專利名稱：Hcv的基因型分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及用于預(yù)測感染了 HCV-Ia的患者對包括干擾素的治療方案的應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(“HCV”)感染是令人關(guān)注的人類醫(yī)學(xué)問題。HCV被認(rèn)為是非甲型、非乙型肝炎的多數(shù)病例的誘因劑，估計(jì)其在全球人類中的血清陽性率是3% (A. Alberti 等人，“Natural History of Hepatitis C, "J. Hepatology,31(Suppl. 1), pp. 17-24(1999)).僅僅在美國就有接近四百萬個體被感染。(M. J. Alter等人，“The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States,"Gastroenterol. Clin. North Am. ,23, pp. 437-455(1994) ；M. J. Alter "Hepatitis C Virus Infection in the United States, ” J. Hepatology, 31 (Suppl. 1)，pp. 88-91 (1999))。在 20 世紀(jì) 90 年代中期引入抗-HCV篩選之前，HCV占美國輸血后肝炎病例的80% -90%。在患有失血病癥的個體或經(jīng)常暴露于血液和血液制品的慢性腎衰竭群體中也經(jīng)常見到HCV的高感染率。在第一次暴露于HCV之后，僅有大約20%的受感染個體患上急性臨床肝炎；而在其它人中感染似乎自發(fā)地消退。但是在幾乎70%的個例中，病毒產(chǎn)生慢性感染，可能持續(xù)數(shù)十年(S. Iwarson, "The Natural Course of Chronic Hepatitis，，，F(xiàn)EMS Microbiology Reviews,14，pp.201-204 (1994) ；D. Lavanchy, "Global Surveillance and Control of Hepatitis C，” J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)) 0 延長的慢性感染可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性的和逐漸惡化的肝臟炎癥，其經(jīng)常引起更嚴(yán)重的疾病狀態(tài)，例如硬化和肝細(xì)胞癌 (M. C. Kew,"Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma",FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220(1994) ；I. Saito et. al. , "Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp.6547-6549(1990))。HCV是包膜病毒，其含有大約9. 5kb的正義單鏈RNA基因組?；谄浠蚪M結(jié)構(gòu)和病毒粒子特性，HCV被歸類為黃病毒科中的單獨(dú)的屬，該科還包括瘟病毒(pestiviruse)和黃病毒(flaviviruse) (Alter, 1995,Semin. Liver Dis. 15 :5-14)。病毒基因組由冗長的 5， 非翻譯區(qū)(UTR)、編碼大約3011個氨基酸的多聚蛋白前體的長開放閱讀框和短的3’UTR組成。多聚蛋白前體被宿主和病毒蛋白酶切割以產(chǎn)生成熟的病毒結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性蛋白。HCV 編碼兩種蛋白酶由NS2-NS3區(qū)域編碼的鋅依賴性金屬蛋白酶和由NS3/NS4區(qū)域編碼的絲氨酸蛋白酶。這些蛋白酶是將前體多聚蛋白的特定區(qū)域切割為成熟肽所需要的。非結(jié)構(gòu)性蛋白5B即NS5B的羧基半部分含有RNA依賴性的RNA聚合酶。其余的非結(jié)構(gòu)性蛋白NS4B以及NS5A在病毒復(fù)制中的確切作用仍然是未知的。干擾素α (干擾素)是食品與藥品管理局批準(zhǔn)的慢性HCV感染的治療。干擾素的效應(yīng)是通過不同的細(xì)胞可誘導(dǎo)蛋白介導(dǎo)的，包括雙鏈RNA激活的蛋白激酶(H(R) (Gale 等人，1997，Virology 230:217-227)。僅有8%-12%的具有HCV基因型1的患者具有對于干擾素治療具有持續(xù)的臨床病毒學(xué)應(yīng)答(SVR) (Carithers等人，1997，Hepatology26 83S-88S ；Lindsay, 1997, Heptatology 26 :71S-77S) 就產(chǎn)生持續(xù)的生物化學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答而言，干擾素與鳥苷類似物利巴韋林(RBV)的組合治療顯示比干擾素的單一治療更優(yōu) (Poynard等人，1998，Lancet352 =1426-1432) 0然而，雖然持續(xù)應(yīng)答率顯著改善，但是仍有多達(dá)60%的具有高效價(jià)HCV基因型1的患者對聚乙二醇化的干擾素和利巴韋林治療無應(yīng)答。例如，在感染了 HCV-I的患者中應(yīng)答率低于40%。也報(bào)道了來自美國的感染了原型基因型Ia的患者的相似的低應(yīng)答率(Mahaney等人1994，Hepatology 20 :1405-1411)。與此相反，感染了 HCV基因型-2的患者的應(yīng)答率接近80% (Fried等人，1995，Semin. Liver Dis. 15 :82-91.)。已經(jīng)表明完整HCV多聚蛋白的表達(dá)抑制人U2-0S骨肉瘤細(xì)胞中的干擾素誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(Heim等人，1999，J. Virol. 73 :8469-8475)。尚無報(bào)道哪個HCV蛋白負(fù)責(zé)該效應(yīng)。干擾素應(yīng)答和HCV的非結(jié)構(gòu)性5A(NS5A)序列之間的關(guān)系是有爭議的。對干擾素治療的應(yīng)答在HCV亞型之間存在差異，HCV-Ib亞型對于干擾素治療的抗性最大(Alter等人，1998，MMWR Recomm. Rep. 47 (RR-19) :1_39)。將來自感染了 HCV的患者的干擾素抗性與干擾素敏感性病毒的全長HCV核酸序列進(jìn)行的比較揭示了對應(yīng)于NS5A蛋白的羧基末端的錯義替換(Enomoto 等人，1995，J. Clin. Invest. 96 :224-230)。NS5A 的對應(yīng)的 40 個氨基酸的區(qū)域(HCV多聚蛋白的氨基酸2209-2M8)被稱為干擾素敏感性決定區(qū)，或ISDR(Enomoto 等人，1995)。ISDR包含于NS5A蛋白中的區(qū)域，已經(jīng)表明該區(qū)域在體外結(jié)合并抑制I3KR的功能(Gale 等人，Mol. Cell Biol.，1998，18 :5208-5218)。Enomoto 等人(1996，N. Eng. J. Med. 334 :77-81)提出了一個模型，其中對干擾素治療有響應(yīng)的患者具有的病毒在ISDR 中具有多個替換(與干擾素抗性的HCV Ib-J原型序列相比)；而干擾素治療失敗的患者具有的病毒在ISDR中鮮有替換。在公開了來自干擾素抗性和干擾素敏感性病毒的ISDR序列的研究中，有9項(xiàng)研究支持Enomoto模型，并且得出結(jié)論在5%的顯著性水平，數(shù)據(jù)提供了足夠的證據(jù)證明干擾素應(yīng)答和ISDR中的替換是依賴性的(Enomoto等人，1995，1996 ；Chayama等人， 1997，Hepatology, 25 :745-749 ；Kurosaki 等人，1997，Hepatology 25 :750-753 ；Fukuda 等人，1998，J. Gastroenterol. Hepatol. 13 :412-418 ；Saiz 等人，1998，J. Infect. Dis. 177 839-847 ；Murashima 等人，1999，Scand. J. Infect. Dis. 31 :27-32 ；Sarrazin 等人 1999， J. Hepatol. 30 :1004-1013 ；Sakuma 等人，1999，J. Infect. Dis. 180 :1001-1009)。其它 16 項(xiàng)研究未能得出存在關(guān)聯(lián)的結(jié)論(Hofgartner 等人，1997，J.Med. Virol. 53 :118-126 ；Khorsi 等人,1997，J. Hepatol. 27 :72-77 ；Squadrito 等人，1997，Gastroenterology! 13 :567-572 ； Zeuzem 等人，1997，Hepatology 25 :740-744 ；Duverlie 等人，1998，J. Gen. Virol. 79 1373-1381 ；Franguel 等人，1998，Hepatology 28 :1674-1679 ；Odeberg 等人，1998，J. Med. Virol. 56 :33-38 ；Pawlotsky 等人，1998，J. Virol. 72 :2795-2805 ；Polyak 等人，1998， J. Virol. 72 :4288-4296 ；Rispeter 等人，1998，J. Hepatol. 29 :352-361 ；Chung 等人，1999，J.Med. Virol. 58 :353-358 ；Sarrazin 等人 1999，J. Hepatol. 30 :1004-1013 ；Squadrito 等人，1999，J. Hepatol. 30 :1023-1027 ；Ibarrola 等人，1999，Am. J. Gastroenterol. 94 2487-2495 ；Mihm 等人，1999，J. Med. Virol. 58 :227-234 ；Arase 等人，1999，Intern. Med. 38 461-466)。有趣的是，支持關(guān)聯(lián)性的9項(xiàng)研究中有7項(xiàng)是基于來自日本的HCV分離體；而 16項(xiàng)不支持關(guān)聯(lián)性的研究中有15項(xiàng)是基于來自歐洲的分離體和北美洲的分離體。雖然在北美和歐洲的研究中一般沒有發(fā)現(xiàn)干擾素應(yīng)答與ISDR序列之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的關(guān)聯(lián)， 但是有證據(jù)證明的確存在一定關(guān)系。當(dāng)把來自單個研究的中間體和突變體類別的ISDR序列組合時(shí)，對干擾素的應(yīng)答率高于具有野生型類別的ISDR序列的患者中的應(yīng)答率(Herion and Hoofnagle,1997, Hepatology 25 :769-771)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在感染了 HCV-Ia亞型的人類受試者中，在該受試者中演化的病毒NS5A序列與他或她對于包括干擾素的治療方案的最終應(yīng)答之間存在顯著相關(guān)性。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明包括使用基于干擾素的治療來治療感染了 HCV-Ia 的患者的方法。該方法包括以下步驟a)分析該患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和b)確定用于預(yù)測對于基于干擾素的治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素i)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的HCV NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū)(ISDR)中的變化數(shù)目；和ii)該患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列。具體地，含有在ISDR中具有高度變異性(例如，從共有序列發(fā)生3個或更多個改變)和/或在NS5A氨基酸的位置2 處具有甲硫氨酸(M)或谷氨酸(E)的病毒的患者將具有達(dá)到對聚乙二醇化干擾素和利巴韋林治療的迅速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)的高可能性。例如， IFN/RBV治療使病毒在4周的治療內(nèi)降低到目前的檢測限值(10IU/ml)以下(RVR)的能力高度預(yù)示達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)。相反，感染了不具有ISDR改變或在NS5A氨基酸的位置2 處具有其它氨基酸的病毒的患者達(dá)到RVR的可能性較低。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為b)中的標(biāo)準(zhǔn)的所有要素分配權(quán)重參數(shù)的步
馬聚ο在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A、L、V、E或M。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是L。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是E。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是M。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是V。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)還包括“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素。所述標(biāo)準(zhǔn)包括三個要素中的一個或多個。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素分配權(quán)重參數(shù)的步驟。另一方面，除了在ISDR中具有一定數(shù)目的改變和在NS5A氨基酸序列的位置2 處具有甲硫氨酸(M)或谷氨酸(E)之外，如果患者感染了在NS5A氨基酸序列的位置311處含有Q、R或A的病毒，則該患者具有達(dá)到對聚乙二醇化干擾素和利巴韋林治療的迅速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)的高可能性。相反，感染了在NS5A氨基酸序列的位置311處不含有Q、R或A 的病毒的患者將具有升高的可能性會對基于干擾素的治療無病毒學(xué)應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S、P、Q、R或A。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是P。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是Q。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是R。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是A。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括分析該患者的遺傳多態(tài)性的步驟。在一個實(shí)施方式中，該患者的遺傳多態(tài)性是rsl2979860。在一些實(shí)施方式中，分析患者的部分或全部HCV NS5A基因的步驟包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器擴(kuò)增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括確定該患者是否對基于干擾素的治療有陽性應(yīng)答的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括以下步驟如果該患者被確定為對基于干擾素的治療有應(yīng)答，則向該患者給予基于干擾素的治療。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了干擾素在制備藥物中的用途，所述藥物用來根據(jù)用于預(yù)測對于基于干擾素的治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)治療感染了 HCV-Ia的患者，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素a)該患者的HCV NS5A氨基酸序列的氨基酸位置226 ；和b)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū)中的變化數(shù)目。在一個實(shí)施方式中，基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為所述標(biāo)準(zhǔn)中的要素分配權(quán)重參數(shù)。在一個實(shí)施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A、L、V、M或E。在一個實(shí)施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A。在一個實(shí)施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是L。在一個實(shí)施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是E。在一個實(shí)施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是M。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是V。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)還包括“患者的NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基”這一要素，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括三個要素中的一個或多個。在一些實(shí)施方式中，基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為所述標(biāo)準(zhǔn)中的元素分配權(quán)重參數(shù)。在一些實(shí)施方式中，患者的NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基是S、P、 Q、R或A。在一個實(shí)施方式中，位置311處的氨基酸殘基是S。在一個實(shí)施方式中，位置311 處的氨基酸殘基是P。在一個實(shí)施方式中，位置311處的氨基酸殘基是Q。在一個實(shí)施方式中，位置311處的氨基酸殘基是R。在一個實(shí)施方式中，位置311處的氨基酸殘基是A。在一個實(shí)施方式中，所述藥物包括一種或多種抗-HCV試劑。在一個實(shí)施方式中，所述藥物包括利巴韋林、HCV蛋白酶抑制劑和HCV聚合酶抑制劑。在一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是BMS-790052、MK 7009、BI 201335、 SCH900518、VX-985、SCH503034、VX-950、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。在另一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是VX-950。在另一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是SCH50303。在另一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是VCH-916、IDX-184、 VX-222、filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS 190、ANA598、MK-3281、BMS-650032 或 R7128。在一個實(shí)施方式中，所述藥物還包括NS4A抑制劑、NS4B抑制劑、親環(huán)蛋白抑制劑及其組合。NS4A抑制劑、NS4B抑制劑和親環(huán)蛋白抑制劑的實(shí)例分別是ACH-806 ；克立咪唑； 和 Debio-025 及 NIM811。在一個實(shí)施方式中，基于干擾素的治療選自Roferon -A、 Pegasys 、Illtroil 禾口 Peg-Intron。在一個實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)還包括患者的遺傳多態(tài)性。在一個實(shí)施方式中，患者的遺傳多態(tài)性是rsl2979860。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了為感染了 HCV-Ia的患者指定治療方案和/ 或治療持續(xù)時(shí)間的方法。該方法包括以下步驟a)分析該患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和b)確定用于預(yù)測對于基于干擾素的治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素i)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的HCV NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū)中的變化數(shù)目；和ii)該患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列；和c)確定該患者的治療方案和/或治療持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為b)中的標(biāo)準(zhǔn)的所有要素分配權(quán)重參數(shù)。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A、L、V、E或M。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是L。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是E。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是M。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是V。
在一些實(shí)施方式中，該方法包括還包括“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311 處的氨基酸殘基的序列”這一要素的標(biāo)準(zhǔn)。所述標(biāo)準(zhǔn)包括三個要素中的一個或多個。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括基于感染了 HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素分配權(quán)重參數(shù)的步驟。在一些實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S、P、Q、R或A。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是P。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是Q。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是R。在一個實(shí)施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是A。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。在一些實(shí)施方式中，確定患者的治療方案和/或治療持續(xù)時(shí)間的步驟包括向患者施用HCV蛋白酶抑制劑、第二 STAT-C、干擾素、利巴韋林或其組合。在一個實(shí)施方式中，向患者給藥的步驟包括向患者施用干擾素和利巴韋林，持續(xù)12周、36周或48周。在一個實(shí)施方式中，向患者給藥的步驟包括向患者給藥持續(xù)12周。在一個實(shí)施方式中，向患者給藥的步驟包括向患者給藥持續(xù)36周。在一個實(shí)施方式中，向患者給藥的步驟包括向患者給藥持續(xù) 48周。在一些實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是SCH503034、VX-950、R7227、 ITMN-191、ACH-1095或TMC435350。在一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是 SCH503034。在一個實(shí)施方式中，所述HCV蛋白酶抑制劑是VX-950。在一些實(shí)施方式中，所述第二 STAT-C是HCV聚合酶抑制劑、NS4A抑制劑、NS4B 抑制劑或親環(huán)蛋白抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述第二 STAT-C是VCH-916、IDX-184、 VX-222、filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032、ACH-806、克立咪唑、Debio-025、NIM811 或 R7128。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括分析該患者的遺傳多態(tài)性的步驟。在一個實(shí)施方式中，遺傳多態(tài)性是rsl2979860。在一些實(shí)施方式中，分析患者的部分或全部HCV NS5A基因的步驟包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器擴(kuò)增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括確定患者是否對基于干擾素的治療有陽性應(yīng)答的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括以下步驟如果患者被確定為對基于干擾素的治療有應(yīng)答，則向該患者給予基于干擾素的治療。


圖1中的圖顯示了受試者的Peg-IFN和RBV應(yīng)答水平。到第4周時(shí)病毒RNA載量低于檢測限值(LOD)的受試者被稱為迅速病毒應(yīng)答者(RVR)；而到第12周時(shí)RNA載量下降至低于LOD的受試者被稱為完全早期病毒應(yīng)答者(cEVR)。部分早期病毒應(yīng)答者(pEVR)為第12周時(shí)RNA載量至少下降2-log ；無應(yīng)答者(NR)在研究過程中的RNA載量下降小于 2-log。每個患者組的趨勢線顯示了每個時(shí)間點(diǎn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2中的圖顯示了 NS5A的氨基酸排列排列，其被分成41個重疊的區(qū)段，每個區(qū)段為40個氨基酸。第一個窗口跨越氨基酸6-45 ；第二個是氨基酸16-55 ；第三個是沈_65， 等等。Logisitic回歸用于確定IFN敏感性(即，患者結(jié)果組，順序評分)是否是任意這些窗口內(nèi)的遺傳變異的函數(shù)(α = 0. 05，使用Boneferroni程序來控制I型誤差)。將從 Logisitic回歸得出的ρ-值(顯著性水平)針對NS5A氨基酸的長度作圖，將每個窗口的顯著性水平對應(yīng)于其中間的殘基(例如，跨越殘基6-45的窗口的ρ-值0. 6934對應(yīng)于殘基 26) 0已經(jīng)被提出作為“干擾素敏感性決定區(qū)”(ISDR;AA 236-275)的40個殘基的區(qū)段以灰色方框標(biāo)示出來。對應(yīng)于該窗口中心的點(diǎn)(P = 0. 0003)是唯一滿足“其中的IFN敏感性是突變數(shù)目的函數(shù)”的區(qū)域，其是顯著的，其Bonferroni校正的α等于0. 05。圖3中的圖顯示了每個應(yīng)答類別中的ISDR突變數(shù)目。相對于每個其它結(jié)果組，迅速病毒應(yīng)答者(RVR)中的感染性病毒粒子的ISDR顯著富含突變，其它結(jié)果組彼此并無顯著差異，如通過6個獨(dú)立的Marm-Whitney U-檢驗(yàn)配對比較所確定(在圖的頂部以‘a(chǎn)’和‘b’ 標(biāo)出了具有顯著差別的組)。雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)測試中使用的是基于秩和(rank-sum)的非參數(shù)比較，但是顯示了每個組的平均值菱形，以其高度顯示了平均值的95%置信區(qū)間，以其寬度顯示了相對樣本大小。淺灰色條表示數(shù)據(jù)集的總體平均值。圖4顯示了餅狀圖，其顯示了在ISDR中具有0、1、2和3個或更多個突變的病毒學(xué)結(jié)果組的組成，在圖下方標(biāo)注了每個圖。在圖上方指明了每組的樣本大小，并且以每幅圖的相對面積來表示。在圖左側(cè)方框中給出了圖例(RVR是迅速病毒應(yīng)答；cEVR是完全早期病毒應(yīng)答；pEVR是部分早期病毒應(yīng)答；NR是無應(yīng)答)。圖5顯示了 H77的核酸序列(圖5a)和氨基酸序列(圖恥)。圖6顯示了對基于干擾素的治療的不同程度應(yīng)答的受試者的核酸序列。圖7顯示了圖6的受試者的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式研究了全長NS5A氨基酸中的病毒序列多樣性對于來自美國的基因型Ia的患者中的干擾素和RBV應(yīng)答的影響。已經(jīng)提出NS5A氨基酸通過誘導(dǎo)準(zhǔn)種(quasispecies)而影響IFN應(yīng)答(見綜述 Macdonald 2004, Tan 2001, Hofmann 2004)。雖然NS5A在HCV生命周期中的確切作用是未知的，但是已經(jīng)證明NS5A是催化HCV基因組復(fù)制的多蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵部分(Egger 2002)。不依賴于其在HCV復(fù)制中的直接作用，NS5A還能結(jié)合多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子，這可能繼而影響細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)并抑制細(xì)胞凋亡應(yīng)答(綜述MaCdonald，2004)。另外，已經(jīng)證明NS5A結(jié)合干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA (dsRNA)激活的蛋白激酶 PKR(Gale 1997)。PKR通過與dsRNA結(jié)合而被激活。已經(jīng)知道，一旦被激活，PKR會使蛋白合成啟動因子2的α亞基2 (eIF-2 α)磷酸化，導(dǎo)致病毒蛋白翻譯的阻止(Macdonald 2004)。 通過結(jié)合eIF-2a，NS5A干擾PKR的二聚體化和自動磷酸化，因此抑制IFN誘導(dǎo)的宿主病毒應(yīng)答途徑(Gale 1997)。詞語“NS5A基因的位置676、677和678處的核苷酸”意思是具有如圖5和6所示的序列(作為用于比對的參考序列)的HCV-Ia NS5AcDNA或RNA的核苷酸位置676、677和 678處的基因座，其中圖5和6中所示的序列代表HCV-Ia基因組核苷酸序列的核苷酸位置 675與核苷酸位置679之間的NS5A編碼區(qū)。詞語“NS5A蛋白的位置2 處的氨基酸”意思是具有如圖5和6所示的序列(作為用于比對的參考序列)的HCV-Ia NS5A蛋白的位置2 處的氨基酸，其中圖5和6所示的序列代表NS5A蛋白的多肽序列，其跨越HCV-Ia基因組多聚蛋白的氨基酸位置225至氨基酸位置227。詞語“NS5A基因的位置931、932和933處的核苷酸”意思是具有如圖5和6所示的序列(作為用于比對的參考序列)的HCV-Ia NS5AcDNA或RNA的核苷酸位置931、932和 933處的基因座，其中圖5和6:1中所示的序列代表HCV-Ia基因組核苷酸序列的核苷酸位置930與核苷酸位置9；34之間的NS5A編碼區(qū)。詞語“NS5A蛋白的位置311處的氨基酸”意思是具有如圖5和7所示的序列(作為用于比對的參考序列)的HCV-Ia NS5A蛋白的位置311處的氨基酸，其中圖5和7所示的序列代表NS5A蛋白的多肽序列，其跨越HCV-Ia基因組多聚蛋白的氨基酸位置310至氨基酸位置312。詞語“ISDR”意思是(1)具有如圖5、6和7所示的序列(作為用于比對的參考序列)的HCV-Ia NS5A cDNA或RNA的位置705和擬6之間的核苷酸序列；和(2)具有如圖5、 6和7所示的序列的HCV-laNS5A蛋白的位置235和276之間的氨基酸序列。但是，ISDR的氨基酸序列中的位置可能有微小變化。術(shù)語“核苷酸替換”和“核苷酸變異”在本文中相互替代地使用；是指特定基因的參考核苷酸序列中某位置處的核苷酸改變。術(shù)語“氨基酸突變”和“氨基酸替換”在本文中相互替代地使用；是指由于編碼參考蛋白的參考核苷酸序列中的核苷酸替換或變異而導(dǎo)致的參考蛋白序列中某位置處的氨基酸改變。術(shù)語“基因分型”意思是確定特定基因座上的核苷酸。術(shù)語“基于干擾素的治療”是指包括施用干擾素的HCV治療。術(shù)語對使用干擾素的治療的“應(yīng)答”是指對于施用的藥劑的想要的應(yīng)答。術(shù)語對使用干擾素治療的“持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答”(SVR)和“完全應(yīng)答”在本文中相互替代地使用；是指在治療結(jié)束后和在治療結(jié)束后對周，通過RT-PCR在感染的受試者的樣品中沒有可以檢測到的HCVRNA。或者，“持續(xù)病毒應(yīng)答”或“SVR”意思是在給藥完成之后，病毒RNA水平保持在不可檢出的水平?！癝VR12”意思是給藥完成之后12周，病毒RNA水平保持在不可檢出的水平?！癝VR24”意思是給藥完成之后M周，病毒RNA水平保持在不可檢出的水平。術(shù)語“完全早期病毒學(xué)應(yīng)答”(cEVR)定義為在治療的第12周，HCV載量(血液中的HCV顆粒數(shù)目)至少減少99% ( > 21ogl0)。如本文使用的術(shù)語“迅速病毒學(xué)應(yīng)答”(RVR)定義為在治療第4周之后，在血液中檢測不到HCV。90%的具有RVR的患者將具有SVR，一些患者可能僅需要M周的治療。具有“部分早期病毒學(xué)應(yīng)答”(pEVR)的受試者的HCV RNA水平下降至1/100，但是繼續(xù)具有可檢出的HCV RNA。相對于具有cEVR的受試者，此類患者較不容易達(dá)到SVR。
術(shù)語對使用干擾素的治療的“病毒學(xué)無應(yīng)答”和“無應(yīng)答”(NR)在本文中相互替換地使用；是指在整個治療過程中和治療結(jié)束時(shí)通過RT-PCR和其它已知的常規(guī)方法在感染的受試者的樣品中存在可檢出的HCV RNA?；蛘撸绫疚氖褂玫摹盁o應(yīng)答”包括對于標(biāo)準(zhǔn)的 peg-IFN與RBV治療未達(dá)到或維持持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)(在治療完成后M周檢測不到HCV RNA)的患者，以及缺乏應(yīng)答的患者。缺乏應(yīng)答定義為由于未達(dá)到檢測不到的HCV病毒水平， 或者由于中止治療后的復(fù)發(fā)，從HCV RNA的基線水平下降<2-logl0。如上文所定義，檢測不到的HCV RNA意思是HCV RNA以低于10IU/mL存在，如通過目前商業(yè)上可獲得的測定法所測，例如，如通過Roche COBAS TaqMan HCV/HPS測定法所測。例如，“無應(yīng)答”包括對標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN與RBV治療的“第4周零應(yīng)答者”、“第12周零應(yīng)答者”、“第M周零應(yīng)答者”、 “第沈至第48周零應(yīng)答者”、“部分應(yīng)答者”、“病毒反跳應(yīng)答者”和“復(fù)發(fā)應(yīng)答者”?！暗?周零應(yīng)答者”定義為在標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN與RBV治療的第4周，HCV RNA的下降< I-IoglO (沒有彡I-IoglO的從HCV RNA基線的下降)?！暗?2周零應(yīng)答者”定義為在標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN與 RBV治療的第12周，HCV RNA的下降< 2_logl0 (在第12周，未達(dá)到早期病毒應(yīng)答(EVR)， 沒有彡2-loglO的從HCVRNA基線的下降)?！暗贛周零應(yīng)答者”定義為在標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN 與RBV治療的第M周，具有可檢測的HCV RNA的受試者?！暗谏蛑恋?8周零應(yīng)答者”定義為在標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN與RBV治療的第沈至48周，具有可檢測的HCV RNA的受試者?！安糠謶?yīng)答者”定義為，在標(biāo)準(zhǔn)的peg-IFN與RBV治療的第12周時(shí)> 2-loglO的下降，但是在治療的第M周時(shí)具有可檢測的HCV RNA?！安《痉刺鴳?yīng)答者”定義為在peg-IFN與RBV治療過程中，達(dá)到檢測不到的HCV-RNA之后出現(xiàn)的可檢測的HCV-RNA。病毒反跳定義為i)與治療時(shí)記錄的最低值相比，HCV RNA的增加> I-IoglO ；或ii)在之前的時(shí)間點(diǎn)具有檢測不到的 HCV RNA的患者中，HCV RNA水平> 100IU/mL。病毒反跳應(yīng)答者的具體實(shí)例包括在第4周至第M周之間發(fā)生病毒反跳的患者?！皬?fù)發(fā)應(yīng)答者”是在完成peg-IFN與RBV(之前的治療) 之后(一般是最后一次給藥后6周或6周內(nèi))具有檢測不到的HCV RNA、但是在回訪時(shí)復(fù)發(fā)的患者(例如在M周后的回訪)。復(fù)發(fā)應(yīng)答者可能在peg-IFN與RBV治療48周之后復(fù)發(fā)。典型的peg-IFN與RBV治療方案包括12周、24周、36周和48周的治療。商業(yè)上可以獲得多種類型的peg-IFN，例如，裝在小瓶中的配制的預(yù)先測定的溶液；或作為凍干(冷凍干燥)的粉末，與單獨(dú)的稀釋劑(混合液體)。聚乙二醇化的干擾素 α-2b (Peg-Intron )和α-2a (Pegasys )是典型的實(shí)例?？捎糜诒景l(fā)明的多種類型的干擾素是商業(yè)上可獲得的，包括多種劑型和制劑類型(參見，例如，以上描述的干擾素的具體實(shí)例)。例如，商業(yè)上可以獲得多種類型的干擾素裝在小瓶中的配制的預(yù)先測定的溶液；或作為凍干(冷凍干燥)的粉末，與單獨(dú)的稀釋劑(混合液體)。聚乙二醇化的干擾素a-2b(Peg-Intron )和α-h(Pegasys )與其它干擾素的區(qū)別在于它們具有與其結(jié)合的聚乙二醇(PEG)分子。PEG被認(rèn)為會使干擾素在體內(nèi)保持更長的時(shí)間，因此延長了干擾素的效應(yīng)以及其有效性。聚乙二醇化的干擾素一般是通過皮膚下(皮下)注射施用。 Pegasys 是裝在預(yù)注入的注射器或裝在小瓶中的可注射的溶液。Pegasys 的通常劑量是180 μ g，一周施用一次。PEG-Intron —般是預(yù)注入的筆，其包含粉末和無菌水； 通過推下筆使其混合在一起。PEG-Intron 的劑量一般取決于體重一1. 5μ g/kg(總共是大約50至大約150 μ g的范圍內(nèi))，一周施用一次。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用聚
14乙二醇化的干擾素，例如聚乙二醇化干擾素α- 或聚乙二醇化干擾素-a 2b。通常而言， 可以根據(jù)其商售產(chǎn)品標(biāo)簽中描述的劑量方案施用干擾素。利巴韋林通?？诜o藥，目前商業(yè)上可獲得藥片形式的利巴韋林。利巴韋林藥片的一般的標(biāo)準(zhǔn)的日劑量(例如大約200mg的藥片)是大約SOOmg至大約1200mg (根據(jù)其商售產(chǎn)品標(biāo)簽中描述的劑量方案)。術(shù)語“STAT-C”是針對丙肝的特別靶向抗病毒治療的縮寫。這種治療模式包括靶向丙肝復(fù)制所需的兩種酶即絲氨酸蛋白酶和聚合酶的藥物，其被稱作丙肝蛋白酶和聚合酶抑制劑。術(shù)語“樣品，，或“生物樣品，，是指從個體中分離的組織或液體樣品，包括但不限于， 例如，活組織檢查樣品、血漿、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮膚的外面的部分、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、眼淚、唾液、乳液、血細(xì)胞、腫瘤、器官。還包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品 (包括但不限于，從細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長獲得的條件化培養(yǎng)基、推斷的被病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞和細(xì)胞成分)。本文所稱的干擾素包括但不限于，α-干擾素、β-干擾素、Y-干擾素和聚乙二醇化的衍生的干擾素-α化合物。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“干擾素”和“干擾素-α ”在本文中相互替換地使用；是指高度同源的物種特異性的蛋白家族，其抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。典型的適宜的干擾素包括但不限于，重組干擾素α-2b，例如可以從 Schering Corporation, Kenilworth, N. J.Intron TM AzFiftS ；StIzFiftS α -2a, 例如可以從Hoffmann-La Roche, Nut ley, N.J.獲得的Roferon TM_A干擾素；重組干擾素 α-2C,例如可以從Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc. ,Ridgefield,Conn.獲得的Berofor TMα 2干擾素；干擾素α-η1，其為純化的天然α干擾素的共混物，例如可以從 Sumitomo, Japan 獲得的 Sumiferon TM 或者可以從 Glaxo-Wellcome Ltd. , London, Great Britain獲得的flfellferon TM干擾素α-nl (INS)；或者共有的α干擾素，例如在美國專利號4，897，471和4，695，623 (尤其是其中的實(shí)施例7、8或9)中描述的那些；以及可以從 Amgen, Inc.，Newbury Park, Calif.獲得的特定產(chǎn)品，或者是干擾素α-n3，其為hterferon Sciences Izfe的胃以/人 Purdue Frederick Co. , Norwalk, Conn.(Alferon) 的天然α干擾素的混合物。優(yōu)選使用干擾素α-加或α-2b。如本文使用的術(shù)語“聚乙二醇化的干擾素α ”意思是干擾素α優(yōu)選干擾素α _2a 和α-2b的聚乙二醇修飾的綴合物。典型的適宜的聚乙二醇化的干擾素α包括但不限于， Pegasys TM 禾口 Peg-Intron TM0如本文使用的術(shù)語“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探針、待檢測的寡聚體片段、寡聚體對照物和未經(jīng)標(biāo)記的封閉構(gòu)建體，對于聚脫氧核糖核苷酸 (包含2-脫氧-D-核糖)、對于聚核糖核苷酸(包含D-核糖)、以及對于任何其它類型的多核苷酸(其為嘌呤或嘧啶堿基或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷)是一般性的。術(shù)語“干擾素敏感性決定區(qū)中的改變”是指，與野生型NS5A相比，NS5R基因的氨基酸序列中的改變，其構(gòu)成編碼NS5A的基因的替代形式。所述改變可以包括插入、添加、刪除或替換。核苷酸序列的表示方法是從5’至3’方向。術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列”是指來自被選擇用于在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行最佳復(fù)制的良好表征的HCV序列的代表性氨基酸序列。標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列的實(shí)例是Η77。
核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含磷酸二酯鍵或修飾的鍵，例如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、氨基乙酸酯、氨基甲酸、硫醚、橋式氨基磷酸酯、 橋式亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、橋式硫代磷酸酯或砜鍵合，以及這些鍵的組合。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含5種生物中存在的堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了這5種生物中存在的堿基之外的堿基。例如， 本發(fā)明的多核苷酸可以包含至少一個修飾的堿基部分，其選自下列但不限于這些5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D甘露糖Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧化乙酸(ν)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W、2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。此外，核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含一個或多個修飾的糖部分，例如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸的來源不是意在限制本發(fā)明。核酸、核苷酸、 多核苷酸或寡核苷酸可以來自人類或非人類哺乳動物，或任何其它生物，或源自任何重組來源，或在體外合成或通過化學(xué)合成。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、 cDNA、DNA-RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、雜交體或這些的任意混合物，并且可以以雙鏈、單鏈或部分雙鏈的形式存在。本發(fā)明的核酸包括純化的或未純化的形式的核酸及其片段，包括基因、染色體、質(zhì)粒、生物材料的基因組，例如微生物，例如細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物、動物、人類，等等。術(shù)語核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸之間沒有有意的長度上的區(qū)別，這些術(shù)語將可以相互替換地使用。這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈的DNA，以及雙鏈和單鏈的RNA?！跋鄳?yīng)的”意思是與指定的序列相同或互補(bǔ)。由于可以使單核苷酸反應(yīng)以產(chǎn)生寡核苷酸，其方式為一個單核苷酸戊糖環(huán)的5’ 磷酸酯與一個方向上的其鄰居的3’氧通過磷酸二酯鍵連接，因此，如果寡核苷酸的5’磷酸酯不與單核苷酸戊糖環(huán)的3’氧連接，則該寡核苷酸的末端被稱作“5’末端”;如果其3’氧不與下一個單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸酯連接，則該寡核苷酸的末端被稱作“3’末端”。如本文使用的“核酸序列”(即使是在較大寡核苷酸的內(nèi)部)也可以被稱作具有5’和3’末端。當(dāng)兩個不同的、不重疊的寡核苷酸與同一線性互補(bǔ)性核酸序列的不同區(qū)域退火， 并且一個寡核苷酸的3’末端朝向另一個的5’末端時(shí)，前者可以被稱作“上游”寡核苷酸; 后者可以被稱作“下游”寡核苷酸。術(shù)語“引物”可以指不止一個引物或者引物的混合物，并且是指寡核苷酸，可以是天然存在的，在純化的限制性消化物中的，或者合成產(chǎn)生的，當(dāng)被置于催化互補(bǔ)于核酸鏈的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時(shí)，其能夠沿著互補(bǔ)鏈作為多核苷酸合成的起始點(diǎn)。所述條件通常包括存在4種不同的脫氧核糖核苷三磷酸酯和誘導(dǎo)聚合的試劑例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，它們存在于合適的緩沖液中(“緩沖液”包括是輔因子或影響PH、離子強(qiáng)度等的取代物)，并在適當(dāng)?shù)臏囟认?。引物?yōu)選為單鏈的，以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的最大效率。rsl2979860是染色體19上的多態(tài)性，其被報(bào)道與HCV患者群中的SVR相關(guān)。多態(tài)性位于編碼IFN-λ -3的IL28B基因上游31Λ處。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的用于預(yù)測感染了 HCV-Ia的患者對基于干擾素的治療的應(yīng)答的方法可以基于分析下列項(xiàng)該患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和該患者的染色體19上的多態(tài)性。如本文使用的核酸序列的互補(bǔ)物是指這樣的寡核苷酸當(dāng)它與核酸序列排列時(shí)， 即一個序列的5’末端與另一個的3’末端配對，是處于“反平行結(jié)合”。本發(fā)明的核酸中可以包括一些天然核酸中不常見的堿基，包括例如，肌苷、7-脫氮雜鳥嘌呤和上文討論的那些。 互補(bǔ)性無需是完美的；穩(wěn)定的雙鏈可以包含錯配的堿基對或非匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)通過考慮多個變量來確定雙鏈的穩(wěn)定性，所述變量包括例如，寡核苷酸的長度、堿基組成和寡核苷酸的序列，離子強(qiáng)度和錯配的堿基對的發(fā)生率。如本文使用的術(shù)語“探針”是指，由于該探針中至少一個序列與核酸區(qū)域中的序列之間的互補(bǔ)性而能與該核酸的區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)、并且可以被檢出的寡核苷酸。優(yōu)選地，探針不含與5’核酸酶反應(yīng)中的引物的序列互補(bǔ)的序列。如下文所討論，探針可以被標(biāo)記或不經(jīng)標(biāo)記。探針的3’末端可以被“封閉”以阻止探針被摻入到引物延伸產(chǎn)物中?？梢酝ㄟ^使用非互補(bǔ)性堿基或通過向最后一個核苷酸的3’羥基添加化學(xué)部分例如生物素或磷酸酯基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)“封閉”，取決于所選的部分，這可以一舉兩得還可以作為后續(xù)的檢測的標(biāo)記物， 或捕獲與標(biāo)記物結(jié)合的核酸。還可以通過除掉3’ -OH或通過使用不含3’ -OH的核苷酸例如雙脫氧核苷酸來實(shí)現(xiàn)封閉。如本文使用的術(shù)語“標(biāo)記物”是指這樣的任意原子或分子其可用于提供可檢測的 (任選可定量的)信號，并且可與核酸或蛋白結(jié)合。標(biāo)記物可以提供可由熒光、放射活性、比色、重量測定、X-射線衍射或吸收、磁學(xué)、酶活性等來檢測的信號。用于本發(fā)明的方便的標(biāo)記物包括那些促進(jìn)寡核苷酸片段的大小的檢測的標(biāo)記物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，“標(biāo)記物”是熒光染料。熒光標(biāo)記物可以包括帶負(fù)電荷的染料，例如熒光素家族的染料；或電荷上為中性的染料，例如若丹明家族的染料；或者帶正電荷的染料，例如花菁家族的染料。熒光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、 NAN 和 ZOE。若丹明家族的染料包括 iTexas Red、ROX、R110、R6G 和 TAMRA。FAM、HEX、ΤΕΤ、 J0E、NAN、Z0E、R0X、R110、R6G* TAMRA 由 Perkin-Elmer (Foster City,Calif.)在市場上銷售，Texas Red由Molecular Probes, Inc. (Eugene、0R)在市場上銷售。花菁家族的染料包括 Cy2> Cy3> Cy5 禾口 CyrJ，由 Amersham(Amersham Place、Little Chalfont, Buckinghamshire, England)在市場上銷售。如本文使用的術(shù)語“猝滅劑”是指吸收從熒光染料中發(fā)射的能量的化學(xué)部分，例如，當(dāng)猝滅劑與熒光染料二者與普通的多核苷酸連接時(shí)。猝滅劑可以通過特異于該猝滅劑的信號重新發(fā)射從熒光染料中吸收的能量，因此，猝滅劑也可以是“標(biāo)記物”。該現(xiàn)象一般被稱作熒光共振能量轉(zhuǎn)移或FRET?；蛘?，猝滅劑可以以熱量的方式分散掉從熒光染料吸收的能量。通常用于FRET的分子包括例如，熒光素、FAM、JOE、若丹明、R6G、TAMRA, ROX、DABCYL 和EDANS。一種熒光染料是標(biāo)記物還是猝滅劑是由其激發(fā)和發(fā)射光譜以及與其配對的熒光染料決定的。例如，F(xiàn)AM的最有效激發(fā)光的波長是488nm，其發(fā)射具有500-650nm光譜的光， 最大發(fā)射為525nm。FAM是用于例如以TAMRA(其在514nm處具有最大激發(fā))為猝滅劑的合適的供體標(biāo)記物。示例性的非熒光的猝滅劑(其分散掉從熒光染料吸收的能量)包括由 Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Calif.)在市場上銷售的 Black Hole Quenchers TM。如本文所定義，“5’至3’核酸酶活性”是指模板特異性的核酸聚合酶的活性，其包括一些DNA聚合酶通常具有的5’至3’核酸外切酶活性，即以連續(xù)方式從寡核苷酸的5’ 末端除掉核苷酸(例如大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性，而Klenow片段則不具有該活性)；或者，5’至3’核酸內(nèi)切酶活性，其中切割發(fā)生在從5’末端開始的不止一個磷酸二酯鍵(核苷酸)；或者這兩種活性。雖然不希望被任何特定操作理論所限，但是對于探針-模板雜交復(fù)合物的5’至3’核酸內(nèi)切酶活性依賴性的切割的優(yōu)選底物是移位的單鏈核酸，其為叉樣結(jié)構(gòu)，在連接移位區(qū)域與鏈的堿基配對部分的磷酸二酯鍵上發(fā)生水解，如Holland 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :7276-80中所討論，通過引用方式將其全部內(nèi)容并入本文。如本文使用的術(shù)語“鄰近”是指就探針在它的模板核酸的互補(bǔ)鏈上而言的引物的位置。引物和探針可以間隔20個核苷酸以上，間隔1至大約20個核苷酸，更優(yōu)選大約1至 10個核苷酸，或者可以彼此直接毗鄰，這可能是使用聚合非依賴性方法進(jìn)行的檢測所需要的?；蛘?，在用于聚合依賴性的方法中，如本方法用于如本文教導(dǎo)的PCR擴(kuò)增和檢測方法時(shí)，“鄰近”可以是被擴(kuò)增的序列內(nèi)的任意位置，引物下游的任意位置，從而引物延伸將決定聚合酶的位置，從而發(fā)生探針的切割。如本文使用的術(shù)語“熱穩(wěn)定性核酸聚合酶”是指，當(dāng)與例如來自大腸桿菌的核苷酸聚合酶相比較時(shí)，對于熱是相對穩(wěn)定的酶，并且其催化三磷酸核苷的聚合。一般而言，酶將在與靶序列退火的引物的3’末端啟動合成，將使新鏈朝著模板的5’末端持續(xù)合成(并且，如果具有5’至3’核酸酶活性，水解插入的退火的探針以釋放標(biāo)記的和未標(biāo)記的探針片段)，直至合成終止或探針片段將靶序列熔融。代表性的分離自水生棲熱菌(Thermus aquaticus, Taq)的熱穩(wěn)定酶描述于美國專利號4，889，818，其在常規(guī)PCR中的使用方法描述于 Saiki 等人，1988，Science 239 :487-91 Taq DNA聚合酶具有DNA合成依賴性的鏈置換5’ _3’核酸外切酶活性。參見 Gelfand, “ Taq DNA Polymerase“,見 PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich 編，Stockton Press, N. Y. (1989)，第 2 章。在溶液中極少有探針的降解(微乎其微)。術(shù)語核酸、引物和探針的“5’核酸反應(yīng)”是指，當(dāng)引物被具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶延伸時(shí)，與核酸雜交的探針的降解，如下文詳細(xì)描述。此類反應(yīng)是基于美國專利號6，214，979,5, 804，375,5, 487，972和5，210，015中描述的那些，通過引用將這些文獻(xiàn)全文并入本文。術(shù)語“靶核酸”是指可以按5’核酸酶反應(yīng)的方向與引物和探針雜交并且包含一個或多個核苷酸變異位點(diǎn)的核酸。
如本文使用的術(shù)語“嚴(yán)格”或“嚴(yán)格條件”是指如本領(lǐng)域所熟知的低離子強(qiáng)度和高溫度的雜交條件。參見，例如 Sambrook 等人，2001，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York ；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，J. Wiley &Sons Inc., New York，1988) ；Tijssen，1993，" Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays“ in Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology :Hybridization with nucleic acid probes (Elsevier)，每篇文獻(xiàn)皆通過引用并入本文。一般而言，將嚴(yán)格條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度和PH時(shí)，比指定序列的熱熔解點(diǎn)(Tm)低大約5-30°C?；蛘?，將嚴(yán)格條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度和PH時(shí)， 比指定序列的Tm低大約5-15°C。Tm是指這樣的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)在平衡時(shí)，50%的互補(bǔ)于靶標(biāo)的探針與靶序列雜交(由于靶序列的過量存在，所以在 Tm時(shí)，在平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。例如，嚴(yán)格雜交條件可以是鹽濃度低于大約1. OM的鈉(或其它鹽)離子，通常是大約0.01至大約IM的鈉離子濃度，pH是7.0至大約pH 8.3， 對于短探針而言(例如10至50個核苷酸的探針)，溫度是至少大約25°C;對于長探針而言 (例如大于50個核苷酸的探針)，溫度是至少大約55°C?？梢酝ㄟ^加入雜交去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來改變嚴(yán)格條件。對于長探針而言(例如大于50個核苷酸的探針)，示例性的非嚴(yán)格或低度嚴(yán)格條件是20mM Tris的緩沖液，pH 8. 5,50mM KCl, 2mM MgCl2,以及反應(yīng)溫度是 25 °C。除非另有指明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有完善的解釋。參見，例如 Sambrook ^Α 2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait H,1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. ,1984) ；A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal,1984)； 以及一個系列:Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)。在圖5和7中提供了完整的HCV-Ia基因組的氨基酸序列。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了能夠檢測NS5A基因的位置676、677或678處的核苷酸替換的測定法。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了能夠檢測NS5A基因的位置931、932或933處的核苷酸替換的測定法。用于檢測核苷酸或氨基酸變異的多種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且都可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。用于鑒定序列變異的具體方法不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。雖然關(guān)于性能、成本和方便性的考慮將使某些特定方法比其它方法更加優(yōu)選，但是需要的是任何可以確定ISDR 中的變異數(shù)目并鑒定圖5和6中的位置676、677、678、931、932和933處的核苷酸或圖5或 7中的位置2 和/或311處的氨基酸的方法都提供實(shí)施本發(fā)明所需的信息。技術(shù)可以是基于多核苷酸的或者基于蛋白質(zhì)的。在任一情況下，所使用的技術(shù)必須是足夠靈敏的，從而精確檢測單一核苷酸或氨基酸變異。技術(shù)的實(shí)例可以包括但不限于以下這些 基于多核苷酸的檢測方法(即參見美國專利號5，310，625 ；5, 322, 770 ； 5，561，058 ;5，641，864 ；和 5，693，517 ；另見 Myers and Sigua, Myers and Sigua,Amplification of RNA :High_temperature reverse transcription and DNA amplification with Thermus thermophiIus DNA polymerase. In :M.A. Innis, D. H. Gelfand and J. J. Sninsky, Editors, PCR Strategies, Academic Press, San Diego (1995)，pp. 58-68))，DNA 測序方法(即 PE Biosystems (Foster City, CA)的 DNA 測序方法；參見 Sanger 等人，1977，Proc. Natl. Acad. Sci. 74 :5463-5467)； 基于擴(kuò)增的基因分型方法(即美國專利號4，683，195 ；4, 683，202 ；和 4，965，188 ；另見 PCR Applications, 1999，(Innis 等人編，Academic Press, San Diego)， PCR Strategies, 1995, (Innis 等人編，Academic Press, San Diego) ；PCR Protocols, 1990，Gnnis 等人編，Academic Press, San Diego)；和 PCR Technology，1989，(Erlich 編， Stockton Press, New York)； 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即 Wu and Wallace 1988, Genomics4 :560-569)；鏈置換測定法(Walker 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392-396, Walker 等人 1992，Nucleic Acids Res. 20 :1691-1696,和美國專利號5,455，166)；以及數(shù)個基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)，包括描述于美國專利號5，437，990 ；5, 409，818 ；和5，399，491中的那些；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS) (Kwoh 等人，1989，Proc. Natl. AcacUci. USA86 :1173-1177)；以及自主維持序列擴(kuò)增(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874-1878 和 WO 92/08800)；·序列特異性擴(kuò)增或引物延伸方法(即美國專利號5，137，806 ；5, 595，890 ； 5，639，611 ；和美國專利號 4，851，331)； 動力學(xué) PCR 方法(S卩 Higuchi 等人，1992，Bio/TechnologylO :413-417 ； Higuchi 等人，1993，Bio/technology 11 :1026-1030 ；Higuchi and Watson，見上文的 PCR Applications，第16章；美國專利號5，994，056 ；和歐洲專利公開號487，218和512，334)； 基于探針的方法，其依賴于在探針與核苷酸變體(其互補(bǔ)性程度不同)之間形成的雜交雙鏈的不穩(wěn)定性差異(即Conner等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 278-282，和美國專利號 5，468，613 ；5，604，099 ；5，310，893 ；5，451，512 ；5，468，613 ；和 5, 604, 099)； 質(zhì)譜法(即 MALDI-MS ；美國專利號 6，258，539)； 基于蛋白的檢測技術(shù)(即蛋白測序、免疫親和測定、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)；放射免疫測定(RIA)；免疫放射分析(IRMA)和免疫酶學(xué)測定(IEMA)；參見例如美國專利號 4，376，110 和 4，486，530)。在基于多核苷酸的檢測方法中，通過鑒定存在于替換位點(diǎn)即圖5和6中的核苷酸位置931、932或933處的核苷酸來完成基因分型。任意類型的來自HCV-Ia感染的個體的包含HCV-Ia多核苷酸的生物樣品都可用于確定基因型?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)的RNA提取方法分離HCV RNA來進(jìn)行基因分型。RNA的擴(kuò)增可以這樣進(jìn)行首先使用例如病毒逆轉(zhuǎn)錄酶將靶RNA逆轉(zhuǎn)錄，然后擴(kuò)增得到的cDNA，或者使用組合的高溫逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)來進(jìn)行，如美國專利號 5，310，652 ；5, 322，770 ；5, 561，058 ；5, 641，864 ； 和5，693，517中所描述；每篇皆通過引用并入本文(另見Myers and Sigua，1995，PCR Strategies,見上文，第5章)。本領(lǐng)域已知有多種用于鑒定存在于單一核苷酸位置上的核苷酸的方法。本發(fā)明還涉及試劑盒、容器單元，其包含用于實(shí)施本方法的有用組分。有用的試劑
20盒可以包含用于檢測NS5A基因中的位置676、677、678、931、932和933處的核苷酸替換的寡核苷酸。在一些情況下，檢測探針可以固定于合適的支持物膜上。試劑盒還可以包含用于擴(kuò)增包含替換位點(diǎn)的NS5A基因座的區(qū)域的擴(kuò)增引物，此類引物用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中?；蛘?，有用的試劑盒可以包含一組引物，所述引物包括用于特異性擴(kuò)增NS5A基因的序列特異性引物。試劑盒的其它可選組分包括用于如本文描述的基因分型方法中的另外的試劑。例如，試劑盒還可以包含用于催化引物延伸產(chǎn)物的合成的試劑、底物三磷酸核苷、 用于標(biāo)記和/或檢測核酸的工具(例如，親和素-酶綴合物和酶底物和色原(如果標(biāo)記物是生物素))、用于擴(kuò)增或雜交反應(yīng)的合適緩沖液，以及用于執(zhí)行本方法的說明書。如本文公開的方法衍生自逐步多變量的最初的logistic回歸分析。以下提供的本發(fā)明的實(shí)施例僅僅為了解釋目的，不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例之后的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的本發(fā)明的多個實(shí)施方式對于閱讀了以上的文本和以下的實(shí)施例的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。實(shí)施例對來自參與臨床試驗(yàn)的對照分支的美國患者的全長NS5A蛋白進(jìn)行分析以確定可能賦予陽性Peg-IFN和RBV應(yīng)答的區(qū)域。80位以前未接受過治療的患者接受48周的 Peg-IFN和RBV。通過群體測序分析基線病毒基因型。55位患者感染基因型為Ia的HCV。 按照對治療的最初應(yīng)答對患者進(jìn)行分組，即迅速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)、完全早期病毒應(yīng)答 (cEVR)、部分早期病毒應(yīng)答。實(shí)施例1受試者群體研究中包括了 250位以前未接受過治療的受試者，他們具有慢性的基因型為1的 HCV感染。所有的受試者年齡介于18至65歲，具有可檢測的基線血漿HCV RNA水平，并且是HBsAg和HIV抗體陰性的。使用Roche COBAS TaqMan HCV/HPS測定法(Roche Molecular Systems Inc. ,Branchburg,NJ,USA)測定血漿 HCV RNA 水平。該 HCV RNA 測定法的定量下限值為30IU/mL，檢測限值(LOD)為10IU/mL。受試者隨機(jī)接受TVR 750mg q8h、聚乙二醇化干擾素-α -2a (Peg-IFN) 180 μ g/周和利巴韋林(RBV) 1000-1200mg/天，持續(xù)12周；然后接受0、12或36周的Peg-IFN和RBV， 或12周的TVR/Peg-IFN(無RBV)。對照組接受48周的安慰劑/Peg-IFN和RBV。最初的治療結(jié)果是基于在治療的首次給藥后的特定間隔定量的血漿HCV RNA水平。在第4周時(shí)在血漿中檢測不到的HCV RNA水平(< 10IU/mL)歸類為迅速病毒應(yīng)答者(RVR)。完全早期病毒應(yīng)答者(cEVR)的HCV RNA在第12周時(shí)低于檢測限值(< 10IU/mL)。部分早期病毒應(yīng)答者 (pEVR)在第12周時(shí)的HCV RNA具有21og的下降；無應(yīng)答者(NR)在第12周時(shí)的HCV RNA 具有 0 或 Ilog 的下降(Hoefs 2007，Pealman 2007)(圖 1)。實(shí)施例2來自受試者血漿的HCV的擴(kuò)增和測序在給藥前(第1天)在250位以前未接受過治療的具有基因型為1的HCV的受試者中進(jìn)行全長NS5A的群體序列分析。通過對前臂靜脈進(jìn)行靜脈穿刺從受試者中采集 4mL的血液樣品，裝入含有EDTAO^)抗凝劑的管中。通過10分鐘的離心分離血漿、分成等份并儲存于-80°C。通過巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增大約91AHCV RNA片段(該片段跨越HCV多聚蛋白編碼區(qū))，以進(jìn)行HCV的序列分析。使用QIAquick 96PCR 純化試劑盒Oliagen)純化來自該P(yáng)CR的DNA，并在瓊脂糖凝膠上分析。通過EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer ffaltham,MA)測定經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。由 Agencourt Biosciences (Beverly，ΜΑ)使用針對跨越整個NS5A區(qū)域設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物的測序。在含有> 1000IU/mL HCV RNA的樣品中的測序測定是成功的。 將受試者的核酸序列(代表對基于干擾素的治療的應(yīng)答程度，顯示于圖6A-6E)翻譯成氨基酸序列，顯示于圖7A-7E。使用軟件 Mutational Surveyor (SoftGenetics, State College, PA)比對并分析序列。實(shí)施例3序列非依賴性分析使用ClustalX的缺省參數(shù)(Gormet Matrix,出現(xiàn)空格罰分=10，空格延伸罰分= 0. 2 [Thompson等人，1997])，將序列與丙肝參照基因組H77 (Genbank號NC_0041(^)比對。 該序列在鑒定每位患者的氨基酸序列中的可變基因座中用作參照，使用方式為與Enomoto 在1996年的研究中使用的參照HCV基因組D90208相當(dāng)?shù)姆绞?。每個患者序列重新編碼進(jìn)入二元矩陣，可變位置由‘1’標(biāo)示，與參照具有相同殘基的位置被分配為數(shù)值‘O’。為了確定突變的分布是否在結(jié)果組(即RVR、EVR、pEVR和NR)中正態(tài)分布，在NS5A蛋白的每個殘基處應(yīng)用卡方檢驗(yàn)。此外，對于每個結(jié)果組，計(jì)算每個殘基的突變頻率。將該突變頻率針對無應(yīng)答患者(NR)的突變頻率進(jìn)行校正，以確定每個結(jié)果組中那些富含突變或貧乏突變的殘基。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定以下項(xiàng)是否可用于預(yù)測HCV對聚乙二醇化干擾素的響應(yīng)性人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素(性別、種族)、最初病毒載量或NS5A內(nèi)的具有聲稱的功能上的重要意義的多個結(jié)構(gòu)域中的突變數(shù)目，包括(i)負(fù)責(zé)細(xì)胞停滯(cytoretention)的區(qū)域，(ii)超磷酸化結(jié)構(gòu)域，(iii)干擾素敏感性決定區(qū)(ISDR)，(iv)H(R-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(ν)細(xì)胞核定位信號；和(vi)V3區(qū)域。這些變量中的每一個用作單變量分析中的獨(dú)立變量，其中使用卡方檢驗(yàn)或logistic回歸，視獨(dú)立變量的類型而定。另外也將所有獨(dú)立變量組合并用作逐步多元序數(shù)回歸混合(正向和反向)模型中的預(yù)測因子(predictor)。進(jìn)入基于單變量統(tǒng)計(jì)的模型所需的α水平被設(shè)定為0.15。對于所有的logistic回歸，按照以下量級將每位患者的應(yīng)答重新編碼進(jìn)入序數(shù)等級=NR (n = 9)，pEVR(n = 11), EVR (η = 26)，RVR (η = 9)。還對結(jié)果組進(jìn)行了比較，以測定它們之間在如上定義的功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變數(shù)目方面的顯著差異。當(dāng)滿足參數(shù)測試的假設(shè)時(shí)，此后使用Tukey比較進(jìn)行變量的分析，其中加以修改以允許進(jìn)行不相等樣本大小的比較(Kramer，1956)。當(dāng)不符合參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的假設(shè)時(shí)， 使用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis) 0所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析皆使用SAS (v. 9. 1，Sas Institute, Cary, NC, USA)或 JMP (ν· 7. 0，Sas Institute)進(jìn)行。實(shí)施例4序列依賴性分析為了確定NS5A內(nèi)的患者結(jié)構(gòu)域序列是否基于他們對Peg-IFN和RBV的響應(yīng)性而聚集，使用Genedoc (Nichols and Nichols, 1997)將NS5A氨基酸排列分成之前定義的結(jié)構(gòu)域。使用Kimura置換矩陣(Kimura，1980)，使用protdist程序(其為Phylip程序包的一部分，V.3.67[i^lsenstein，2007])的缺省參數(shù)，為每個結(jié)構(gòu)域排列產(chǎn)生距離矩陣。使用最接近的鄰接算法(Saitou and Nei, 1987)產(chǎn)生序列簇。評估星系統(tǒng)發(fā)生(star phylogenies) 以確定序列是否基于結(jié)構(gòu)域上的序列相似性而聚集。另外，為了確定ISDR內(nèi)的特定殘基的突變是否負(fù)責(zé)產(chǎn)生HCV對Peg-IFN和RBV的更大的敏感性，我們在多變量逐步序數(shù)logistic回歸中將每個殘基處的字符針對病毒應(yīng)答進(jìn)行回歸分析。在分析中包括了種族這個變量，因?yàn)橐呀?jīng)表明該變量在“序列非依賴性” 多變量模型中顯著影響病毒應(yīng)答(見結(jié)果)。該分析使用正向逐步回歸模型；進(jìn)入基于單變量統(tǒng)計(jì)的模型所需的顯著性水平被設(shè)定為0. 15 ；而保留在多變量模型中所需的顯著性水平設(shè)定為0. 10。本研究中的55位基因型為Ia的患者的最初治療應(yīng)答包括7位患者達(dá)到RVR，24 位達(dá)到cEVR，14位達(dá)到pEVR，10位是NR。數(shù)據(jù)集包括這些55個NS5A序列的446個殘基的比對，總共24695個氨基酸位置。這些殘基中的大多數(shù)( 94.6% )與H77相同，其中275 個比對位置( 61% )在比對中是不變的。在我們的數(shù)據(jù)集中觀察到的1338個突變分布于其余的174個比對位置中。在NS5A之中，在結(jié)果組之間存在顯著性差異(Krukal-Wallis非參數(shù)單因素變量分析；ρ = 0. 0306)，RVR患者(每位患者的NS5A突變的中位數(shù)=31)具有比cEVR(中位數(shù) =24)、pEVR(中位數(shù)=21)和NR患者(中位數(shù)=26. 5)更多的突變。Logistic回歸用于測試病毒對Peg-IFN和RBV敏感性是否為NS5A蛋白的任何區(qū)域內(nèi)的突變數(shù)的函數(shù)。在41 個重疊的區(qū)段(每個區(qū)段40個氨基酸殘基)上獨(dú)立進(jìn)行回歸分析。發(fā)現(xiàn)Peg-IFN和RBV 敏感性是ISDR內(nèi)的病毒異質(zhì)性的函數(shù)(Logisitc回歸；X2 = 13. 02，ρ = 0. 0003)，但是與任何其它NS5A區(qū)域內(nèi)的異質(zhì)性無顯著相關(guān)性(圖2)。在ISDR內(nèi)，RVR結(jié)果組(每位患者的ISDR突變的中位數(shù)=3)比cEVR(中位數(shù)= 1 ；Mann-Whitney U-檢驗(yàn)，ρ = 0. 0018)、pEVR(中位數(shù)=0. 5 ；Mann-Whitney U-檢驗(yàn)，ρ = 0. 0009)和NR(中位數(shù)=1 ；Mann-Whitney U-檢驗(yàn)，ρ = 0. 0031)組具有顯著更多的突變。 在任何其它結(jié)果組之間都未檢測到顯著性差異(圖3)。僅有1位在ISDR內(nèi)具有少于3個突變的患者達(dá)到了 RVR，所有其它RVR患者ISDR內(nèi)都具有至少3個突變(圖4)。在ISDR 中具有3個或更多個突變的所有患者(n = 10)都達(dá)到了 cEVR或RVR。為了鑒定影響病毒對使用Peg-IFN和RBV的治療的敏感性的其它參數(shù)，我們開發(fā)了一種多變量模型，其使用患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)(性別、種族)、最初病毒載量(范圍 1.4X105,3. lX107IU/ml)和NS5A蛋白內(nèi)的每個殘基的氨基酸組成。另外，包括了 ISDR內(nèi)的突變數(shù)目作為預(yù)測因子(鑒于Peg-IFN和RBV敏感性對該變量的單變量依賴性)?；旌系亩嘧兞啃驍?shù)logistic回歸使用正向和反向選擇，用于進(jìn)入的顯著性水平設(shè)定為0. 15 ；變量保留在模型中所需的顯著性水平閾值設(shè)定為0. 10。結(jié)果表明性別和最初病毒載量不影響我們的數(shù)據(jù)集內(nèi)的I3R敏感性。有趣的是，除了 ISDR內(nèi)的突變數(shù)目之外，發(fā)現(xiàn)NS5A中的 446個NS5A氨基酸位置中的2個中的改變與IFN敏感性相關(guān)-M22&和AA311 (編號是基于 HCV參照物H77)。在AA226的情況下，甲硫氨酸和谷氨酸與HCV的Peg-IFN和RBV-敏感性表型相關(guān)；而丙氨酸和亮氨酸與Peg-IFN和RBV-抗性表型相關(guān)，纈氨酸代表中間水平的表型。在位置311處，谷氨酰胺、精氨酸和丙氨酸與IFN-敏感性相關(guān)；而絲氨酸和脯氨酸與 Peg-IFN和RBV-抗性相關(guān)(表1)。
表 權(quán)利要求
1.使用基于干擾素的治療來治療感染了HCV-Ia的患者的方法，所述方法包括a)分析該患者的部分或全部的HCVNS5A基因；和b)確定用于預(yù)測對于基于干擾素的治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素i)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū) (ISDR)中的變化數(shù)目；和 )該患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括基于感染了HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為b)中的標(biāo)準(zhǔn)的所有要素分配權(quán)重參數(shù)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A、L、V、E或M。
4.權(quán)利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是M。
5.權(quán)利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是E。
6.權(quán)利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A。
7.權(quán)利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是L。
8.權(quán)利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是V。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)還包括“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括所述三個要素中的一個或多個。
10.權(quán)利要求9的方法，還包括基于感染了HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素分配權(quán)重參數(shù)。
11.權(quán)利要求9的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S、P、Q、R或A。
12.權(quán)利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S。
13.權(quán)利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是P。
14.權(quán)利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是Q。
15.權(quán)利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是R。
16.權(quán)利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是A。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述的標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。
18.權(quán)利要求1的方法，還包括分析該患者的遺傳多態(tài)性的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中患者的遺傳多態(tài)性是rsl2979860。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中分析患者的部分或全部HCVNS5A基因的步驟包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器擴(kuò)增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步驟。
21.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，還包括確定該患者是否對基于干擾素的治療有陽性應(yīng)答的步驟。
22.權(quán)利要求20的方法，還包括以下步驟如果該患者被確定為對基于干擾素的治療有應(yīng)答，則向該患者給予基于干擾素的治療。
23.干擾素在制備藥物中的用途，所述藥物用來根據(jù)用于預(yù)測對于基于干擾素的治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)治療感染了 HCV-Ia的患者，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素a)該患者的HCVNS5A氨基酸序列的氨基酸位置226 ；和b)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū)中的變化數(shù)目。
24.權(quán)利要求23的用途，其中，基于感染了HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為所述標(biāo)準(zhǔn)中的要素分配權(quán)重參數(shù)。
25.權(quán)利要求23的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A、L、V、M或E。
26.權(quán)利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A。
27.權(quán)利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是L。
28.權(quán)利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是E。
29.權(quán)利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是M。
30.權(quán)利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是V。
31.權(quán)利要求25-30任一項(xiàng)的用途，其中所述標(biāo)準(zhǔn)還包括“患者的NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基”這一要素，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括所述三個要素中的一個或多個。
32.權(quán)利要求31的用途，其中患者的NS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基是 S、P、Q、I^A。
33.權(quán)利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311處的氨基酸殘基是So
34.權(quán)利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311處的氨基酸殘基是P。
35.權(quán)利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311處的氨基酸殘基 是Q。
36.權(quán)利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311處的氨基酸殘基是Ro
37.權(quán)利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311處的氨基酸殘基是A。
38.權(quán)利要求M-37任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物包括一種或多種抗-病毒藥物。
39.權(quán)利要求38的用途，其中所述一種或多種抗病毒藥物包括利巴韋林、HCV蛋白酶抑制劑或HCV聚合酶抑制劑。
40.權(quán)利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是BMS-790052、MK7009、BI 201335、SCH900518、VX-985、SCH503034、VX-950、VX-500、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。
41.權(quán)利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是VX-950。
42.權(quán)利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是SCH50303。
43.權(quán)利要求39的用途，其中所述HCV聚合酶抑制劑是VCH-916、IDX-184、VX-222、 filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032 或 R7128。
44.權(quán)利要求39-43任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物還包括NS4A抑制劑、NS4B抑制劑、親環(huán)蛋白抑制劑及其組合。
45.權(quán)利要求38-44任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物還包括ACH-806、克立咪唑、 Debio-025 或 NIM811。
46.權(quán)利要求23-45任一項(xiàng)的用途，其中所述標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。
47.權(quán)利要求23的用途，其中所述標(biāo)準(zhǔn)還包括患者的遺傳多態(tài)性。權(quán)利要求47的方法，其中患者的遺傳多態(tài)性是rsl2979860。
48.為感染了HCV-Ia的患者指定治療方案和/或治療持續(xù)時(shí)間的方法，包括a)分析該患者的部分或全部的HCVNS5A基因；和b)確定用于預(yù)測對于干擾素治療的陽性應(yīng)答的可能性的標(biāo)準(zhǔn)，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括以下一個或多個要素i)與標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列相比，該患者的HCV NS5A氨基酸序列的干擾素敏感性決定區(qū)中的變化數(shù)目；和 )該患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列；和c)確定該患者的治療方案和/或治療持續(xù)時(shí)間。
49.權(quán)利要求49的方法，還包括基于感染了HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為b)中的標(biāo)準(zhǔn)的所有要素分配權(quán)重參數(shù)。
50.權(quán)利要求49或50的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A、L、V、E或M。
51.權(quán)利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是A。
52.權(quán)利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是L。
53.權(quán)利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是M。
54.權(quán)利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是E。
55.權(quán)利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 處的氨基酸殘基的序列是V。
56.權(quán)利要求49-56任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)還包括“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列”這一要素，其中所述標(biāo)準(zhǔn)包括所述三個要素中的一個或多個。
57.權(quán)利要求48-56任一項(xiàng)的方法，還包括基于感染了HCV-Ia的患者群體的序列分析以及他們各自對于基于干擾素的治療的應(yīng)答而為“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311 處的氨基酸殘基的序列”這一要素分配權(quán)重參數(shù)。
58.權(quán)利要求58的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S、P、Q、R或A。
59.權(quán)利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是S。
60.權(quán)利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是P。
61.權(quán)利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是Q。
62.權(quán)利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是R。
63.權(quán)利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311處的氨基酸殘基的序列是A。
64.權(quán)利要求49-64任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)NS5A氨基酸序列是H77。
65.權(quán)利要求49-65任一項(xiàng)的方法，其中患者的治療方案和/或治療持續(xù)時(shí)間的確定包括向患者施用HCV蛋白酶抑制劑、第二 STAT-C、干擾素、利巴韋林或其組合。
66.權(quán)利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用12周、36周或48周的持續(xù)時(shí)間。
67.權(quán)利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用12周的持續(xù)時(shí)間。
68.權(quán)利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用36周的持續(xù)時(shí)間。
69.權(quán)利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用48周的持續(xù)時(shí)間。
70.權(quán)利要求66-70任一項(xiàng)的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是SCH503034、VX_950、 VX-500、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。
71.權(quán)利要求71任一項(xiàng)的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是SCH503034。
72.權(quán)利要求71任一項(xiàng)的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制劑是VX-950。
73.權(quán)利要求66的方法，其中所述第STAT-C是HCV聚合酶抑制劑、NS4A抑制劑、NS4B 抑制劑或親環(huán)蛋白抑制劑。
74.權(quán)利要求74 的方法，其中所述第 STAT-C 是 VCH-916、IDX-184、VX-222、filibuvir、 ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032、ACH-806、克立咪唑、Debio-025、 NIM811 或 R7128。
75.權(quán)利要求49的方法，還包括分析該患者的遺傳多態(tài)性的步驟。
76.權(quán)利要求76的方法，其中該患者的遺傳多態(tài)性是rsl2979860。
77.權(quán)利要求49-77任一項(xiàng)的方法，其中分析患者的部分或全部HCVNS5A基因的步驟包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器擴(kuò)增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步驟。
78.權(quán)利要求49-78任一項(xiàng)的方法，還包括給予該患者基于干擾素的治療的步驟。
全文摘要
用于預(yù)測感染了HCV-Ia的患者對干擾素治療的應(yīng)答的方法。
文檔編號G01N33/50GK102307589SQ200980137534
公開日2012年1月4日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者A·夸昂, D·巴特爾斯, T·基弗 申請人:沃泰克斯藥物股份有限公司