專利名稱：定量蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定量蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露的方法，所述樹(shù)脂包括但不限于蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L系親和色譜樹(shù)脂。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)系親和色譜已廣泛用于從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模、試生產(chǎn)規(guī)模到生產(chǎn)規(guī)模的各種規(guī)模的蛋白質(zhì)、DNA以及其他化學(xué)和生物分子的純化。參見(jiàn)，例如，Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,Inc. San Diego, CA,pgs. 317-346(1992)。 其中，蛋白質(zhì)A(PrA)、蛋白質(zhì)G(ft~G)和蛋白質(zhì)L(ft~L)系親和色譜是公知的并廣泛使用的用于免疫球蛋白(Ig)的檢測(cè)和/或純化的方法，然而，它們就結(jié)合Ig而言各自具有不同的特異性。
舉例而言，PrA系試劑在生物技術(shù)領(lǐng)域中具有特別廣泛的應(yīng)用，例如在親和色譜中用于捕獲和純化抗體以及用于抗體檢測(cè)法中。目前，PrA系的親和介質(zhì)或樹(shù)脂可能是用于從包括細(xì)胞培養(yǎng)物在內(nèi)的不同樣品分離單克隆抗體及其片段的最廣泛使用的親和介質(zhì)。因此，各種包含蛋白質(zhì)A-配體的基質(zhì)是可商購(gòu)的，包括，例如，ProS^ _vA High Capacity、 ProSep vA Ultra和 ProSep(g) UltraPlus (Millipore) 1 Protein A Sepharose >rmp Protein A Sepharose Fast Flow、MabSelect 、MabSelect Xtra 和 MabSelect SuRe (GE Healthcare)、Poros MabCapture A (Applied Biosystems)以及 Sartobind Protein A (Sartorius)。
發(fā)明概述 盡管蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂例如蛋白質(zhì)A、G和L系親和色譜樹(shù)脂對(duì)于純化與它們結(jié)合的分析物或分子，例如免疫球蛋白(Ig)(在PrA、PrG和的情況下)，是非常合乎需要的，但是一個(gè)缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)A、G或L與感興趣的分析物或分子例如免疫球蛋白一起從色譜柱泄露。例如，由于例如能夠以高容量特異地結(jié)合抗體并能夠達(dá)到高純度，所以蛋白質(zhì)A系親和色譜對(duì)于大規(guī)?？贵w純化是非常合乎需要的，然而，由于洗出的PrA自身的生物學(xué)活性和毒理學(xué)性質(zhì)，其通常被認(rèn)為是免疫球蛋白洗出液中不期望的雜質(zhì)。因此，在本發(fā)明的一些方面，監(jiān)測(cè)PrA泄露并最終在后續(xù)的色譜步驟中將其除去是有益的。例如，一種最小化PrA泄露的方法是使用顯示出從色譜柱的最小量PrA泄露的PrA樹(shù)脂。因此，在一些方面，本發(fā)明的方法可用于鑒定顯示出從色譜柱的最小量PrA泄露的蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂，包括但不限于PrA、PrG和PrL系親和色譜樹(shù)脂。此類蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂包括已知的樹(shù)脂和可能在將來(lái)被開(kāi)發(fā)的那些樹(shù)脂。
還開(kāi)發(fā)了許多基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)的篩選測(cè)定法用于檢測(cè)色譜柱的PrA泄露。然而，大多數(shù)這些測(cè)定法在本質(zhì)上是定性的并且通常顯示出較高的變異性(例如，彡25% )，因而不適合用作分析工具用于例如提供PrA系親和色譜樹(shù)脂的比較、鑒定顯示出最小量PrA泄露的樹(shù)脂以及用于在親和色譜和后續(xù)色譜步驟之后監(jiān)測(cè)抗體洗出液池中的洗出的PrA。
由于與熒光標(biāo)記物相關(guān)的高靈敏度和選擇性，所以此類標(biāo)記物被廣泛用于生物化學(xué)和化學(xué)研究中。例如，之前已使用熒光染料檢測(cè)來(lái)自親和樹(shù)脂的洗出的蛋白質(zhì)A， 然而，這些染料大多用于生成定性信息例如檢測(cè)，并且不能提供任何定量信息，例如洗出的 PrA 的量。參見(jiàn)，例如，Carter-Franklin 等人，Journal of Chromatography A, 1163 105-111(2007)。
本發(fā)明至少部分涉及用例如熒光標(biāo)記物檢測(cè)色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的蛋白質(zhì)(例如 PrA)泄露的定量方法。本發(fā)明方法顯示出低于10%的變異性并特別適于鑒定顯示出最小量PrA泄露的PrA色譜樹(shù)脂。
本發(fā)明一方面提供定量PrA系親和色譜樹(shù)脂的PrA泄露的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrA系色譜樹(shù)脂；(b)將標(biāo)記的樹(shù)脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用適合的方法處理第一部分以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的 PrA，并且向所述第二部分加入過(guò)量的Ig;(d)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第一部分中經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光和PrA濃度([PrA])；以及(e)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第二部分的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLIg)，其中通過(guò)計(jì)算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量 PrA 泄露。
本發(fā)明的另一方面提供定量PrA系親和色譜樹(shù)脂的PrA泄露的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrA系色譜樹(shù)脂；(b)向標(biāo)記的樹(shù)脂加入過(guò)量的Ig并且測(cè)量來(lái)自所述樹(shù)脂的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg) ； (c)從所述樹(shù)脂除去殘留的Ig，然后用適合的方法處理所述樹(shù)脂以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的PrA;以及(d)測(cè)量來(lái)自經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光和PrA濃度([PrA])，其中通過(guò)計(jì)算KFLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量PrA泄露。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于定量PrG系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì)G(ft~G) 的泄露。
因此，本發(fā)明的又一方面提供定量PrG系親和色譜樹(shù)脂的PrG泄露的方法，所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrG色譜樹(shù)脂；(b)將標(biāo)記的樹(shù)脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用適合的方法處理第一部分以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的ft~G，并且向所述第二部分加入過(guò)量的Ig; (d)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第一部分中經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FL·。和PrG濃度([PrG])；以及(e)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第二部分的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg)，其中通過(guò)計(jì)算{(FLIg)/((FL·
/[PrG])}/[Ig]定量 PrG 泄露。
在又一方面，定量PrG系色譜樹(shù)脂的PrG泄露的方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrG系色譜樹(shù)脂；(b)向標(biāo)記的樹(shù)脂加入過(guò)量的Ig并且測(cè)量來(lái)自所述樹(shù)脂的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg) ； (c)從所述樹(shù)脂除去殘留的Ig，然后用適合的方法處理所述樹(shù)脂以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的I^rG ；以及(d)測(cè)量來(lái)自經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FLm物)和PrG濃度(PrG])，其中通過(guò)計(jì)算{(FLIg)/((FL消化/[PrG])}/[Ig]定量 PrG 泄露。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于定量PrL系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì) L(PrL)的泄露。
因此，在本發(fā)明的另一方面提供定量PrL系親和色譜樹(shù)脂的PrL泄露的方法，所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrL系色譜樹(shù)脂；(b)將標(biāo)記的樹(shù)脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用適合的方法處理第一部分以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的ft~L，并且向所述第二部分加入過(guò)量的Ig; (d)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第一部分中經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FL·物)和PrL濃度([PrL])；以及(e)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第二部分的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLIg)，其中通過(guò)計(jì)算KFLlg)/ ((FL消化物)/ [PrL])} / [Ig]定量 PrL 泄露。
在另一方面，定量PrL系色譜樹(shù)脂的PrL泄露的方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrL系色譜樹(shù)脂；(b)向標(biāo)記的樹(shù)脂加入過(guò)量的Ig并且測(cè)量來(lái)自所述樹(shù)脂的樹(shù)脂Ig洗脫濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg) ； (c)從所述樹(shù)脂除去殘留的Ig，然后用適合的方法處理所述樹(shù)脂以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的I^rL;以及(d)測(cè)量來(lái)自經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FL·物)和PrL濃度(PrL])，其中通過(guò)計(jì)算{(FLlg)/((FL m
/[PrL])}/[Ig]定量 PrL 泄露。
另外，不希望受到理論的限制，設(shè)想本發(fā)明方法可用于定量蛋白質(zhì)系親和色譜法的任何蛋白質(zhì)和/或其片段的泄露，所述蛋白質(zhì)系親和色譜法用于從混合物分離或除去結(jié)合所述蛋白質(zhì)的分析物或分子。
因此，本發(fā)明另一方面提供定量蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂；(b)將標(biāo)記的樹(shù)脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用適合的方法處理第一部分以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并且向所述第二部分加入過(guò)量的結(jié)合所述蛋白質(zhì)的分析物；(d)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第一部分中經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光和蛋白質(zhì)濃度 ([PrL])；以及(e)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第二部分的樹(shù)脂分析物洗出液濃度([分析物]) 和分析物洗出液中的熒光信號(hào)(FL#_)，其中通過(guò)計(jì)算化物)/[PrL])}/ [分析物]定量ft·泄露。
本發(fā)明另一方面提供定量蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述蛋白質(zhì)系色譜樹(shù)脂；(b)向標(biāo)記的樹(shù)脂加入過(guò)量的分析物并測(cè)量來(lái)自所述樹(shù)脂的樹(shù)脂分析物洗脫濃度([Ig])和分析物洗出液中的熒光信號(hào)； (c)從所述樹(shù)脂除去殘留的分析物，然后用適合的方法處理所述樹(shù)脂以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的蛋白質(zhì)；以及(d)測(cè)量來(lái)自經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光物)和蛋白質(zhì)濃度([Pr])，其中通過(guò)計(jì)算KFL分析物)/((FL消化物)/[Pr])}/[分析物]定量蛋白質(zhì)泄露。
在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括用陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水交換色譜、弱分配色譜、羥基磷灰石色譜中的一種或多種或它們的任意組合除去洗出的蛋白質(zhì)例如PrA、PrG或PrL的步驟。示例性的色譜形式包括但不限于填充柱和膜裝置形式。
在本發(fā)明的方法的各種實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記物選自Alexa Fluor488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、Dylight 488 (ThermoFisher, ffaltham, MA)、HiLyte Fluor 488,5-FAM , SE 和 6-FAM ，SE (Anaspec, San Jose, CA)。
在各種實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的用于從所述樹(shù)脂釋放所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)例如PrA、PrG和PrL的適合的方法包括化學(xué)處理或酶處理。示例性的酶處理包括使用消化所述蛋白質(zhì)諸如PrA、PrG或PrL的酶，包括但不限于例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和枯草溶菌素(subtlelysin)。示例性的化學(xué)處理包括使用適合的酸或堿。
在本發(fā)明的方法的各種實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法比較可商購(gòu)的PrA系親和色譜樹(shù)脂以鑒定顯示出最小量的PrA泄露的那些樹(shù)脂。示例性的樹(shù)脂包括但不限于 ProSep -vA High Capacity^ ProSep (g) vA Ultra 禾口 ProSep (g) UltraPlus (Millipore)； Protein A Sepharose 、MabSelect 、MabSelect Xtra 禾Π MabSelect SuRe (GE Healthcare) ；Sartobind Protein A(Sartorius) \)JsR POROS (g) MabCapture A (Applied Biosystems)。
在本發(fā)明的方法的一些方面，可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)例如使用6M鹽酸胍或 4-8M脲從所述樹(shù)脂除去殘留Ig (例如IgG)。
在本發(fā)明的方法的一些方面，分析物或分子(例如Ig)的過(guò)量是用于分離或除去所述分析物或分子的蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂或介質(zhì)的最大結(jié)合容量的至少2-5倍大的量。 在一些實(shí)施方案中，所述分析物或分子是結(jié)合PrA系親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的Ig(例如IgG)， 其中所述Ig(例如IgG)的過(guò)量是所述樹(shù)脂的結(jié)合容量的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或大于5倍。一般而言，可基于通常由所述樹(shù)脂生產(chǎn)商提供的所述樹(shù)脂的最大結(jié)合容量來(lái)確定，或者可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)容易地計(jì)算所述分析物或分子(例如Ig)的所述過(guò)量。
可使用任何適合的方法包括但不限于用熒光計(jì)測(cè)量熒光。用熒光計(jì)檢測(cè)的樣品載荷可以是比色皿或孔板形式。
在本發(fā)明的方法的各種實(shí)施方案中，可使用任何適合的方法例如使用適合的pH 洗脫所述Ig(例如IgG)。在示例性的實(shí)施方案中，用于IgG洗脫的適合的pH是約2. O-約 4.0&ρΗ。在特定的實(shí)施方案中，將pH 2. O的甘氨酸用于IgG洗脫。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了本發(fā)明示例性方法的示意圖，其中用熒光染料(Alexa Fluor 488)標(biāo)記PrA。簡(jiǎn)而言之，如圖1所描繪，將標(biāo)記的介質(zhì)分成兩個(gè)Iml部分。一個(gè)部分用胰蛋白酶進(jìn)行酶處理。通過(guò)在UV/Vis分光光度計(jì)上于UV275Iim以及在激發(fā)波長(zhǎng)為495nm的熒光計(jì)上于發(fā)射波長(zhǎng)519nm讀取上清，得到FL,擔(dān)/[PrA]比值。將另一部分暴露于約為估計(jì)的介質(zhì)容量的5倍的Ig (例如IgG)，這樣形成過(guò)量IgG。在用PBS (IOmM磷酸鹽緩沖液)洗滌過(guò)量 IgG之后，用pH 2的0. IM甘氨酸洗脫結(jié)合至PrA介質(zhì)的IgG。溫和混合后，在UV/Vis分光光度計(jì)上于UV28ciIim分析IgG洗脫([IgG])并在激發(fā)波長(zhǎng)為495nm的熒光計(jì)上于發(fā)射波長(zhǎng) 519nm 分析 IgG 洗脫(FLIgG)。
圖2描繪的圖顯示標(biāo)記的(例如用Alexa Fluor 488)和未標(biāo)記的PrA的靜態(tài) IgG結(jié)合是相等的。簡(jiǎn)而言之，在三個(gè)不同的日期試驗(yàn)來(lái)自相同批次的熒光標(biāo)記的A型樹(shù)脂(FL-A-1至FL-A-5)和未標(biāo)記的樹(shù)脂(A-1至A-3)的IgG靜態(tài)結(jié)合容量。如圖2中的圖所描繪的，結(jié)果表明標(biāo)記的和未標(biāo)記的A型PrA親和色譜樹(shù)脂具有相等的靜態(tài)結(jié)合容量值。 用不同的PrA系親和色譜B型樹(shù)脂進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，用FL-B-I至FL-B-4表示標(biāo)記樹(shù)脂并用B-I至B-3表示未標(biāo)記的樹(shù)脂。如圖2所顯示的，標(biāo)記的和未標(biāo)記的B型樹(shù)脂也顯示相等的IgG靜態(tài)結(jié)合容量值。因此，熒光標(biāo)記對(duì)于不同樹(shù)脂的PrA-IgG親和作用顯示出極小的干擾。該結(jié)果還總結(jié)于圖2的表中。來(lái)自標(biāo)記的和未標(biāo)記的A型樹(shù)脂(介質(zhì)A)的樹(shù)脂靜態(tài)結(jié)合容量Ois)顯示于該表的左側(cè)，來(lái)自標(biāo)記的和未標(biāo)記的B型樹(shù)脂(介質(zhì)B)的樹(shù)脂靜態(tài)結(jié)合容量顯示該表的右側(cè)。還顯示了標(biāo)準(zhǔn)偏差(STD)和變異系數(shù)(CV)。標(biāo)記的和未標(biāo)記的介質(zhì)對(duì)3%)以及標(biāo)記的和未標(biāo)記的介質(zhì)B (7%對(duì)6%)的試驗(yàn)變異性是可比的。
圖3描繪的表格總結(jié)了五個(gè)不同批次的二氧化硅系蛋白質(zhì)親和樹(shù)脂的PrA泄露值，各自用兩批不同的Alexa Fluor 488試驗(yàn)。如表格中所描述的，用兩種不同批次的熒光染料進(jìn)行的兩組實(shí)驗(yàn)達(dá)到小于8. 4%的變異性。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及定量蛋白質(zhì)系親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂例如PrA、PrG或PrL系親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的蛋白質(zhì)例如PrA、PrG或PrL的泄露的方法。不希望受到理論的限制，設(shè)想本發(fā)明的方法可用于定量蛋白質(zhì)系親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的任何蛋白質(zhì)的泄露，其中所述蛋白質(zhì)用于分離或除去結(jié)合所述蛋白質(zhì)的分子，包括但不限于例如結(jié)合Ig的蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L。
為了使本申請(qǐng)更容易被理解，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。另外的定義列于整個(gè)發(fā)明詳述中。
I.定義 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)A”或“PrA”包括從天然來(lái)源例如細(xì)菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)回收的蛋白質(zhì)Α、合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)A(例如通過(guò)肽合成或通過(guò)重組技術(shù))，包括保留了結(jié)合具有CH2/CH3區(qū)的蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白)的能力的變體或 行生物。PrA的商業(yè)來(lái)源包括R印Iigen、GE Healthcare、Fersenius Medical和 Fermatech。
如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“色譜(法)”指任何類型的純化技術(shù)，該純化技術(shù)例如通過(guò)在固體基質(zhì)和流動(dòng)相(包括但不限于溶液、緩沖液或溶劑)之間的分配差異，將在混合物中的感興趣的分析物(例如免疫球蛋白或Ig)與其他分子分開(kāi)，并使感興趣的分析物被分離。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“親和色譜”、“親和分離”或“親和純化”指涉及將包含靶分析物或分子(例如免疫球蛋白或Ig)的樣品添加到攜帶與所述分析物結(jié)合的蛋白質(zhì)例如 PrA.PrG和的固體支持體的任何純化或測(cè)定技術(shù)。當(dāng)靶分析物或分子(例如Ig)與所述蛋白質(zhì)(例如PrA)結(jié)合并且不需要的雜質(zhì)流出后，可用適合的方法洗脫所述靶分析物或分子。例如，可使用具有適合的PH例如約2-約5的pH或約2-約4的pH的適合的洗脫緩沖液回收所述分析物例如IgG。用于這一目的的洗脫緩沖液的實(shí)例包括檸檬酸鹽、甘氨酸或醋酸鹽緩沖液。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“PrA系親和色譜”或“蛋白質(zhì)A系親和色譜”指使用蛋白質(zhì) A或者其衍生物或變體分離或純化物質(zhì)和/或分子例如免疫球蛋白，其中所述PrA通常被固定在固體支持體上。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“PrG系親和色譜”或“蛋白質(zhì)G系親和色譜”指使用蛋白質(zhì) G或者其衍生物或變體分離或純化物質(zhì)和/或分子例如免疫球蛋白，其中所述通常被固定在固體支持體上。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“PrL系親和色譜”或“蛋白質(zhì)L系親和色譜”指使用蛋白質(zhì) L或者其衍生物或變體分離或純化物質(zhì)和/或分子例如免疫球蛋白，其中所述通常被固定在固體支持體上。
術(shù)語(yǔ)“固相”或“固體支持體”通常指用于分離或除去感興趣的分析物或分子的蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)A(PrA)、蛋白質(zhì)G(ft~G)或蛋白質(zhì)L(ft~L)能夠粘附或共價(jià)結(jié)合的非水基質(zhì)。 例如，PrA可與多種材料偶聯(lián)，例如瓊脂糖、多糖、葡聚糖、硅膠、合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯苯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯醚以及它們對(duì)應(yīng)的共聚物)和玻璃球。固體支持體形式包括但不限于純化柱、不連續(xù)顆粒的間斷相、填充床柱以及膨脹床柱、膜等。在一些實(shí)施方案中，作為任選的預(yù)備步驟，可在對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)實(shí)施色譜法之前用適合的緩沖液平衡蛋白質(zhì)A親和色譜的固相。示例性的平衡緩沖液包括PH 7. 4的IOmM磷酸鹽緩沖液。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“親和樹(shù)脂”或“親和色譜樹(shù)脂”指色譜配體(例如PrA、PrG 或所結(jié)合的色譜支持體。所述配體能夠結(jié)合待從混合物中純化或除去的感興趣的分子(例如免疫球蛋白)。用于蛋白質(zhì)A系親和色譜的示例性蛋白質(zhì)A系親和色譜樹(shù)脂包括固定至可控孔度玻璃骨架(controlled pore glass backbone)例如 PROSEP Α 和 PROSEP vA 樹(shù)脂、High Capacity，Ultra 和 PROSEP Ultra Plus (Millipore Inc.)上的蛋白質(zhì) A; 固定至聚苯乙烯固相例如 P0R0S 50A 樹(shù)脂和 P0R0S MabCapture A (Applied BioSystems he.)上的蛋白質(zhì)A ；或固定至瓊脂糖固相例如rPROTEIN A SEPHAR0SE FAST FLOW 或 MABSELECT 樹(shù)脂(GEHealthcare)上的蛋白質(zhì) A。
可在蛋白質(zhì)A親和色譜步驟之前或之后對(duì)洗脫的Ig(例如IgG)進(jìn)行另外的純化步驟。示例性的進(jìn)一步的純化步驟包括但不限于過(guò)濾、羥基磷灰石色譜、疏水作用色譜 (HIC)、硫酸銨沉淀、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、乙醇沉淀、反相HPLC、弱分配色譜、色譜聚焦、凝膠過(guò)濾等。
在一些實(shí)施方案中?？蓪⑾疵摰腎g(例如IgG)配制在藥學(xué)可接受的載體中并用于各種診斷、治療或已知的此類分子的其他用途。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)洗出(protein leaching) ”、“蛋白質(zhì)泄露(protein leakage)，，、"洗出的蛋白質(zhì)(leached protein) ” “ft·洗出(Pr leaching) ”、“Pr 泄露(Pr leakage)”和“洗出的ft· (leached protein) ”指蛋白質(zhì)(Pr)(包括完整的和/或其片段) 從其結(jié)合的固相分離或洗脫。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的方法定量PrA、PrG或PrL系親和色譜樹(shù)脂的PrA、PrG或PrL泄露。蛋白質(zhì)泄露可由許多不同的原因引起。例如，PrA 泄露或PrA洗出可由諸如機(jī)械剪切、低/高pH暴露、接觸免疫球蛋白、蛋白水解活性等原因引起?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的各種技術(shù)定量測(cè)量蛋白質(zhì)A洗出，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELI SA), SDS PAGE、蛋白質(zhì)印跡法、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法等。洗出的PrA的量通常表示為ng Pr A/ml親和基質(zhì)，或表示為ng蛋白質(zhì)A/mg抗體。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗體”(在本文中互換地使用)指具有特異性結(jié)合抗原的能力并具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四條多肽鏈基本結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中所述鏈通過(guò)例如鏈間二硫鍵被穩(wěn)定化。術(shù)語(yǔ)“單鏈免疫球蛋白”或“單鏈抗體”(在本文中互換地使用)指具有特異性結(jié)合抗原的能力并具有由一條重鏈和一條輕鏈組成的二條多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中所述鏈通過(guò)例如鏈間肽鍵被穩(wěn)定化。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域” 指重鏈或輕鏈多肽的球形區(qū)域，其包括例如通過(guò)β -折疊和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定化的肽環(huán) (例如包含3-4個(gè)肽環(huán))。本文中將結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步稱作“恒定的”或“可變的”，在“恒定”結(jié)構(gòu)域的情況下是根據(jù)各類成員的結(jié)構(gòu)域中相對(duì)缺少序列變異，或者在“可變”結(jié)構(gòu)域的情況下是根據(jù)各類成員的結(jié)構(gòu)域中的顯著變異。在本領(lǐng)域中，抗體或多肽“結(jié)構(gòu)域”常常被互換地稱作抗體或多肽“區(qū)”?？贵w輕鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“輕鏈恒定區(qū)”、“輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CL”區(qū)或“CL”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“重鏈恒定區(qū)”、“重鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CH”區(qū)或“CH”結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作 “輕鏈可變區(qū)”、“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VL”區(qū)或“VL”結(jié)構(gòu)域。抗體重鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“重鏈可變區(qū)”、“重鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VH”區(qū)或“VH”結(jié)構(gòu)域。
在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白是IgG抗體。免疫球蛋白或抗體可以是單克隆的或多克隆的，并可以單體或多聚體形式存在，例如以五聚體形式存在的IgM抗體和/或以單體、二聚體或多聚體形式存在的IgA抗體。術(shù)語(yǔ)“片段”指抗體或抗體鏈的部分，其包含少于完整或完全的抗體或抗體鏈的氨基酸殘基。可通過(guò)對(duì)完整或完全的抗體或抗體鏈進(jìn)行化學(xué)或酶處理獲得片段。還可通過(guò)重組方式獲得片段。示例性的片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2、 Fc和/或Fv片段。
術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”指結(jié)合抗原或與完整抗體(即與它們所衍生自的完整抗體) 競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合(即特異性結(jié)合)的免疫球蛋白或抗體的多肽部分。結(jié)合片段可通過(guò)重組 DNA技術(shù)、或者通過(guò)酶裂解或化學(xué)裂解完整的免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、 F(ab' ) 2、Fv、單鏈以及單鏈抗體。
11· WtPrA結(jié)構(gòu)和免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn) PrA是衍生自細(xì)菌金黃色葡萄球菌的約42_kDa的蛋白質(zhì)并在N-端包含五個(gè)串聯(lián)的高同源性胞外免疫球蛋白(Ig)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，命名為E、D、A、B和C。PrA的各胞外結(jié)構(gòu)域具有不同的Ig結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)位點(diǎn)針對(duì)Fc y (IgG型Ig的恒定區(qū))，另一個(gè)位點(diǎn)針對(duì)某些 Ig分子的Fab部分(負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的Ig部分)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，各所述結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ab結(jié)合位點(diǎn)。 SpA的非-Ig結(jié)合部分位于C-端并稱作X-區(qū)或X-結(jié)構(gòu)域。
編碼WtPrA的基因的克隆記載于美國(guó)專利5，151，350，其完整內(nèi)容以其整體通過(guò)援引加入本文。
III.示例性的Pr系親和餼譜介質(zhì) 本發(fā)明的方法可用于定量蛋白質(zhì)親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露，其中此類蛋白質(zhì)系親和色譜樹(shù)脂用于分離或純化結(jié)合所述蛋白質(zhì)的分子。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于定量親和色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的蛋白質(zhì)泄露，其中此類介質(zhì)或樹(shù)脂用于從混合物中分離或除去免疫球蛋白，所述蛋白質(zhì)包括但不限于PrA、PrG和PrL及其衍生物、變體和片段。
可用于本發(fā)明方法中的示例性的蛋白質(zhì)A系樹(shù)脂包括但不限于PROSEP vA High Capacity^ PROSEP A Ultra> PROSEP Ultra Plus (Millipore) 、Protein A Sepharose FastFlow、rmp Protein A Sepharose FastFlow、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelectSuRe(GEHealthcare)、POROS A、POROS MabCapture A (Applied Biosystems)禾口 Sartobind Protein A(Sartorius)。示例性的蛋白質(zhì)G系樹(shù)脂包括但不限于PROSEP-G(Millipore)、 Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GEHealthcare)、POROS G (Applied Biosystems)。
IV.示例件的熒光標(biāo)記物和熒光測(cè)量 能夠標(biāo)記蛋白質(zhì)的任何適合的熒光標(biāo)記物或染料均可用于本發(fā)明的方法中。一般而言，使用消光系數(shù)￡_不低于70，000(^_^_1、量子產(chǎn)率> 80%并顯示出最小的光漂白或淬滅的熒光標(biāo)記物或染料是有益的。所使用的染料應(yīng)在實(shí)驗(yàn)條件下例如約1. O-約10. O的 PH下是穩(wěn)定的。對(duì)于蛋白質(zhì)系親和色譜介質(zhì)，使用胺、硫醇和羧基反應(yīng)性染料是有益的。示例性的胺反應(yīng)性熒光染料包括但不限于琥珀酰亞胺酯(succinimidyl ester)包括磺基琥珀酰亞胺酯(sulfosuccinimidyl ester)、異硫氰酸酯、磺酰氯和四氟苯基酯。示例性的硫醇反應(yīng)性染料包括但不限于馬來(lái)酰亞胺、苯基汞、碘乙酰胺、硫代硫酸鹽、羅丹明衍生物和苯并噁二唑衍生物。在示例性實(shí)施方案中，可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)系親和色譜介質(zhì)的染料包括 AlexaFluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、Dylight 488 (ThermoFisher, ffaltham, ΜΑ)、 HiLyte Fluor 488 以及 5-FAM，SE 和 6-FAM，SE (Anaspec, San Jose, CA)。
本發(fā)明的方法通常是基于熒光測(cè)量。一般而言，熒光是一類光學(xué)光譜，其中分子通過(guò)吸收紫外線、可見(jiàn)光或近紅外線照射被提高至電子激發(fā)態(tài)。被激發(fā)的分子然后通過(guò)發(fā)射可使用諸如熒光計(jì)的儀器來(lái)檢測(cè)的光衰減至基態(tài)或較低的激發(fā)電子態(tài)。在本發(fā)明的方法的情況下，所述熒光染料是結(jié)合蛋白質(zhì)例如PrA的反應(yīng)性染料。有益的是，此類染料在本發(fā)明的方法使用的實(shí)驗(yàn)條件例如使用約1. O-約10. O的pH下將熒光強(qiáng)度保持在約20%最大熒光強(qiáng)度的范圍內(nèi)至少半小時(shí)。
V.的蛋白質(zhì)從蛋白Jli系親禾口代i普積M旨釋放的方法 將蛋白質(zhì)系色譜介質(zhì)或樹(shù)脂的蛋白質(zhì)標(biāo)記后，使共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)從親和介質(zhì)或樹(shù)脂釋放。使共價(jià)結(jié)合標(biāo)記的蛋白質(zhì)從親和介質(zhì)釋放的方法包括但不限于化學(xué)方法和酶法。在示例性的化學(xué)處理方法中，可使用不顯著干擾UV吸收的酸或堿催化的水解?？捎糜诒景l(fā)明的方法的示例性酸包括但不限于一價(jià)酸如鹽酸、二價(jià)酸如磺酸和三甲酸如磷酸?？捎糜诒景l(fā)明的方法的示例性堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化銫。另外，可使用能夠斷裂某些肽鍵由此使標(biāo)記的蛋白質(zhì)從其結(jié)合的固體支持體釋放的化學(xué)試劑諸如CNBr。 參見(jiàn)，例如，Uhlen 和 Nilsson，In Proc. Biotech 85 (Europe)，pg. 173(1985)。
示例性的酶處理法包括但不限于使用能夠消化蛋白質(zhì)的酶。示例性的酶包括但不限于例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和枯草溶菌素。
VI.測(cè)IJ■來(lái)自經(jīng)化學(xué)或射對(duì)H旨的熒光禾ngSJI!濃It 然后，過(guò)濾化學(xué)或酶處理的樹(shù)脂得到無(wú)顆粒的上清。所述上清包含被消化的標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如PrA)，可例如使用UV/Vis分光光度計(jì)于275nm測(cè)量其熒光。該讀數(shù)包括由被消化的蛋白質(zhì)(例如從樹(shù)脂消化的蛋白質(zhì)A和蛋白A片段)引起的UV吸收。為了特異性地獲得所述蛋白質(zhì)的濃度(例如PrA濃度或[PrA])，需要減去來(lái)自化學(xué)試劑或酶以及熒光染料的貢獻(xiàn)。可通過(guò)測(cè)量起始的化學(xué)試劑或酶濃度(將稀釋系數(shù)考慮在內(nèi))來(lái)檢測(cè)來(lái)自用于釋放所述蛋白質(zhì)(例如PrA)的化學(xué)試劑或酶的貢獻(xiàn)UV,/ft￥i·。還可以通過(guò)獲得所述熒光標(biāo)記物或染料的峰UV吸收(通常為激發(fā)波長(zhǎng)下的UV，UVmax)計(jì)算來(lái)自所述熒光標(biāo)記物或染料的貢獻(xiàn)。通?？蓮墓?yīng)商獲得各染料的UV275/UVmax(f)比。例如，假設(shè)蛋白質(zhì)A的消光系數(shù)是0. 149，可使用下式獲得蛋白質(zhì)A的濃度[UV275-UV^im--UVmaxXf]/0. 149。
通過(guò)在某一波長(zhǎng)下激發(fā)分子并在更長(zhǎng)的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)以接受發(fā)射光譜而生成熒光。一般而言，可以使用供應(yīng)商建議的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。例如對(duì)于來(lái)自 hvitrogen的染料Alexa Fluor 488而言，激發(fā)波長(zhǎng)是495nm，發(fā)射波長(zhǎng)是519nm。必要時(shí)還可從經(jīng)過(guò)系列稀釋的上清獲得熒光讀數(shù)。通常在設(shè)定的溫度下例如在25°C，在比色皿或孔板形式熒光計(jì)上讀取熒光。
VII.測(cè)量洗出液濃度 在要求保護(hù)的發(fā)明的各種方法中，需要洗脫的感興趣的分子或分析物(例如免疫球蛋白或Ig)的濃度用于計(jì)算洗出的蛋白質(zhì)，將其測(cè)量為ng洗出的蛋白質(zhì)每mg洗脫的分子。在示例性的本發(fā)明方法中，所述洗脫的分子是免疫球蛋白，用PrA、PrG或PrL系親和色譜介質(zhì)將其分離。在一些實(shí)施方案中，采用通過(guò)梯度變化或階躍變化改變PH、離子強(qiáng)度/鹽濃度和/或溫度，使所述洗脫的分子例如免疫球蛋白從所述親和色譜介質(zhì)釋放。例如，對(duì)于 IgG而言，通常通過(guò)將洗脫pH降低至小于5但是不低于pH 2，最有利地降低至pH 2_4來(lái)實(shí)現(xiàn)從PrA系色譜介質(zhì)的洗脫。示例性的洗脫緩沖液包括醋酸、甘氨酸和檸檬酸。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)速率為2000cm/hr或更低、1000cm/hr或更低、800cm/hr或更低、600cm/hr或更低、200cm/hr或更低、lOOcm/hr或更低、或者50cm/hr或更低的洗脫緩沖液流動(dòng)達(dá)到IgG 洗脫。一般而言，流速越慢，越多的IgG結(jié)合至所述介質(zhì)并且洗脫IgG濃度通常越高。當(dāng)洗脫流速< 5cm/hr時(shí)，介質(zhì)結(jié)合接近其能夠結(jié)合的最大量的IgG，并因此達(dá)到靜態(tài)結(jié)合容量。 將過(guò)量(一般為>3-5倍于介質(zhì)最大結(jié)合容量)的IgG用于靜態(tài)結(jié)合容量試驗(yàn)。因此，通常將洗出的蛋白質(zhì)的量定義為溶液中ng蛋白質(zhì)A每mg IgG。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制性的。在本申請(qǐng)全文中引用的所有文獻(xiàn)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容以及附圖均通過(guò)援引加入本文。
實(shí)施例 實(shí)施例1 用熒光標(biāo)記物標(biāo)記PrA系親和餼譜樹(shù)脂。
用Alexa Fluor 488染料標(biāo)記可控孔度玻璃系蛋白質(zhì)A親和色譜樹(shù)脂(例如 ProSep -vA High Capacity 禾口卩！^^印 Ultra PrA(Millipore))。簡(jiǎn)而言之，Img Alexa Fluor 488 染料(Invetrogen, Carlsbad, CA)溶于約 ImlDMSO 中。將約 3ml 的各 PrA 樹(shù)脂用 NaHCO3 (0. IM ρΗ8· 4)處理，真空干燥并裝入 15ml Evergreen 柱中(Evergreen Scientific,Los Angeles, CA) 向各柱子中加入約:3ml NaHCO3,將柱子加蓋并用鋁箔包裹。 向各柱子中加入約100 μ 1染料并在振蕩器上放置約0. 5小時(shí)。再將100 μ 1染料溶液加入柱子中并再振蕩一小時(shí)。然后使柱子成漿狀并用每次約2個(gè)柱體積的NaHCO3洗滌三次，每次約2個(gè)柱體積的20%乙醇洗滌三次以及每次約2個(gè)柱體積的NaHCO3洗滌兩次。
然后將標(biāo)記的樹(shù)脂分成Iml份并轉(zhuǎn)移至小瓶中。
實(shí)施例1 熒光標(biāo)記物標(biāo)記的PrA樹(shù)脂的酶處理 然后用酶消化一部分熒光標(biāo)記的PrA樹(shù)脂。將無(wú)熒光標(biāo)記的PrA樹(shù)脂用作對(duì)照。簡(jiǎn)而言之，將Iml各PrA樹(shù)脂用0. IM NH4HCO3處理并真空干燥。將胰蛋白酶溶于0. IM NH4HCO3 并讀取275nm下的UV測(cè)量值使其在0. 7和1之間。然后向各樹(shù)脂中加入約3ml胰蛋白酶溶液并于37°c溫育約2小時(shí)。將溫育的介質(zhì)漿通過(guò)7mL Evergreen濕柱以從介質(zhì)除去上清。 在UV275nmll讀取濾液測(cè)量值并從該值減去胰蛋白酶的UV275nmT。還讀取濾液的UV495nmp測(cè)量值。 用0. 149的消光系數(shù)，用式(UV27miX稀釋系數(shù)_UV275nmT-fX UV495nmpX稀釋系數(shù))/0. 149獲得蛋白質(zhì)A濃度，其得到被消化的蛋白質(zhì)A的濃度[PA]。f的值是染料在UV275nm/UV495nm的UV 消光系數(shù)比并由熒光染料的供應(yīng)商提供。
以 2000X稀釋度(用0. IM甘氨酸)測(cè)量上述濾液的熒光，這樣得到[FL消化物]值。
實(shí)施例3 測(cè)量IgG洗出液濃度/標(biāo)記和未標(biāo)記的數(shù)脂的靜態(tài)容量 如下測(cè)定IgG洗出液濃度/標(biāo)記和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)A系親和色譜樹(shù)脂的靜態(tài)容量。靜態(tài)容量的測(cè)量還是用熒光標(biāo)記物標(biāo)記PrA樹(shù)脂是否干擾該P(yáng)rA樹(shù)脂與例如IgG的相互作用的指示。
邊輕彈邊量取Iml體積的標(biāo)記和未標(biāo)記的PrA樹(shù)脂(Evergreen Scientific, Los Angeles, CA)。用IOml IOmM磷酸鹽緩沖液(PBS)使各樣品重新成漿狀并將其平衡。棄去 PBS的重力洗脫，然后加入5ml 0. IM pH2甘氨酸。棄去洗脫。另加入5ml 0. IM pH2甘氨酸并收集洗脫，作為 Frbkgd。在加入 5ml 的 50mg/mL 多克隆 hIgG(Sigma_Aldrich，Milwaukee， WI)之前加入兩份5ml PBS以平衡介質(zhì)。然后再加入兩份5ml PBS。棄去所有重力作用下的 PBS和IgG洗脫。加入甘氨酸(5ml, 0. 1M，pH2)，收集洗出液，標(biāo)記為FR10另加入5ml甘氨酸溶液并收集洗出液，標(biāo)記為F&。讀取^Onm的UV測(cè)量值用于獲得洗脫IgG濃度[IgG]。 一項(xiàng)測(cè)量PrA樹(shù)脂的靜態(tài)容量的此類實(shí)驗(yàn)的結(jié)果描繪于圖2。如圖2所示，各PrA樹(shù)脂與 IgG的相互作用未受到向樹(shù)脂加入熒光染料的干擾。靜態(tài)容量的測(cè)量值還顯示于圖2的表中。
用(FR1的A28tlJ(稀釋系數(shù)+F&的A28tlJ(稀釋系數(shù))/IgG的消光系數(shù)測(cè)量洗出液濃度[IgG]。然后用 Jasco FP-6500 熒光計(jì)(Great Dunmow，UK)用 495nm 的激發(fā)波長(zhǎng)于 519nm 測(cè)量熒光。將未標(biāo)記的介質(zhì)的FR1和熒光值從對(duì)應(yīng)的標(biāo)記介質(zhì)的FR1和熒光值中減去。進(jìn)一步地從以上得到的部分1和部分2的熒光信號(hào)的總和減去Frtogd以獲得[FLlgJ。 用下式計(jì)從樹(shù)脂的洗出的蛋白質(zhì)A {(FLlgc) / ((FL消化物)/ [PrA])}} / [IgG]。
根據(jù)本說(shuō)明書中引用的文獻(xiàn)的教導(dǎo)可最全面地理解本說(shuō)明書，這些文獻(xiàn)通過(guò)援引加入本文。本說(shuō)明書中的實(shí)施方案提供了本發(fā)明的實(shí)施方案的說(shuō)明并且不應(yīng)被解誓為限制其范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地意識(shí)到本發(fā)明包括許多其他實(shí)施方案。所有出版物和發(fā)明以其整體通過(guò)援引加入本文。對(duì)于通過(guò)援引加入的材料與本說(shuō)明書相?；虿灰恢碌那闆r， 以本說(shuō)明書代替任何此類材料。本文中任何文獻(xiàn)引用不是承認(rèn)這些文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
除非另外指明，用于包括權(quán)利要求在內(nèi)的本說(shuō)明書中的表示成分、細(xì)胞培養(yǎng)、處理?xiàng)l件等的所有數(shù)字應(yīng)理解為均受到術(shù)語(yǔ)“約”的修飾。因此，除非另外相反地說(shuō)明，數(shù)字參數(shù)是近似值并可根據(jù)本發(fā)明所尋求獲得的期望性質(zhì)而變化。除非另外說(shuō)明，出現(xiàn)在一系列要素之前的術(shù)語(yǔ)“至少”應(yīng)理解為指該系列中的每一要素。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解或僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能確定本文所述的發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等同。以下的權(quán)利要求包括這些等同。
在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的條件下可對(duì)其進(jìn)行許多修改和變化，修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見(jiàn)的。本文所述的特定實(shí)施方案僅以舉例方式提供并無(wú)意具有任何限制性。本說(shuō)明書和實(shí)施例僅應(yīng)看做是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由以下的權(quán)利要求指明。
權(quán)利要求
1.定量PrA系親和色譜樹(shù)脂的PrA泄露的方法，所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrA系色譜樹(shù)脂；(b)將標(biāo)記的樹(shù)脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用適合的方法處理第一部分以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的PrA，并向所述第二部分加入過(guò)量的免疫球蛋白(Ig)；(d)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第一部分中經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FL^fcft)和PrA濃度 ([PrA])；以及(e)測(cè)量來(lái)自步驟(c)所述第二部分的樹(shù)脂Ig洗出液濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg)，其中通過(guò)計(jì)算KFLIg)/((FL消化物)/[PrA]))}/[Ig]定量PrA泄露。
2.定量PrA系親和色譜樹(shù)脂的PrA泄露的方法，所述方法包括以下步驟(a)用一種或多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述PrA系色譜樹(shù)脂；(b)向標(biāo)記的樹(shù)脂加入過(guò)量的免疫球蛋白(Ig)并測(cè)量來(lái)自所述樹(shù)脂的樹(shù)脂Ig洗出液濃度([Ig])和Ig洗出液中的熒光信號(hào)(FLlg)；(c)從所述樹(shù)脂除去殘留的Ig，然后用適合的方法處理所述樹(shù)脂以從所述樹(shù)脂釋放標(biāo)記的PrA;以及(d)測(cè)量來(lái)自經(jīng)處理的樹(shù)脂的熒光(FLiimft)和PrA濃度([PrA])，其中通過(guò)計(jì)算KFLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量PrA泄露。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括用陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水交換色譜、弱分配色譜、羥基磷灰石色譜中的一種或多種或它們的任意組合除去洗出的 PrA的步驟。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自AlexaFluor 488、Dylight 488、HiLyte Fluor 488、5_FAM，SE 和 6-FAM，SE。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述適合的方法包括化學(xué)處理。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述適合的方法包括酶處理。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酶處理包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和枯草溶菌素。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述化學(xué)處理包括使用酸或堿。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PrA系色譜樹(shù)脂選自ProS印AHigh Capacity、ProSep A Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、Sepharose Protein A、Sartobind Protein A 以及 Protein Sepharose Fast Flow。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用熒光計(jì)測(cè)量所述熒光。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用適合的pH洗脫所述Ig。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述Ig是單克隆的。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述Ig是多克隆的。
15.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG。
16.如權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括用陽(yáng)離子交換色譜、陰離子交換色譜和疏水交換色譜、弱分配色譜、羥基磷灰石色譜中的一種或多種或它們的任意組合除去洗出的PrA的步驟。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自AlexaFluor 488、Dylight 488、HiLyte Fluor 488、5_FAM，SE 和 6-FAM，SE。
18.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述適合的方法包括化學(xué)處理。
19.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述適合的方法包括酶處理。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述酶處理包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和枯草溶菌素。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化學(xué)處理包括使用酸或堿。
22.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述PrA系色譜樹(shù)脂選自印AHigh Capacity、ProSep A Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、Sepharose Protein A、Sartobind Protein A 禾口 Protein Sepharose Fast Flow。
23.如權(quán)利要求2所述的方法，其中用熒光計(jì)測(cè)量所述熒光。
24.如權(quán)利要求2所述的方法，其中用適合的pH洗脫所述Ig。
25.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述Ig是單克隆的。
26.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述Ig是多克隆的。
全文摘要
本發(fā)明提供定量蛋白質(zhì)系親和色譜介質(zhì)(例如蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L系親和色譜介質(zhì))的蛋白質(zhì)泄露的方法，其中此類蛋白質(zhì)用于分離和/或除去結(jié)合所述蛋白質(zhì)的分子(例如免疫球蛋白)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102187227SQ200980140986
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月15日
發(fā)明者卞南英 申請(qǐng)人:米利波爾公司