專(zhuān)利名稱(chēng)：Dna的定量或檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的定量或檢測(cè)方法等。
背景技術(shù)：
作為樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的定量或檢測(cè)方法，例如，已知抽提出樣本中所含的生物來(lái)源的基因組DNA后，通過(guò)利用DNA聚合酶的DNA合成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction ；以下有時(shí)也記作PCR)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增而進(jìn)行檢測(cè)的方法； 使熒光標(biāo)記的寡核苷酸與生物來(lái)源樣本中的DNA所具有的目標(biāo)DNA區(qū)域雜交而進(jìn)行檢測(cè)的方法等(例如，參見(jiàn) J. Cataract. Refract. Surg.，2007 ；33 (4) :635_641、Environ. Mol. Mutagen.，1991 ； 18 (4) :259_262)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供簡(jiǎn)便地對(duì)樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)的方法。
本發(fā)明提供以下的發(fā)明。
[發(fā)明1] 一種DNA的定量或檢測(cè)方法(以下，有時(shí)記作本發(fā)明的方法)，所述DNA為樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA，其特征在于，包括如下步驟 (1)第一步驟，制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA 區(qū)域的DNA ； (2)第二步驟，將第一步驟中制備的樣本中含有的被測(cè)寡核苷酸和與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸混合，形成含有該被測(cè)寡核苷酸與該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物，并使該檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上；和 (3)第三步驟，利用檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)第二步驟中形成的檢測(cè)復(fù)合物中所含的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)。
[發(fā)明2] 如發(fā)明1所述的方法，其中，具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸是由多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸、或含有具有多個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化寡核苷酸的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。
[發(fā)明3] 如發(fā)明2所述的方法，其中，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸含有具有甲基化DNA的寡核苷酸。
[發(fā)明4] 如發(fā)明2或3所述的方法，其中，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能為所結(jié)合的甲基化 DNA抗體的識(shí)別功能。
[發(fā)明5] 如發(fā)明3或4所述的方法，其中，甲基化DNA為5_甲基胞嘧啶。
[發(fā)明6] 如發(fā)明4或5所述的方法，其中，甲基化DNA抗體為甲基胞嘧啶抗體。
[發(fā)明7] 如發(fā)明1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，樣本為下述任何一種生物來(lái)源樣本 (a)哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液或組織裂解液、 (b)從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液和組織裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的DNA、 (c)以從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的組織、細(xì)胞、組織裂解液和細(xì)胞裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的RNA為模板制作的DNA、 (d)從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或 (e)以從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的RNA為模板制作的DNA。
[發(fā)明8] 一種樣本的標(biāo)記方法，其中，使用發(fā)明2 7中任一項(xiàng)所述的方法中所用的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。
[發(fā)明9] 一種樣本的標(biāo)記方法，其中，使用發(fā)明2 7中任一項(xiàng)所述的方法中所用的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸和能夠標(biāo)記該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的試劑。
[發(fā)明10] 如發(fā)明8或9所述的方法，其中，標(biāo)記對(duì)象為DNA或蛋白質(zhì)。
[發(fā)明11] 如發(fā)明1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第二步驟中，通過(guò)不妨礙被測(cè)寡核苷酸與檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合且能夠與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的特定寡核苷酸，使檢測(cè)復(fù)合物與支撐體結(jié)合。
[發(fā)明12] 如發(fā)明1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為下述任意一種具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA (a)預(yù)先用不以目標(biāo)DNA區(qū)域作為識(shí)別切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理后得到的DNA、 (b)預(yù)先進(jìn)行純化后得到的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA、 (c)血液中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的游離DNA、 (d)微生物基因組來(lái)源的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA、或 (e)利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA生成的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA。
[發(fā)明13] 一種DNA的定量或檢測(cè)方法，所述DNA為樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA， 其特征在于，包括如下步驟 (1)第一步驟，制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA 區(qū)域的DNA ； (2)第二步驟，將第一步驟中制備的樣本中含有的被測(cè)寡核苷酸和與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且含有甲基化寡核苷酸的檢測(cè)寡核苷酸混合，形成含有該被測(cè)寡核苷酸與該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物，并使該檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上；和 (3)第三步驟，利用檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)第二步驟中形成的檢測(cè)復(fù)合物中所含的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)。
[發(fā)明 14] 如發(fā)明13所述的方法，其特征在于，識(shí)別功能使用甲基化DNA抗體、甲基胞嘧啶抗體。


圖1是表示實(shí)施例1中實(shí)施對(duì)照1處理(使用5’末端FITC化寡核苷酸)、對(duì)照2 處理(使用3’末端FLC化寡核苷酸)、X處理(使用甲基化寡核苷酸Ml)和Y處理(使用甲基化寡核苷酸M12)，對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施結(jié)果的圖。圖中，B表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 001pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液測(cè)定吸光度所得到的值。C表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. Olpmol DNA/10 μ L TE緩沖液的溶液測(cè)定吸光度所得到的值。
圖2是表示實(shí)施例2中實(shí)施X處理(使用甲基化寡核苷酸Ml)和Y處理(使用甲基化寡核苷酸M12)，對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施結(jié)果的圖。圖中，B表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 0001pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。C表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 001pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。D表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. Olpmol/lO μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。
圖3是表示實(shí)施例3中實(shí)施處理法1 (僅使用第1寡核苷酸)、處理法2 (使用第 1寡核苷酸和第2寡核苷酸)和處理法3 (使用第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸)，對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施結(jié)果的圖。圖中，B表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 003pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。C表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為O.Olpmol/lOyL TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。D表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 03pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。
圖4是表示實(shí)施例4中實(shí)施處理法1 (使用第1寡核苷酸和第2、1寡核苷酸)、處理法2 (使用第1寡核苷酸和第2、2寡核苷酸)和處理法3 (使用第1寡核苷酸、第2、1寡核苷酸和第2、2寡核苷酸)，對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施結(jié)果的圖。圖中，B表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0.003pmol/10yL TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。C 表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. ΟΙρπιοΙ/ΙΟμ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。D 表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 03pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。
圖5是表示實(shí)施例5中實(shí)施處理法1 (使用第1寡核苷酸)和處理法2 (使用第1 寡核苷酸和第2寡核苷酸)，對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施結(jié)果的圖。圖中，B表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0.003pmol/10yL TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。C 表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. ΟΙρπιοΙ/ΙΟμ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。D 表示對(duì)被測(cè)寡核苷酸濃度為0. 03pmol/10 μ L TE緩沖液的溶液進(jìn)行熒光測(cè)定所得到的值。
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明方法的第一步驟的“制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA”，是指制備具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA作為DNA試樣。
作為本發(fā)明方法中的“樣本”，可以列舉例如食品、河流、土壤、一般市售制品的表面附著物等，這樣的樣本中可能含有真菌、細(xì)菌、病毒等的混入微生物或核酸。
食品中有無(wú)食物中毒菌的檢查和病原菌的確定是很重要的，通常使用利用微生物表面抗原的免疫法。但是，免疫法中為制作抗原需要大量的勞動(dòng)，而且需要確定病原菌。即， 微生物檢查時(shí)的免疫法利用的是微生物種類(lèi)的特異性，因此難以通過(guò)一次檢查將多種菌種總括在一起檢查其有無(wú)，而且，對(duì)于免疫法無(wú)法成立的微生物，要使用PCR法等，因而檢查中需要大量的勞動(dòng)。本發(fā)明的方法能夠提供一種檢查方法，首先，即使在難以用免疫法進(jìn)行檢查的情況下，利用基因也能夠使檢查方法成立，其次，能夠同時(shí)檢測(cè)多種微生物。即，本發(fā)明方法能夠用于非生物來(lái)源樣本中存在的真菌類(lèi)、微生物類(lèi)、病毒等的檢查。另外，通過(guò)使用本發(fā)明，能夠檢測(cè)例如食品中的混入微生物或病毒，從而可望用于感染癥的檢查或食品污染檢查等。
作為樣本，還可以列舉(a)哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液或組織裂解液；(b)從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液和組織裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的DNA ； (c)以從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的組織、細(xì)胞、 組織裂解液和細(xì)胞裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的RNA為模板制作的DNA ； (d) 從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的DNA ； (e)以從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的RNA為模板制作的 DNA ；等。另外，所述組織表示包括血液、淋巴結(jié)等在內(nèi)的廣義的含義，作為所述體液可以列舉血漿、血清、淋巴液等，作為所述體分泌物可以列舉尿、乳汁等。
作為樣本中所含的DNA，可以列舉從所述生物試樣或所述混入微生物中抽提得到的基因組DNA、來(lái)自基因組DNA的DNA片段或RNA等。另外，在哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣本為人的血液、體液或體分泌物等的情況下，可以利用人的定期體檢的臨床檢查等中采集的樣本。在使用血液作為樣本的情況下，根據(jù)通常的方法由血液制備血漿或血清，以制得的血漿或血清為樣本，分析其中所含的游離DNA (含有胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞來(lái)源的DNA)時(shí)，能夠避開(kāi)血細(xì)胞來(lái)源的DNA而對(duì)胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞來(lái)源的DNA進(jìn)行分析，從而能夠提高胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞以及含有癌細(xì)胞的組織等的檢測(cè)靈敏度。
從哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣本中獲得基因組DNA時(shí)，使用例如市售的DNA抽提用試劑盒等即可。另外，從RNA獲得DNA時(shí)，使用市售的cDNA制作試劑盒等利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成DNA的試劑盒即可。另外，本發(fā)明的方法中，作為樣本，也可以是人工合成的DNA。
本發(fā)明方法中的“哺乳動(dòng)物”是指分類(lèi)為動(dòng)物界-脊索動(dòng)物門(mén)-脊椎動(dòng)物亞門(mén)哺乳綱(Mammalia)的動(dòng)物，具體而言，可以列舉人、猿、狨猴、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、山羊、狗、 貓等。
本發(fā)明中的“體液”是指構(gòu)成個(gè)體的細(xì)胞間存在的液體，可以列舉血漿和間質(zhì)液， 多數(shù)情況下，發(fā)揮維持個(gè)體的穩(wěn)態(tài)的功能。更具體而言，可以列舉淋巴液、組織液(組織間液、細(xì)胞間液、間質(zhì)液)、體腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心包液、腦脊液(脊髓液)、關(guān)節(jié)液 (滑液)、眼房水(房水)、腦脊液等。
本發(fā)明中的“體分泌液”是指由外分泌腺分泌的分泌液。具體而言，可以列舉唾液、胃液、膽汁、胰液、腸液、汗液、淚液、鼻涕、精液、陰道液、羊水、乳汁等。
本發(fā)明中的“細(xì)胞裂解液”是指通過(guò)將例如在細(xì)胞培養(yǎng)用的IOcm培養(yǎng)皿等中培養(yǎng)的細(xì)胞、即細(xì)胞株、原代培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞等破壞而得到的含有細(xì)胞內(nèi)液的裂解液。作為破壞細(xì)胞膜的方法，可以列舉使用超聲波的方法、使用表面活性劑的方法、使用堿性溶液的方法等。另外，將細(xì)胞裂解時(shí)，也可以使用各種試劑盒等。例如具體而言，在IOcm培養(yǎng)皿中將細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿后，棄去培養(yǎng)液，在IOcm培養(yǎng)皿中加入0. 6mL的RIPA緩沖液(lx TBS, 1% 諾納德P-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS,0. 004%疊氮化鈉)。在4°C將培養(yǎng)皿緩慢振搖 15分鐘后，用細(xì)胞刮等將IOcm培養(yǎng)皿上的貼壁細(xì)胞剝落下來(lái)，并將培養(yǎng)皿上的裂解液轉(zhuǎn)移到微量離心管中。添加裂解液的1/10容量的lOmg/mL PMSF后，在冰上放置30 60分鐘。 在4°C以IOOOOXg離心10分鐘，取上清作為細(xì)胞裂解液。
本發(fā)明中的“組織裂解液”是指通過(guò)將采自哺乳動(dòng)物等動(dòng)物的組織中的細(xì)胞破壞而取得的含有細(xì)胞內(nèi)液的裂解液。
更具體而言，將取自動(dòng)物的組織測(cè)定重量后，使用剃須刀片等將組織裁切為小片。 將冷凍組織切片時(shí)，需要切成更小的小片。裁切后，以每Ig組織為3mL的比率添加冰冷卻的RIPA緩沖液(可以添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等，例如可以添加RIPA緩沖液的 1/10容量的lOmg/mLPMSF)，并在4°C下勻漿化。勻漿化使用超聲波儀或加壓型細(xì)胞破碎裝置。勻漿化的作業(yè)中，溶液恒定維持于4°C，以抑制發(fā)熱。將勻漿液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在 40C以10000 X g離心10分鐘，取上清作為組織裂解液。
第一步驟是制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本的步驟，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo) DNA區(qū)域的DNA。
本發(fā)明方法中的“被測(cè)寡核苷酸”是指包含目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸。另外，被測(cè)寡核苷酸可以是包含目標(biāo)區(qū)域的DNA，也可以是包含目標(biāo)區(qū)域的RNA。具體而言，可以列舉基因組DNA中的目標(biāo)DNA區(qū)域、目標(biāo)RNA(可以是一部分)或以RNA為模板制作的DNA(可以是一部分)、或者含有它們的DNA片段、RNA片段。另外，本發(fā)明方法中的被測(cè)寡核苷酸可以是人工合成的寡核苷酸。
本發(fā)明中，例如，在被測(cè)寡核苷酸為從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的DNA、從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的RNA或以RNA為模板而制作的DNA、以及具有上述DNA、RNA的部分序列的寡核苷酸的情況下，被測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)是對(duì)能夠推測(cè)導(dǎo)致食品中的微生物污染或感染癥的微生物或病毒的有無(wú)及其種類(lèi)的指標(biāo)進(jìn)行定量或檢測(cè)。另外，例如，在被測(cè)寡核苷酸表示血液中的游離DNA及具有其部分序列的寡核苷酸的情況下，被測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)是通過(guò)血液中的游離DNA的定量對(duì)能夠推測(cè)癌癥的進(jìn)展程度的指標(biāo)進(jìn)行定量或檢測(cè)。另外，在被測(cè)寡核苷酸表示從組織、組織裂解液、細(xì)胞裂解液或組織裂解液中抽提的DNA或RNA、或者以該RNA為模板而制作的DNA、以及具有上述DNA或RNA的部分序列的寡核苷酸的情況下，被測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)是對(duì)在細(xì)胞中起作用的RNA的量進(jìn)行定量，從而對(duì)能夠推測(cè)與RNA的功能相關(guān)的細(xì)胞的功能或性質(zhì)、狀態(tài)的指標(biāo)進(jìn)行定量或檢測(cè)。例如，如果從組織裂解液中檢測(cè)到微生物或病毒來(lái)源的RNA或DNA，則能夠推測(cè)組織受到微生物或病毒的感染。例如，對(duì)于癌癥而言，已知血液中的來(lái)自基因組DNA的游離DNA會(huì)增加，通過(guò)定量或檢測(cè)血中游離DNA， 可以作為能夠推測(cè)癌癥的進(jìn)展情況(程度)的指標(biāo)。此時(shí)，作為被測(cè)寡核苷酸，優(yōu)選血液中的來(lái)自基因組DNA的游離DNA或該游離DNA中所含的含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸、以及具有上述兩者的部分序列的寡核苷酸的任意一種。
第一步驟中的“制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA”，也包括獲取含有要檢測(cè)的目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA試樣作為被測(cè)寡核苷酸的情況。 例如，在要檢測(cè)RNA上的堿基序列的情況下，獲取以該RNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄酶而合成的 DNA,作為含有該RNA上的要檢測(cè)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列作為目標(biāo)DNA區(qū)域的被測(cè)寡核苷酸。另外，在要檢測(cè)RNA的情況下，“從樣本中獲取作為具有目標(biāo)區(qū)域的RNA的被測(cè)寡核苷酸”是指，獲取含有要檢測(cè)的目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA試樣作為被測(cè)寡核苷酸。
在第一步驟中獲得的被測(cè)寡核苷酸為DNA的情況下，可以預(yù)先用不以該被測(cè)寡核苷酸所具有的目標(biāo)區(qū)域作為識(shí)別切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理，或者也可以包含在預(yù)先純化得到的DNA試樣中。另外，作為第一步驟中獲得的DNA，可以列舉血液中的游離 DNA、微生物基因組來(lái)源的DNA、利用逆轉(zhuǎn)錄酶從樣本中的RNA制作的DNA等。另外，“具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA”也可以是合成的DNA。另外，第一步驟中獲得的被測(cè)寡核苷酸，作為 RNA，可以列舉組織裂解液、細(xì)胞裂解液的游離RNA、純化的RNA、從微生物獲得的RNA等。
第一步驟中，獲取包含目標(biāo)區(qū)域的堿基序列的基因組DNA時(shí)，在樣本為哺乳動(dòng)物來(lái)源的情況下，使用例如市售的DNA抽提用試劑盒(Genfind v2試劑盒(Beckman Coulter 公司制)、FastPure DNA試劑盒(Takara bio公司制))等抽提DNA即可?；蛘?，在樣本為真菌等微生物的情況下，使用如Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南) (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)中記載的、一般的酵母基因組的制備方法等即可，在樣本為大腸菌等原核生物的情況下，使用如Molecular Cloning-Α Laboratory Manual-(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)中記載的一般的微生物基因組制備方法等即可。
另外，在要從哺乳類(lèi)來(lái)源的組織或細(xì)胞株等樣本中獲取RNA的情況下，可以使用市售的 RNA 抽提用試劑盒(IS0GEN(311-02501) (NIPPON GENE 公司制)、或者 FastRNA Pro Green試劑盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Blue 試劑盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Red試劑盒(Funakoshi公司制)等)從組織、細(xì)胞株等中抽提RNA。以RNA為模板合成 DNA時(shí)，使用逆轉(zhuǎn)錄酶即可，可以使用市售的試劑盒(Transcriptor高保真cDNA合成試劑盒、Roche Diagnostics公司制)。另外，也可以抽提病毒粒子后再抽提病毒的DNA。另外， 也可以使用市售的試劑盒(QuickGene RNA組織試劑盒S II、富士膠片公司制)等抽提病毒基因組?；蛘撸梢詮牟《靖腥镜慕M織中抽提RNA后利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲取病毒來(lái)源的DNA，也可以從病毒感染的組織中獲取DNA。
另外，在樣本為食品的情況下，可以從食品中分離出微生物等后獲取DNA，也可以同時(shí)獲取食品中所含的微生物以外的例如病毒等的基因組DNA與微生物來(lái)源的基因組 DNA。
另外，在樣本為哺乳動(dòng)物來(lái)源的組織、目標(biāo)DNA區(qū)域?yàn)椴《緛?lái)源的DNA的情況下，可以使用市售的RNA抽提用試劑盒(IS0GEN(311-02501)NIPPON GENE公司制)、或者 FastRNA Pro Green 試劑盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Blue 試劑盒(Funakoshi 公司制)、FastRNAPro Red試劑盒(Funakoshi公司制)等從組織中抽提RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲取DNA。另外，在樣本為哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣本的情況下，可以抽提病毒粒子后抽提病毒的DNA，或者也可以抽提病毒粒子后使用市售的試劑盒(QuickGene RNA組織試劑盒S II、 富士膠片公司制)等抽提病毒RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲取病毒來(lái)源的DNA?？梢詮牟《靖腥镜慕M織中抽提RNA后利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲取病毒來(lái)源的DNA，也可以從病毒感染的組織中獲取 DNA而獲取病毒來(lái)源的DNA。另外，在利用逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA獲取DNA的情況下，可以使用市售的試劑盒CTranscriptor高保真cDNA合成試劑盒、Roche Diagnostics公司制)等。
本發(fā)明中的“目標(biāo)DNA區(qū)域”(以下有時(shí)也記作目標(biāo)區(qū)域)是指，樣本中所含的DNA 中想要通過(guò)本發(fā)明檢測(cè)或定量的DNA區(qū)域。樣本為DNA的情況下的目標(biāo)DNA區(qū)域是指DNA 的堿基序列上的規(guī)定的堿基序列，在樣本為RNA的情況下，是指利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA制作的 DNA上的堿基序列，是RNA上的作為檢測(cè)或定量對(duì)象的規(guī)定堿基序列的互補(bǔ)堿基序列?！熬哂心繕?biāo)DNA區(qū)域的DNA”，可以是預(yù)先用在該DNA所具有的目標(biāo)DNA區(qū)域內(nèi)的堿基序列處不具有識(shí)別切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理后得到的DNA，或者也可以是預(yù)先純化后得到的DNA試樣、血液中的游離DNA、微生物基因組來(lái)源的DNA、利用逆轉(zhuǎn)錄酶從樣本中的 RNA合成的DNA等。
“目標(biāo)DNA區(qū)域”可以是在基因組中可見(jiàn)到多個(gè)的堿基序列(以下，有時(shí)也記作重復(fù)序列)，如果是作為疾病指標(biāo)的堿基序列則更好。例如，對(duì)于癌癥而言，已知血液中的來(lái)自基因組DNA的游離DNA會(huì)增加，此時(shí)，被測(cè)寡核苷酸可以列舉具有血液中的游離DNA中的重復(fù)序列或其部分序列的寡核苷酸。這些具有重復(fù)序列或其部分序列的寡核苷酸的定量值， 可以作為表示癌癥進(jìn)展程度的指標(biāo)。另外，重復(fù)序列如后所述，可以是簡(jiǎn)單重復(fù)序列(稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列，tandem r印eat)、散在重復(fù)序列、重復(fù)基因或假基因等 本發(fā)明中的“目標(biāo)RNA區(qū)域”的一種情況是指，生物細(xì)胞中的RNA上的要檢測(cè)的堿基序列。作為生物來(lái)源樣本中所含的“具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA”，可以列舉從樣本中抽提的RNA，具體而言，可以列舉核糖體RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA以及小RNA等。RNA不僅包括由 RNA聚合酶從宿主的基因組轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA，也包括以RNA為基因組的病毒基因組等，只要是RNA即可。
本發(fā)明中的“目標(biāo)DNA區(qū)域”可以是與疾病等相關(guān)的基因。例如，作為與癌癥相關(guān)的基因，可以列舉賴(lài)氨酰氧化酶、HRAS樣抑制因子、bA305P22. 2. 1、γ細(xì)絲蛋白、HAND1、 RIKEN 2210016F16同源蛋白、FLJ32130、PPARG血管生成素相關(guān)蛋白、血栓調(diào)節(jié)蛋白、ρ53應(yīng)答基因2、原纖蛋白2、神經(jīng)絲蛋白3、去整合素-金屬蛋白酶域23、G蛋白偶聯(lián)受體7、G蛋白偶聯(lián)生長(zhǎng)抑素和血管緊張素樣肽受體、溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去甲腎上腺素成員2等有用蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))等。可以逐個(gè)對(duì)所述“目標(biāo)DNA區(qū)域”中甲基化的DNA進(jìn)行檢測(cè)或定量，但是，例如如果能在一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中定量或檢測(cè)更多的該“目標(biāo)DNA區(qū)域”，則能夠相應(yīng)地提高定量精度和檢測(cè)靈敏度。
具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)橘?lài)氨酰氧化酶基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的賴(lài)氨酰氧化酶基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉賴(lài)氨酰氧化酶基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank 收錄號(hào)AF270645所記載的堿基序列的堿基序號(hào)16001 18661所示的堿基序列)。該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的賴(lài)氨酰氧化酶蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào) 18031 18033所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)17958 18662所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镠RAS樣抑制因子基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的HRAS樣抑制因子基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉HRAS樣抑制因子基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC068162所記載的堿基序列的堿基序號(hào)172001 173953所示的堿基序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的HRAS樣抑制因子基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào) 173744 173954 所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)閎A305P22. 2. 1基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的bA305P22. 2. 1基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉bA305P22. 2. 1基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AL121673所記載的堿基序列的堿基序號(hào)13001 13889所示的堿基序列)。該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的bA305P22. 2. 1蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào)13850 13852所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)13664 13890所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)閅細(xì)絲蛋白基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的Y細(xì)絲蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉γ細(xì)絲蛋白基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank 收錄號(hào)AC074373所記載的堿基序列的堿基序號(hào)63528 64390所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的、細(xì)絲蛋白蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào)64101 64103所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)63991 64391所示。
另夕卜，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镠ANDl基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的HANDl基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉HANDl基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC026688 所記載的堿基序列的堿基序號(hào)24303 26500所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的HANDl蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào)25959 25961所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)25703 26501所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镽IKEN 2210016F16同源蛋白基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的RIKEN 2210016F16同源蛋白基因的外顯子 1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉RIKEN 2210016F16同源蛋白基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AL354733所記載的堿基序列的堿基序號(hào)157056 159000所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的 RIKEN 2210016F16同源蛋白蛋白質(zhì)的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)158448 159001所不。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镕LJ32130基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列， 可以列舉包含人來(lái)源的FLJ32130基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組 DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉FLJ32130基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC002310所記載的堿基序列的堿基序號(hào)1 2379所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列)。 該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的FLJ32130蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào) 2136 2138所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)2136 2379所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镻PARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上 CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的PPARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉序列號(hào)8所示的堿基序列。該區(qū)域中，優(yōu)選編碼人來(lái)源的PPARG血管生成素相關(guān)蛋白蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子的、含有5’側(cè)約1200個(gè)堿基 2000個(gè)堿基的區(qū)域。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)檠ㄕ{(diào)節(jié)蛋白基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的血栓調(diào)節(jié)蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉血栓調(diào)節(jié)蛋白基因的堿基序列(相當(dāng)于 Genbank收錄號(hào)AF4卯471所記載的堿基序列的堿基序號(hào)1 6096所示的堿基序列)。該區(qū)域中，編碼人來(lái)源的血栓調(diào)節(jié)蛋白蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸的ATG編碼子如堿基序號(hào) 2590 2592所示，上述外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)2048 6096所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)閜53應(yīng)答基因2基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的P53應(yīng)答基因2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉p53應(yīng)答基因2基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC009471所記載的堿基序列的堿基序號(hào)113501 116000所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的P53應(yīng)答基因2基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)114059 115309所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)樵w蛋白2基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的原纖蛋白2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉原纖蛋白2基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank 收錄號(hào)ACl 13387所記載的堿基序列的堿基序號(hào)118801 121000所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的原纖蛋白2基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)119892 112146 所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)樯窠?jīng)絲蛋白3基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉神經(jīng)絲蛋白3基因的堿基序列(相當(dāng)于 Genbank收錄號(hào)AF106564所記載的堿基序列的堿基序號(hào)28001 30000所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào) 28615 29695 所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)槿フ纤?金屬蛋白酶域23基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上 CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的去整合素-金屬蛋白酶域23基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉去整合素-金屬蛋白酶域23基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC009225所記載的堿基序列的堿基序號(hào)21001 23300所示的堿基序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的去整合素_金屬蛋白酶域 23基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)22195 2沈31所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镚蛋白偶聯(lián)受體7基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉G蛋白偶聯(lián)受體7基因的堿基序列 (相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC009800所記載的堿基序列的堿基序號(hào)75001 78000所示的堿基序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào) 76667 77653 所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)镚蛋白偶聯(lián)生長(zhǎng)抑素和血管緊張素樣肽受體基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的G蛋白偶聯(lián)生長(zhǎng)抑素和血管緊張素樣肽受體基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉G蛋白偶聯(lián)生長(zhǎng)抑素和血管緊張素樣肽受體基因的堿基序列(相當(dāng)于 Genbank收錄號(hào)AC008971所記載的堿基序列的堿基序號(hào)57001 60000所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的G蛋白偶聯(lián)生長(zhǎng)抑素和血管緊張素樣肽受體基因的外顯子 1的堿基序列如堿基序號(hào)57777 59633所示。
另外，具體而言，例如，在有用蛋白質(zhì)基因?yàn)槿苜|(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去甲腎上腺素成員2基因的情況下，作為其啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列中存在的含有一個(gè)以上CpG的堿基序列，可以列舉包含人來(lái)源的溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以列舉溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去甲腎上腺素成員2基因的堿基序列(相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)AC026802所記載的堿基序列的堿基序號(hào) 78801 81000所示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。該區(qū)域中，人來(lái)源的溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1的堿基序列如堿基序號(hào)80280 80605所
7J\ ο 作為“目標(biāo)DNA區(qū)域”(以下，有時(shí)也記作目標(biāo)區(qū)域)，可以列舉包含由例如MLH1、 RUNX3、CDHl、TIMP3、CSPG, RARBU4-3-3 σ、CALCA, HICl、ESRl、PTEN、SOCSl、BLTl、ESR2、 MTMG, TWIST、INK4、CDKN2、GSTP, DCR2、TP73、PGR、HIC2、MTHFR, TFFU MLLT7、SLC5A8、 THBSl、S0CS2、ACTB, CDHl3, FGF18、GSTM3、HSD17B4、HSPA2、PPP1R13B、PTGS2、SYK, TERT, TITFl、BRACAl、AATF, ABCBl、ABCCl、ABI1、ABLl、AF1Q、AF3P21、AF4、AF9、AFF3、AKAP12、 AKAP9、ALEX3、ALK、ALOXl5、APAF1、APC、ARHA、ARHGAP26、ARHGEF12、ARNT、ATBFl、ATFl、 ATM、AXIN2、BCAS3、BCAS4、BCLl、BCL10、BCLl 1A、BCLlIB、BCL2、BCL5、BCL7A、BCR、BIRC3、 BMPRlA、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BUBIB、CAGE-1、CARS、CASC5、CCDC6、CCND2、CCND3、CDHl1、 CDKNlB, CDKN2A、CDX2、CEPl 10、CKNl、CLPl、CLTC, CLTCLl、CNC, COLlAl、C0X6C、CREBBP、 CXXC6、DAB2IP、DDIT3、DDX43、DIRCl、DIRC2、DKKl、E2F3、EEN、EGFR、ELL、EPS 15、ERBB2、 ERCl、ERCCl、ERCC4、ERG、ETVl、ETV6、EVI1、EffSRl、EXTl、EXT2、FANCA、FANCD2、FANCF、FAS、 FBP17、FCRL4、FEV、FGFRl、FHIT、FLI1、F0X03A、FUS、FVTl、GAS7、GLI1、GNAS、G0LGA5、GOPC、 GRB2、HCMOGT-1、HI ST1H41、HLF、HMGA2、HOXA13、HOXC11、HOXC13、HOXD13、HSPBAP1、HSPCB、HSPDl、HSPHl、IKZF2、INTS6、IRF4、JAGl、JAG2、JAK2、JARID1A、JAZFl、JMJD2C、JUN、KIT、 KITLG、KLF5、KLF6、LASPl、LDBl、LHFP, LMOl、LM02、LPHN2、LPP, LYLl、MADH4、MAF, MAFB, MDM2、MDS2、MET、MKL1、MLF1、MLH1、MLL、MLLT10、MMP2、MN1、MRE11B、MSF、MSH2、MSH6、MS 12、 MUCl、MUTYH、MXI1、MYC、MYH9、MYST3、NFl、NFKBl、NIN、NKX2-5、Ν0Ν0、NOTCHl、N-RAS、NTRK3、 NUMAl、NUP214、NUP98、0LIG2、P53、PALB2、PAX2、PAX5、PAX7、PAX9、PBXl、PCMl、PCSK7、PDGFB、 PDGFRA, PDGFRB, PH0X2B、PICALM、PLAG1、PLCBl、PLK、PML, PMSU POLH, P0U5F1P1、P0U6F2、 PPP1R13L、PRDM16、PRRX1、PSIP1、PTCH、RABEP1、RAD51L1、RAD53、RANBP17、RAP1⑶S1、RAP2B、 RARA, RASSFl、RBI、RBL2、RBMl5, RBM5、RCHYl、RECQL, RECQL5、RET、RUNX, RUNX1T1、SBDS, SDHC, SDHD, SET、SHH、SIL、SIX1、SNAI2、SPI1、SPINK7、STARD3、STAT3、STKl 1、STK4、SUFU, SYK, SYNP02、TBX2、TCF3、THBS2、THRAP3、TMPRSS2、TNF, TOPI、TPM4、TPR、TRIM24、TRIM33、 TRIPl 1、TSCl、TSC2、TSHR、TTL、VAV1、VHL、WFDC1、WTl、WffOX、XPC、ZBTB16、ZNF146、ZNF217 等符號(hào)表示的基因的啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)或翻譯區(qū)(編碼區(qū))的堿基序列的DNA的區(qū)域等。本發(fā)明的方法中，可以逐個(gè)對(duì)這些目標(biāo)DNA區(qū)域進(jìn)行定量或檢測(cè)，但若能在一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中定量或檢測(cè)更多的這些目標(biāo)DNA區(qū)域，則能夠相應(yīng)地提高定量精度和檢測(cè)靈敏度。
在本發(fā)明中的目標(biāo)區(qū)域?yàn)槲⑸飦?lái)源的堿基序列的情況下，作為目標(biāo)區(qū)域，可以列舉從樣本中抽提的基因組DNA或DNA片段、或利用逆轉(zhuǎn)錄酶將從樣本中抽提出的RNA變?yōu)镈NA而得到的堿基序列。因此，作為能夠與檢測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列，選擇對(duì)該微生物具有特異性的區(qū)域即可。例如，在本發(fā)明中的目標(biāo)區(qū)域?yàn)槲⑸锏膲A基序列的情況下，為了從樣本中選擇性地抽提出目標(biāo)區(qū)域，將微生物基因組DNA或利用逆轉(zhuǎn)錄酶由樣本中抽提出的RNA而得到的DNA等的堿基序列中，位于目標(biāo)區(qū)域附近的微生物特有的堿基序列作為與特定寡核苷酸特異性結(jié)合的堿基序列即可。
作為本發(fā)明中的“具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA”，可以列舉革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌等細(xì)菌、真菌、病毒、病原性原蟲(chóng)等微生物等來(lái)源的DNA、或利用逆轉(zhuǎn)錄酶從這些微生物等來(lái)源的RNA獲取的DNA。例如，生殖支原體(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae)、■{白氏 旋體(Borrelia burgdorferi)B31、普氏立克次氏體 (Rickettsia prowazekii)、梅毒螺方寵體(Treponema pallidum)、月市炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、幽門(mén)螺方寵桿菌(Helicobacter pylori) J99、幽門(mén)螺旋桿菌26695、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)RcU結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv、綠月農(nóng)假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 口耆月市軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、豐占質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、腸道沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)、空腸彎曲！flif (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni) > 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 蠟樣芽胞桿菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、小腸結(jié)腸炎耳口爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 假結(jié)核耳口爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、紅色毛痛菌(Trichophyton ruburum)、須發(fā);)||菌(Trichophyton mentagrophytes)、白菌(Candida albicans) > 新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、卡氏月市孢子菌(Pneumocystis carinii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、巨細(xì)胞病_ (Cytomegalovirus) > XMM^iIPlM (human herpesvirus) 5> g^Sjrfi - E/K # (Epstein-Barr virus)、人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人類(lèi)乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus)、腸病毒(Enterovirus)、諾如病毒(Norovirus)、 流感病毒anfluenza Virus)、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)、微小隱孢子蟲(chóng) (Cryptosporidium parvum)、溶組織內(nèi)阿米(Entamoeba histolytica)的基因組 DNA 或利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA制作的DNA，可以用于樣本中的感染癥病原菌或食品中的食物中毒病原菌等的檢測(cè)。
在檢查活檢樣品中或食品等一般制品中所含的病原性微生物等的有無(wú)的情況下， 通常，通過(guò)利用對(duì)各個(gè)微生物等的抗原的免疫法進(jìn)行檢查，來(lái)決定病原性微生物等的有無(wú)或確定病原性微生物等。但是，免疫法檢查所用的抗體有時(shí)不易制作，并且為了檢測(cè)多種細(xì)菌，需要制作針對(duì)各個(gè)細(xì)菌等的抗原的抗體。但是，通過(guò)利用本發(fā)明，無(wú)需制作抗體即可進(jìn)行檢查。即，通過(guò)利用本發(fā)明，能夠?qū)﹄y以制作抗體的微生物或未制作出抗體的微生物提供簡(jiǎn)易的檢查方法。另外，本發(fā)明中，能夠同時(shí)檢查不同微生物的堿基序列，因此能夠同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中所含的多種微生物。作為這些微生物，具體而言，已知單核細(xì)胞土曾牛寺胃(Listeria monocytogenes)(Salmonella enterica) > 彎曲桿菌(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、賭樣芽胞桿菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、小腸結(jié)腸炎耳口爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)等食物中毒菌，但是尚未已知同時(shí)檢測(cè)這些細(xì)菌的技術(shù)。本發(fā)明中，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)堿基序列，因此能夠同時(shí)檢查多種食物中毒菌的有無(wú)。另外，在通過(guò)后述的特定寡核苷酸選擇(結(jié)合)作為檢測(cè)對(duì)象的堿基序列的CRISHUClustered regularly interspaced short palindromic r印eats，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列)區(qū)域等、 在基因組中可見(jiàn)到多個(gè)的堿基序列的情況下，能夠以高于檢測(cè)1個(gè)基因組中的1個(gè)基因的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。這樣的技術(shù)對(duì)于感染癥的診斷、食物中毒菌的迅速檢測(cè)也有用。另外， 本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)環(huán)境中的微生物的基因組DNA，也可以用于產(chǎn)業(yè)上的有用菌的鑒定和土壤、河流、湖沼的底質(zhì)等的微生物群的簡(jiǎn)易調(diào)查等。在環(huán)境中生息的微生物中，可以確認(rèn)例如詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum) deltaH、超口譽(yù)熱菌(Aquifex aeolicus)、掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii) 0T3、發(fā)光古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8> 1 Λ ^ (Aeropyrum pernix)Kl> Φ g ik ^ (Haloferax mediterranei)等的生息。另外，還可以對(duì)硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)等工業(yè)上能利用的細(xì)菌、嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcus thermophilus)等用于發(fā)酵的微生物等進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
例如，作為用于檢測(cè)微生物中的基因組的目標(biāo)區(qū)域和后述的檢測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域，具體而言，可以是相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)NC_001139等所示的酵母染色體VII 的堿基序號(hào)271743-272083的堿基序列、相當(dāng)于Genbank收錄號(hào)NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基序號(hào)384569-384685的堿基序列等不編碼基因的堿基序列。另外，以各種病原性微生物中共有的特征性基因的、在病原性微生物中保守的堿基序列作為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，能夠提供同時(shí)檢測(cè)多種病原性微生物的方法，因而是很有用的。具體而言，mce-家族基因(結(jié)核桿菌(Micobacterium tuberculosis))、13號(hào)染色體上的tRNA-Tyr堿基序列 (新型隱球菌(Cryptococcus neoformans))、幾丁質(zhì)合成酶活化因子(Chs3)具有煙曲霉菌 (Aspergillus fumigatus)和新薩托菌(Neosartorya)屬特有的堿基序列，因此，通過(guò)鑒定從人的痰、肺的活檢樣本中抽提的DNA中是否含有來(lái)源于這些微生物的DNA，能夠用于微生物所致感染癥的鑒定。另外，actA(單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)), pyrG(NC_002163、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni))等為食物中毒菌特有的共同的基因，因此，這些基因能夠用于食物中毒的微生物鑒定。另外，thrA具有在腸道沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)、小腸結(jié)腸炎耳口爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 大腸桿菌(Escherichia coli)中保存的序列，通過(guò)一個(gè)基因也能夠檢測(cè)多種微生物。
“重復(fù)序列”是指在基因組中可見(jiàn)到多個(gè)相同的規(guī)定序列的堿基序列。作為這樣的重復(fù)序列，已知簡(jiǎn)單重復(fù)序列(稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列，tandem r印eat)、散在重復(fù)序列等。
簡(jiǎn)單重復(fù)序列的特征在于，相同的序列以相同的朝向相鄰存在。已知衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星、著絲粒、端粒、動(dòng)粒、核糖體基因簇等一系列堿基序列等。
散在重復(fù)序列的特征在于，不相鄰而散在，認(rèn)為其為來(lái)自于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的 DNA。根據(jù)堿基序列的長(zhǎng)度，散在重復(fù)序列分類(lèi)為SINE (Short Interspersed Repetitive Element,短散在重復(fù)序列)和LINE (Long Interspersed Elements,長(zhǎng)散在重復(fù)序列)，作為人的堿基序列，已知Alu序列和LINE-I序列分別為其代表性重復(fù)序列。另外，還已知由 RNA或蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄而得到的失活加工假基因、通過(guò)基因重復(fù)擴(kuò)增而得到的基因序列。
重復(fù)基因是指在一個(gè)基因組中存在多個(gè)具有高同源性的基因的情況，多數(shù)情況下，為在一個(gè)基因附近隨機(jī)排列而存在的堿基序列。另外，假基因中已知也包括包含于重復(fù)基因中的基因。
作為重復(fù)序列的具體例子，例如，作為含有比較短的堿基序列的重復(fù)序列，已知 (A) n、(T) η、(GA) η、(CA) η、(TAA) η、(GGA) η、(CAGC) η、(CATA) η、(GAAA) η、(TATG) η、(TTTG) η、 (TTTA) η、(TTTC) η、(TAAA) η、(TTCA) η、(TATAA) η、(TCTCC) η、(TTTCC) η、(TTTAA) η、(TTTTC) η、(TTTTA) η、(TTTTG) η、(CAAAA) η、(CACCC) η、(TATATG) η、(CATATA) η、(TCTCTG) η、(AGGGGG) η、(CCCCCA) η, (TGGGGG) η (η表示重復(fù)數(shù))等序列；作為來(lái)自于轉(zhuǎn)錄因子的序列，有hAT組 (group)的 MERl-Charlie、Zaphod，Tc-l組(group)的 MER2_Tigger、Tc_l、Mariner。此夕卜， 具體而言，還已知Tiggerl、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等。這些序列通常為較短且簡(jiǎn)單的堿基序列，難以設(shè)定后述的特定接合序列(日文接著配列)和檢測(cè)用接合序列，但是只要具有能夠設(shè)定為本發(fā)明中的后述的特定接合序列和檢測(cè)用接合序列的設(shè)定對(duì)象的序列，則也可以用于本發(fā)明，因此未必一定排除在本發(fā)明的對(duì)象之外。另外，衛(wèi)星DNA、 小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等是分類(lèi)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)序列。
另外，作為在基因中存在多個(gè)拷貝的序列，可以列舉存在于著絲粒中的序列ALR6 或作為snRNA的U2、U6，或者tRNA、rRNA等已知通常在基因組中存在多個(gè)拷貝的基因，除此之外還可以舉出通過(guò)基因重復(fù)在基因組中存在多個(gè)拷貝的基因等。
關(guān)于假基因，是指在DNA的序列中，具有以使人聯(lián)想到其曾經(jīng)編碼基因產(chǎn)物(特別是蛋白質(zhì))為特征的堿基序列，但目前已喪失功能的基因。認(rèn)為其是由原來(lái)的具有功能的序列發(fā)生突變的結(jié)果而產(chǎn)生的。例如有由突變導(dǎo)致終止密碼子產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的肽鏈縮短，無(wú)法發(fā)揮作為蛋白質(zhì)的功能的情況；或由單堿基置換等突變導(dǎo)致正常轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列喪失功能的情況等。假基因大多會(huì)另外留有原來(lái)的正常的基因，但也有單獨(dú)成為假基因的情況。
假基因根據(jù)基因序列的特點(diǎn)可以分類(lèi)為3種類(lèi)型。有如下情況基因組中插入有由逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA制作成的DNA的情況(加工型假基因)；原基因序列在基因組內(nèi)重復(fù)，其拷貝中的一部分因突變等喪失功能而成為假基因的情況(重復(fù)假基因或非加工型假基因)；以及基因組內(nèi)的基因(無(wú)重復(fù)基因而僅有單獨(dú)的基因的狀態(tài))喪失功能而成為假基因的情況。
目前，在作為假基因已知的基因中，還已知進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的例子、具有基因功能的例子 (尚不確定是否應(yīng)稱(chēng)為假基因)，因此本發(fā)明方法中的“假基因”，不表示有無(wú)基因功能或是否進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而表示前述的“加工型假基因”和“重復(fù)假基因(非加工型假基因)”。
重復(fù)基因是指，通過(guò)基因重復(fù)使基因組中的特定基因、基因片段加倍而產(chǎn)生的基因或其基因片段。基因重復(fù)是包含基因的DNA的某個(gè)區(qū)域產(chǎn)生重復(fù)的現(xiàn)象。作為產(chǎn)生基因重復(fù)的原因，有基因重組的異常、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移、染色體整體的重復(fù)等。例如，當(dāng)1 個(gè)基因被復(fù)制而插入基因組DNA時(shí)，有插入到不同的染色體位置的情況和插入到原基因的附近的情況。通過(guò)插入到原基因的附近而使所復(fù)制的基因串聯(lián)的場(chǎng)所稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列 (tandem r印eat)，通過(guò)基因重復(fù)而制作的基因組稱(chēng)為基因簇(基因家族)。
此外，已知逆轉(zhuǎn)錄病毒、末端具有LTR(Long terminal r印eat，長(zhǎng)末端重復(fù)序列)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons，哺乳動(dòng)物顯性 LTR-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)等認(rèn)為來(lái)源于病毒的內(nèi)源序列、逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的LTR等也在一個(gè)基因組中存在多個(gè)。例如，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的LTR，具體而言，已知LTR1、LTR1B、LTR5、 LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E, MER48、MLT2CB 等亞家族。另外，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子來(lái)源的LTR分類(lèi)為ERV、ERVK, ERVL各類(lèi)，具體而言，可以列舉LTR8A、LTR28、 MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL, LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、 MLT2A1、MLT2E、MER11C、MERllC等亞家族。另外，MaLRs是指與典型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子同樣地在其序列的兩端含有LTR，但是LTR所夾的內(nèi)部序列并非逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的序列的DNA 因子?？梢粤信e例如MLT1A1、MLT1A2、MLTIB, MLT1C、MLTID, MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLT1J、 MLT1K、MLTlI、MLT2CB、MSTA、MSTA-int、MSTB、THE1A、THE IB, THElB-internal、THEl 等亞家族。
“散在重復(fù)序列”的特征在于不相鄰而散在，認(rèn)為其來(lái)自于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。另外， 散在重復(fù)序列根據(jù)其長(zhǎng)度分類(lèi)為SINE (Short Interspersed Repetitive Element，短散在重復(fù)序列)和LINE(Long Interspersed Elements，長(zhǎng)散在重復(fù)序列)。SINE中，大部分為屬于Alu家族的序列。作為特征，具有7SL RNA的3’側(cè)的序列或5’側(cè)的序列，并且具有由稱(chēng)為左單體(Left-monomer)和右單體(Right-monomer)的區(qū)域夾著的AT富集區(qū)域。作為 Alu 家族的亞家族，可以列舉 Alu、Alujb、Alujo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluY， 以及 FAM (Fossil Alu Monomer)和具有 FAM 的序列的 FLAM (Free Left Alu Monomer)禾口 FRAM (Free Right Alu Monomer)。作為 Alu 家族以外的 SINE，已知 MIR 及 Ther/MIR3，作為各自的亞家族，已知MIR、MIR3。此外，作為其它生物種類(lèi)的Alu家族的亞家族，已知B1、B2、 B4、PB1、PB1D 等。作為 LINE，報(bào)道了從 LINEl 到 Line23 的亞家族，但已知 LINE—1、LINE2、LINE3在基因組中廣泛存在。另外，對(duì)于LINE-I,已知例如L1M1、L1M2、L1M3、LlM3d、L1M4、 LlM4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、LlMBU LlMBU L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、 LIMCa、LlMCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、LlMC4a、L1MC5、LIMDa、LIME、LlMEc、LIMEd、LIMEg、 LlMEl、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、LlME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、 L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、LlPBU L1PB3、L1PB4、L1PREC2、 HALl的亞家族，作為L(zhǎng)INE-2，已知L2、L2c的亞家族。另外，對(duì)于例如Alu家族或Alu的亞家族中共有的序列、LINE-I家族或LINE-I的亞家族中共有的序列，如果能夠設(shè)定后述的特定接合序列和檢測(cè)用接合序列，則能夠在一個(gè)基因組中設(shè)定多個(gè)檢測(cè)對(duì)象，因此能夠以更高的靈敏度進(jìn)行基因組的檢測(cè)。
作為目標(biāo)DNA區(qū)域，具體可以列舉例如LINE-I的部分序列(序列號(hào)12、序列號(hào)13 或序列號(hào)14所示的堿基序列)、Alu的部分序列(序列號(hào)15所示的堿基序列)或顯示它們的同源性的堿基序列等。
本發(fā)明中，測(cè)定重復(fù)序列是指同時(shí)測(cè)定一個(gè)基因組中存在多個(gè)的堿基序列，例如， 與序列號(hào)13表示的堿基序列具有80%以上的序列同源性的堿基序列，在人基因組中約有 280個(gè)拷貝，與序列號(hào)15表示的堿基序列具有80%以上的同源性的堿基序列，在人基因組中約有820個(gè)拷貝。因此，如果能夠在各個(gè)堿基序列中設(shè)定檢測(cè)用接合序列和特定接合序列，與在一個(gè)基因組中僅存在一種的序列中設(shè)定檢測(cè)用接合序列和特定接合序列的情況相比，理論上能夠?qū)⒁粋€(gè)基因組的檢測(cè)靈敏度提高沈0 820倍。
第二步驟是將第一步驟中制備的樣本中含有的被測(cè)寡核苷酸和與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸混合，形成含有該被測(cè)寡核苷酸和該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物，并使該檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上的步驟。
作為具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸，可以列舉由多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸、含有具有多個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化寡核苷酸的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸寸。
本發(fā)明中的“檢測(cè)寡核苷酸”是指，能夠通過(guò)后述的“識(shí)別功能”進(jìn)行檢測(cè)且與被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸。另外，檢測(cè)寡核苷酸只要具有“識(shí)別功能”且與被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，則可以是任意的寡核苷酸，也可以是多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合寡核苷酸。作為識(shí)別功能，在結(jié)合后述的“檢測(cè)分子”的情況下，檢測(cè)寡核苷酸可以具有后述的“檢測(cè)序列”。
作為本發(fā)明方法中的“具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸”，是指檢測(cè)寡核苷酸具有多種識(shí)別功能。例如，在檢測(cè)寡核苷酸為多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合寡核苷酸的情況下，只要復(fù)合寡核苷酸上具有多種識(shí)別功能則可以是任意的復(fù)合寡核苷酸，特別是不確定識(shí)別功能的位置。更具體而言，可以是后述的“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”。另外，在檢測(cè)寡核苷酸為單鏈寡核苷酸的情況下，只要寡核苷酸上具有多種識(shí)別功能則可以是任意的寡核苷酸。例如，在檢測(cè)寡核苷酸為甲基化寡核苷酸的情況下，可以在檢測(cè)寡核苷酸上合成多個(gè)具有的甲基化DNA而作為檢測(cè)寡核苷酸使用。甲基化DNA可以使用甲基化DNA抗體進(jìn)行檢測(cè)，因此，檢測(cè)寡核苷酸上結(jié)合的甲基化DNA抗體數(shù)越多，則可以期待得到越高的檢測(cè)靈敏度。另外，為了檢測(cè)甲基化DNA，除了使用甲基化DNA抗體的方法以外，還有后述的利用“鋨絡(luò)合物”的方法。
在檢測(cè)寡核苷酸為甲基化寡核苷酸的情況下，可以容易地增加檢測(cè)寡核苷酸上的識(shí)別功能，并且，可以從使用甲基化DNA抗體的檢測(cè)方法、使用鋨絡(luò)合物等的檢測(cè)方法等多種檢測(cè)方法中選擇適合測(cè)定的檢測(cè)方法。
本發(fā)明中的“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”是指，與被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且由多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的寡核苷酸。另外，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸具有后述的識(shí)別功能，并采用多個(gè)寡核苷酸通過(guò)各個(gè)寡核苷酸所具有的含有相互互補(bǔ)的堿基序列的接合堿基序列結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)。
另外，識(shí)別功能可以預(yù)先與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸結(jié)合，也可以間接與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸結(jié)合。
構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸，可以全部或部分被甲基化。本發(fā)明中，將至少一部分被甲基化的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸稱(chēng)為甲基化復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。在使甲基化寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而形成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的情況下，甲基化復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸例如可以僅由甲基化寡核苷酸結(jié)合而成，也可以由甲基化寡核苷酸與未甲基化的寡核苷酸組合結(jié)合而成。
“甲基化寡核苷酸”是指，構(gòu)成寡核苷酸的核苷酸的堿基被甲基化的寡核苷酸，本發(fā)明中可以是人工合成的甲基化寡核苷酸。另外，也可以通過(guò)將人工合成的寡核苷酸或基因組DNA片段化所得到的寡核苷酸用甲基轉(zhuǎn)移酶修飾來(lái)制備。已知若干種甲基轉(zhuǎn)移酶將寡核苷酸中的“CpG”中的胞嘧啶的5位甲基化，作為這樣的甲基化酶的具體例，可以列舉SssI 甲基化酶、Dmntl甲基化酶等。另外，由于基因組DNA是部分甲基化的，因而將從細(xì)胞等獲取的基因組DNA片段化時(shí)，有時(shí)可以獲得在基因組中被甲基化的區(qū)域作為甲基化寡核苷酸。 另外，胞嘧啶的5位被甲基化的甲基化寡核苷酸，可以是使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶而人工合成的甲基化寡核苷酸。此時(shí)，不僅能夠?qū)ⅰ癈pG”的胞嘧啶而且能夠?qū)⑺械陌奏?(例如，5，-CA-3’、5’ -CT-3’、5’ -CC-3’等)均合成為5-甲基胞嘧啶。
"DNA甲基化酶”是將DNA中的堿基甲基化的酶，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌等已分離出多種DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根據(jù)底物的堿基的種類(lèi)分類(lèi)為腺嘌呤甲基化酶、胞嘧啶甲基化酶等幾種。胞嘧啶甲基化酶是識(shí)別DNA堿基序列中的特定序列并將該序列附近的胞嘧啶甲基化的酶，根據(jù)所識(shí)別的堿基序列已知有不同的胞嘧啶甲基化酶。
另外，DNA甲基化酶所催化的DNA的甲基化反應(yīng)多數(shù)是從稱(chēng)為限制性修飾系統(tǒng)的原始的免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的。限制性修飾系統(tǒng)是指，在細(xì)菌中起作用的、通過(guò)將整個(gè)基因組定期甲基化從而使其不被識(shí)別特定序列的限制性內(nèi)切酶(限制性核酸內(nèi)切酶)消化、并且使外源DNA(特別是噬菌體)被限制性內(nèi)切酶消化的功能來(lái)保護(hù)微生物基因組免受噬菌體感染的系統(tǒng)。已知作用于基因組的甲基化的酶，將胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，多數(shù)將嘌呤殘基的 6位的氮(N6)或5位的碳(C5)甲基化。這樣的酶中，作為將胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有SssI (M. SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、HaeIII甲基化酶等。另外，這些將胞嘧啶的C5位甲基化的酶所識(shí)別的堿基序列不同，識(shí)別CpG的胞嘧啶甲基化酶僅有SssI。
另外，作為人基因組中的DNA的甲基化反應(yīng)，就表觀遺傳(不依賴(lài)基因序列而產(chǎn)生基因表達(dá)的多樣性的機(jī)制)而言，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作為這樣的胞嘧啶甲基化酶，已知DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，已知DnmtI甲基轉(zhuǎn)移酶。
因此，由于人細(xì)胞中CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，因而在人為地將基因組甲基化的情況下，通過(guò)使用SssI，可以將與人細(xì)胞內(nèi)的甲基化相同的序列(CpG)的相同的胞嘧啶的相同的位置甲基化。
為了利用胞嘧啶甲基化酶得到甲基化的DNA，具體而言例如如下實(shí)施即可。在DNA 試樣中加入最適IOX緩沖液(NEBuffer2 (NEB公司制))5 μ L、S-腺苷蛋氨酸(3. 2mM, NEB 公司制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基化酶ksl (NEB公司制)0. 5 μ L，然后在該混合物中加入滅菌超純水使液量為50 μ L，并在37°C孵育30分鐘即可。
本發(fā)明中，在構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸相互互補(bǔ)地串聯(lián)結(jié)合(連接)的情況下(有時(shí)也稱(chēng)為“串聯(lián)型”)，將構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中具有通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸上連接堿基序列結(jié)合的互補(bǔ)連接堿基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)稱(chēng)為第1寡核苷酸。
第1寡核苷酸具有第1接合堿基序列，所述第1接合堿基序列是能夠與第2寡核苷酸的互補(bǔ)接合序列互補(bǔ)結(jié)合的接合堿基序列，所述第2寡核苷酸是不與被測(cè)寡核苷酸的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合并且能夠與第1寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
第2寡核苷酸具有第2接合堿基序列，所述第2接合堿基序列是能夠與第3寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的接合堿基序列，所述第3寡核苷酸是不與被測(cè)寡核苷酸和第1接合序列以外的第1寡核苷酸的堿基序列部分互補(bǔ)結(jié)合而能夠與第2寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。將具有含有能夠與第2接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第 2接合堿基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)稱(chēng)為第3寡核苷酸。
同樣地，將具有含有能夠與第N接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第N接合堿基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)稱(chēng)為第(N+1)寡核苷酸。第(N+1)寡核苷酸具有第(N+1)接合堿基序列，所述第(N+1)接合堿基序列是能夠與第(N+幻寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的接合堿基序列，所述第(N+幻接合堿基序列是不與被測(cè)寡核苷酸和第N接合序列以外的、第1寡核苷酸至第N寡核苷酸的寡核苷酸的堿基序列部分互補(bǔ)結(jié)合而能夠與第 (N+1)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。將具有含有能夠與第(N+1) 接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第(N+1)接合堿基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)稱(chēng)為第(N+幻寡核苷酸。
同樣地，將具有含有能夠與第(N-I)接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第 (N-I)接合堿基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)稱(chēng)為第N寡核苷酸。第N寡核苷酸具有第N接合堿基序列，所述第N接合堿基序列是能夠與第(N+1)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的接合堿基序列，所述第(N+1)寡核苷酸是不與被測(cè)寡核苷酸和第(N-I)接合序列以外的、第 1寡核苷酸至第(N-I)寡核苷酸的寡核苷酸的堿基序列部分互補(bǔ)結(jié)合而能夠與第N寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
另外，在不存在第(N+1)寡核苷酸的情況下，將第N寡核苷酸稱(chēng)為末端寡核苷酸， 該第N寡核苷酸可以不具有第N接合堿基序列。
即，本發(fā)明方法中的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的一種形態(tài)，是將第1寡核苷酸至末端寡核苷酸通過(guò)接合堿基序列與互補(bǔ)接合堿基序列的互補(bǔ)結(jié)合連接而成的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。
在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸僅由含有具有多個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化寡核苷酸的第1寡核苷酸形成的情況下，根據(jù)上述，該第1寡核苷酸可以不具有接合堿基序列。
另外，即使不使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸而使用含有僅具有一個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化寡核苷酸的檢測(cè)寡核苷酸，也能夠?qū)颖局兴木哂心繕?biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)。
接合堿基序列與互補(bǔ)接合堿基序列，只要是能使寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列即可，可以位于寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)的末端，也可以位于中間。
另外，第N接合堿基序列優(yōu)選不與互補(bǔ)第N接合堿基序列以外的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合，并且也不妨礙該互補(bǔ)第N接合堿基序列以外的堿基序列的任意互補(bǔ)結(jié)合。另外，第N接合堿基序列優(yōu)選不與互補(bǔ)第N接合堿基序列以外的、包含構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸、樣本中所含的核酸、被測(cè)寡核苷酸及后述的特定寡核苷酸在內(nèi)的其它寡核苷酸的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。
本發(fā)明的方法中，在構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸能夠相互互補(bǔ)地分枝(除串聯(lián)之外)結(jié)合(連接)的情況下(有時(shí)也稱(chēng)為“分枝型”)，構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中，在第N寡核苷酸上可以存在多個(gè)接合堿基序列。例如，在第N寡核苷酸上存在M個(gè)接合堿基序列的情況下，分別將其稱(chēng)為第(N，l)接合堿基序列、第 (N, 2)接合堿基序列、第(N, 3)接合堿基序列、…、第(N, (M-I))接合堿基序列、第(N，M)接合堿基序列，將通過(guò)互補(bǔ)性與這些接合堿基序列結(jié)合的寡核苷酸分別稱(chēng)為第((N+l)，l)寡核苷酸、第((N+l)，2)寡核苷酸、第((N+l)，3)寡核苷酸、…、第((N+l)，(N-I))寡核苷酸、 第((N+1)，M)寡核苷酸。此時(shí)，例如在不存在第((N+2)，l)寡核苷酸的情況下，第((N+1), 1)寡核苷酸為末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+l)，l)接合堿基序列。
同樣地，在第(N，l)寡核苷酸上存在多個(gè)接合堿基序列的情況下，例如在第(N， 1)寡核苷酸上存在L個(gè)接合堿基序列的情況下，將其分別稱(chēng)為第(N，l，l)接合堿基序列、 第(N, 1,2)接合堿基序列、第(N, 1,3)接合堿基序列、…、第(N，l，(L-I))接合堿基序列、 第(N，l，L)接合堿基序列，將通過(guò)互補(bǔ)性與這些接合堿基序列結(jié)合的寡核苷酸分別稱(chēng)為第((N+l)，l，l)寡核苷酸、第((N+l)，l，2)寡核苷酸、第((N+l)，l，3)寡核苷酸、…、第 ((N+l)，l，(L-I))寡核苷酸、第((N+1)，1，L)寡核苷酸。此時(shí)，例如在不存在第((N+2)，l， 1)寡核苷酸的情況下，第((N+l)，l，l)寡核苷酸為末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+1)， 1,1)接合堿基序列。
分枝型的復(fù)合寡核苷酸也包括存在多種第1寡核苷酸且被測(cè)寡核苷酸上結(jié)合多個(gè)第1寡核苷酸的情況。此時(shí)，在被測(cè)寡核苷酸上存在M個(gè)第1寡核苷酸的情況下，只要是具有能夠分別與被測(cè)寡核苷酸上的第1連接序列、第2連接序列…第M連接序列互補(bǔ)結(jié)合的第(1，1)接合序列、第(1，2)接合序列、第(1，3)接合序列…第(1、M)接合序列的第(1， 1)寡核苷酸、第(1，幻寡核苷酸、第(1，；3)寡核苷酸…第(1、M)寡核苷酸即可。
另外，在第1寡核苷酸上存在M個(gè)第2寡核苷酸的情況下，只要是各自具有能夠分別與第ι寡核苷酸上的第1連接序列、第2連接序列…第M連接序列互補(bǔ)結(jié)合的第(2，1)接合序列、第(2，2)接合序列、第(2，3)接合序列…第(2，M)接合序列的第(2，1)寡核苷酸、 第(2，幻寡核苷酸、第(2，；3)寡核苷酸…第(2、M)寡核苷酸即可。
另外，在第N寡核苷酸上存在M個(gè)第N+1寡核苷酸的情況下，只要是各自具有能夠分別與第N寡核苷酸上的第1連接序列、第2連接序列…第M連接序列互補(bǔ)結(jié)合的第(N+1， 1)接合序列、第(N+1,2)接合序列、第(N+1,3)接合序列…第(N+Ι,Μ)接合序列的第(Ν+1，1)寡核苷酸、第(N+1,2)寡核苷酸、第(N+1,3)寡核苷酸…第(N+1、M)寡核苷酸即可。
另外，在第(N，M)寡核苷酸上存在P個(gè)第N+1寡核苷酸的情況下，只要是各自具有分別能夠與第(N，M)寡核苷酸上的第(N+1，M，1)連接序列、第(N+1，M，2)連接序列…第 (N+1，M，P)連接序列互補(bǔ)結(jié)合的第(N+1，M，1)接合序列、第(N+1，M，2)接合序列、第(N+1, M，3)接合序列…第(N+1, M, P)接合序列的第(N+1, M，l)寡核苷酸、第(N+1, M，2)寡核苷酸、第(N+1，M，3)寡核苷酸…第(N+1,M, P)寡核苷酸即可。
另外，在第(Ν，Μ，…，X)寡核苷酸上存在P個(gè)第Ν+1寡核苷酸的情況下，只要是各自具有分別能夠與第(N，Μ，…，X)寡核苷酸上的第(N+Ι,Μ,…，X，l)連接序列、第(Ν+1， Μ，…，Χ，2)連接序列…第(N+Ι,Μ,…，Χ，Ρ)連接序列互補(bǔ)結(jié)合的第(N+Ι,Μ,…，X，l)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，2)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，3)接合序列…第(N+l，Μ，…， Χ，Ρ)接合序列的第(Ν+1，Μ，…，X，l)寡核苷酸、第(Ν+1，Μ，…，X，2)寡核苷酸、第(Ν+1， Μ，…，Χ，3)寡核苷酸…第(Ν+1，Μ，…，X，P)寡核苷酸即可。
如上所述，可以進(jìn)行各種組合來(lái)提高靈敏度，可以根據(jù)檢測(cè)所需的靈敏度或精度來(lái)制備各寡核苷酸、末端寡核苷酸的組合。
在一個(gè)寡核苷酸上存在多個(gè)接合堿基序列的情況下，這些接合堿基序列可以相同，也可以不同。具體而言，例如，前述第(N，l)接合堿基序列、第(Ν，2)接合堿基序列、第 (N, 3)接合堿基序列的堿基序列可以全部相同，也可以是各自不同的堿基序列。連接接合序列與互補(bǔ)連接堿基序列、以及接合堿基序列與互補(bǔ)接合堿基序列，只要是能夠相互互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列即可，具體而言，只要具有90%以上的同源性即可，通常分別為5 lOObp、優(yōu)選10 50bp。接合堿基序列和互補(bǔ)接合堿基序列優(yōu)選以不與基因組互補(bǔ)結(jié)合的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，或者優(yōu)選為人工合成的DNA。為了簡(jiǎn)便地確認(rèn)所設(shè)計(jì)的接合堿基序列和連接堿基序列等不與基因組互補(bǔ)結(jié)合，用PubMeD等公共機(jī)構(gòu)等的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast檢索，確認(rèn)不存在顯示80%以上的同源性的堿基序列即可。
即，“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”通過(guò)連接堿基序列和互補(bǔ)連接堿基序列的互補(bǔ)結(jié)合與被測(cè)寡核苷酸連接，從而形成檢測(cè)復(fù)合物。
檢測(cè)復(fù)合物是一個(gè)被測(cè)寡核苷酸上結(jié)合有檢測(cè)寡核苷酸的復(fù)合物、或多個(gè)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸結(jié)合成的復(fù)合物。多個(gè)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸結(jié)合在一個(gè)被測(cè)寡核苷酸上的情況下，各個(gè)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸可以是相同的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸，或者也可以是不同的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。另外，被測(cè)寡核苷酸上的連接堿基序列，可以是多種連接堿基序列各存在一個(gè)，也可以是一種連接堿基序列存在多個(gè)。
本發(fā)明中的“檢測(cè)復(fù)合物”是指，通過(guò)被測(cè)寡核苷酸的連接堿基序列與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的互補(bǔ)連接堿基序列的互補(bǔ)結(jié)合，將復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與被測(cè)寡核苷酸連接。檢測(cè)復(fù)合物只要具有用于通過(guò)利用后述的識(shí)別功能進(jìn)行檢測(cè)而在后述的第三步驟中對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)的識(shí)別功能、或能夠與具有識(shí)別功能的檢測(cè)分子結(jié)合即可。
“識(shí)別功能”是指能夠?qū)?fù)合檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)或定量的功能。即，識(shí)別功能只要是能夠識(shí)別復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的功能則可以是任意識(shí)別功能，可以列舉例如基于復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的標(biāo)記的識(shí)別功能、或由復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上結(jié)合的檢測(cè)分子賦予檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能。具體而言，可以列舉在構(gòu)成復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的寡核苷酸的5’末端或3’末端進(jìn)行了銪標(biāo)記、膠體金標(biāo)記、乳膠珠標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、熒光物質(zhì)(FITC等)標(biāo)記、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記、堿性磷酸酶標(biāo)記等的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的熒光、發(fā)色等特性。
為了檢測(cè)銪，添加增強(qiáng)溶液(Enhancement Solution) (PerkinElmer公司制)并混合，在室溫下靜置約45分鐘后，用熒光檢測(cè)器測(cè)定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)即可。另夕卜，在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸為甲基化寡核苷酸的情況下，作為檢測(cè)分子，具體可以列舉甲基化 DNA抗體、鋨絡(luò)合物(J. Am. Chem. Soc.，2007 ；129 =5612-5620)等。甲基化復(fù)合寡核苷酸是指具體包含5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤等的復(fù)合寡核苷酸。另外，在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸用FITC標(biāo)記的情況下，作為檢測(cè)分子可以列舉FITC抗體。
在檢測(cè)分子為甲基化DNA抗體的情況下，通過(guò)以下的方法，可以賦予其作為用于定量或檢測(cè)的識(shí)別功能的功能。具體而言，銪標(biāo)記、膠體金標(biāo)記、乳膠珠標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、熒光物質(zhì)(FITC等)標(biāo)記、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記、堿性磷酸酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等標(biāo)記具有熒光、發(fā)色等功能。另外，作為對(duì)這些作為檢測(cè)分子的抗體賦予識(shí)別功能的方法，可以在作為檢測(cè)分子的抗體上直接結(jié)合識(shí)別功能，也可以列舉使具有識(shí)別功能的二次抗體或三次抗體與作為檢測(cè)分子的抗體結(jié)合的方法。具體而言，熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體、生物素標(biāo)記的抗體、銪標(biāo)記的抗體有市售品，因此可以作為二次抗體或三次抗體來(lái)利用。另外，也可以是結(jié)合有能夠通過(guò)酶循環(huán)法檢測(cè)的底物的抗體。作為這些功能的定量或檢測(cè)手段，可以列舉例如利用放射線檢測(cè)器、分光光度計(jì)等進(jìn)行測(cè)定或目測(cè)等。例如，在利用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)或定量的情況下，具體而言在使用附加有銪的二次抗體作為能夠檢測(cè)或定量的功能的情況下，使二次抗體與檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合后，添加增強(qiáng)溶液(PerkinElmer公司制)并混合，在室溫下靜置約45分鐘。然后，用熒光檢測(cè)器測(cè)定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)即可。
在使甲基化DNA抗體與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上的甲基化DNA結(jié)合，并利用其功能進(jìn)行檢測(cè)或定量的情況下，具體而言例如如下操作即可。使甲基化DNA抗體與結(jié)合在支撐體上的檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合后，添加抗甲基化DNA抗體的二次抗體(例如，Eu-Nl標(biāo)記的小鼠IgG 抗體，PerkinElmer公司制)，在室溫下靜置約1小時(shí)，從而促進(jìn)二次抗體在檢測(cè)復(fù)合物上的結(jié)合。然后，添加增強(qiáng)溶液(PerkinElmer公司制)并混合，并在室溫下靜置例如約45分鐘。然后，用熒光檢測(cè)器測(cè)定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)，由此進(jìn)行檢測(cè)或定量。
另外，為與支撐體結(jié)合而使用甲基化DNA抗體的情況下，使用與為與支撐體結(jié)合而使用的甲基化DNA抗體具有不同底物特異性的甲基化DNA抗體作為與該檢測(cè)寡核苷酸的甲基化DNA結(jié)合的檢測(cè)分子。
另外，在用FITC將與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上的甲基化DNA結(jié)合的甲基化DNA抗體進(jìn)行了標(biāo)記的情況下，也可以使用結(jié)合有FITC的抗體作為二次抗體。此時(shí)，也可以通過(guò)公知的方法測(cè)定FITC的熒光，進(jìn)行檢測(cè)或定量，也可以以抗FITC抗體作為二次抗體進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，在檢測(cè)寡核苷酸上直接結(jié)合有FITC的情況下，也可以利用FITC作為識(shí)別功能， 也可以通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的FITC抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的FITC抗體、生物素標(biāo)記的FITC抗體、銪標(biāo)記的FITC抗體等來(lái)賦予標(biāo)記功能。具體而言，作為復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸，在使用FITC標(biāo)記的寡核苷酸作為復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的情況下，將包含該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合到支撐體上后，添加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體(例如，HRP標(biāo)記的FITC抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司制))，在室溫下靜置約1 小時(shí) 2小時(shí)，從而促進(jìn)FITC抗體與結(jié)合在支撐體上的檢測(cè)復(fù)合物的結(jié)合。然后，將FITC 抗體溶液洗滌除去后，添加適當(dāng)?shù)牡孜?例如，底物試劑包#DY999，R&D SYSTEMS公司制) 并混合。在室溫下靜置約5 60分鐘后，添加終止溶液ON H2SO4水溶液)，使辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的反應(yīng)停止，反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測(cè)定450nm的吸光度即可。
將被測(cè)寡核苷酸固定在支撐體上時(shí)未使用生物素的情況下，檢測(cè)或定量中可以使用生物素化檢測(cè)寡核苷酸。對(duì)生物素化的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)或定量的情況下，例如，將 HRP標(biāo)記的鏈霉親和素添加到固定在支撐體上的檢測(cè)復(fù)合物中并混合，形成生物素化檢測(cè)寡核苷酸與HRP標(biāo)記的鏈霉親和素的結(jié)合物并分離后，通過(guò)公知的方法測(cè)定HRP的活性，由此可以對(duì)生物素化甲基化DNA抗體進(jìn)行檢測(cè)或定量。
另外，作為識(shí)別功能，可以利用酶循環(huán)法等高靈敏度檢測(cè)法中使用的底物等。具體而言，以結(jié)合有酶循環(huán)法中使用的酶的抗體作為檢測(cè)分子，使其與檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合即可。另外，作為本發(fā)明中賦予檢測(cè)分子的識(shí)別功能，不限于上述的方法。
“檢測(cè)分子”只要具有對(duì)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)或定量的性質(zhì)即可。另外，檢測(cè)分子可以識(shí)別復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)序列，也可以預(yù)先結(jié)合在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上。 即，檢測(cè)分子只要具有與檢測(cè)寡核苷酸特異性結(jié)合的性質(zhì)，并且具有能夠用于定量或檢測(cè)的功能、特性即“識(shí)別功能”或能夠被賦予識(shí)別功能即可。具體而言，在檢測(cè)序列為甲基化寡核苷酸的情況下，檢測(cè)分子只要是與該甲基化寡核苷酸結(jié)合從而能夠檢測(cè)該甲基化寡核苷酸的檢測(cè)分子即可，只要是與該甲基化寡核苷酸特異性結(jié)合而顯示識(shí)別功能的檢測(cè)分子即可。(其中，在為了與支撐體結(jié)合而使用甲基化DNA抗體的情況下，使用與為了與支撐體結(jié)合而使用的甲基化DNA抗體具有不同底物特異性的甲基化DNA抗體作為與該檢測(cè)寡核苷酸的甲基化DNA結(jié)合的檢測(cè)分子)。此外，例如，檢測(cè)分子可以是甲基化DNA抗體。另外，在檢測(cè)序列為檢測(cè)分子本身的情況下，為了對(duì)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，可以不添加新的檢測(cè)分子，通過(guò)對(duì)檢測(cè)寡核苷酸中結(jié)合的檢測(cè)分子進(jìn)行檢測(cè)，可以進(jìn)行該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)。
本發(fā)明方法中的“檢測(cè)序列”是指，用于使檢測(cè)分子與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸結(jié)合的堿基序列。
檢測(cè)序列只要是不與接合序列、互補(bǔ)接合序列等與本發(fā)明方法中的檢測(cè)復(fù)合物的形成有關(guān)的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的序列即可，可以是合成的堿基序列，也可以與自然界中存在的堿基序列具有同源性，只要以能夠使檢測(cè)分子與檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合的形式存在即可。
例如，具體而言，檢測(cè)序列可以存在于全部復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸中，也可以僅存在于檢測(cè)復(fù)合物中所含的特定的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸中。
本發(fā)明中，“甲基化DNA抗體”是指以DNA中的甲基化的堿基為抗原進(jìn)行結(jié)合的抗體。具體而言，可以列舉作為甲基胞嘧啶抗體、具有識(shí)別單鏈DNA中的5位被甲基化的胞嘧啶并與之結(jié)合的性質(zhì)的抗體。另外，只要是特異性識(shí)別本說(shuō)明書(shū)記載的甲基化狀態(tài)的DNA 并能夠特異性結(jié)合的抗體即可，也可以使用市售的甲基化DNA抗體。甲基化DNA抗體可以以甲基化的堿基、甲基化DNA等為抗原，通過(guò)通常的方法制作。具體而言，為了制作甲基胞嘧啶抗體，可以通過(guò)從以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或者含有5-甲基胞嘧啶的DNA 等為抗原而制作的抗體中，以該抗體與DNA中的甲基胞嘧啶的特異性結(jié)合為指標(biāo)進(jìn)行挑選來(lái)制作。另外，從這樣的固定化甲基化DNA抗體的性質(zhì)(1個(gè)甲基化的堿基(胞嘧啶)上結(jié)合1個(gè)抗體)來(lái)考慮，優(yōu)選挑選存在數(shù)量較多的甲基化的堿基(胞嘧啶)即CpG的區(qū)域作為目標(biāo)DNA區(qū)域，并且可以期待定量精度和檢測(cè)靈敏度的提高。
作為使動(dòng)物接觸抗原而得到的抗體，有用從動(dòng)物純化得到的抗原進(jìn)行免疫后，利用IgG級(jí)分(fraction)的抗體(多克隆抗體)的方法和利用生產(chǎn)單一克隆的抗體(單克隆抗體)的方法。本發(fā)明中優(yōu)選為能夠特異性識(shí)別甲基化DNA或甲基胞嘧啶的抗體，因而優(yōu)選利用單克隆抗體。
作為制作單克隆抗體的方法，可以列舉利用細(xì)胞融合法的方法。例如，細(xì)胞融合法是通過(guò)使來(lái)自于免疫小鼠的脾細(xì)胞(B細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合來(lái)制作雜交瘤，挑選雜交瘤所生產(chǎn)的抗體，從而能夠制作甲基胞嘧啶抗體(單克隆抗體)。在通過(guò)細(xì)胞融合法制作單克隆抗體的情況下，不需要純化抗原，例如，可以以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等的混合物作為抗原，施用于免疫所用的動(dòng)物。作為施用方法，將5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接施用于產(chǎn)生抗體的小鼠。在難以產(chǎn)生抗體的情況下，也可以使抗原與支撐體結(jié)合而進(jìn)行免疫。另外， 通過(guò)將佐劑溶液(例如，將液體石蠟與Aracel A混合并混合結(jié)核桿菌的死菌作為佐劑而得到的溶液)與抗原混合施用、或?qū)⒖乖盏胶颂求w中來(lái)免疫，能夠提高抗原的免疫性?；蛘撸€有等量添加含有抗原的溶液與佐劑溶液，充分形成乳液狀后，注射到小鼠的皮下或腹腔內(nèi)的方法；或與明礬水充分混合后添加百日咳死菌作為佐劑的方法。另外，也可以在初次免疫后間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，向小鼠的腹腔內(nèi)或靜胍內(nèi)進(jìn)行追加免疫。另外，抗原的量較少的情況下，可以將懸浮有抗原的溶液直接注入小鼠脾臟內(nèi)來(lái)進(jìn)行免疫。自末次免疫起數(shù)天后摘取脾臟并剝離脂肪組織后，制作脾細(xì)胞懸浮液。將該脾細(xì)胞與例如HGPRT缺陷骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，從而制作雜交瘤。作為細(xì)胞融合劑，只要是能夠使脾細(xì)胞(B細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞有效融合的方法則可以是任何方法，可以列舉例如使用仙臺(tái)病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，也可以通過(guò)使用高壓脈沖的方法進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合操作后，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的雜交瘤的克隆，等待細(xì)胞生長(zhǎng)到能夠進(jìn)行篩選的程度。作為用于選擇生產(chǎn)目標(biāo)抗體的雜交瘤的抗體檢測(cè)方法或抗體效價(jià)的測(cè)定方法，可以利用抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)。具體而言，在抗可溶性抗原的抗體的測(cè)定方法中，可以列舉放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶聯(lián)免疫定量法(ELISA)等。
“互補(bǔ)結(jié)合”是指，通過(guò)堿基之間利用氫鍵進(jìn)行的堿基配對(duì)，使兩條單鏈DNA或者單鏈DNA與RNA形成雙鏈DNA或者由DNA與RNA構(gòu)成的雜合雙鏈。例如，構(gòu)成單鏈DNA的堿基通過(guò)與構(gòu)成其它單鏈DNA的堿基之間產(chǎn)生嘌呤與嘧啶的堿基配對(duì)，使這些單鏈DNA形成雙鏈DNA，更具體而言，是指通過(guò)多個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的利用氫鍵進(jìn)行的堿基結(jié)合，形成雙鏈DNA。另外，例如，構(gòu)成單鏈DNA的堿基通過(guò)與構(gòu)成RNA的堿基之間產(chǎn)生嘌呤與嘧啶的堿基配對(duì)，使這些單鏈DNA與RNA形成雙鏈，更具體而言，是指通過(guò)多個(gè)連續(xù)的尿嘧啶與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的利用氫鍵進(jìn)行的堿基結(jié)合，形成雜合雙鏈。
“互補(bǔ)結(jié)合”有時(shí)也記作“通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)進(jìn)行的結(jié)合”、“互補(bǔ)的堿基配對(duì)”或 “通過(guò)互補(bǔ)性而結(jié)合”。另外，能夠互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列有時(shí)也記作相互“具有互補(bǔ)性”、“為互補(bǔ)性”。人工制作的寡核苷酸中所含的次黃嘌呤通過(guò)氫鍵與胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶的結(jié)合也包括在互補(bǔ)性結(jié)合中?！昂邢鄬?duì)于目標(biāo)DNA區(qū)域?yàn)榛パa(bǔ)性的堿基序列的單鏈DNA”是指，為了與含有目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈DNA形成結(jié)合物(雙鏈)所需的堿基序列，即，含有與目標(biāo)DNA區(qū)域的堿基序列的一部分互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列，有時(shí)也記作“互補(bǔ)堿基序列”。
“顯示同源性的堿基序列”是指具有序列同源性的堿基序列。本發(fā)明中，在未記載序列同源性的比率的情況下，是指具有75%以上、優(yōu)選80%以上的序列同源性的堿基序列。具體而言，“與序列號(hào)1顯示同源性的堿基序列”是指，與序列號(hào)1的堿基序列或序列號(hào) 1的部分序列具有75%以上的序列同源性的堿基序列，優(yōu)選具有80%以上的序列同源性的堿基序列。
第二步驟中，檢測(cè)復(fù)合物被固定于支撐體上。將檢測(cè)復(fù)合物固定于支撐體上時(shí)，可以通過(guò)預(yù)先將所得的被測(cè)寡核苷酸的5’末端或3’末端生物素化并實(shí)施與上述同樣的方法，使其直接結(jié)合到支撐體上。
例如，可以將生物素標(biāo)記的被測(cè)寡核苷酸固定于鏈霉親和素標(biāo)記的抗體上。該情況下，利用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行定量或檢測(cè)，就變成對(duì)鏈霉親和素標(biāo)記的抗體進(jìn)行定量或檢測(cè)。即，在被測(cè)寡核苷酸為人工合成的寡核苷酸的情況下， 能夠用于固定被測(cè)寡核苷酸的對(duì)象(即支撐體)的定量或檢測(cè)。
作為將本發(fā)明中的“被測(cè)寡核苷酸”固定化的支撐體，不僅可以檢測(cè)DNA、RNA，也可以是抗體等蛋白質(zhì)。例如，在“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”含有甲基化寡核苷酸的情況下，由于“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”上能夠結(jié)合多個(gè)甲基化DNA抗體，因此，能夠以與甲基化DNA抗體的結(jié)合數(shù)相關(guān)的檢測(cè)靈敏度來(lái)檢測(cè)支撐體。通常在抗體等的檢測(cè)中，一個(gè)抗體分子對(duì)應(yīng)一個(gè)標(biāo)記分子(HRP、FITC等)，因此通過(guò)本發(fā)明可以期待高靈敏度化。另外，在甲基化寡核苷酸含有 5-甲基胞嘧啶的情況下，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸能夠被鋨絡(luò)合物識(shí)別，因此，可以期待與“復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸”中所含的5-甲基胞嘧啶數(shù)相關(guān)的檢測(cè)靈敏度的高靈敏度化。
具體而言，在將含有使用至第3寡核苷酸的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與被測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物通過(guò)生物素化特定寡核苷酸固定于支撐體上的情況下，在包含被測(cè)寡核苷酸的基因組DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因組DNA的情況下，優(yōu)選預(yù)先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，將DNA片段化)中，加入通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合的第2寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通過(guò)互補(bǔ)性與第2寡核苷酸結(jié)合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ,此時(shí)第3寡核苷酸成為末端寡核苷酸)、不妨礙該被測(cè)寡核苷酸與該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合并且與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的生物素化特定寡核苷酸(0. 02 μ Μ)各5 μ L，再加入IOOmM的MgCl2 20 μ L以及最適 IOX 緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ 1，然后向該混合物中加入滅菌超純水使液量為10(^。在951加熱10分鐘，在 70°C保溫10分鐘，在50°C保溫10分鐘后，在37°C進(jìn)行10分鐘冷卻處理，得到檢測(cè)復(fù)合物與特定寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的特定檢測(cè)復(fù)合物。將這樣形成的特定檢測(cè)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到鏈霉親和素培養(yǎng)皿中，在室溫下靜置30分鐘即可。然后，進(jìn)行殘留溶液的除去和洗滌。以 200 μ L/孔的比例添加洗滌緩沖液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重復(fù)數(shù)次該洗滌操作，殘留(選擇) 通過(guò)特定寡核苷酸結(jié)合在鏈霉親和素培養(yǎng)皿上的檢測(cè)復(fù)合物。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一個(gè)以上的寡核苷酸必須為甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均為甲基化寡核苷酸。上述中，說(shuō)明了使用至第3寡核苷酸的情況，在使用至第N 寡核苷酸的情況下通過(guò)與上述同樣的方法實(shí)施即可。將被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物固定化 (選擇)時(shí)，只要最終形成被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物并將其固定化(選擇)即可，因此，雖然上述方法中是同時(shí)添加被測(cè)寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸、甲基化寡核苷酸(復(fù)合物)而獲得該復(fù)合物，然后使用生物素化特定寡核苷酸進(jìn)行固定(選擇)，但對(duì)其順序并沒(méi)有特別限制。即，也可以先將生物素化特定寡核苷酸固定于鏈霉親和素培養(yǎng)皿上，然后，添加被測(cè)寡核苷酸和甲基化寡核苷酸(復(fù)合物)而獲得被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物，從而進(jìn)行固定(選擇)。
另外，洗滌緩沖液只要適于將溶液中漂浮的單鏈DNA等除去即可，不限于上述洗滌緩沖液，可以是DELFIA緩沖液(PerkinElmer公司制、含Tween 80的Tris-HCl、pH 7.8)、 TE緩沖液等。
作為“支撐體”，只要是檢測(cè)復(fù)合物能夠結(jié)合的支撐體，則材質(zhì)、形狀沒(méi)有特別限制。例如，形狀適合使用目的即可，可以列舉管狀、檢測(cè)板狀、過(guò)濾器狀、盤(pán)狀、珠狀等。另外， 材質(zhì)可以是通常的免疫測(cè)定法用支撐體所用的材質(zhì)，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龍等合成樹(shù)脂、或者在所述合成樹(shù)脂中引入磺基、氨基等反應(yīng)性官能團(tuán)而得到的物質(zhì)。另外，也可以是玻璃、多糖類(lèi)或其衍生物(纖維素、硝酸纖維素等)、硅膠、多孔陶瓷、金屬氧化物等。另外，支撐體可以是膠體金(金納米粒子)、乳膠珠。另外，支撐體也可以是作為生物分子的蛋白質(zhì)、抗體、脂質(zhì)等生物分子、寡核苷酸。
第二步驟中的“使檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上”時(shí)，可以通過(guò)使該被測(cè)寡核苷酸與不妨礙其與該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合且與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合、并且能夠與支撐體結(jié)合的特定寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，將檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上。使特定寡核苷酸與支撐體結(jié)合時(shí)，特定寡核苷酸只要具有與支撐體結(jié)合的功能和能夠與被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的序列即可。
作為本發(fā)明的第二步驟中的“形成檢測(cè)復(fù)合物”的方法，具體而言，例如，在獲得含有使用至第3寡核苷酸的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與被測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物的情況下，在包含被測(cè)寡核苷酸的基因組DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因組DNA的情況下，優(yōu)選預(yù)先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，將DNA片段化)中，加入通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合的第2寡核苷酸水溶液 (0. 02 μ Μ)和通過(guò)互補(bǔ)性與第2寡核苷酸結(jié)合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ,此時(shí)第3 寡核苷酸成為末端寡核苷酸)各5 μ L，再加入IOOmM的MgCl2 20 μ L以及最適IOX緩沖液 (330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ 1，然后向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100μ L，在95°C加熱10分鐘，在70°C保溫10分鐘， 在50°C保溫10分鐘后，在37°C進(jìn)行10分鐘冷卻處理即可。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一個(gè)以上的寡核苷酸必須為甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均為甲基化寡核苷酸。上述中，說(shuō)明了使用至第3寡核苷酸的情況，在使用至第N寡核苷酸的情況下通過(guò)與上述同樣的方法實(shí)施即可。
本發(fā)明中的“特定寡核苷酸”是指，具有能夠通過(guò)互補(bǔ)性與包含目標(biāo)DNA區(qū)域的 DNA結(jié)合的堿基序列的寡核苷酸，并且，只要具有與支撐體結(jié)合的功能即可。具體而言，具有與包含目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA互補(bǔ)結(jié)合的特定接合序列，且與上述支撐體結(jié)合。另外，“特定寡核苷酸”優(yōu)選不妨礙復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與被測(cè)寡核苷酸的結(jié)合，并且優(yōu)選不妨礙復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的形成。并且，優(yōu)選不與樣本中所含的核酸或其它寡核苷酸的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。
“特定接合序列”是指，含有與具有目標(biāo)DNA區(qū)域的堿基序列(被測(cè)寡核苷酸)互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。特定接合序列能夠配對(duì)的被測(cè)寡核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列，與特定接合序列的堿基序列具有75%以上、優(yōu)選90%以上的同源性。特定接合序列的堿基序列的長(zhǎng)度為5bp lOObp、優(yōu)選IObp 50bp即可。另外，特定接合序列不妨礙檢測(cè)用接合序列與目標(biāo)DNA區(qū)域的結(jié)合即可。另外，“特定接合序列”優(yōu)選為與基因組中的重復(fù)序列結(jié)合的堿基序列，更優(yōu)選在同一重復(fù)序列中設(shè)計(jì)有檢測(cè)用接合序列的堿基序列。另外，在同一重復(fù)序列中設(shè)計(jì)的檢測(cè)用接合序列和特定接合序列優(yōu)選不妨礙彼此與被測(cè)寡核苷酸的結(jié)合。
為了將特定寡核苷酸固定在支撐體上，具體而言，可以列舉將特定寡核苷酸的5’ 末端或3’末端生物素化而得到的生物素化寡核苷酸固定于用鏈霉親和素包被的支撐體 (例如，用鏈霉親和素包被的PCR管、用鏈霉親和素包被的磁珠、用鏈霉親和素部分包被的層析條等)上的方法。
也有在特定寡核苷酸的5’末端或3’末端共價(jià)結(jié)合具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能團(tuán)的分子后，使其與表面經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑等活化的玻璃、多糖類(lèi)衍生物、硅膠、或前述合成樹(shù)脂等、或耐熱性塑料制的支撐體共價(jià)結(jié)合的方法。另外，對(duì)于共價(jià)結(jié)合，例如，通過(guò)5 個(gè)甘油三酯串聯(lián)連接而成的間隔物、交聯(lián)劑等進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。另外，還可以列舉在玻璃或硅制的支撐體上直接自特定寡核苷酸的末端側(cè)進(jìn)行化學(xué)合成的方法。
第三步驟是利用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)第二步驟中形成的檢測(cè)復(fù)合物中所含的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)的步驟。
作為本發(fā)明的第三步驟中的“利用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)檢測(cè)復(fù)合物中所含的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)”的方法，例如，(1)利用甲基化寡核苷酸作為被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸的情況下，使可與甲基化DNA抗體結(jié)合的銪(以下有時(shí)也記作“Eu”)標(biāo)記的抗體 (二次抗體)與結(jié)合有檢測(cè)復(fù)合物的鏈霉親和素培養(yǎng)皿結(jié)合，添加增強(qiáng)溶液(Perkin Elmer 公司制)后，在激發(fā)340nm/熒光612nm下測(cè)定熒光即可。也可以使用FITC標(biāo)記代替Eu標(biāo)記。另外，也可以使FITC標(biāo)記的抗體(二次抗體)進(jìn)一步與HRP標(biāo)記的FITC抗體結(jié)合，并利用HRP的酶活性進(jìn)行檢測(cè)。在利用HRP的酶活性進(jìn)行檢測(cè)的情況下，添加底物(R&D公司、#DY999)并在室溫下孵育，然后添加終止溶液(1M KSO4JOyL/孔)，測(cè)定450nm(參比值650nm)的吸光即可。
(2)例如，在前述的方法具體例中得到的結(jié)合在鏈霉親和素培養(yǎng)皿上的檢測(cè)復(fù)合物中添加適當(dāng)量(例如，4 μ g/mL溶液、100 μ L/孔)的甲基化DNA抗體，然后，在室溫下靜置例如約3小時(shí)，促進(jìn)甲基化DNA抗體與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸中所含的甲基化DNA的結(jié)合。 然后，進(jìn)行殘留溶液的除去和洗滌。以例如300 μ L/孔的比例添加洗滌緩沖液(例如，含 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7·4))，并除去溶液。重復(fù)數(shù)次該洗滌操作，使結(jié)合有甲基化DNA抗體的檢測(cè)復(fù)合物殘留在孔上。另外，洗滌緩沖液只要適于將上述的游離的甲基化DNA抗體、溶液中漂浮的單鏈DNA等除去即可，不限于上述洗滌緩沖液，也可以是DELFIA緩沖液(PerkinElmer公司制、含Tween 80的 Tris-HCUpH 7. 8)、TE 緩沖液等。
(3)例如，在鏈霉親和素培養(yǎng)皿的各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology 公司制、0· 5μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImMKH2PO4、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]100 μ L，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，通過(guò)移液操作去除溶液，將各孔用 200 μ L 洗滌緩沖液[含 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl pH7. 4)]洗滌3次。再添加抗甲基化DNA抗體的二次抗體(例如，Eu-Nl標(biāo)記的小鼠IgG抗體，PerkinElmer公司制)，在室溫下靜置約1小時(shí)，促進(jìn)二次抗體與復(fù)合物的結(jié)合。然后，添加增強(qiáng)溶液(PerkinElmer公司制)并混合，并在室溫下靜置例如約45分鐘。然后，用熒光檢測(cè)器測(cè)定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)，由此對(duì)甲基化DNA抗體進(jìn)行檢測(cè)或定量。
或者，在鏈霉親和素培養(yǎng)皿上結(jié)合的檢測(cè)復(fù)合物中，以IOOyL/孔的比例添加調(diào)節(jié)為2 μ g/mL的FITC標(biāo)記的小鼠IgG抗體(山羊)作為二次抗體，在室溫下靜置1小時(shí)后，除去殘留溶液，以200 μ L/孔的比例添加洗滌緩沖液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重復(fù)數(shù)次該洗滌操作。再以100 μ L/孔的比例在鏈霉親和素包被的培養(yǎng)皿中添加抗FITC的三次抗體 (例如，HRP 標(biāo)記的 FITC 抗體，Jackson ImmunoResearchLaboratories 公司制)，并在室溫下孵育。以200 μ L/孔的比例添加洗滌緩沖液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4、3mMNa2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重復(fù)數(shù)次該洗滌操作。以 100 μ L/孔的比例添加底物(R&D公司、#DY999)，并攪拌約10秒鐘。在室溫下孵育，添加終止溶液(1M H2SO4,50 μ L/孔)，并攪拌約10秒鐘。在30分鐘以內(nèi)測(cè)定450nm(參比值650nm) 的吸光(優(yōu)選避光)。
本發(fā)明中，作為對(duì)具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA進(jìn)行定量或檢測(cè)的方法，首先，從生物來(lái)源樣本獲取具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA即可。
例如，具體而言，為了從生物來(lái)源樣本獲得RNA，使用例如市售的RNA抽提用試劑盒等抽提RNA即可。
接著，使和能夠與具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA互補(bǔ)結(jié)合的被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合物，固定在該支撐體上，利用被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能進(jìn)行檢測(cè)即可。為了使含有該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA與該被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上，在形成該檢測(cè)復(fù)合物時(shí)添加能夠與構(gòu)成檢測(cè)復(fù)合物的該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA互補(bǔ)結(jié)合、并且具有與支撐體結(jié)合的功能的特定寡核苷酸，形成含有該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA、該被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸和該特定寡核苷酸的復(fù)合物，并固定在支撐體上即可。
為了“形成含有該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA、該被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸和該特定寡核苷酸的復(fù)合物”，例如，使從生物來(lái)源樣本中抽提的RNA形成下述檢測(cè)復(fù)合物與生物素化特定寡核苷酸構(gòu)成的復(fù)合物而固定在支撐體上即可，所述檢測(cè)復(fù)合物由第1寡核苷酸至第3寡核苷酸所形成的“直鏈型”的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA互補(bǔ)結(jié)合而成。具體而言，在包含該RNA的水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，用不含RNA酶的水溶液制備。具體而言，使用在120個(gè)氣壓下處理20分鐘后的水等，制備水溶液等)中，添加通過(guò)互補(bǔ)性與該RNA結(jié)合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合的第2寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通過(guò)互補(bǔ)性與第2寡核苷酸結(jié)合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ, 此時(shí)，第3寡核苷酸成為末端寡核苷酸)、不妨礙該RNA與該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合且與該RNA互補(bǔ)結(jié)合的生物素化特定寡核苷酸(0. 02 μ Μ)各5 μ L，使用所得的溶液制備混合液 (包含50%甲酰胺、5XSSC(150mM的NaCl、15mM的檸檬酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(ρΗ7· 6)、 5 X Denhardt，s液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml的變性剪切鮭魚(yú)精子DNA)，將該混合液的液量調(diào)節(jié)為100μ L，在95°C加熱10分鐘，在70°C保溫10分鐘，在50°C保溫10分鐘后，在 37°C進(jìn)行10分鐘冷卻處理，得到檢測(cè)復(fù)合物與特定寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的特定檢測(cè)復(fù)合物。另外，該混合液為一般的雜交溶液，是Molecular Cloning,A Laboratory Manual (分子克隆試驗(yàn)指南)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989)中記載的公知的雜交方法中使用的溶液。
為了使“含有該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA、該被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸和該特定寡核苷酸的復(fù)合物"‘固定在支撐體上”，具體而言，使生物素化特定寡核苷酸和由第1寡核苷酸至第3 寡核苷酸形成的“直鏈型”的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA互補(bǔ)結(jié)合而成的檢測(cè)復(fù)合物互補(bǔ)結(jié)合，將所得的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到鏈霉親和素培養(yǎng)皿中，在室溫下靜置30分鐘即可。然后，進(jìn)行殘留溶液的除去和洗滌。以200 μ L/孔的比例添加洗滌緩沖液[例如， 含有 0.05%Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]，并除去溶液。重復(fù)數(shù)次該洗滌操作，殘留(選擇)通過(guò)特定寡核苷酸結(jié)合在鏈霉親和素培養(yǎng)皿上的檢測(cè)復(fù)合物。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一個(gè)以上的寡核苷酸必須為甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均為甲基化寡核苷酸。上述中，說(shuō)明了使用至第3寡核苷酸的情況，在使用至第N寡核苷酸的情況下通過(guò)與上述同樣的方法實(shí)施即可。將被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物固定化(選擇)時(shí)，只要最終形成被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物并將其固定化(選擇)即可，因此，雖然上述方法中是同時(shí)添加被測(cè)寡核苷酸、 生物素化特定寡核苷酸、甲基化寡核苷酸(復(fù)合物)而獲得該復(fù)合物，然后使用生物素化特定寡核苷酸進(jìn)行固定(選擇)，但其順序并沒(méi)有特別限制。即，也可以先將生物素化特定寡核苷酸固定于鏈霉親和素培養(yǎng)皿上，然后，添加被測(cè)寡核苷酸和甲基化寡核苷酸(復(fù)合物) 而獲得被測(cè)甲基化寡核苷酸復(fù)合物，從而進(jìn)行固定(選擇)。
本發(fā)明中，作為對(duì)具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA進(jìn)行定量或檢測(cè)的方法，為了對(duì)“使生物素化特定寡核苷酸與由所述第1寡核苷酸至第3寡核苷酸所形成的“直鏈型”的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與該具有目標(biāo)RNA區(qū)域的RNA互補(bǔ)結(jié)合而成的檢測(cè)復(fù)合物互補(bǔ)結(jié)合而得到的復(fù)合物”進(jìn)行定量或檢測(cè)，利用被測(cè)檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能即可。具體而言，在鏈霉親和素培養(yǎng)皿的各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/mL含0. 1 % BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20U54mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，通過(guò)移液操作去除溶液，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。再添加抗甲基化DNA抗體的二次抗體(例如，Eu-m標(biāo)記的小鼠IgG抗體，PerkinElmer公司制)， 在室溫下靜置約1小時(shí)，促進(jìn)二次抗體與復(fù)合物的結(jié)合。然后，添加增強(qiáng)溶液(PerkinElmer 公司制)并混合，并在室溫下靜置例如約45分鐘。然后，用熒光檢測(cè)器測(cè)定熒光(激發(fā) 340nm/熒光612nm)，由此對(duì)甲基化DNA抗體進(jìn)行檢測(cè)或定量，從而能夠得到生物來(lái)源樣本中所含的、該RNA的目標(biāo)區(qū)域的相關(guān)測(cè)定值。
本發(fā)明可以用于下述場(chǎng)合。
各種疾病中，通過(guò)對(duì)與各種疾病的程度顯示相關(guān)性的RNA本身、以該RNA為模板制作的DNA或與各種疾病的程度顯示相關(guān)性的DNA等進(jìn)行定量或檢測(cè)，能夠推測(cè)各種疾病的程度。例如，在癌癥等的診斷中，通過(guò)血液中的游離DNA的定量，可以作為定期體檢中的篩選檢查來(lái)利用。在感染癥等中，通過(guò)對(duì)致病的細(xì)菌、病毒的DNA、RNA、以該RNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄酶制作的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)，能夠確定病原菌或致病病毒。另外，對(duì)于迄今為止由于微量而需實(shí)施PCR等將DNA擴(kuò)增后再進(jìn)行檢測(cè)的DNA、或利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的RNA等，通過(guò)本發(fā)明即使不進(jìn)行PCR等繁雜的方法也能夠檢測(cè)DNA。另外，即使不用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA也能夠進(jìn)行RNA的定量或檢測(cè)。
作為血液、尿等生物試樣中所含的微量物質(zhì)的檢測(cè)或定量方法，通用免疫學(xué)測(cè)定方法。該免疫學(xué)測(cè)定方法中，利用層析法的所謂免疫層析法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)所需的時(shí)間也短，因此，目前廣泛用于例如醫(yī)院的臨床檢查、研究室的檢驗(yàn)試驗(yàn)等多種場(chǎng)合。另外，近年來(lái)，開(kāi)始使用通過(guò)將標(biāo)記的DNA(基因)在層析條上展開(kāi)，并使用能夠捕獲目標(biāo)DNA(基因) 的探針進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA(基因)的、所謂的雜交層析法。該方法也操作簡(jiǎn)便，檢驗(yàn)所需的時(shí)間也短，因此目前開(kāi)始廣泛用于醫(yī)院的臨床檢查、研究室的檢驗(yàn)試驗(yàn)等場(chǎng)合。本發(fā)明測(cè)定方法中，在概念上使上述的免疫層析法與雜交層析法的混合方法成為可能。本發(fā)明的測(cè)定方法中，關(guān)于復(fù)合物形成和復(fù)合物獲取的順序沒(méi)有特別限制，因此可以使用各種方法。 具體而言，例如如下實(shí)施即可。
例如，在剛結(jié)束第二步驟后的試樣中添加生物素化特定寡核苷酸和具有識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸，使包含目標(biāo)DNA區(qū)域的甲基化的單鏈DNA、具有識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸與生物素化特定寡核苷酸結(jié)合，形成包含目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈DNA、具有識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸與生物素化特定寡核苷酸結(jié)合而成的檢測(cè)復(fù)合物。將所得的試樣滴加(導(dǎo)入)到層析條的導(dǎo)入部時(shí)，所述復(fù)合物由于毛細(xì)管現(xiàn)象沿展開(kāi)部移動(dòng)，并被預(yù)先用鏈霉親和素包被的部分捕獲。然后，基于檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)所得的復(fù)合物中所含的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)或定量，由此能夠?qū)哂心繕?biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行檢測(cè)或定量。
也可以使目標(biāo)DNA區(qū)域中存在多個(gè)檢測(cè)部位(使用分別能夠與不同的目標(biāo)DNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的檢測(cè)寡核苷酸)，依次檢測(cè)或定量各目標(biāo)DNA區(qū)域，另外，為了與多個(gè)目標(biāo)DNA 區(qū)域形成復(fù)合物，使用同時(shí)檢測(cè)基因組中的重復(fù)序列、重復(fù)基因或多個(gè)不同基因的、能夠與多個(gè)目標(biāo)DNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的檢測(cè)寡核苷酸，也能夠飛躍性地提高檢測(cè)靈敏度。另外，在一個(gè)目標(biāo)區(qū)域中設(shè)計(jì)多數(shù)的檢測(cè)寡核苷酸，將它們用于支撐體一側(cè)或檢測(cè)一側(cè)，也能夠飛躍性地提高檢測(cè)靈敏度。
作為實(shí)施使檢測(cè)寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸及目標(biāo)DNA區(qū)域或目標(biāo)RNA區(qū)域形成復(fù)合物并結(jié)合到支撐體上的過(guò)程的方法，并不限于前述的方法，只要是使用免疫抗體法的方法即可。例如，在ELISA法中，使用與層析條法同樣的原理，因而可以按照記載的順序?qū)嵤┬纬蓮?fù)合物并結(jié)合到支撐體上的過(guò)程。
這樣的本發(fā)明中的甲基化寡核苷酸等，作為檢測(cè)用試劑盒的試劑有用。另外，本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍也包括利用該方法的實(shí)質(zhì)性原理而得到的前述那樣的檢測(cè)用試劑盒等形態(tài)的應(yīng)用。
從數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的堿基序列中，可以查找微生物特有的堿基序列。例如，如果是 PubMed等公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的堿基序列，則可以通過(guò)通常的手續(xù)獲得，獲得的堿基序列通過(guò)按照通常的手續(xù)用Blast進(jìn)行檢索，能夠研究其是否為特有的堿基序列。另外，特有的堿基序列是指，檢測(cè)對(duì)象的堿基序列不具有與檢測(cè)對(duì)象微生物以外的生物來(lái)源的堿基序列顯示同源性的堿基序列。
特別是在樣本為人體活檢樣品的情況下，設(shè)計(jì)不與人基因互補(bǔ)結(jié)合的特定寡核苷酸是很重要的。另外，同樣地，在樣本為食品的情況下，設(shè)計(jì)不與食品中所含的檢測(cè)對(duì)象以外的生物來(lái)源的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的接合用堿基序列、特定堿基序列是很重要的。
在想要研究某個(gè)區(qū)域中的重復(fù)序列的情況下，難以用PubMed等一般的序列檢索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，通常使用 Repbase (www. girinst. org/repbase/)、RepeatMasker (www. repeatmasker. org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)即可。如果設(shè)定本發(fā)明的特定接合序列和檢測(cè)用接合序列， 則能夠提高檢測(cè)靈敏度。另外，這些重復(fù)序列的測(cè)定例如可以作為血液中的游離DNA量的替代標(biāo)志物來(lái)處理，在關(guān)注于生物種類(lèi)特異性的重復(fù)序列的情況下，可以用于生物種類(lèi)的確定等。
本發(fā)明方法中的“使用了復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的樣本的標(biāo)記方法”是指，通過(guò)結(jié)合由多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸來(lái)對(duì)被測(cè)寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記的方法。例如，利用檢測(cè)甲基化DNA作為復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能的方法的情況下，理論上可以在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上無(wú)上限地設(shè)計(jì)甲基化DNA，因此，可以期待與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸上設(shè)計(jì)的甲基化DNA數(shù)相關(guān)的檢測(cè)靈敏度的增加。本發(fā)明的方法包含通過(guò)像這樣使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸來(lái)增加檢測(cè)靈敏度的方法。
檢測(cè)寡核苷酸可以含有1個(gè)甲基化寡核苷酸，此時(shí)，可以期待與檢測(cè)寡核苷酸上設(shè)計(jì)的甲基化DNA數(shù)相關(guān)的檢測(cè)靈敏度的提高。即，本發(fā)明的方法中，通過(guò)使用甲基化寡核苷酸作為檢測(cè)寡核苷酸，與所述復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸帶來(lái)的檢測(cè)靈敏度提高同樣地，可以期待與檢測(cè)寡核苷酸上設(shè)計(jì)的甲基化DNA數(shù)相關(guān)的檢測(cè)靈敏度的提高。
本發(fā)明的方法中，“使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸和能夠標(biāo)記該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的試劑的樣本的標(biāo)記方法”中，也包含將使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的標(biāo)記方法與復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能組合的任何方法。例如，在復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能利用甲基化DNA的情況下、利用甲基化DNA抗體檢測(cè)復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的情況下，可以列舉使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸和甲基化DNA抗體的標(biāo)記方法。例如，在使復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸與熒光標(biāo)記的寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記的情況下，可以列舉使用復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸和熒光標(biāo)記的寡核苷酸的標(biāo)記方法。
實(shí)施例 以下，通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 作為被測(cè)寡核苷酸，合成含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸，制備以下的 TE緩沖溶液。
溶液A 被測(cè)寡核苷酸Opmol/lO μ L TE緩沖溶液(陰性對(duì)照液) 溶液B 被測(cè)寡核苷酸0. 001pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液C 被測(cè)寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 〈被測(cè)寡核苷酸〉 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列號(hào) 1) 作為用于獲得被測(cè)寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列號(hào)2所示的堿基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列號(hào) 2) 為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸，作為一般的DNA檢測(cè)中使用的熒光修飾寡核苷酸(對(duì)照 1處理組用)，合成1個(gè)部位能夠結(jié)合熒光素抗體的、含有序列號(hào)3所示的堿基序列的5’末端FITC化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端FITC化寡核苷酸> 5，-FITC-TGACATTCTCGATGGTGTCACT-3，(序列號(hào) 3) 另外，為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸，作為一般的DNA檢測(cè)中使用的熒光修飾寡核苷酸 (對(duì)照2處理組用)，合成1個(gè)部位能夠結(jié)合熒光素抗體的、含有序列號(hào)4所示的堿基序列的3’末端FLC化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<3 ’末端FLC化寡核苷酸> 5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACACAGACAACGCCTCGTTCTCGG-FLC-3，(序列號(hào)4) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、X處理組用)，合成1個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的、含有序列號(hào)5 所示的堿基序列的甲基化寡核苷酸Μ1，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ1>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列號(hào)5) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、Y處理組用)，合成12個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的、含有序列號(hào) 6所示的堿基序列的甲基化寡核苷酸Μ12Α，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ12Α>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列號(hào)6) 對(duì)于上述所得到的被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸和甲基化(或熒光修飾)寡核苷酸溶液，進(jìn)行以下四種處理(對(duì)照1處理組、對(duì)照2處理組、X處理組、Y處理組)。
<對(duì)照1處理組> 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的5，末端FITC化寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與5’末端FITC化寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與5’末端FITC化寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘， 迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
<對(duì)照2處理組> 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的3，末端FLC化寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為IOOyL,并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與3’末端FLC化寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、 特定寡核苷酸與3’末端FLC化寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫 10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
〈X處理組> 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的甲基化寡核苷酸Ml溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與甲基化寡核苷酸Ml形成雙鏈(S卩，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化寡核苷酸Ml的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到 700C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘， 然后恢復(fù)到室溫。
〈Y處理組> 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5口1^、上述的甲基化寡核苷酸機(jī)24溶液5 4 1^、緩沖液(3301111 Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為IOOyL,并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與甲基化寡核苷酸M12A形成雙鏈(S卩，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化寡核苷酸M12A的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
將所得混合物全部轉(zhuǎn)移到經(jīng)鏈霉親和素包被的8孔條板(strip)中，在室溫下放置約30分鐘，使被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化(或熒光修飾)寡核苷酸的復(fù)合物通過(guò)生物素-鏈霉親和素結(jié)合固定在8孔條板上。然后，通過(guò)傾析除去溶液，將各孔用 200 μ L 洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
之后的操作分別對(duì)對(duì)照1處理組和對(duì)照2處理組、及X處理組和Y處理組進(jìn)行如下的不同處理。
對(duì)對(duì)照1處理組和對(duì)照2處理組(使用5’末端FITC化寡核苷酸和3’末端FLC 化寡核苷酸的情況)進(jìn)行以下的處理。
在各孔中以100 μ L的比例添加抗體溶液[過(guò)氧化物酶標(biāo)記小鼠抗熒光素IgG單克隆抗體、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 1 μ g/mL 含 0· BSA 的憐酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置 1 小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反應(yīng)開(kāi)始。
在室溫下放置約5分鐘，在各孔中以50 μ L的比例添加終止溶液(IN H2SO4水溶液)，使反應(yīng)停止。反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測(cè)定450nm的吸光度。
對(duì)X處理組和Y處理組(使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸M12A的情況)進(jìn)行以下的處理。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗體溶液[甲基胞嘧啶抗體、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
然后，在各孔中以100μ L的比例添加第二抗體溶液[小鼠IgG抗體FITC(山羊來(lái)源)、MBL 公司制、2 μ g/mL 含 0· 1 % BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]，然后在室溫下放置1小時(shí)。放置后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3次。
在各孔中以IOOyL的比例添加第三抗體溶液[過(guò)氧化物酶標(biāo)記小鼠抗熒光素 IgG 單克隆抗體(Peroxidase-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein)、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司制、0. 1 μ g/mL 含 0. 1 % BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反應(yīng)開(kāi)始。
在室溫下放置約5分鐘，在各孔中以50 μ L的比例添加終止溶液(IN H2SO4水溶液)，使反應(yīng)停止。反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測(cè)定450nm的吸光度。
數(shù)據(jù)的分析使用以下的方法。為了使陰性對(duì)照液的值在所有的組中為一定的值， 用各測(cè)定值除以各組的陰性對(duì)照液的測(cè)定值，再乘以所有組中陰性對(duì)照液的最小值。然后， 從各值中減去所有組中陰性對(duì)照液的最小值，將其作為校正值使用。
[校正值]=[測(cè)定值]X[最小值]/[各組陰性對(duì)照液的值]-[最小值] 結(jié)果如圖1所示。本實(shí)施例中，對(duì)照1處理組、對(duì)照2處理組和X組中的檢測(cè)靈敏度大致為同等程度。因此可知，如果甲基胞嘧啶抗體所能結(jié)合的部位為1個(gè)部位(甲基化胞嘧啶為1個(gè))，則與現(xiàn)有檢測(cè)法的檢測(cè)靈敏度沒(méi)有太大差異。在使用具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(12個(gè)部位)的甲基化寡核苷酸的Y處理組中，可知與對(duì)照1處理組、對(duì)照2處理組和X組相比檢測(cè)靈敏度高。即表明使用具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(存在多個(gè)甲基化胞嘧啶)的寡核苷酸時(shí)，檢測(cè)靈敏度提高。
實(shí)施例2 作為被測(cè)寡核苷酸，合成含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸，制備以下的 TE緩沖溶液。
溶液A 被測(cè)寡核苷酸Opmol/lO μ L TE緩沖溶液(陰性對(duì)照液) 溶液B 被測(cè)寡核苷酸0. 0001pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液C 被測(cè)寡核苷酸0. 001pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液D 被測(cè)寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 <被測(cè)寡核苷酸> 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列號(hào) 1) 作為用于獲得被測(cè)寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列號(hào)2所示的堿基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列號(hào) 2) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、X處理組用)，合成含有序列號(hào)5所示的堿基序列的、1個(gè)部位能夠結(jié)合熒光素抗體的甲基化寡核苷酸Ml，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ1>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列號(hào)5) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、Y處理組用)，合成含有序列號(hào)6所示的堿基序列的、12個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸Μ12Α，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ12Α>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列號(hào)6) 對(duì)于所得的被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸和甲基化寡核苷酸溶液，進(jìn)行以下兩種處理(X處理組、Y處理組)。
〈X處理組〉 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的甲基化寡核苷酸Ml溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與甲基化寡核苷酸Ml形成雙鏈(S卩，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化寡核苷酸Ml的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到 70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘， 然后恢復(fù)到室溫。
〈Y處理組> 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5μ L、上述的甲基化寡核苷酸Μ12Α溶液5μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為IOOyL,并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與甲基化寡核苷酸M12A形成雙鏈(S卩，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化寡核苷酸M12A的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
將所得混合物全部轉(zhuǎn)移到經(jīng)鏈霉親和素包被的8孔條板中，在室溫下放置約30 分鐘，使被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與甲基化寡核苷酸的復(fù)合物通過(guò)生物素-鏈霉親和素結(jié)合固定在8孔條板上。然后，通過(guò)傾析除去溶液，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP047H20U54mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗體[甲基胞嘧啶抗體、AVIVA公司制、1 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mMNa2HP047H20,154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
然后，在各孔中以IOOyL的比例添加第二抗體[小鼠IgG抗體Eu-Nl、0. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室溫下放置1小時(shí)。放置后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以200μ L的比例添加增強(qiáng)溶液并混合，在室溫下用板振蕩器(plate shaker)振蕩5分鐘。然后，在激發(fā)340nm/熒光612nm下測(cè)定熒光。
數(shù)據(jù)的分析使用以下的方法。為了使陰性對(duì)照液的值在所有的組中為一定的值， 用各測(cè)定值除以各組的陰性對(duì)照液的測(cè)定值，再乘以所有組中陰性對(duì)照液的最小值。然后， 從各值中減去所有組中陰性對(duì)照液的最小值，將其作為校正值使用。
[校正值]=[測(cè)定值]X[最小值]/[各組陰性對(duì)照液的值]-[最小值] 結(jié)果如圖2所示。本實(shí)施例中，在使用具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(12 個(gè)部位)的甲基化寡核苷酸的Y組中，可知與X組相比檢測(cè)靈敏度高。即表明使用具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(存在多個(gè)甲基化胞嘧啶)的寡核苷酸時(shí)，檢測(cè)靈敏度提尚O 實(shí)施例3 作為被測(cè)寡核苷酸，合成含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸，制備以下的 TE緩沖溶液。
溶液A 被測(cè)寡核苷酸Opmol/lO μ L TE緩沖溶液(陰性對(duì)照液) 溶液B 被測(cè)寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液C 被測(cè)寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液D 被測(cè)寡核苷酸0. 03pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 <被測(cè)寡核苷酸> 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列號(hào) 1) 作為用于獲得被測(cè)寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列號(hào)2所示的堿基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列號(hào) 2) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的寡核苷酸，合成含有序列號(hào)7所示的堿基序列的、3個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸 (第1寡核苷酸)，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。該第1寡核苷酸在3’末端具有作為接合堿基序列的第1接合堿基序列。
<第1寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5，-TGACATTCTCGATGGTGTCACTANACANACANATGCGCACCGTGCGCGAGC-3'(序列號(hào) 7) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、具有含有能夠與第1接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第1接合堿基序列(通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合)的寡核苷酸，合成含有序列號(hào)8所示的堿基序列的、未甲基化的寡核苷酸(第2寡核苷酸)，制備0. lpmoL/5 μ L 的TE緩沖溶液。該第2寡核苷酸在5’末端具有作為接合堿基序列的第2接合堿基序列。
<第2寡核苷酸> 5，-ATAGTCTCGTGGTGCGCCGTACACACACACAGCTCGCGCACGGTGCGCA-3，(序列號(hào) 8) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、具有含有能夠與第2接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第2接合堿基序列(通過(guò)互補(bǔ)性與第2寡核苷酸結(jié)合)的寡核苷酸，合成含有序列號(hào)9所示的堿基序列的、3個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸(第3 寡核苷酸)，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<第3寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5，-ACGGCGCACCACGAGACTATANACANACANACAGACACAGACTGGCAAGTTGGA-3，(序列號(hào) 9) 使用所得的被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第2寡核苷酸、第3寡核苷酸溶液，進(jìn)行以下三種處理(處理法1、2和3)。
處理法1 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5yL、上述的第1寡核苷酸溶液5yL、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與第1寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘， 迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
處理法2 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10yL、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、第2寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1 寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第2寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10 分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
處理法3 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液、第2寡核苷酸溶液、第3寡核苷酸溶液各5 μ L、 緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、 lmg/mLBSA溶液10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為 100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第2寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第2寡核苷酸與第3寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第 1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫 10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
將處理法1、2和3所得的混合物全部轉(zhuǎn)移到經(jīng)鏈霉親和素包被的8孔條板中，在室溫下放置約30分鐘，使被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸和第1寡核苷酸、和/或第2寡核苷酸、和/或第3寡核苷酸的復(fù)合物固定在8孔條板上。然后，通過(guò)傾析除去溶液，將各孔用 200 μ L 洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗體溶液[甲基胞嘧啶抗體、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
然后，在各孔中以100 μ L的比例添加第二抗體[小鼠IgG抗體Eu-NUO. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室溫下放置1小時(shí)。放置后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以200 μ L的比例添加增強(qiáng)溶液并混合，在室溫下用板振蕩器振蕩5分鐘。然后，在激發(fā)340nm/熒光612nm下測(cè)定熒光。
數(shù)據(jù)的分析使用以下的方法。為了使陰性對(duì)照液的值在所有的組中為一定的值， 用各測(cè)定值除以各組的陰性對(duì)照液的測(cè)定值，再乘以所有組中陰性對(duì)照液的最小值。然后， 從各值中減去所有組中陰性對(duì)照液的最小值，將其作為校正值使用。
[校正值]=[測(cè)定值]X[最小值]/[各組陰性對(duì)照液的值]-[最小值] 結(jié)果如圖3所示。在為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸而僅使用第1寡核苷酸的情況下(處理法1)和使用第1寡核苷酸與第2寡核苷酸的情況下(處理法2)，檢測(cè)靈敏度未見(jiàn)差異。 認(rèn)為這是由于使用未甲基化的寡核苷酸作為第2寡核苷酸，S卩，甲基胞嘧啶抗體能結(jié)合的部位(甲基化胞嘧啶)數(shù)量相同，因而檢測(cè)靈敏度為同等程度。在為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸而使用第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸的情況下(處理法3)，可知檢測(cè)靈敏度提高。認(rèn)為這是由于被測(cè)寡核苷酸上連接有第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸， 因而具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(甲基化胞嘧啶)。
實(shí)施例4 作為被測(cè)寡核苷酸，合成含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸，制備以下的TE緩沖溶液。
溶液A 被測(cè)寡核苷酸OpmoL/lO μ L TE緩沖溶液(陰性對(duì)照液) 溶液B 被測(cè)寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液C 被測(cè)寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液D 被測(cè)寡核苷酸0. 03pmol/10 μ L TE緩沖溶液 〈被測(cè)寡核苷酸〉 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列號(hào) 1) 作為用于獲得被測(cè)寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列號(hào)2所示的堿基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列號(hào) 2) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的、未甲基化的寡核苷酸(第1寡核苷酸)，合成含有序列號(hào)10所示的堿基序列的寡核苷酸(第1寡核苷酸)，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。該第1寡核苷酸具有作為接合堿基序列的第(1、 1)接合堿基序列和第(1、2)接合堿基序列。
<第1寡核苷酸> 5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACACACACACACA GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列號(hào) 10) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、具有含有能夠與第(1、1)接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第(1、1)接合堿基序列(通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合)的寡核苷酸 (第(2、1)寡核苷酸)，合成含有序列號(hào)11所示的堿基序列的、12個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸(第(2、1)寡核苷酸)，制備0. lpmoL/5yL的TE緩沖溶液。
〈第(2、1)寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -AGCCGACGAAGGGCTTATTAGNANANANANANANANANANANANACCGAGAACGAGGCGTTGTCT-3’(序列號(hào)11) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、具有含有能夠與第(1、2)接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第(1、2)接合堿基序列(通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合)的寡核苷酸(第(2、2)寡核苷酸)，合成作為甲基化寡核苷酸的、含有序列號(hào)16所示的堿基序列的、12個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸(第(2、2)寡核苷酸)，制備 0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
〈第(2、2)寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG-3’(序列號(hào)16) 使用所得的被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸、第 (2,2)寡核苷酸溶液，進(jìn)行以下三種處理(處理法1、2和3)。
處理法1 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、1)寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為 100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第(2、1)寡核苷酸形成雙鏈 (即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、1)寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到 50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
處理法2 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、2)寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mMK0Ac、IOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/ mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為 100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第(2、2)寡核苷酸形成雙鏈 (即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到 50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
處理法3 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、1)寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、2)寡核苷酸溶液5μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為IOOyL,并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第(2、1)寡核苷酸及第(2、2)寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C 加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
將所得的混合物全部轉(zhuǎn)移到經(jīng)鏈霉親和素包被的8孔條板中，在室溫下放置約30 分鐘，使被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、1)寡核苷酸、和/或第(2、 2)寡核苷酸的復(fù)合物固定在8孔條板上。然后，通過(guò)傾析除去溶液，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗體[甲基胞嘧啶抗體、AVIVA公司制、1 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4、3mMNa2HP04 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
然后，在各孔中以IOOyL的比例添加第二抗體[小鼠IgG抗體Eu-Nl、0. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室溫下放置1小時(shí)。放置后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以200 μ L的比例添加增強(qiáng)溶液并混合，在室溫下用板振蕩器振蕩5分鐘。然后，在激發(fā)340nm/熒光612nm下測(cè)定熒光。
數(shù)據(jù)的分析使用以下的方法。為了使陰性對(duì)照液的值在所有的組中為一定的值， 用各測(cè)定值除以各組的陰性對(duì)照液的測(cè)定值，再乘以所有組中陰性對(duì)照液的最小值 。然后， 從各值中減去所有組中陰性對(duì)照液的最小值，將其作為校正值使用。
[校正值]=[測(cè)定值]X[最小值]/[各組陰性對(duì)照液的值]-[最小值] 結(jié)果如圖4所示。在為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸而使用第1寡核苷酸與第(2、1)寡核苷酸的情況下(處理法1)和使用第1寡核苷酸與第(2、2)寡核苷酸的情況下(處理法2)， 檢測(cè)靈敏度未見(jiàn)差異。認(rèn)為這是由于甲基胞嘧啶抗體能結(jié)合的部位(甲基化胞嘧啶)數(shù)量相同。在為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸而使用第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的情況下(處理法3)，可知檢測(cè)靈敏度提高。認(rèn)為這是由于通過(guò)在被測(cè)寡核苷酸上形成與第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸、第(2、2)寡核苷酸的復(fù)合物，而具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(甲基化胞嘧啶)。
實(shí)施例5 作為被測(cè)寡核苷酸，合成含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸，制備以下的 TE緩沖溶液。
溶液A 被測(cè)寡核苷酸OpmoL/lO μ L TE緩沖溶液(陰性對(duì)照液) 溶液B 被測(cè)寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液C 被測(cè)寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE緩沖溶液 溶液D 被測(cè)寡核苷酸0. 03pmol/10 μ L TE緩沖溶液 <被測(cè)寡核苷酸> 5’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列號(hào) 1) 作為用于獲得被測(cè)寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列號(hào)2所示的堿基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列號(hào) 2) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、通過(guò)互補(bǔ)性與被測(cè)寡核苷酸結(jié)合的寡核苷酸(第 1寡核苷酸)，合成含有序列號(hào)17所示的堿基序列的、3個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。該第1寡核苷酸具有作為接合堿基序列的第1接合堿基序列。
<第1寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACANACANACANA GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列號(hào) 17) 作為用于檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸的、具有含有能夠與第1接合堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的互補(bǔ)第1接合堿基序列(通過(guò)互補(bǔ)性與第1寡核苷酸結(jié)合)的寡核苷酸(第2寡核苷酸)，合成含有序列號(hào)16所示的堿基序列的、12個(gè)部位能夠結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的甲基化寡核苷酸，制備0. lpmoL/5 μ L的TE緩沖溶液。
<第2寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG-3’(序列號(hào)16) 使用所得的被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第2寡核苷酸溶液，進(jìn)行以下兩種處理(處理法1和2)。
處理法1 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5yL、上述的第1寡核苷酸溶液5yL、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為100μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈(即，形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸與第1寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在95°C加熱10分鐘， 迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
處理法2 在PCR管中添加上述制備的被測(cè)寡核苷酸溶液10yL、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第2寡核苷酸溶液5 μ L、緩沖液(330mM Tris-乙酸鹽 pH 7. 9、660mMK0Ac、IOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、lmg/ mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向該混合物中加入滅菌超純水使液量為 100 μ L，并混合。然后，為了使被測(cè)寡核苷酸與特定寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使被測(cè)寡核苷酸與第1寡核苷酸形成雙鏈，并且同時(shí)使第1寡核苷酸與第2寡核苷酸形成雙鏈(即， 形成被測(cè)寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的復(fù)合物)，將該P(yáng)CR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻到70°C，并在該溫度保溫10分鐘。然后，冷卻到50°C并保溫10 分鐘，再在37°C保溫10分鐘，然后恢復(fù)到室溫。
將所得混合物全部轉(zhuǎn)移到經(jīng)鏈霉親和素包被的8孔條板中，在室溫下放置約30分鐘，使被測(cè)寡核苷酸和特定寡核苷酸和第1寡核苷酸、或者被測(cè)寡核苷酸和特定寡核苷酸、 第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的復(fù)合物固定在8孔條板上。然后，通過(guò)傾析除去溶液，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗體溶液[甲基胞嘧啶抗體、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置1小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
然后，在各孔中以100μ L的比例添加第二抗體溶液[小鼠IgG抗體FITC(山羊來(lái)源)、MBL 公司制、2 μ g/mL 含 0· 1 % BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]，然后在室溫下放置1小時(shí)。放置后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第三抗體溶液[過(guò)氧化物酶標(biāo)記小鼠抗熒光素IgG 單克隆抗體、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0. lyg/mL 含 0. 1%BSA 的憐酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室溫下放置 1 小時(shí)。然后，將各孔用200 μ L洗滌緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗滌 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反應(yīng)開(kāi)始。
在室溫下放置約5分鐘，在各孔中以50 μ L的比例添加終止溶液(INH2SO4水溶液)，使反應(yīng)停止。反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測(cè)定450nm的吸光度。
數(shù)據(jù)的分析使用以下的方法。為了使陰性對(duì)照液的值在所有的組中為一定的值， 用各測(cè)定值除以各組的陰性對(duì)照液的測(cè)定值，再乘以所有組中陰性對(duì)照液的最小值。然后， 從各值中減去所有組中陰性對(duì)照液的最小值，將其作為校正值使用。
[校正值]=[測(cè)定值]X[最小值]/[各組陰性對(duì)照液的值]-[最小值] 結(jié)果如圖5所示。在為了檢測(cè)被測(cè)寡核苷酸而僅使用第1寡核苷酸的情況下(處理法1)和使用第1寡核苷酸與第2寡核苷酸的情況下(處理法2、，可知處理法2中檢測(cè)靈敏度提高。認(rèn)為這是由于通過(guò)在被測(cè)寡核苷酸上形成第1寡核苷酸與第2寡核苷酸的復(fù)合物，而具有多個(gè)能結(jié)合甲基胞嘧啶抗體的部位(甲基化胞嘧啶)。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供簡(jiǎn)便且高靈敏度地定量或檢測(cè)樣本中所含的具有目標(biāo)DNA 區(qū)域的DNA的方法等。
序列表自由文本 序列號(hào)1 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)2 為固定化而設(shè)計(jì)的生物素化寡核苷酸 序列號(hào)3 設(shè)計(jì)的FITC標(biāo)記的寡核苷酸 序列號(hào)4 設(shè)計(jì)的FLC標(biāo)記的寡核苷酸 序列號(hào)5 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)6 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)7 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)8 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)9 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)10 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)11 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)16 設(shè)計(jì)的寡核苷酸 序列號(hào)17 設(shè)計(jì)的寡核苷酸
權(quán)利要求
1. 一種DNA的定量或檢測(cè)方法，所述DNA為樣本中所含的、具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA， 其特征在于，包括如下步驟(1)第一步驟，制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA區(qū)域的 DNA ；(2)第二步驟，將第一步驟中制備的樣本中含有的被測(cè)寡核苷酸和與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸混合，形成含有該被測(cè)寡核苷酸與該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物，并使該檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上；和(3)第三步驟，利用檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)第二步驟中形成的檢測(cè)復(fù)合物中所含的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，具有多種識(shí)別功能的檢測(cè)寡核苷酸是由多個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合而成的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸、或含有具有多個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化寡核苷酸的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸含有具有甲基化DNA的寡核苷酸。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能為所結(jié)合的甲基化DNA抗體的識(shí)別功能。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，甲基化DNA為5-甲基胞嘧啶。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，甲基化DNA抗體為甲基胞嘧啶抗體。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，樣本為下述任何一種生物來(lái)源樣本(a)哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液或組織裂解液、(b)從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞裂解液和組織裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的DNA、(c)以從由哺乳動(dòng)物來(lái)源的組織、細(xì)胞、組織裂解液和細(xì)胞裂解液組成的組中選擇的一種物質(zhì)中抽提的RNA為模板制作的DNA、(d)從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或(e)以從細(xì)菌、真菌或病毒中抽提的RNA為模板制作的DNA。
8.—種樣本的標(biāo)記方法，其中，使用了權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的方法中所用的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸。
9.一種樣本的標(biāo)記方法，其中，使用了權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的方法中所用的復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸和能夠標(biāo)記該復(fù)合檢測(cè)寡核苷酸的試劑。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，標(biāo)記對(duì)象為DNA或蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第二步驟中，通過(guò)不妨礙被測(cè)寡核苷酸與檢測(cè)寡核苷酸的結(jié)合且能夠與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的特定寡核苷酸，使檢測(cè)復(fù)合物與支撐體結(jié)合。
12.如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為下述任意一種具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA (a)預(yù)先用不以目標(biāo)DNA區(qū)域作為識(shí)別切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理后得到的 DNA、(b)預(yù)先進(jìn)行純化后得到的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA、(C)血液中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的游離DNA、(d)微生物基因組來(lái)源的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA、或(e)利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA生成的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA。
13.一種DNA的定量或檢測(cè)方法，所述DNA為樣本中所含的、具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA， 其特征在于，包括如下步驟(1)第一步驟，制備含有被測(cè)寡核苷酸的樣本，所述被測(cè)寡核苷酸為具有目標(biāo)DNA區(qū)域的 DNA ；(2)第二步驟，將第一步驟中制備的樣本中含有的被測(cè)寡核苷酸和與該被測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合且含有甲基化寡核苷酸的檢測(cè)寡核苷酸混合，形成含有該被測(cè)寡核苷酸與該檢測(cè)寡核苷酸的檢測(cè)復(fù)合物，并使該檢測(cè)復(fù)合物固定在支撐體上；和(3)第三步驟，利用檢測(cè)寡核苷酸的識(shí)別功能對(duì)第二步驟中形成的檢測(cè)復(fù)合物中所含的檢測(cè)寡核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，由此對(duì)所述具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測(cè)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，識(shí)別功能使用甲基化DNA抗體、甲基胞嘧啶抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及樣本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的定量或檢測(cè)方法等。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102186990SQ20098014073
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者冨原祥隆, 佐藤日出夫, 樽井弘和 申請(qǐng)人:住友化學(xué)株式會(huì)社