專利名稱：采用強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置和熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置和熒光檢測方法，其中，朝向測量對象物照射進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光的同時，接收測量對象物通過照射發(fā)出熒光的熒光信號，并對該信號進(jìn)行信號處理。例如涉及適用于醫(yī)療、生物領(lǐng)域的流式細(xì)胞儀等分析裝置的熒光檢測裝置和熒光檢測方法，該分析裝置利用熒光色素所發(fā)出的熒光對以蛋白為代表的細(xì)胞、DNA和RNA等測量對象物進(jìn)行識別，由此在短時間內(nèi)進(jìn)行測量對象物的分析等。
背景技術(shù)：
應(yīng)用于醫(yī)療、生物領(lǐng)域的流式細(xì)胞儀中內(nèi)置有一種熒光檢測裝置，該熒光檢測裝置接收測量對象物的熒光色素通過激光照射而發(fā)出的熒光，由此識別出測量對象物的種類。特別是在醫(yī)療領(lǐng)域，盛行對蛋白之間的生物結(jié)合等相互作用的研究。特別是，盛行采用螢光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的計測方法對蛋白之間的相互作用進(jìn)行的研究。以往，通過改變熒光強(qiáng)度進(jìn)行FRET的測量，但近年來，公開有各種利用熒光弛豫時間(熒光壽命)的變化對測量對象物進(jìn)行分析的流式細(xì)胞儀。一般來說，流式細(xì)胞儀中，采用熒光色素(熒光試劑)使含有以蛋白為代表的細(xì)胞、DNA、RNA、酶的活體物質(zhì)等的測量對象物的混濁液標(biāo)簽化，然后施加壓力以使鞘液以每秒IOm以下的速度在管道內(nèi)流動，且使含有被熒光色素標(biāo)簽化的測量對象物的混濁液流動于該鞘液中，由此形成測量對象物的流動池。通過該流動中的測量對象物被激光照射，流式細(xì)胞儀接收附著在測量對象物上的熒光色素所發(fā)出的熒光，并將該熒光作為標(biāo)簽進(jìn)行識另U，由此特定測量對象物。該流式細(xì)胞儀，例如能夠測量出細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、酶、蛋白等測量對象物在細(xì)胞內(nèi)的相對量，且在短時間對能夠?qū)@些測量對象物的作用進(jìn)行分析。另外，使用通過熒光對特定類型的細(xì)胞或染色體進(jìn)行特定、并僅在特定的細(xì)胞或染色體以活著的狀態(tài)下在短時間內(nèi)進(jìn)行分選收集的細(xì)胞分類器等。在上述儀器的使用中，要求在短時間內(nèi)根據(jù)熒光信息對更多的測量對象物進(jìn)行正確地特定。下述專利文獻(xiàn)1中記載有根據(jù)熒光壽命(熒光弛豫時間)對采用不同熒光色素進(jìn)行標(biāo)簽的每個粒子或細(xì)胞進(jìn)行識別的識別裝置和識別方法。該文獻(xiàn)中，通過來自調(diào)制器的調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光從光源射出，并朝向流動腔內(nèi)的照射口照射，并照射在一個個的粒子或細(xì)胞上。粒子或細(xì)胞所發(fā)出的熒光在光檢測器變成熒光信號后被輸送到兩個混頻器。另一方面，調(diào)制器的調(diào)制信號通過可變移相器被輸送到兩個混頻器。此時，在一個混頻器，通過使信號的相位發(fā)生90度位移的90度移相器，供給相位發(fā)生90度位移的調(diào)制信號，而在另一個混頻器，相位沒有發(fā)生位移的調(diào)制信號按照原樣進(jìn)行供給。由此，輸送到各混頻器的熒光信號和調(diào)制信號混合在一起，并通過低通濾波器可以得到作為熒光信號相位滯后信息的實數(shù)部成分和虛數(shù)部成分。根據(jù)該實數(shù)部成分和虛數(shù)部成分之間的比可計算出熒光壽命。
由此，根據(jù)熒光壽命能夠識別出每個粒子或細(xì)胞。除此之外，在專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)3中也記載有利用熒光的相位滯后求出熒光壽命用以識別粒子或細(xì)胞的流式細(xì)胞儀。專利文獻(xiàn)1 :US專利5504337號公報專利文獻(xiàn)2 =US專利5270548號公報專利文獻(xiàn)3 =US專利5317162號公報然而，對于上述專利文獻(xiàn)中所記載的流式細(xì)胞儀，在熒光信號中作為調(diào)制信號相位滯后信息的實數(shù)部成分(或余弦成分)和虛數(shù)部成分(正弦成分)必定為固定值。另一方面，用來混合熒光信號和調(diào)制信號的混頻器以含有因調(diào)制信號導(dǎo)致的DC成分的偏移量方式進(jìn)行輸出。當(dāng)熒光信號的熒光強(qiáng)度較弱(熒光信號電平低)時，該偏移量對用于求出熒光強(qiáng)度的熒光弛豫時間的相位滯后信息影響較大，因此在上述流式細(xì)胞儀中存在無法正確計算出熒光弛豫時間的問題。因此，本發(fā)明為了解決上述問題，其目的在于提供一種熒光檢測裝置和熒光檢測方法，朝向測量對象照射以規(guī)定頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光并接收該測量對象物發(fā)出的熒光，且對此時所得到的熒光信號進(jìn)行信號處理并對其進(jìn)行熒光檢測時，即使混頻器所輸出的混合信號中含有DC信號，也能夠比以往高精度地計算出熒光弛豫時間。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明為了解決上述問題，其目的在于提供一種熒光檢測裝置和熒光檢測方法，朝向測量對象照射以規(guī)定頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光并接收該測量對象物發(fā)出的熒光，對此時所得到的熒光信號進(jìn)行信號處理并對其進(jìn)行熒光檢測時，即使像以往那樣混頻器所輸出的混合信號中含有DC成分的情況下，也與以往的熒光檢測裝置和熒光檢測方法相比，能夠高精度地計算出熒光弛豫時間(熒光壽命)。本發(fā)明的一個實施方式的熒光檢測裝置，朝向測量對象照射激光以接收該測量對象物所發(fā)出的熒光，并從通過接收所述熒光而得到的熒光信號求出熒光弛豫時間，所述熒光檢測裝置包括激光光源部，朝向測量對象物照射進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光；受光部，輸出測量對象物被強(qiáng)度調(diào)制的激光照射后所發(fā)出的熒光的熒光信號；信號生成部，為了對從所述激光光源部射出的激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制而生成具有規(guī)定頻率的調(diào)制信號，而且，還另外生成與所述調(diào)制信號不同的、所具有的頻率與所述調(diào)制信號頻率不同且與所述調(diào)制信號同步的第一參照信號；信號處理部，包括第一混頻器，將利用所述調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光照射在測量對象物上，由此對輸出自所述受光部的熒光信號與所述第一參照信號進(jìn)行第一混合處理；第一低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第一混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第一低通濾波處理以輸出熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述調(diào)制信號頻率和所述第一參照信號頻率的合計頻率且高于所述調(diào)制信號頻率和所述第一參照信號頻率之間的差分頻率；熒光檢測部，將所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，并利用上述數(shù)字信號中對應(yīng)于所述差分頻率的第一信號成分，計算出相對于所述調(diào)制信號的所述熒光信號的相位，根據(jù)所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。此時，優(yōu)選熒光檢測裝置的所述信號生成部包括第一振蕩器，生成時鐘信號 ’第二振蕩器，與所述第一振蕩器生成的所述時鐘信號同步且生成所述調(diào)制信號；第三振蕩器， 使所述第一參照信號按照與所述時鐘信號同步的方式生成。所述熒光檢測部對在頻率中具有所述差分頻率的作為數(shù)字信號的第二參照信號， 對所述第二參照信號和所述低頻信號的數(shù)字信號進(jìn)行混合，由此能夠求出所述第一信號成分。另外，所述熒光檢測部也可以生成所述第二參照信號?；蛘撸鲂盘柼幚聿堪ǖ诙祛l器，對所述調(diào)制信號和所述第一參照信號進(jìn)行第二混合處理；第二低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部通過使輸出自所述第二低通濾波器的所述正弦波信號成數(shù)字化信號，由此也能夠生成所述第二參照信號。另外，所述熒光檢測部對所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號的數(shù)字信號進(jìn)行快速傅立葉變換(FFT，F(xiàn)ast Fourier Transformation)處理，將通過FFT處理而得到的、對應(yīng)所述差分頻率的實數(shù)部值和虛數(shù)部值作為第一信號成分來計算，并根據(jù)所述實數(shù)部值和所述虛數(shù)部值也可以計算出所述相位。另外，所述受光部除了接收所述熒光的受光元件以外，還具有接收通過所述激光而產(chǎn)生的測量對象物的側(cè)向散射光的受光元件，并輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號；所述信號處理部包括第三混頻器，對所述受光信號和所述第一參照信號進(jìn)行第三混合處理；第三低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部，通過所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號和所述第二參照信號的混合處理、或者通過對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號進(jìn)行FFT 處理，求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號中對應(yīng)所述差分頻率的第二信號成分的相位，并以該第二信號成分的相位為基準(zhǔn)，校正所述熒光信號的相位，然后利用被校正的所述相位能夠求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。另外，所述信號處理部包括第二混頻器，對所述調(diào)制信號和所述第一參照信號進(jìn)行第二混合處理；第二低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部使輸出自所述第二低通濾波器的所述正弦波信號進(jìn)行數(shù)字化，由此生成所述第二參照信號，且從所述熒光信號的相位中減去所述第二參照信號的相位，由此校正所述熒光信號的相位，然后利用被校正的所述相位能夠求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。此時，在所述熒光檢測部，通過對所述第二參照信號進(jìn)行FFT處理、或者使另生成的具有所述差分頻率的正弦波信號與所述第二參照信號進(jìn)行混合，由此能夠求出所述第二參照信號的相位。另外，在所述熒光檢測部，對所述另外生成的具有所述差分頻率的正弦波信號和所述第二參照信號進(jìn)行混合時，使正弦信號和余弦信號分別與所述第二參照信號進(jìn)行混合以求出混合后的結(jié)果值比，由此也能夠求出所述第二參照信號的相位。
在所述熒光檢測部，求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間時，利用預(yù)先設(shè)定的校正量，對已進(jìn)行所述校正的所述熒光信號的相位進(jìn)行進(jìn)一步的校正，然后利用使用所述校正量進(jìn)行校正的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間，優(yōu)選所述校正量是在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的熒光色素作為測量對象物來測量熒光時使所求出的所述熒光弛豫時間與所述熒光色素所具有的熒光弛豫時間相一致的求出量。另外優(yōu)選，在所述受光部，除了接收所述熒光的受光元件以外，還具有接收通過所述激光而產(chǎn)生的測量對象物的側(cè)向散射光的受光元件，并輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號；所述信號處理部包括第三混頻器，對所述受光信號和所述參照信號進(jìn)行第三混合處理；第三低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號的振幅，且所述熒光檢測部將所求出的所述振幅規(guī)定為所述側(cè)向散射光的熒光強(qiáng)度，而且將從所述第一信號成分求出的振幅規(guī)定為熒光強(qiáng)度，并輸出所述側(cè)向散射光的強(qiáng)度、所述熒光強(qiáng)度和所述熒光弛豫時間。本發(fā)明的一個實施方式的熒光檢測方法，通過朝向測量對象照射激光以接收該測量對象物所發(fā)出的熒光，并從通過接收所述熒光而得到的熒光信號求出熒光弛豫時間，所述熒光檢測方法包括下述工序朝向測量對象物照射以規(guī)定頻率的調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光；通過檢測裝置接收測量對象物被所述激光照射后所發(fā)出的熒光，并獲得通過所述檢測裝置而得到的熒光信號；另生成與所述調(diào)制信號不同的、所具有的頻率與所述調(diào)制信號頻率不同且與所述調(diào)制信號同步的第一參照信號；對通過朝向測量對象物照射進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光而在所述檢測裝置中得到熒光信號和所述第一參照信號進(jìn)行第一混合處理，進(jìn)而以截止頻率進(jìn)行第一低通濾波處理，由此生成熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，截止頻率低于所述調(diào)制信號頻率和所述參照信號頻率的合計頻率且高于所述調(diào)制信號頻率和所述參照信號頻率之間的差分頻率；將生成的所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，并利用上述數(shù)字信號中對應(yīng)所述差分頻率的第一信號成分計算出相對于所述調(diào)制信號的所述熒光信號相位，根據(jù)所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。此時，當(dāng)將在頻率中具有所述差分頻率的數(shù)字正弦波信號作為第二參照信號時， 優(yōu)選所述第一信號成分是通過混合所述第二參照信號和所述熒光基準(zhǔn)的低頻信號的的數(shù)字信號而求出的。此時，除了對所述熒光信號進(jìn)行所述第一混合處理和所述第一低通濾波處理以外，還進(jìn)行所述調(diào)制信號和所述第一參照信號的第二混合處理，并以低于所述合計頻率且高于所述差分頻率的截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，然后對通過所述第二低通濾波處理而得到的所述正弦波信號進(jìn)行數(shù)字化處理，由此能夠生成所述第二參照信號。另外，接收所述熒光時，除了接收所述熒光之外，還接收測量對象物被所述激光照射后所發(fā)出的側(cè)向散射光，且輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號；對于所述受光信號，進(jìn)行所述受光信號和所述第一參照信號的第三混合處理和以低于所述合計頻率且高于所述差分頻率的截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，然后對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號和在頻率中具有所述差分頻率的數(shù)字正弦波信號進(jìn)行混合處理，或者對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號進(jìn)行FFT處理，由此求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號的、對應(yīng)所述差分頻率的第二信號成分的相位，并以所述第二信號成分的相位為基準(zhǔn)校正所述熒光信號相位，且利用校正后的相位能夠求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。另外，根據(jù)所述熒光信號的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間時，利用預(yù)先設(shè)定好的校正量對所述熒光信號的相位進(jìn)行校正，且也可以利用該校正后的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。此時，所述校正量是將在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的熒光色素作為測量對象物來測量熒光時使從所述校正后相位求出的所述熒光弛豫時間與所述熒光色素所具有的熒光弛豫時間相一致的方式求出的量。在本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法的實施方式中，對激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的調(diào)制信號頻率和參照信號頻率被設(shè)定成不同的方式，因此即使對以與調(diào)制信號相同的頻率進(jìn)行強(qiáng)度變化的熒光信號和參照信號進(jìn)行混合處理，進(jìn)行低通濾波處理后的信號還是形成以調(diào)制信號頻率和參照信號頻率之間的差分頻率為主要成分的AC成分信號。因此，根據(jù)該信號計算出相對于調(diào)制信號的熒光信號相位(相位滯后)，由此即使像以往那樣、混頻器所輸出的混合信號中含有DC成分的偏移量，也能夠計算出精度比以往高的熒光弛豫時間。另外，由于采用不同的振蕩器生成調(diào)制信號和參照信號，因此在調(diào)制信號和參照信號中，因振蕩器而產(chǎn)生的噪音成分在相同時刻被含有的情況較少。因此，噪音成分很少存在于通過混合熒光信號和參照信號而得到的、含有相位滯后信息的信號中。因此，與以往的、利用一個振蕩器生成調(diào)制信號和參照信號的情況相比，能夠高精度地計算出熒光弛豫時間。本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法的一個實施方式中，由于考慮到參照信號和熒光信號的傳送或信號處理的延遲，因此通過利用側(cè)向散射光的相位信息校正熒光信號相位、或者通過利用調(diào)制信號和參照信號的差分頻率信號的相位信息校正熒光信號相位， 因此能夠高精度地求出熒光信號相位。由此，本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法中能夠求出正確的熒光弛豫時間。另外，將在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的熒光色素作為測量對象物測量熒光色素所發(fā)出的熒光時，在本發(fā)明的熒光檢測裝置和熒光檢測方法的一實施方式中，利用用于校正的校正量對熒光弛豫時間進(jìn)行校正，以使根據(jù)熒光信號相位所求出的所述熒光弛豫時間與所述熒光色素所具有的熒光弛豫時間相一致，由此能夠計算出正確的熒光弛豫時間。


圖1為采用本發(fā)明中強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置的流式細(xì)胞儀的概略構(gòu)成圖；圖2為對圖1所示的流式細(xì)胞儀構(gòu)成進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明的說明圖；圖3為對圖1所示的流式細(xì)胞儀的信號處理部的構(gòu)成進(jìn)行說明的說明圖；圖4為對圖1所示的流式細(xì)胞儀的分析裝置的處理內(nèi)容進(jìn)行說明的說明圖5為對與圖4所示的分析裝置的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖；圖6為對與圖4、圖5所示的分析裝置的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖；圖7為對與圖4 6所示的分析裝置的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖；圖8為對與圖4 7所示的分析裝置的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖。附圖標(biāo)記說明10流式細(xì)胞儀12 樣品20信號處理裝置22激光發(fā)射部23激光光源部24J6 受光部24b聚光透鏡26a透鏡系統(tǒng)26b!,26b2、26b3 分色鏡26ci、26c2、26c3、26c4 帶通濾波器27a、27b、27c、27d 光電轉(zhuǎn)換器28控制和處理部30 管道32回收容器34激光驅(qū)動器40信號生成部42信號處理部46、47、48 振蕩器52a 52d處理電路54、66、68 放大器56可變放大器58功率分配器60、62、52e RF 混頻器6490度混合移相器70、72、52f低通濾波器74、76高通濾波器80分析裝置82AD 轉(zhuǎn)換板84分析裝置主體86FFT處理模塊
88振幅計算模塊90相位計算模塊92相位滯后計算模塊94被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊96熒光弛豫時間計算模塊98混合處理模塊
具體實施例方式以下，根據(jù)適合使用本發(fā)明強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置的流式細(xì)胞儀，進(jìn)行詳細(xì)說明。圖1為適用強(qiáng)度調(diào)制激光L的熒光檢測裝置的流式細(xì)胞儀10的概略構(gòu)成圖。圖2 為對流式細(xì)胞儀10的構(gòu)成進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明的說明圖。以下，對流式細(xì)胞儀10的構(gòu)成進(jìn)行說明。流式細(xì)胞儀10包括信號處理裝置20和分析裝置80。信號處理裝置20中，使作為測量對象的、蛋白等的測量對象物的樣品12在流動池中逐一流動，且朝向該測量對象物照射激光。此時，信號處理裝置20對在樣品12上用來起到標(biāo)簽作用而附著的熒光色素所發(fā)出的熒光的熒光信號進(jìn)行檢測并對其進(jìn)行信號處理。分析裝置80根據(jù)在信號處理裝置20中所得到的處理結(jié)果求出熒光的熒光弛豫時間，進(jìn)而對樣品12中的測量對象物進(jìn)行分析。即，分析裝置80與本發(fā)明的熒光檢測部相對應(yīng)。信號處理裝置20包括激光射出部22、受光部對、26、控制和處理部28和管道30。 控制和處理部觀包括控制部，對來自激光射出部22的激光以規(guī)定頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制；以及信號處理部，對來自樣品12的熒光信號進(jìn)行識別。在管道30中，使樣品12包括在形成高速流的鞘液中，并使樣品12逐一地流動，以形成流動池。如圖1所示，管道30的出口處設(shè)置有回收容器32。在流式細(xì)胞儀10的構(gòu)成中也可以配置用來通過激光L照射在短時間內(nèi)分離出樣品12中的特定細(xì)胞等活體物質(zhì)的細(xì)胞分類器，以將其分離于各自的回收容器。樣品12為包括以蛋白為代表的細(xì)胞、DNA、RNA、酶的活體物質(zhì)等的測量對象物，該樣品12通過熒光試劑(熒光色素)預(yù)先被標(biāo)簽化，且如圖1所示，在混濁液的狀態(tài)下使用。 對于所準(zhǔn)備的樣品12，例如其含有不同種類的多個活體物質(zhì)，且在活體物質(zhì)中，每一個不同種類的活體物質(zhì)上附著有作為熒光色素的、發(fā)出不同的已知波長熒光的已知色素。由此，流式細(xì)胞儀10能夠?qū)Χ鄠€種類的活體物質(zhì)之間的生物結(jié)合等特性進(jìn)行研究。樣品12并不限定于活體物質(zhì)，例如，也可以是能夠與特定活體物質(zhì)相結(jié)合的、設(shè)置人工結(jié)構(gòu)的微球(Micro-beads)。激光射出部22包括激光光源部23和激光驅(qū)動器34。激光光源部23是發(fā)射具有規(guī)定波長的激光L的部分。未圖示的透鏡系統(tǒng)按照使激光L聚焦在管道30中的規(guī)定位置的方式進(jìn)行設(shè)置，在該聚焦位置上形成有樣品12的測量點。在激光L的測量點中射束直徑為數(shù)十微米。其中，在激光光源部23射出一個波長的激光L，但也可以是多個激光形成一個激光束后射出的構(gòu)成。此時，激光光源部23利用半透明反射鏡等使激光匯集成一個光束。在激光光源部23中，強(qiáng)度恒定的CW(連續(xù)波)激光L以規(guī)定頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制后射出。作為發(fā)射出激光L的光源，例如可以使用半導(dǎo)體激光器。激光L是例如以5 IOOmW的輸出功率輸出的激光。另一方面，對于使激光L進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的頻率(調(diào)制頻率)，其的周期與熒光弛豫時間相比稍長，例如10 50MHz。激光驅(qū)動器34按照與控制和處理部觀相連接且能夠控制激光L的發(fā)射強(qiáng)度的方式構(gòu)成。在此，如后述，各激光L的強(qiáng)度通過調(diào)制信號以規(guī)定頻率進(jìn)行調(diào)制。激光光源部23在預(yù)先規(guī)定好的波段進(jìn)行振蕩，以使激光L通過激發(fā)熒光色素使其發(fā)射出特定波長區(qū)域的熒光。被激光L激發(fā)的熒光色素附著在活體物質(zhì)等的樣品12上，當(dāng)樣品12作為測量對象物通過管道30時，在測量點受到激光L的照射后以特定的波長發(fā)射熒光。受光部M按照夾著管道30與激光光源部22相對而置的方式進(jìn)行配置。受光部 M包括光電轉(zhuǎn)換器Ma、聚光透鏡Mb以及遮蔽板Mc。其中，光電轉(zhuǎn)換器2 通過測量點的樣品12使激光L發(fā)生前向散射，由此輸出樣品12通過測量點情況的檢測信號。遮蔽板2 用來遮蔽激光L，以使光電轉(zhuǎn)換器2 不直接接收激光L，而是接收前向散射光。輸出自該受光部M的信號作為觸發(fā)信號來使用，該觸發(fā)信號成為后述分析裝置 80中使AD轉(zhuǎn)換板82開始進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換和使分析裝置主體84開始進(jìn)行分析的定時器。另一方面，受光部沈按照垂直于發(fā)射自激光光源部23的激光發(fā)射方向且垂直于管道30中的樣品12的移動方向的方式進(jìn)行配置。受光部沈包括光電轉(zhuǎn)換器，以用來接收樣品12在測量點被照射后所發(fā)出的熒光和激光的側(cè)向散射光。圖2表示受光部沈的一例的概略構(gòu)成。受光部沈包括對來自樣品12的熒光信號進(jìn)行聚焦的透鏡系統(tǒng)^a、分色鏡^bp 沈132、2乩3、帶通濾波器^(^26(^^6(^26 和光電倍增管等的光電轉(zhuǎn)換器27a 27d。透鏡系統(tǒng)26a將入射到受光部沈的熒光聚焦在光電轉(zhuǎn)換器27a 27d的受光面上。分色鏡^b1Jeb2Jeb3是對規(guī)定范圍波段的熒光進(jìn)行反射而對其它熒光進(jìn)行透射的分色鏡。根據(jù)樣品12發(fā)射的各熒光波長設(shè)定分色鏡^b1Jeb2Jeb3和帶通濾波器^Cl、 26C2,26C3>26C4的反射波段或透射波段，以使分色鏡^b1Jeb2Jeb3和帶通濾波器^^、 26c2,26C3>26C4能夠透射規(guī)定波段的熒光。分色鏡是對激光的側(cè)向散射光的波長區(qū)域光進(jìn)行反射，而對含有熒光波長的波長區(qū)域光進(jìn)行透射的分色鏡。帶通濾波器^c1、26c2,26c3>26c4被分別設(shè)置在光電轉(zhuǎn)換器27a、27b、27c、27d的前面，僅使具有規(guī)定波段的熒光透射。分色鏡26 設(shè)置在光電轉(zhuǎn)換器27a、27d的受光面的前面，光電轉(zhuǎn)換器27a接收來自分色鏡的透射光，光電轉(zhuǎn)換器27d接收來自分色鏡的反射光。透射的熒光波段被設(shè)定成與熒光色素所發(fā)出的熒光波段相對應(yīng)的方式。光電轉(zhuǎn)變換器27a 27d包括如具有光電倍增管的傳感器，該傳感器是在作為受光面的光電面上將接收到的光轉(zhuǎn)換成電信號的傳感器。光電轉(zhuǎn)換器27a 27c中，光的波長區(qū)域受到分色鏡和帶通濾波器的限制，接收具有規(guī)定波長的熒光。光電轉(zhuǎn)換器27d所接收的光的波長區(qū)域受到分色鏡26 的限制，因此光電轉(zhuǎn)換器27d接收激光L的側(cè)向散射光。 由此，受光部沈在接收具有三個不同波長的熒光的同時，接收激光L的側(cè)向散射光。在此，對于所接收的熒光和側(cè)向散射光，由于其作為具有以恒定頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的信號信息的光信號來接收，因此所輸出的熒光信號和受光信號成為具有與進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光L相對應(yīng)的頻率的熒光信號和受光信號。該熒光信號和受光信號被供給到控制和處理部觀。以下，通過接收熒光而得到的信號稱為熒光信號，通過激光L的側(cè)向散射光而得到的信號稱為受光信號。控制和處理部28的構(gòu)成包括信號生成部40、信號處理部42。信號生成部40是除了生成以規(guī)定頻率對激光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制(強(qiáng)度調(diào)制)的調(diào)制信號以外，生成參照信號的部分。具體來說，信號生成部40包括振蕩器(第一振蕩器)46、振蕩器(第二振蕩器)47 和振蕩器(第三振蕩器)48。這些振蕩器也可以是根據(jù)不同電路構(gòu)成的振蕩器。振蕩器46是生成具有規(guī)定頻率的時鐘信號的時鐘生成器。振蕩器47生成用于調(diào)制激光L強(qiáng)度的調(diào)制信號。所生成的調(diào)制信號通過未圖示的濾波器形成單一頻率成分，并通過放大器供給到激光驅(qū)動器34。在激光驅(qū)動器34中，與另準(zhǔn)備的直流電流重疊后被供給到激光光源部23。如后述，振蕩器48生成用于求出熒光弛豫時間的參照信號(第一參照信號)。在振蕩器48所生成的參照信號頻率和在振蕩器47所生成的調(diào)制信號頻率雖不同，但形成相互同步的信號。相互同步是指，在信號開始生成的時刻，能夠生成相同相位的信號，相互相位變?yōu)?的時刻會周期性地存在。振蕩器47和振蕩器48中，信號的生成以與振蕩器46所生成的時鐘信號同步的方式進(jìn)行。因此，調(diào)制信號和參照信號能夠以相互同步的方式生成。調(diào)制信號和參照信號之間的差分頻率，例如為IOOkHz 1MHz，通常為數(shù)百kHz。當(dāng)將樣品12通過測量點的時間設(shè)定為T秒時，優(yōu)選差分頻率范圍的下限為1/T的4倍、上限為后述的AD轉(zhuǎn)換板82的取樣頻率。信號生成部40中，使用代替振蕩器47和振蕩器48的、包括相位比較器、環(huán)路濾波器、壓控振蕩器和分頻器的鎖相環(huán)電路(PLL電路，Phase Locked Loop)。此時，PLL電路也可以同步生成調(diào)制信號和參照信號。由此，分別生成調(diào)制信號和參照信號的理由在于，通過一個振蕩器生成調(diào)制信號和參照信號的情況相比，在后述的RF混頻器中混合調(diào)制信號和參照信號而得到的混合信號不容易受到來自振蕩器的噪音成分的影響的緣故。而且，調(diào)制信號和參照信號由于采用各自的振蕩器而生成的信號，因此在作為混合處理對象的調(diào)制信號和參照信號中，在相同時刻含有噪音成分的幾率較少。將振蕩器47和振蕩器48的頻率按照使調(diào)制信號和參照信號的頻率不同的方式進(jìn)行設(shè)定的原因在于，如后述，在RF混頻器進(jìn)行熒光信號和參照信號的混合處理時，能夠減少作為以往技術(shù)所存在的問題的包括在混合信號中的DC成分的偏移量的影響。對于這點， 在后面進(jìn)行說明。信號處理部42為利用光電轉(zhuǎn)換器27a 27d所輸出的熒光信號和側(cè)向散射光的受光信號提取與樣品12被激光照射后發(fā)出的熒光相對于調(diào)制信號的相位相關(guān)的信息的部分，具體來說，信號處理部42是提取上述熒光相對于調(diào)制信號的相位滯后的相關(guān)信息的部分。具體來說，包括信號處理通道1、2、3，分別對來自光電轉(zhuǎn)換器27a 27c的熒光信號進(jìn)行處理；信號處理通道4，對來自光電轉(zhuǎn)換器27d的受光信號進(jìn)行處理。信號處理通道1 4的信號處理內(nèi)容相同。另外，與上述相位相關(guān)的信息是指，例如，用復(fù)數(shù)表示正弦波信號的相位滯后時的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im成分)。信號處理部42的信號處理通道1包括處理電路52a。信號處理通道2 4分別包括處理電路52b 52d。圖3為表示處理電路52a、52b、52c、52d內(nèi)容的構(gòu)成圖。處理電路5 52d分別包括放大器M，放大熒光信號(受光信號)；可變放大器56 ；功率分配器58，對放大的熒光信號(受光信號)進(jìn)行分配；RF混頻器(第一混頻器)60、62 ；90度混合移相器64 ；放大器66、68 ；以及低通濾波器(第一低通濾波器)70、72 和高通濾波器74、76。其中，信號處理通道4的RF混頻器對應(yīng)第三混頻器，低通濾波器對應(yīng)第三低通濾波器。光電轉(zhuǎn)換器27a 27d所輸送的熒光信號(受光信號)在放大器M被放大，而且在可變放大器56被放大到所需水平。進(jìn)而，熒光信號(受光信號)在功率分配器58被分成兩個信號后輸送到RF混頻器60、62。另外，信號處理通道1、2、3的處理電路52a、52b、52c中RF混頻器(未圖示)對應(yīng)本發(fā)明的第一混頻器，信號處理通道4的處理電路52d的RF混頻器60、62對應(yīng)本發(fā)明的第
三混頻器。另一方面，振蕩器48所生成的參照信號被供給到90度混合移相器64，并生成相位被90度位移的參照信號和保持該相位的(進(jìn)行0度位移)參照信號。通過90度混合移相器64進(jìn)行90度位移的參照信號被供給到RF混頻器62。另一個保持上述相位的參照信號被供給到RF混頻器60。RF混頻器60、62分別對被供給的參照信號和熒光信號(受光信號)進(jìn)行混合處理。作為RF混頻器60、62可以使用有源混頻器或者雙平衡混頻器等無源混頻器。在本實施方式中，對參照信號的相位進(jìn)行90度位移后供給到RF混頻器62，但也可以將進(jìn)行90度位的信號作為熒光信號(受光信號)。放大器66、68對RF混頻器60、62中通過參照信號和熒光信號(受光信號)而制成的混合信號進(jìn)行放大。低通濾波器70、72為了在通過混合處理而得到的混合信號中除去在以參照信號的頻率上加上熒光信號(受光信號)頻率的合計頻率為成分的高頻成分使得以參照信號的頻率和熒光信號(受光信號)的頻率之間的差分頻率為成分的低頻成分通過，例如，作為截止頻率設(shè)置有低于所述合計頻率且高于所述差分頻率的頻率。由此，從低通濾波器70輸出作為熒光信號(受光信號)的相位信息的實數(shù)部成分(Re成分)，從低通濾波器72輸出作為熒光信號(受光信號)的相位信息的虛數(shù)部成分(Im成分)。該Re成分和加成分的信號被輸送到高通濾波器74、76。高通濾波器74、76除去Re成分和Lii成分信號中的DC成分。由此，在AC成分中含有熒光信號(受光信號)的相位滯后信息的狀態(tài)下，能夠除去被包括于輸出自RF混頻器74、76的混合信號中的DC成分的偏移量。通過高通濾波器74、76的Re成分和加成分的信號被輸送到分析裝置80的AD轉(zhuǎn)換板82。另外，信號處理通道1、2、3的處理電路52a、52b、52c的低通濾波器(未圖示)對應(yīng)本發(fā)明的第一低通濾波器，相當(dāng)于信號處理通道4的處理電路52d的低通濾波器(未圖示)對應(yīng)本發(fā)明的第三低通濾波器。如上所述，調(diào)制信號的頻率和參照信號的頻率相不同。因此熒光信號(受光信號) 的頻率和參照信號的頻率也不同。由此，低通濾波器70、72所輸出的實數(shù)部成分(Re成分) 和虛數(shù)部成分am成分)的信號是具有調(diào)制信號頻率和參照信號頻率之間的差分頻率的AC 成分信號。該信號中含有與相位滯后相關(guān)的信息。在以往的方法中，調(diào)制信號和參照信號的頻率相同，因此輸出自低通濾波器70、72的信號是具有固定值的DC成分。如上所述，通過RF混頻器進(jìn)行混合處理的結(jié)果中偏移的DC成分相重疊，因此當(dāng)與相位滯后相關(guān)的信息為DC成分時，分析裝置80無法求出高精度的熒光弛豫時間。因此，在流式細(xì)胞儀10中，調(diào)制信號頻率和參照信號頻率按照作為混合處理結(jié)果而得到的、與相位滯后相關(guān)的信息被包括在AC成分的方式進(jìn)行設(shè)定。AC成分的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分( 成分)被輸送到分析裝置80。分析裝置80包括AD轉(zhuǎn)換板(參照圖1)82和分析裝置主體(計算機(jī))84，其中， AD轉(zhuǎn)換板將分別輸送自信號處理通道1 4的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Lii成分)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。AD轉(zhuǎn)換板82以輸送自受光部M的信號作為觸發(fā)信號，開始對實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換。進(jìn)而，數(shù)字化的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)被供給到分析裝置主體84。分析裝置80利用數(shù)字化的實數(shù)部成分(Re 成分)和虛數(shù)部成分am成分)開始進(jìn)行分析。在分析裝置主體84中，根據(jù)實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分( 成分)，求出相對于激光的熒光相位滯后角度，進(jìn)而由該相位滯后角度求出熒光弛豫時間。然后，根據(jù)所求出的熒光弛豫時間，可以特定出輸出自受光部26的熒光信號是來自哪個熒光色素的信號。在分析裝置主體84中，通過得知熒光弛豫時間的計算結(jié)果是基于哪個信號處理通道的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im成分)的結(jié)果，由此能夠得知上述熒光弛豫時間是來自哪個波長的熒光。另外，熒光色素發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間在每一個熒光色素上是固定的，因此分析裝置主體84得知熒光弛豫時間值和該值是來自哪個信號處理通道的熒光弛豫時間之后，能夠特定出上述信號是哪個熒光色素發(fā)出的熒光。而且，由于預(yù)先知道該熒光色素是附著于哪個樣品12的熒光色素，因此分析裝置主體84通過所特定的熒光能夠知道通過測量點的樣品12是哪個種類的樣品。由此，當(dāng)樣品12內(nèi)的不同種類的活體物質(zhì)相互進(jìn)行生物結(jié)合時，結(jié)合在活體物質(zhì)的兩個熒光色素的熒光基本上同時被檢測出，因此根據(jù)熒光弛豫時間特定出熒光的種類，分析裝置主體84能夠得知進(jìn)行生物結(jié)合的活體物質(zhì)種類。這樣的分析是在樣品12形成流動狀態(tài)、且其每一個樣品橫切測量點時進(jìn)行，因此分析裝置主體84能夠?qū)λ玫降亩鄠€結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理，能夠?qū)悠?2進(jìn)行綜合性分析。在分析裝置主體84中形成有在本發(fā)明中計算熒光弛豫時間的熒光檢測部，且由計算機(jī)構(gòu)成。
圖4為對分析裝置主體84內(nèi)所進(jìn)行的處理內(nèi)容的一例進(jìn)行說明的說明圖。在分析裝置主體84中，通過AD轉(zhuǎn)換板82使各信號處理通道的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)后，進(jìn)行如圖4所示的處理。該處理為軟件處理。軟件處理中，各處理通過輔程序(subprogram)或子程序(subroutine)而被模塊化。具體來說，在分析裝置主體84設(shè)置有FFT處理模塊86、振幅計算模塊88、相位計算模塊90、相位滯后計算模塊92、被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94和熒光弛豫時間計算模塊96。在4所示的例中，表示了輸送自處理電路5 和處理電路52d的熒光實數(shù)部成分 (Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)、以及激光L的側(cè)向散射光的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im)的處理內(nèi)容。在圖4所示的例中，未表示輸送自處理電路52b、52c的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im成分)的處理內(nèi)容。輸送自處理電路52b、52c的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)的處理內(nèi)容與來自處理電路5 的實數(shù)部成分 (Re成分)和虛數(shù)部成分(Im)的處理內(nèi)容相同，因此沒有表示該處理內(nèi)容，也省略該說明。輸送自處理電路52d的涉及到側(cè)向散射光相位滯后的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)、以及熒光的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)，這些信號分別被輸送至FFT處理模塊86以進(jìn)行FFT處理。在FFT處理模塊86中，從實數(shù)部成分(Re成分)求出對應(yīng)調(diào)制信號和參照信號之間的差分頻率Δι的實數(shù)部成分值(Re_Af)，從虛數(shù)部成分(Im成分)求出對應(yīng)差分頻率Af的虛數(shù)部成分值(Im_Af)。所求出的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_ Af)被輸送到振幅計算模塊88。對于從熒光信號得到的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)，其在本發(fā)明中對應(yīng)于與差分頻率相對應(yīng)的第一信號成分，對于從受光信號得到的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)，其在本發(fā)明中對應(yīng)于與差分頻率相對應(yīng)的第二信號成分。在振幅計算模塊88中，計算出實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af) 的二次平方和的平方根，并將該計算結(jié)果作為強(qiáng)度來輸出。即，在振幅計算模塊88輸出側(cè)向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。另外，通過FFT處理而得到的、對應(yīng)差分頻率的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)被輸送到相位計算模塊90。在相位計算模塊90中計算出tar^anuAf/ Re_Af)。由此計算出側(cè)向散射光相位和熒光的相位滯后。進(jìn)而，在相位滯后計算模塊92中，從通過相位計算模塊90而求出的熒光相位滯后減去通過相位計算模塊90所求出的側(cè)向散射光的相位滯后，由此求出被校正的、相對于參照信號的熒光信號的相位滯后。進(jìn)行上述校正的理由在于，要對參照信號的傳送線路和熒光信號或側(cè)向散射光的受光信號傳送線路的差異而引起的相位偏移進(jìn)行校正的緣故。接下來，在熒光弛豫時間計算模塊96中，利用校正的相位滯后角度θ計算出 tan θ/ω。該計算結(jié)果為熒光弛豫時間τ。在此，ω為2 π f，f表示調(diào)制信號的頻率。之所以能夠?qū)an θ/ω值作為熒光弛豫時間τ，這是因為發(fā)生熒光弛豫的過程中做出一次滯后響應(yīng)發(fā)出熒光的緣故。進(jìn)而，在被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94中，計算出(1+(τ ω )2) (1/2)，該所計算出的值與由振幅計算模塊88所計算的熒光振幅相乘，由此計算出通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度。
如上所述，在分析裝置主體84計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間 τ和通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度，這些計算結(jié)果均用于統(tǒng)計處理和分析。當(dāng)然，分析裝置主體84沒有必要計算出所有側(cè)向散射光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ和通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度，并將其全部用于統(tǒng)計處理和分析。只要至少計算出熒光弛豫時間τ并將其用于統(tǒng)計處理和分析即可。其中，對于側(cè)向散射光強(qiáng)度，因樣品12的結(jié)構(gòu)不同而使散射強(qiáng)度有較大的不同，因此上述側(cè)向散射光強(qiáng)度能夠作為表示樣品12的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的指標(biāo)來使用。流式細(xì)胞儀10是通過上述方式構(gòu)成。流式細(xì)胞儀10中，振蕩器46生成時鐘信號，振蕩器47與該振蕩器46所生成的時鐘信號同步而生成調(diào)制信號，振蕩器48與時鐘信號同步而生成參照信號。因此，包括于振蕩器47的調(diào)制信號和振蕩器48的參照信號的噪音成分處于獨立狀態(tài)，因此在RF混頻器60、62中，即使熒光信號和參照信號被混合，也不會像以往那樣，存在因包括噪音成分的熒光信號和包括相同時刻噪音成分的參照信號被相乘而使混合信號含有較大噪音成分的情況。在這樣的流式細(xì)胞儀10的信號處理裝置20中，首先，與振蕩器46所發(fā)出的時鐘信號同步而使規(guī)定頻率的調(diào)制信號發(fā)生在振蕩器47。該信號在激光驅(qū)動器34進(jìn)行規(guī)定處理后被供給到激光光源部23。在激光光源部23，朝向測量點發(fā)射出通過調(diào)制信號頻率光強(qiáng)度被調(diào)制的激光L。在測量點，激光L通過未圖示的透鏡系統(tǒng)形成直徑為數(shù)十微米的射束。該狀態(tài)下，樣品12在管道30中流動而形成液流。該流動，例如在100 μ m的流路徑上具有1 IOm/秒的流速。激光光源部23朝向測量點照射激光L。如果在受光部M生成能夠檢測出樣品12 的通過的檢測信號，則將該檢測信號作為觸發(fā)信號而輸出到分析裝置80。在振蕩器48生成與上述觸發(fā)信號匹配的、且與振蕩器46所生成的時鐘信號同步的參照信號。信號處理部42中，利用光電轉(zhuǎn)換器27a 27d輸送送來的熒光信號、受光信號和參照信號，按照圖3所示的信號處理電路進(jìn)行混合處理和低通濾波處理。由此，信號處理部 42生成作為與熒光和側(cè)向散射光的各信號相位滯后相關(guān)信息的、實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)。在此，例如，調(diào)制激光L的調(diào)制信號頻率為10 50MHz，調(diào)制信號和參照信號之間的差分頻率為IOOkHz 1MHz。參照信號頻率可以高于調(diào)制信號頻率，也可以低于調(diào)制信號頻率。所計算出的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)被輸送到分析裝置 80。分析裝置80中，對輸送來的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Lii成分)的信號進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換以使其數(shù)字化。然后，在分析裝置80進(jìn)行圖4所示的處理，進(jìn)而計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ和通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度。這些計算結(jié)果被用于樣品12的統(tǒng)計處理或分析。其中，分析裝置80根據(jù)以通過側(cè)向散射光而得到的受光信號的相位滯后為基準(zhǔn)的熒光信號相位滯后θ，并根據(jù)式tan θ/ω而計算出熒光弛豫時間。
(變形例1)圖5為對與圖4所示的分析裝置的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖。在圖5所示的處理中，使用具有圖4所示功能的FFT處理模塊86、振幅計算模塊88、相位計算模塊90、相位滯后計算模塊92、被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94和熒光弛豫時間計算模塊96。進(jìn)行圖5所示的處理內(nèi)容時，將包括RF混頻器(第二混頻器)5 和低通濾波器 (第二低通濾波器)52f的電路設(shè)置在信號處理部42。在上述RF混頻器52e中，對生成在振蕩器47的調(diào)制信號和生成在振蕩器48的參照信號進(jìn)行混合處理。上述低通濾波器52f 中，相對于通過混頻器進(jìn)行混合處理后得到的混合信號，以截止頻率進(jìn)行低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有差分頻率的正弦波信號(第二參照信號)，其中，上述截止頻率的頻率低于調(diào)制信號頻率和參照信號頻率的合計頻率且高于調(diào)制信號頻率和參照信號頻率之間的差分頻率。此時，來自上述電路的信號通過AD轉(zhuǎn)換板而供給到分析裝置主體84。在圖5所示的處理內(nèi)容中，首先，在FFT處理模塊86處理于信號處理通道4計算出的受光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分)，由此求出差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)。利用上述兩個值在振幅計算模塊88計算出側(cè)向散射光的受光信號振幅，該振幅作為側(cè)向散射光強(qiáng)度而被輸出。另一方面，在FFT處理模塊86處理于信號處理通道1獲得的熒光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im成分)，由此求出差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af) 和虛數(shù)部成分值(Im_ Δ f)，然后利用該兩個值，在振幅計算模塊88和相位計算模塊90計算出熒光強(qiáng)度和熒光信號的相位滯后9a。在信號處理通道2、3獲得的熒光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Li!成分)的處理內(nèi)容也與信號處理通道1獲得的熒光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Im成分)的處理內(nèi)容相同，因此省略該說明。關(guān)于信號處理通道2、3所得到的熒光信號處理的圖示也被省略。如上所述，分析裝置主體82獲取差分頻率Δ f的信號的AD轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)，其中， 上述差分頻率Δι是通過混合調(diào)制信號和參照信號并對其進(jìn)行低通濾波處理后得到的。然后，F(xiàn)FT處理模塊86求出差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_ Af)。相位計算模塊90利用該兩個值計算出相位eb。接下來，在相位滯后計算模塊92中，利用熒光信號的相位滯后ea、上述相位
預(yù)先存儲保持在分析裝置主體84的校正相位Θ。，計算出θ a-θ b-θ。，由此計算出相對于參照信號的、校正后的相位滯后Θ。從熒光信號的相位滯后θ a減去上述相位理由在于，為了除去因輸送至信號處理部42的信號的傳送延遲時間和因處理所需的延誤時間引起的相位滯后。在此，校正相位(校正量)θ。被預(yù)先存儲保持在分析裝置主體84中。該校正相位θ。如下被確定而存儲。S卩，將在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的已知熒光色素作為樣品12，在該狀態(tài)下測量該樣品12的熒光。此時，確定校正相位θ。，以使從校正的相位滯后θ a- θ b- θ。所求出的熒光弛豫時間與熒光色素所具有的已知的熒光弛豫時間相一致。由此，校正相位θ。是通過校正使上述熒光弛豫時間與已知的熒光弛豫時間相一致的校正量。被校正的相位滯后θ被輸送到熒光弛豫時間計算模塊96。在熒光弛豫計算模塊96中，通過計算tan θ / ω而計算出熒光弛豫時間τ。而且，在被校正的熒光強(qiáng)度計算模塊94中，計算出(1+(τ ω )2) (1/2)且計算出通過 τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度。由此，在分析裝置主體84中，計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ，并將計算結(jié)果適用于樣品12的統(tǒng)計處理或分析。(變形例2)圖6為對與圖4、圖5所示的分析裝置84的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖。在圖6所示的處理中，使用具有圖4所示功能的振幅計算模塊88、相位計算模塊90、相位滯后計算模塊92、被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94、熒光弛豫時間計算模塊96和混合處理模塊98。圖6所示的處理內(nèi)容與圖4所示的處理內(nèi)容不同，即與利用FFT處理模塊86而求出差分頻率Δι的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)的內(nèi)容不同，且分析裝置主體84利用另生成的cos (2 π · Δ f t)，并通過混合處理模塊98分別對熒光信號和側(cè)向散射光的受光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Li!成分)進(jìn)行混合處理。 通過該混合處理，求出差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)?；旌咸幚砟K98通過作為計算機(jī)的分析裝置主體84的軟件處理而進(jìn)行，因此在 RF混頻器60、62進(jìn)行混合處理時不發(fā)生DC成分的偏移。因此能夠進(jìn)行高精度的混合處理。另外，為了不發(fā)生DC成分的偏移，也考慮在分析裝置80中進(jìn)行RF混頻器60、62 的混合處理。但是，對于利用分析裝置的80的AD轉(zhuǎn)換板82對以10 50MHz的頻率進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的熒光信號和受光信號進(jìn)行AD轉(zhuǎn)換的AD轉(zhuǎn)換板來說，其價格昂貴，且利用這種昂貴的AD轉(zhuǎn)換板的方式是不實用的。在混合處理模塊98計算出的差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)被輸送到振幅計算模塊88和相位計算模塊90后，然后進(jìn)行與圖4所示的處理內(nèi)容相同的處理。以下省略對處理內(nèi)容的說明。由此，在分析裝置主體84中，計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ，并將計算結(jié)果適用于樣品12的統(tǒng)計處理或分析。(變形例3)圖7為對與圖4、圖5、圖6所示的分析裝置主體84進(jìn)行的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖。在圖7所示的處理中，使用具有圖5所示功能的振幅計算模塊88、相位計算模塊90、相位滯后計算模塊92、被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94、熒光弛豫時間計算模塊96和圖6所示的混合處理模塊98。圖7所示的處理內(nèi)容與圖5所示的處理內(nèi)容相不同，即利用FFT處理模塊86而求出差分頻率Δι的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)的內(nèi)容不同，且在分析裝置主體84通過混合處理模塊98分別對分析裝置主體84所生成的cos O π · Δ f .t)、 熒光信號和側(cè)向散射光的受光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分am成分) 進(jìn)行混合處理，由此求出差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_ Δ f)。而且，分析裝置主體84通過混合處理模塊98分別對分析裝置主體84所生成的 cos (2 JI ·八€4)、另生成的^乂231 · Δ f . t)和差分頻率Δ ·的信號進(jìn)行混合處理。差分頻率Δ f的信號是指，如圖7所示，利用RF混頻器5 對調(diào)制信號和參照信號進(jìn)行混合
20處理后，通過低通濾波器52f對上述混合信號進(jìn)行低通濾波處理而發(fā)生AD轉(zhuǎn)換的信號。由此，能夠求出差分頻率Af的信號中差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)。在混合處理模塊98算出的差分頻率Af的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_ Af)被輸送到相位計算模塊90。然后進(jìn)行與圖5所示的處理內(nèi)容相同的處理。以下省略對處理內(nèi)容的說明。由此，在分析裝置主體84中，計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ，并將計算結(jié)果適用于樣品12的統(tǒng)計處理或分析。(變形例4)圖8為對與圖4 圖7所示的分析裝置主體84進(jìn)行的處理內(nèi)容不同的、其他處理內(nèi)容的例子進(jìn)行說明的說明圖。在圖8所示的處理中，使用具有圖5所示功能的振幅計算模塊88、相位計算模塊90、相位滯后計算模塊92、被補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度計算模塊94、熒光弛豫時間計算模塊96和圖6所示的混合處理模塊98。進(jìn)行如8所示的處理內(nèi)容時，與圖5所示的處理內(nèi)容相同地、在信號處理部42混合調(diào)制信號和參照信號并實施低通濾波處理，由此，通過計算差分頻率Δι的電路，即、來自設(shè)置有如8所示的RF混頻器5 和低通濾波器52f的電路的信號通過AD轉(zhuǎn)換板82而供給到分析裝置主體84。在圖8所示的處理內(nèi)容中，首先，混合處理模塊98使由信號處理通道4所計算出的受光信號的實數(shù)部成分(Re成分)和虛數(shù)部成分(Li!成分)分別與上述差分頻率Af進(jìn)行混合處理，由此求出差分頻率Δ f的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)。 振幅計算模塊88利用該兩個值計算出側(cè)向散射光的受光信號振幅和熒光信號振幅，并將其作為側(cè)向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度而輸出。另外，相位計算模塊90從熒光信號的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)計算出熒光信號相位θ a。接下來，熒光弛豫時間計算模塊96利用所計算出的熒光信號相位θ a和預(yù)先存儲保持在分析裝置主體84的校正相位Θ。計算出θ a-θ。，由此計算出相對于參照信號的、被校正的熒光信號的相位滯后θ。在此，校正相位(校正量)θ。預(yù)先存儲保持在分析裝置主體84內(nèi)。對于該校正相位θ。，其按照與圖5所示的校正相位θ。相同的方式進(jìn)行被確定和存儲。S卩，將在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的已知熒光色素確定為樣品12，并在該狀態(tài)下測量該樣品12的熒光。此時，確定校正相位θ。，以使由校正的相位滯后θ a-θ。所求出的熒光弛豫時間τ與熒光色素所具有的已知的熒光弛豫時間相一致。由此，校正相位θ。是通過校正使上述熒光弛豫時間與已知的熒光弛豫時間相一致的校正量。另外，在圖8所示的處理內(nèi)容中，與圖5所示的處理內(nèi)容不同點在于，不是利用相位9b計算相位滯后θ。其理由在于，在利用差分頻率Δ f的信號進(jìn)行混合處理而得到的熒光信號的實數(shù)部成分值(Re_Af)和虛數(shù)部成分值(Im_Af)中，因信號的傳送時間和信號處理的延遲時間而產(chǎn)生的相位滯后成為被減去的信息的緣故。因此，通過計算θ a- θ。，能夠求出被校正的相位滯后θ。對于下述處理，由于其與圖5所示的處理相同，因此省略該說明。由此，在分析裝置主體84中，計算出側(cè)向散射光強(qiáng)度、通過τ進(jìn)行補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度、熒光強(qiáng)度、熒光弛豫時間τ，并將計算結(jié)果適用于樣品12的統(tǒng)計處理或分析。如此地，在上述各變形例中，雖然進(jìn)行了用來計算相位滯后的校正，但此時的校正方法是各不同。如上所述，對本發(fā)明的采用強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置和熒光近側(cè)方法進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限定于上述實施方式，在不脫離本發(fā)明主題的范圍內(nèi)所進(jìn)行的各種改良或改變均包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種采用強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測裝置，朝向測量對象照射激光以接收該測量對象物所發(fā)出的熒光，并從通過接收所述熒光而得到的熒光信號求出熒光弛豫時間，其特征在于，包括激光光源部，朝向測量對象物照射進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光；受光部，輸出測量對象物被強(qiáng)度調(diào)制的激光照射后所發(fā)出的熒光的熒光信號；信號生成部，為了對從所述激光光源部射出的激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制而生成具有規(guī)定頻率的調(diào)制信號，而且，還另外生成與所述調(diào)制信號不同的、所具有的頻率與所述調(diào)制信號頻率不同且與所述調(diào)制信號同步的第一參照信號；信號處理部，包括第一混頻器，將利用所述調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光照射在測量對象物上，由此對輸出自所述受光部的熒光信號與所述第一參照信號進(jìn)行第一混合處理； 第一低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第一混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第一低通濾波處理以輸出熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述調(diào)制信號頻率和所述第一參照信號頻率的合計頻率且高于所述調(diào)制信號頻率和所述第一參照信號頻率之間的差分頻率；熒光檢測部，將所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，并利用上述數(shù)字信號中對應(yīng)于所述差分頻率的第一信號成分，計算出相對于所述調(diào)制信號的所述熒光信號的相位，根據(jù)所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測裝置，其中，所述信號生成部包括第一振蕩器，生成時鐘信號；第二振蕩器，與所述第一振蕩器生成的所述時鐘信號同步而生成所述調(diào)制信號；第三振蕩器，使所述第一參照信號按照與所述時鐘信號同步的方式生成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的熒光檢測裝置，其中，所述熒光檢測部對在頻率中具有所述差分頻率的作為數(shù)字信號的第二參照信號和所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號的數(shù)字信號進(jìn)行混合，由此求出所述第一信號成分。
4.如權(quán)利要求3所述的熒光檢測裝置，其中，所述熒光檢測部生成所述第二參照信號。
5.如權(quán)利要求3所述的熒光檢測裝置，其中，所述信號處理部包括第二混頻器，對所述調(diào)制信號和所述第一參照信號進(jìn)行第二混合處理；第二低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部通過使輸出自所述第二低通濾波器的所述正弦波信號形成為數(shù)字化信號，由此生成所述第二參照信號。
6.如權(quán)利要求1或2所述的熒光檢測裝置，其中，所述熒光檢測部對所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號的數(shù)字信號進(jìn)行FFT處理，將通過FFT處理而得到的、對應(yīng)所述差分頻率的實數(shù)部值和虛數(shù)部值作為所述第一信號成分來計算，并根據(jù)所述實數(shù)部值和所述虛數(shù)部值計算出所述相位。
7.如權(quán)利要求3 5中任一項所述的熒光檢測裝置，其中，所述受光部除了接收所述熒光的受光元件以外，還包括接收通過所述激光而產(chǎn)生的測量對象物的側(cè)向散射光的受光元件，并輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號；所述信號處理部包括第三混頻器，對所述受光信號和所述第一參照信號進(jìn)行第三混合處理；第三低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部通過對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號和所述第二參照信號的混合處理、或者通過對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號進(jìn)行FFT處理，求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號中對應(yīng)所述差分頻率的第二信號成分的相位，并以該第二信號成分的相位為基準(zhǔn)， 校正所述熒光信號的相位，然后利用被校正的所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
8.如權(quán)利要求3所述的熒光檢測裝置，其中，所述信號處理部包括第二混頻器，對所述調(diào)制信號和所述第一參照信號進(jìn)行第二混合處理；第二低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部使輸出自所述第二低通濾波器的所述正弦波信號進(jìn)行數(shù)字化處理，由此生成所述第二參照信號，且從所述熒光信號的相位中減去所述第二參照信號的相位，由此校正所述熒光信號的相位，然后利用被校正的所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
9.如權(quán)利要求8所述的熒光檢測裝置，其中，在所述熒光檢測部通過對所述第二參照信號進(jìn)行FFT處理、或者使另生成的具有所述差分頻率的正弦波信號與所述第二參照信號進(jìn)行混合，由此求出所述第二參照信號的相位。
10.如權(quán)利要求9所述的熒光檢測裝置，其中，在所述熒光檢測部對所述另外生成的具有所述差分頻率的正弦波信號和所述第二參照信號進(jìn)行混合時，使正弦信號和余弦信號分別與所述第二參照信號進(jìn)行混合以求出正弦信號和余弦信號分別進(jìn)行混合后的結(jié)果值比， 由此求出所述第二參照信號的相位。
11.如權(quán)利要求8 10中任一項所述的熒光光檢測裝置，其中，所述熒光檢測部在求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間時，利用預(yù)先設(shè)定的校正量，對已進(jìn)行所述校正的所述熒光信號的相位進(jìn)行進(jìn)一步的校正，然后利用使用所述校正量進(jìn)行校正的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間，所述校正量是在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的熒光色素作為測量對象物來測量熒光時使所求出的所述熒光弛豫時間與所述熒光色素所具有的熒光弛豫時間相一致的方式求出的量。
12.如權(quán)利要求1或2所述的熒光檢測裝置，其中，在所述受光部除了接收所述熒光的受光元件以外，還具有接收通過所述激光而產(chǎn)生的測量對象物的側(cè)向散射光的受光元件， 并輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號；所述信號處理部包括第三混頻器，對所述受光信號和所述參照信號進(jìn)行第三混合處理；第三低通濾波器，其以截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，所述截止頻率的頻率低于所述合計頻率且高于所述差分頻率；所述熒光檢測部求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號的振幅，所述熒光檢測部將所求出的所述振幅規(guī)定為所述側(cè)向散射光的熒光強(qiáng)度，而且將從所述第一信號成分求出的振幅規(guī)定為熒光強(qiáng)度，并輸出所述側(cè)向散射光的強(qiáng)度、所述熒光強(qiáng)度和所述熒光弛豫時間。
13.一種采用強(qiáng)度調(diào)制激光的熒光檢測方法，通過朝向測量對象照射激光以接收該測量對象物所發(fā)出的熒光，并從通過接收所述熒光而得到的熒光信號求出熒光弛豫時間，其特征在于，該方法包括下述工序朝向測量對象物照射以規(guī)定頻率的調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光；通過檢測裝置接收測量對象物被所述激光照射后所發(fā)出的熒光，并獲得通過所述檢測裝置而得到的熒光信號；另生成與所述調(diào)制信號不同的、所具有的頻率與所述調(diào)制信號頻率不同且與所述調(diào)制信號同步的第一參照信號；對通過朝向測量對象物照射進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光而在所述檢測裝置中得到熒光信號和所述第一參照信號進(jìn)行第一混合處理，進(jìn)而以截止頻率進(jìn)行第一低通濾波處理，由此生成熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號，其中，截止頻率低于所述調(diào)制信號頻率和所述參照信號頻率的合計頻率且高于所述調(diào)制信號頻率和所述參照信號頻率之間的差分頻率；將生成的所述熒光信號基準(zhǔn)的低頻信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，并利用上述數(shù)字信號中對應(yīng)所述差分頻率的第一信號成分計算出相對于所述調(diào)制信號的所述熒光信號相位，根據(jù)所述相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
14.如權(quán)利要求13所述的熒光檢測方法，其中，當(dāng)將在頻率中具有所述差分頻率的數(shù)字正弦波信號作為第二參照信號時，所述第一信號成分通過混合所述第二參照信號和所述熒光基準(zhǔn)的低頻信號的數(shù)字信號而求出。
15.如權(quán)利要求14所述的熒光檢測方法，其中，除了對所述熒光信號進(jìn)行所述第一混合處理和所述第一低通濾波處理以外，還進(jìn)行所述調(diào)制信號和所述第一參照信號的第二混合處理，并以低于所述合計頻率且高于所述差分頻率的截止頻率對通過所述第二混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第二低通濾波處理，由此輸出在頻率中具有所述差分頻率的正弦波信號，對通過所述第二低通濾波處理而得到的所述正弦波信號進(jìn)行數(shù)字化處理，由此生成所述第二參照信號。
16.如權(quán)利要求13或14所述的熒光檢測方法，其中，接收所述熒光時，除了接收所述熒光之外，還接收測量對象物被所述激光照射后所發(fā)出的側(cè)向散射光，且輸出通過接收所述側(cè)向散射光而得到的受光信號，對于所述受光信號，進(jìn)行所述受光信號和所述第一參照信號的第三混合處理，和以低于所述合計頻率且高于所述差分頻率的截止頻率對通過所述第三混合處理而得到的混合信號進(jìn)行第三低通濾波處理，由此輸出受光信號基準(zhǔn)的低頻信號，對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號和以在頻率中具有所述差分頻率的數(shù)字正弦波信號進(jìn)行混合處理，或者對所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號進(jìn)行FFT處理，由此求出所述受光信號基準(zhǔn)的低頻信號的、對應(yīng)所述差分頻率的第二信號成分的相位，并以所述第二信號成分的相位為基準(zhǔn)校正所述熒光信號相位，且利用校正后的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
17.如權(quán)利要求13或14所述的熒光檢測方法，其中，根據(jù)所述熒光信號的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間時，利用預(yù)先設(shè)定好的校正量對所述熒光信號的相位進(jìn)行校正，且利用該校正后的相位求出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間； 所述校正量是將在已知的熒光弛豫時間內(nèi)發(fā)出熒光的熒光色素作為測量對象物來測量熒光時使從所述校正后的相位求出的所述熒光弛豫時間與所述熒光色素所具有的熒光弛豫時間相一致的方式求出的量。
全文摘要
一種熒光檢測裝置和熒光檢測方法，在利用流式細(xì)胞儀的熒光檢測裝置中，照射通過調(diào)制信號進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制的激光，由此獲得以橫切激光測量點的方式通過測量點的測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光信號。在所述熒光檢測裝置另生成與所述調(diào)制信號不同的、所具有的頻率與所述調(diào)制信號頻率不同且與所述調(diào)制信號的相位同步的參照信號。熒光檢測裝置利用參照信號從熒光信號計算出測量對象物所發(fā)出的熒光的熒光弛豫時間。
文檔編號G01N21/64GK102159937SQ20098013654
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者中田成幸, 土井恭二, 星島一輝, 林弘能 申請人:三井造船株式會社