時的聚合反應(yīng)，將所 得乳液聚合顆粒洗滌，得到鐵氧體顆粒被聚合物包覆而成的聚合物磁性顆粒的水懸浮液。進而，進行如下修飾使作為間隔物(spacer)的乙二醇二縮水甘油醚(EOTE)結(jié)合 于上述步驟中制備的聚合物磁性顆粒。首先，為了在聚合物磁性顆粒中導(dǎo)入氨基而在該顆 粒的漿料中添加NH4OH水溶液，對其用HCl水溶液調(diào)整pH來使其反應(yīng)，從而使GMA的環(huán)氧 基開環(huán)來導(dǎo)入氨基。接著，對于該聚合物磁性顆粒的開環(huán)的氨基，投加過量的EGDE，用NaOH水溶液調(diào)整PH并進行攪拌，使聚合物包覆鐵氧體顆粒的氨基與EGDE的環(huán)氧基鍵合。反應(yīng)后，利用磁 分離操作來進行水洗滌，得到被EGDE修飾的聚合物磁性顆粒的水懸浮液。〈熒光分子的引入〉(熒光分子溶液的制備)將作為熒光分子的1. Img Eu(TTA)3(TOPO)2絡(luò)合物(配位有噻吩甲酰三氟丙酮的 Eu絡(luò)合物)添加到0. 22g丙酮中，制備熒光分子的丙酮溶液。(醇洗滌)為了促進聚合物磁性顆粒的高分子層溶脹而需要除去附著于高分子層的親水性 物質(zhì)，為此進行聚合物磁性顆粒的醇洗滌。具體而言，使用離心分離機對按上述步驟制備的 聚合物磁性顆粒的水懸浮液Img進行固液分離來除去水，對殘留的粒料添加甲醇并使之分 散，然后再次以同樣的步驟反復(fù)進行數(shù)次固液分離的操作。使用在最后的固液分離中除去 甲醇之后殘留的粒料來進行下述實施例和比較例的實驗。(實施例1)對按上述步驟得到的聚合物磁性顆粒的粒料添加含有1.08 μ mol熒光分子的丙 酮溶液，將聚合物磁性顆粒分散于丙酮溶液中。將該丙酮溶液在室溫下振蕩1小時，然后在 該丙酮溶液中添加超純水。此外，超純水是以與丙酮溶液相等的量來添加的。此后，在60°C 下進行真空加熱來蒸發(fā)除去丙酮，得到聚合物磁性顆粒的水懸浮液。(比較例1)對按上述步驟得到的聚合物磁性顆粒的粒料添加超純水，將聚合物磁性顆粒分散 于水中。接著，在該水懸浮液中添加含有1.08 μ mol熒光分子的丙酮溶液并進行混合。此 外，熒光分子的丙酮溶液是以與上述超純水相等的量來添加的。最后，將該混合溶液在室溫 下振蕩1小時，然后在60°C下進行真空加熱來蒸發(fā)除去丙酮，得到聚合物磁性顆粒的水懸 浮液。(比較例2)對按上述步驟得到的聚合物磁性顆粒的粒料添加含有1.08 μ mol熒光分子的丙 酮溶液，將聚合物磁性顆粒分散。將該丙酮溶液在室溫下振蕩1小時，然后在60°C下進行真 空加熱來蒸發(fā)除去丙酮，得到聚合物磁性顆粒的粉末。<分散性的檢驗>使用離心機分別對上述實施例1和比較例1中得到的聚合物磁性顆粒的水懸浮液 進行固液分離，將所得粒料分散于ο. 1 % NP40 (表面活性劑Nonidet P-40,經(jīng)銷商NACALAI TESQUE，INC.)的溶液中來進行洗滌，然后再次使其懸浮在水中來進行分散性的評價。另外， 對于比較例2中得到的聚合物磁性顆粒的粉末也同樣地添加0. 1% NP40的溶液，嘗試在水 中進行分散。此外，分散性的評價基于用動態(tài)光散射法得到的粒徑的重量換算分布測定結(jié) 果來進行。粒徑的重量換算分布的測定使用FPAR-1000 (大冢電子株式會社)。圖2示出實施例1的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測定 結(jié)果，圖3示出比較例1的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測定結(jié) 果。另外，圖4示出引入熒光分子之前的聚合物磁性顆粒的粒徑的重量換算分布測定結(jié)果。 引入熒光分子之前的聚合物磁性顆粒顯示如圖4所示的單峰性分布，對于實施例1和比較 例1，結(jié)果如圖2和圖3所示，顯示與圖4同樣的單峰性分布，平均粒徑均為220nm左右，由此可知在熒光分子引入后仍保持為單顆粒分散。此外，對比較例2也嘗試進行了測定，但由 于作為樣品的聚合物磁性顆粒明顯發(fā)生聚集，因此無法分散在水中，測定本身成為不可能。 上述實施例的結(jié)果顯示，本發(fā)明的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒具有適宜的分散性。這 保證了其在傳感標記物用途中的優(yōu)異的定量性?！礋晒夥肿拥囊肓康臋z驗〉接著，分別對實施例1和比較例1進行Eu(TTA)3(TOPO)2絡(luò)合物的引入量的測定。 具體而言，使用丙酮使銪絡(luò)合物從引入了熒光分子的聚合物磁性顆粒中溶出，用原子發(fā)射 光譜對這些溶出的銪(ICP-OES, Leeman Labs, INC U. S. Α.，裝置名=Prodigy ICP)進行定 量。下述表1示出其定量結(jié)果。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的制造方法，該方法包括下述工序?qū)⒕酆衔锎判灶w粒分散在溶解有熒光分子的非水性溶劑中來使包覆聚合物層溶脹，并 使該溶脹的包覆聚合物層吸收熒光分子的工序；在分散有吸收了所述熒光分子的所述聚合物磁性顆粒的所述非水性溶劑中添加水的工序；蒸發(fā)除去所述非水性溶劑的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述非水性溶劑為與水具有親和性、沸點低 于水且蒸氣壓高于水的有機溶劑。
3.一種含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，其特征在于，其在包覆聚合物層的內(nèi)部引入 了熒光分子，且每mg所述含有熒光分子的聚合物磁性顆粒含有至少IOOnmol的熒光分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，其中，所述包覆聚合物層 是通過由包含苯乙烯的單體成分制成的聚合物來形成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，其中，所述熒光分子為 稀土金屬螯合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，其中，構(gòu)成所述稀土金屬 螯合物的稀土金屬選自由銪、釤、鋱和鏑組成的組。
7.一種含有熒光分子的聚合物磁性顆粒的制造方法，該方法包括下述工序通過用非水性溶劑對聚合物磁性顆粒的水懸浮液進行溶劑置換來除去水，然后將該聚 合物磁性顆粒分散在溶解有熒光分子的非水性溶劑中來使包覆聚合物層溶脹，并使該溶脹 的包覆聚合物層的內(nèi)部吸收熒光分子的工序；在分散有吸收了所述熒光分子的所述聚合物磁性顆粒的所述非水性溶劑中添加水的 工序；蒸發(fā)除去所述非水性溶劑，得到吸收了所述熒光分子的所述聚合物磁性顆粒的水懸浮 液的工序。
8.一種含有熒光分子的聚合物顆粒的制造方法，該方法包括下述工序?qū)⒕酆衔镱w粒分散在溶解有熒光分子的非水性溶劑中來使聚合物層溶脹，并使該溶脹 的聚合物層吸收熒光分子的工序；在分散有吸收了所述熒光分子的所述聚合物顆粒的所述非水性溶劑中添加水的工序；蒸發(fā)除去所述非水性溶劑的工序。
9.一種含有熒光分子的聚合物顆粒，其特征在于，其在聚合物層中引入了熒光分子，且 每mg所述含有熒光分子的聚合物顆粒含有至少IOOnmol的熒光分子。
10.一種熒光免疫染色方法，其特征在于，該方法通過熒光抗體法來進行免疫染色，其對貼附在基板上的組織切片賦予固定有抗體的權(quán)利要求3 6中的任一項所述的所 述含有熒光分子的聚合物磁性顆粒，并使該含有熒光分子的聚合物磁性顆粒朝向所述組織 切片來進行強制性的磁感應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的熒光免疫染色方法，其中，所述磁感應(yīng)通過在所述基板的 背面?zhèn)扰渲么盆F來進行。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供在聚合物層中以高含有率含有熒光分子的聚合物顆粒及其制造方法。通過使聚合物顆粒在除去了水的非水性溶劑中溶脹，不僅可促進聚合物層溶脹，而且熒光分子向聚合物層內(nèi)部的移動不會被水分子阻礙，因此可使更多的熒光分子被引入聚合物層的內(nèi)部。另外，由于在蒸發(fā)除去非水性溶劑之前會在反應(yīng)體系中添加水，因此殘留在反應(yīng)體系中的水會防止聚合物顆粒被干燥，其結(jié)果是，可適宜地維持該含有熒光分子的聚合物顆粒的高分散性。
文檔編號G01N33/543GK102149753SQ20098013568
公開日2011年8月10日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者半田宏, 坂本聰, 望月勇輔, 河田慎太郎, 畠山士 申請人:國立大學(xué)法人東京工業(yè)大學(xué)