專利名稱：神經(jīng)性自身免疫紊亂的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身免疫紊亂，尤其涉及診斷哺乳動物這種紊亂的方法。同時本發(fā)明提供用于所述診斷的試劑盒，和用于檢測自身抗體的方法和組合物。
背景技術(shù)：
電壓門控性鉀通道(Voltage-gated potassium channel ；VGKC)抗體與三個主要臨床癥狀有關(guān)神經(jīng)性肌強直(NMT)、莫旺氏綜合征(MoS)、和邊緣葉腦炎(LE)。NMT是指末稍夕卜周神經(jīng)過度興奮綜合征(peripheral nerve hyperexcitability syndromes),會導(dǎo)致肌肉痙攣和僵直，有時疼痛。MoS是指NMT加上自發(fā)癥狀，例如，出汗過度、便秘、心率異常， 和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，尤其是錯亂、幻覺和失眠。與抗VGKC抗體有關(guān)的LE包括受限制中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的特征失憶癥、人格障礙或精神病，以及癲癇發(fā)作(癲癇癥)。這些疾病(尤其是MoS)可能與胸腺或其他腫瘤(肺癌、淋巴瘤、婦科惡性腫瘤)有關(guān)，但與抗VGKC抗體有關(guān)的LE則主要是非副腫瘤性的(non-paraneoplastic)。所有這三種病癥都為亞急性發(fā)作， 且有免疫療法反應(yīng)。此外，在某些具有其它臨床病癥例如特發(fā)性癲癇的患者身上也發(fā)現(xiàn)了這些抗體。到目前為止，大部分患者為成人，但也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些具有這些抗體和LE或癲癇的兒童。在體內(nèi)已經(jīng)由NMT證明[1]，大量證據(jù)支持LE和MoS免疫球蛋白G (IgG)的致病作用。第一，患者在血漿交換后經(jīng)常經(jīng)歷快速的臨床痊愈[2』。第二，單個患者中的抗體濃度測定與臨床狀態(tài)的變化相關(guān)良好[2、3]。第三，患者IgG結(jié)合在海馬體上，該解剖區(qū)域可定位幾乎所有的CNS臨床特征[2_4]。過去5年在英國已經(jīng)診斷了近500例具有抗VGKC抗體和有CNS特征的患者(A Vincent未公開的觀察報告)?；颊哐灞徽J(rèn)為是含有抗-VGKC抗體[5、6]，該患者血清能免疫沉淀碘化的α _樹眼鏡蛇毒素(I125-α DTX)標(biāo)記的洋地黃皂苷增溶的哺乳動物腦勻漿。電壓門控性鉀通道由多個結(jié)構(gòu)不同的通道家族構(gòu)成，包括Kvl (Shaker)亞型[Kvl (shaker) subtype]。Kvl α 亞單位可特異地與其它kvl亞單位同或異四聚(homo- or heterotetramerise)以形成活性通道。α DTX與Kvl. 1，1.2和1.6通道結(jié)合，Kvl. 1，1.2和1. 6都存在于腦組織中，且Kvl. 1 和1. 2被發(fā)現(xiàn)存在于外周神經(jīng)中。這三種亞單位的功能和表面表達(dá)可由Kvl. 4和Κνβ 1、2 和3調(diào)節(jié)，其中Kv β 2是腦組織中存在量最大的Kv β成員。LE和MoS患者通常具有較匪T患者更高的抗VGKC抗體濃度。匪T抗VGKC抗體的抗原目標(biāo)和功能效果先前已經(jīng)被詳細(xì)地研究過，且NMT IgG已經(jīng)被顯示結(jié)合于表達(dá)的Kvl 并下調(diào)Kvl電流[5_7]，但僅有一項研究檢測了 LE或MoS抗VGKC抗體[8]。最近，大量新的Kvl相互作用蛋白(Kvl -interacting proteins)被揭示[9、1CI]。本發(fā)明表明Kvl復(fù)合蛋白例如三種復(fù)合蛋白CASPR2 (接觸蛋白相關(guān)蛋白2)、Lgil (富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活基因1)、TAG1 (瞬變軸突糖蛋白1，也就是接觸蛋白2)，而未必是Kvl蛋白本身，是某些LE和MoS患者自身抗體(autoantibodies)的目標(biāo)
發(fā)明內(nèi)容
按照第一個方面，本發(fā)明提供一種診斷哺乳動物的自身免疫神經(jīng)性紊亂的方法， 包括檢測步驟，在取自哺乳動物的體液樣品中檢測至少一種Kvl復(fù)合蛋白的表位的自身抗 /[本(autoantibodies)。該至少一種Kvl復(fù)合蛋白可復(fù)合或結(jié)合于其它Kvl復(fù)合蛋白，或該至少一種Kvl 復(fù)合蛋白可獨立于Kvl復(fù)合物，例如不共定位，或不物理結(jié)合到該復(fù)合物。自身抗體可結(jié)合到正常復(fù)合或結(jié)合的蛋白上，即便當(dāng)它們不處于復(fù)合或結(jié)合狀態(tài)時。Kvl復(fù)合蛋白可以是必需的或非必需的Kvl輔助蛋白。Kvl復(fù)合蛋白可包含Kvl， CASPR2, Lgil and TAGl 中的至少一個。Kvl 復(fù)合蛋白可包含 CASPR2, Lgil and TAGl 中的至少一個。在一個實施方式中Kvl復(fù)合蛋白可不包含Kvl。CASPR2, Lgil and TAGl已經(jīng)被顯示出是與Kvl相互作用或物理地聯(lián)結(jié)的蛋白。 例如，CASPR2和Tagl對于Kvl蛋白在朗維結(jié)(nodes of Ranvier)上的定位是必要的。Kvl復(fù)合蛋白可包括CASPR2或主要由CASPR2組成。Kvl復(fù)合蛋白可包括Lgil或主要由Lgil組成。Kvl復(fù)合蛋白可包括TAGl或主要由TAGl組成。Kvl復(fù)合蛋白可包括除 CASPR2, Tagl, Lgil, Kvl 之外的 Kvl 復(fù)合蛋白，或主要由除 CASPR2，Tagl, Lgil, Kvl 之外的Kvl復(fù)合蛋白組成。優(yōu)選地，自身免疫神經(jīng)性紊亂為邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直或相關(guān)病癥。優(yōu)選地，神經(jīng)性紊亂為邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直。當(dāng)神經(jīng)性紊亂為邊緣葉腦炎時，神經(jīng)性紊亂的主要特征包括癲癇發(fā)作，例如癲癇癥，或失憶癥，或單純的精神錯亂。當(dāng)自身免疫神經(jīng)性紊亂為莫旺氏綜合癥和/或神經(jīng)性肌強直時，Kvl復(fù)合蛋白可包括CASPR2。針對CASPR2的自身抗體可能反映了胸腺惡性腫瘤和/或其他惡性腫瘤增加的風(fēng)險、或可能與胸腺惡性腫瘤和/或其他惡性腫瘤增加的風(fēng)險相關(guān)。當(dāng)自身免疫神經(jīng)性紊亂為邊緣葉腦炎或主要為癲癇癥時，Kvl復(fù)合蛋白可包括 Lgil0當(dāng)自身免疫神經(jīng)性紊亂為神經(jīng)性肌強直和/或邊緣葉腦炎和/或癲癇癥時，Kvl復(fù)合蛋白可包括TAGl。當(dāng)自身免疫神經(jīng)性紊亂為Kvl-復(fù)合蛋白可包括CASPR2和TAGl。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括步驟a)將體液與Kvl復(fù)合蛋白或其抗原決定簇相接觸；和b)檢測抗體-抗原復(fù)合物，其由Kvl復(fù)合蛋白或其抗原決定簇與存在于體液中的抗體形成，其中，上述復(fù)合物的存在反映了自身免疫神經(jīng)性紊亂，進(jìn)一步地是邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直或相關(guān)病癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法結(jié)合臨床癥狀的評估來進(jìn)行。本發(fā)明的方法和臨床癥狀的分析的結(jié)合可用來確定個體身上具體的神經(jīng)性紊亂。自身抗體可通過任何免疫分析技術(shù)檢測出，許多這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。適合的技術(shù)的實例包括ELISA、放射性免疫測定、競爭分析、抑制分析、夾芯式分析等。 總的來說，這類分析使用抗原，其可能被固定于固體支撐物上。使待測樣品與抗原接觸，如果抗原特定的自身抗體存在于樣品中，他們會與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而形成自身抗體-抗原復(fù)合物，其可隨后被檢測出或檢測定量。或者，抗原可在表面上或滲透化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[16]。 自身抗體-抗原復(fù)合物的檢測可使用作為第二抗體的人免疫球蛋白抗體進(jìn)行，典型的是抗IgG或抗人lgM，它們分別能夠識別所有的人IgG或IgM通有的一般特征。第二抗體通常由酶標(biāo)記，例如；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidise, HRP),以此自身抗體或抗原或第二抗體復(fù)合物的測定可通過加入酶底物，以及后續(xù)的比色測定、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行，或者第二抗體由熒光信號標(biāo)記[16]。優(yōu)選地，該方法使用的第二抗體，是經(jīng)標(biāo)記或標(biāo)簽的抗IgG抗體。優(yōu)選地，抗IgG抗體是標(biāo)記了報道分子(importer molecule)的抗體。該報道分子可以通過重金屬、熒光或冷光分子、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。酶標(biāo)記可以是 HRP。優(yōu)選地，當(dāng)與陽性或陰性對照進(jìn)行比較時，來自抗IgG抗體的信號強度反映了體液中Kvl復(fù)合蛋白自身抗體的相對含量。按照另一方面，本發(fā)明提供一種分析試劑盒用于診斷哺乳動物自身免疫神經(jīng)性紊亂包括至少一種Kvl復(fù)合蛋白的至少一種表位。按照另一方面，本發(fā)明提供一種分析試劑盒用于檢測哺乳動物自身免疫神經(jīng)性紊亂增加的風(fēng)險，包括至少一種Kvl復(fù)合蛋白的至少一種表位。優(yōu)選地，該試劑盒包括該試劑盒的使用方法說明。優(yōu)選地，該試劑盒還包括使至少一種Kvl復(fù)合蛋白的至少一種表位與哺乳動物體液樣品相接觸的方法。優(yōu)選地，神經(jīng)性紊亂是邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直或相關(guān)病癥。相關(guān)病癥包括不具嚴(yán)重癲癇發(fā)作的失憶癥，不具嚴(yán)重失憶癥的癲癇癥和/或不具嚴(yán)重失憶癥的人格障礙或精神紊亂和/或胸腺惡性腫瘤。按照本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)而包括制備校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照另一方面，本發(fā)明提供一種分離或純化的自身抗體，其特異用于至少一種Kvl 復(fù)合蛋白的表位。這樣的抗體可能分離于體液樣品。按照另一方面，本發(fā)明提供一種分離或純化的特異用于至少一個Kvl復(fù)合蛋白自身抗體的抗體或抗體片斷。這種抗體可作為藥物或用于制備治療神經(jīng)性紊亂和/或相關(guān)病癥的藥物。優(yōu)選地，神經(jīng)性紊亂是指邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、或神經(jīng)性肌強直。這種抗體可包含在藥物組合物中，與藥物可接受載體、賦形劑或稀釋劑一起。相關(guān)病癥包括不具嚴(yán)重癲癇發(fā)作的失憶癥，不具嚴(yán)重失憶癥的癲癇癥和/或不具嚴(yán)重失憶癥的人格障礙或精神紊亂和/或胸腺惡性腫瘤。單克隆的或多克隆的抗體或抗體片斷可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來制備。特異用于Kvl復(fù)合蛋白自身抗體的抗體還可用于診斷試劑盒，用來檢測神經(jīng)性紊亂例如邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直或相關(guān)病癥，或用來確定這些病癥或胸腺惡性腫瘤所增加的的患病風(fēng)險。體液用于本發(fā)明任何方面可以包括血漿、血清、全血、尿液、汗液、淋巴液、糞便、腦脊髓液或乳頭抽吸液。優(yōu)選地，體液是血清或血漿。按照再一方面，本發(fā)明提供一種治療患者所患的神經(jīng)性紊亂例如邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征或相關(guān)病癥的方法，包括向所述患者施用有效劑量的如本發(fā)明所述的抗體或至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位。按照另一方面，本發(fā)明提供一種確定能夠緩解和治療神經(jīng)性紊亂例如邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征或相關(guān)病癥的化合物的方法，包括步驟在存在至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位的情況下，使候選化合物與能夠結(jié)合至少一種Kvl復(fù)合蛋白的抗體相接觸，其中，阻止所述抗體結(jié)合到至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位的化合物即為用于治療神經(jīng)性紊亂的候選化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解上面討論的任何優(yōu)選特征能適用于本發(fā)明的任一方面?，F(xiàn)在僅通過舉例、參照下述附圖和實施例來描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。


圖1- LE或MoS血清從兔子皮層提取物中沉淀Kvl但不直接與Kvl結(jié)合。A.在增溶的兔子皮層勻漿中LE和MoS血清滴定沉淀高含量的I125- α DTX標(biāo)記的 Kvl。B.抗Kvl. 1、1.2和1. 6抗體(1 500)，結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)表位，與滲透化的Kvl. 1,1. 2 或1. 6轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合。通過抗兔IgG (1 750 ；568nm)觀察?？筀vl抗體的良好特異性被觀察到。C. HEK細(xì)胞經(jīng)Kvl和增強型綠色熒光蛋白(EGFP) (488nm)共轉(zhuǎn)染。LE (n=15)和 MoS (n=6)血清(1 :20)用于Kvl. 1-EGFP共表達(dá)的HEK細(xì)胞，未被檢測到結(jié)合在使用了抗人IgG Alexa Fluor的表面上。Kvl亞單位聯(lián)合體的共轉(zhuǎn)染之后未見結(jié)合，包括1. 1、1. 2、 1.4、1.6和32。但是，指向1^1.1(1 100)細(xì)胞外表位的抗體確實與Kvl轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合。圖2-功能性的、α DTX敏感的Kvl電流未受LE和MoS IgG急性應(yīng)用的影響。Α. ΗΕΚ-293細(xì)胞經(jīng)Kvl. 1轉(zhuǎn)染表現(xiàn)了 α DTX敏感的電流。B.類似地，ΗΕΚ493細(xì)胞經(jīng)Kvl. 6轉(zhuǎn)染表現(xiàn)了大振幅α DTX敏感電流。這些電流較Kvl. 1介導(dǎo)電流具有明顯更大的振幅。C和D. Kvl. 1 (C)和Kvl. 6 (D)電流未受對照或患者血清急性應(yīng)用的影響。圖3- α DTX敏感的Kvl電流未受LE和MoS IgG慢性應(yīng)用的影響。A和B.在孵育患者血清1天后，α DTX敏感的Kvl. 1 (A)和Kvl. 6 (B)介導(dǎo)電流未顯著減少(Ρ> 0. 05，單因素方差分析(one-way AN0VA))。C和D.同樣地，在患者血清孵育3天后，未有明顯減少在Kvl. 1 (C)和Kvl. 6 (D) 介導(dǎo)電流中被觀察到(P> 0.05，單因素方差分析(one-way AN0VA))。圖4-患者血清和抗Kvl沉淀不同含量的I125- α DTX標(biāo)記Kvl取自兔皮層提取物， 患者血清不能沉淀I125- α DTX標(biāo)記Kvl取自轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物。Α.在各個分析(η=3個實驗)中，多個抗Kvl商品化抗體，LE (n = 5)和MoS (η =3)血清滴定以50000cpm取自兔皮層提取物的I125-CiDTX標(biāo)記Kvl。健康對照數(shù)值被減去以獲得具體數(shù)據(jù)。B.最大數(shù)量的I125-Ci DTX結(jié)合位點被圖4A中的每個抗血清沉淀，并通過單位點結(jié)合雙曲線進(jìn)行預(yù)測(GrapUad Prism V5)。C.提取自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的I125-α DTX標(biāo)記的Kvl. 1/1. 2/1. 4/1. 6/β 2未被LE或MoS 血清(5 μ 1)沉淀，但被抗Kvl抗體沉淀(5μ 1，η=5個實驗)。用健康對照血清或不相關(guān)的抗兔抗體進(jìn)行的非特異性結(jié)合已經(jīng)被扣除。圖5-LE和MoS血清結(jié)合位點從I125- α DTX復(fù)合物中分離。CASPR2抗體免疫共沉淀I125- α DTX取自于腦提取物，并類似于LE/MoS血清進(jìn)行分離。A. LE (n = 5)和MoS (n = 3) IgG結(jié)合到I125-α DTX標(biāo)記的、洋地黃皂苷增溶的兔皮層復(fù)合物顯示出比抗Kvl. 1/1. 2IgG結(jié)合(所有8個血清結(jié)合的結(jié)果)更大的對十二烷基硫酸鈉(SDS)的敏感性。B.抗CASPR2抗體沉淀20%的全部I125-Q DTX結(jié)合位點取自標(biāo)記的腦勻漿，類似于LE和MoS血清中所發(fā)現(xiàn)的(圖4A)。此外，抗Lgil抗體沉淀大于60%的全部I125- α DTX 結(jié)合位點，抗TAGl抗體沉淀小于10%的全部I125- α DTX結(jié)合位點。因此，全部I125- α DTX結(jié)合位點中大部分與Lgil復(fù)合，小部分與TAGl復(fù)合。C.與如A所示相似的實驗中，CASPR2抗體(平均2個實驗)和Lgil抗體(平均3 個實驗)的分離模式與LE患者的IgG (η=5)相似，與抗Kvl. 1/1. 2結(jié)合相比。圖6-某些LE/MoS血清直接結(jié)合到CASPR2的細(xì)胞外的區(qū)域。在溶液中的結(jié)合是高度特異性的，且這些濃度與I125- α DTX免疫沉淀濃度相關(guān)。A. LE和MoS血清(1 :100)結(jié)合到表達(dá)的CASPR2的細(xì)胞外區(qū)域(xlOOO倍放大)。B.用5 μ 1患者血清孵育IOOfU (熒光單位)的CASPR2-EGFP提取物，并進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。188個已知免疫沉淀I125-aDTX標(biāo)記的腦勻漿的血清中，32個(18%)也沉淀 CASPR2-EGFP。具有其他神經(jīng)性疾病的患者的血清不能沉淀I125-α DTX結(jié)合位點的，在使用 CASPR2-GFP熒光免疫沉淀分析(FIPA)時不呈陽性。這些疾病包括腦病(ΕΝ)、胸腺瘤、多發(fā)性硬化(MS)、植物性神經(jīng)病(ANS)和健康對照(HC)。這些血清不能沉淀或結(jié)合MuSK-EGFP 的細(xì)胞外區(qū)域(圖6A，下方panel)。C.抗CASPR2 FIPA滴定量與I125-α DTX腦勻漿免疫沉淀滴定量的呈線性關(guān)系 (Spearman correlation, r2=0. 89, Ρ<0·0001)οD.抗CASPR2陽性血清對CASPR2細(xì)胞外區(qū)域的免疫吸附避免了沉淀I125-α DTX腦提取物*。但是，對Kvl. 1-1. 2-1. 6表達(dá)的HEK細(xì)胞的細(xì)胞外區(qū)域的吸附不能移除I125-α DTX 腦提取物沉淀。圖7-CASPR2抗體為IgGl和IgG4亞類，且具有高的親和性。它們不能結(jié)合在蛋白質(zhì)印跡上的線性化CASPR2。A.亞類特定的第二抗體IgG與已經(jīng)結(jié)合到CASPR2-GFP表達(dá)的HEK細(xì)胞上的抗 CASPR2抗體的結(jié)合，允許抗CASPR2抗體亞類的相對量的定量測定。B.抗體親和性的斯卡查德分析(Scatchard analyses)通過用CASPR2-GFP提取物滴定非飽和體積的患者血清(n=5)來計算。得到Kd值為1.2X10_8M (士標(biāo)準(zhǔn)偏差 0. 54 X I(T8M)。
C. CASPR2分子量為180KDa。鼠抗CASPR2抗體在CASPR2提取物中檢測到一個 180KDa條帶(+，圈出的)，但在Kvl. 1/1. 2/1. 6提取物中未檢測出(*)。已證明的抗CASPR2 陽性血清在蛋白質(zhì)印跡的CASPR2提取物(+ )中不能結(jié)成一個固定的條帶。圖8-血清IgG結(jié)合到TAGl轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞上。A.商品化的抗體結(jié)合在TAGl轉(zhuǎn)染細(xì)胞上證明了其是表達(dá)在細(xì)胞表面上。B.匪T患者血清IgG結(jié)合到TAGl-HEK (EGFP陽性)細(xì)胞上的例子。108個臨床確診的患者經(jīng)測試的血清中，僅4個明確地結(jié)合到TAGl上。其中的3個為神經(jīng)性肌強直患
者οC.對照血清((n=40))不發(fā)生結(jié)合。圖9-血清IgG與Lgil轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的結(jié)合。
A.血清IgG結(jié)合到Lgil-HEK細(xì)胞的兩個例子。在108個經(jīng)測試的血清中，39個結(jié)合到Lgil轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。對照血清(其它疾病，健康個體)不發(fā)生結(jié)合(ri=70)。B.但是，該結(jié)合不是專門地針對EGFP共轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞，這表明(如前所報道的 [24~25])，Lgil被分泌到基質(zhì)中且其中一些同時結(jié)合到轉(zhuǎn)染(EGFP陽性，綠色)HEK細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染(EGFP陰性，非綠色)HEK細(xì)胞的表面。圖10-具有Lgil反應(yīng)活性的血清IgG與未轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞的結(jié)合。A. Lgil培養(yǎng)基，未轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞用Lgil轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞的上清液孵育1小時，被患者血清IgG結(jié)合，該患者血清IgG之前被認(rèn)為是與Lgil結(jié)合的。(圖9)。B. MUSK培養(yǎng)基，未轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞用MUSK轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞上清液孵育1小時，未被這些患者IgG結(jié)合。圖11-常規(guī)臨床測試的VGKC抗體滴定量被顯示在具有對應(yīng)于不同VGKC Kvl復(fù)合蛋白的抗體的患者中。對照血清沉淀< 100 PM (直線)。圖12-患者VGKC抗體滴定量被分為不同的臨床表型，由指定的神經(jīng)病學(xué)專家提交的問卷確定。圖13-表格所示為所研究的108位患者樣品的臨床特征。圖14-表格所示為按照抗體特異性分類的患者的臨床特征。39位具有Lgil抗體的患者當(dāng)中，36位患者患有邊緣性腦炎，無人患有神經(jīng)性肌強直，無人患有胸腺惡性腫瘤。 通過對比，27位具有CASPR2抗體的患者中，10位患者患有莫旺氏綜合癥，8位患者患有神經(jīng)性肌強直，10位患者患有胸腺惡性腫瘤。因此，對這兩種不同抗體的識別解釋了與“VGKC” 抗體有關(guān)的大部分的臨床異質(zhì)性。
具體實施例方式MM
LE/MoS血清免疫沉淀取自兔皮層提取物的I125- α DTX-VGKC,但不抑制VGKC Kvl. 1和 1. 6電流
LE/MoS血清可通過根據(jù)其能夠免疫沉淀取自兔子或人類皮層的洋地黃皂苷提取物的 I125-α DTX標(biāo)記的VGKC的特點而被識別確定，如本研究中所用的8個血清(5個LE，3個 MoS)所示(圖1Α)?？贵w滴定量從這些樣品中測定并在2006至6412ρΜ之間變化(正常范圍 <100ρΜ)。為了確定抗體是否與單個VGKC結(jié)合，我們表達(dá)了單個Kvl. 1、1. 2和1. 6亞單位在 HEK細(xì)胞中。我們首先用兔抗Kvl抗血清間接免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)了存在適當(dāng)?shù)膩唵挝槐磉_(dá)。 由于這些兔抗體結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)表位，我們對細(xì)胞進(jìn)行滲透(permeabilised the cells)。這些抗體顯示出了對適當(dāng)?shù)腒vl亞型的特異性(圖1B)。此外，這些細(xì)胞在其表面上表達(dá)了一些Kvl亞單位，如Kvl. 1細(xì)胞外免疫染色(immunostaining)所示(圖1C)，也如對未滲透的細(xì)胞上I125- α DTX結(jié)合位點的測試所示。無論如何，令人失望地是，我們測量的21個LE/ MoS血清中沒有一個顯示出相似的可測表面結(jié)合(圖1C)。仍然存在血清對Kvl的功能或表達(dá)產(chǎn)生影響的可能性。轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞證明了取決于電壓的電流被α DTX所抑制(圖2Α、B)。我們在血清(1 50_1 1000稀釋)中孵育表達(dá)的Kvl. 1或1.6的HEK細(xì)胞，并比較加入血清前后的電流(圖2C、D)。當(dāng)與培養(yǎng)基單獨對比時，健康血清未改變Kvl電流。盡管在記錄的平均電流上存在某些變化，但總體來說，相比于在健康對照血清中的孵育，患者血清對電流沒有顯著影響(單因素方差分析(one-way AN0VA);圖 2C、D)。某些抗體不直接影響其目標(biāo)抗原的功能，但通過表面表達(dá)的減少引起內(nèi)化造成對時間和溫度的依賴性增加[12~13]。為了觀察患者抗體是否隨著時間而減少細(xì)胞表面表達(dá)，在測試0 01乂敏感電流前，我們在371下孵育細(xì)胞1天或3天[12]。但是，這對α DTX敏感電流沒有影響(圖3A-D)。因此，總體來說，這些結(jié)果驗證了在HEK細(xì)胞表面上存在功能性的 α DTX結(jié)合Kvl，但不能證明患者抗體結(jié)合在這些細(xì)胞或影響了通道的功能或者數(shù)量。LE/MoS血清不沉淀取自腦提取物的1125_ α DTX-VGKC亞群，不沉淀取自Kv轉(zhuǎn)染的 HEK 細(xì)胞的 Iim- α DTX-VGKC
為了進(jìn)一步研究，我們比較了 I125- α DTX標(biāo)記的提取自兔皮層的VGKC用患者血清與用兔抗體時對Kvl. 1、1. 2和1. 6的免疫沉淀。所有哺乳動物腦I125-Ci DTX結(jié)合位點被認(rèn)為含有Kvl. 2[14]?？筀vl. 2免疫沉淀81%的50000最大I125- α DTX結(jié)合位點(圖4Α)。加入Kvl. 1 或Kvl. 6未能獲得進(jìn)一步的沉淀(補充數(shù)據(jù)，圖1Β)。因此，僅19%的I125-Ci DTX未與VGKC 結(jié)合。相比較，通過抗Kvl. 1、1.6和1.4的沉淀分別穩(wěn)定在51%、17%和7% (圖4Α)。這些數(shù)據(jù)與先前未公開的使用替代的Kvl抗體的實驗結(jié)果一致(補充數(shù)據(jù)1C)。當(dāng)我們以相同分析方法測試單個LE/MoS血清時，即時在血清過量的情況下，他們也一致地免疫沉淀小于 I125-α DTX的最大量。盡管對每個血清的穩(wěn)定值不相同(圖1Α)，對于所有測試的LE/MoS血清而言，平均值為最大值的32% (23-43%范圍)(圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明血清可能結(jié)合于α DTX標(biāo)記的通道的亞群。為進(jìn)一步探究，我們在 HEK細(xì)胞中單獨地和一起地表達(dá)了 Kvl. 1、1. 2、1. 4、1. 6和β 2亞單位，并在洲洋地黃皂苷中以與制備兔皮層提取物相同的方式提取細(xì)胞。提取物用I125-α DTX進(jìn)行標(biāo)記并用抗Kvl 和LE/MoS血清測試免疫沉淀反應(yīng)。單個的兔抗體的結(jié)果與兔皮層提取物中的發(fā)現(xiàn)類似，但是用LE/MoS血清時未發(fā)生沉淀(圖4C)。因此，這些結(jié)果使我們得出結(jié)論，LE/MoS抗體不直接Kvl亞單位與同聚或異聚結(jié)合。 LE/MoS結(jié)合到Kvl復(fù)合蛋白
對于這些發(fā)現(xiàn)的一種解釋是，LE/MoS抗體結(jié)合到與兔皮層提取物中的Kvl相關(guān)的蛋白上，但這種蛋白不存在于轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞中。為測試這種假設(shè)，我們對I125- α DTX標(biāo)記的兔皮層提取物用濃度增加的十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行處理，并用兔抗Kvl抗體和LE/MoS血清進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。結(jié)果證明，患者抗體和α DTX復(fù)合物的結(jié)合與Kvl. 1和1. 2抗體和 α DTX復(fù)合物的結(jié)合之間沒有關(guān)系(圖5Α)，前者對SDS處理敏感得多。
有數(shù)種蛋白已經(jīng)被報道過與Kvl或DTX在腦提取物中結(jié)合位點有關(guān)，包括富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活基因1 (Lgil)、接觸蛋白相關(guān)蛋白2 (CASPR2)、瞬變軸突糖蛋白1 (TAGl) 和突觸后密度(PSD)成員[9、1(K15]。當(dāng)我們用這些蛋白測試抗體時，抗Lgil免疫沉淀61%的 α DTX結(jié)合位點，TAGl免疫沉淀約5%。但是，抗CASPR2抗體證明與LE/MoS血清在從兔提取物中沉淀的α DTX位點的比例上(圖5Β)，和在對濃度增加的SDS的敏感性上(圖5C)均具有類似的反應(yīng)活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，在我們的兔皮層提取物中的很大部分的aDTX標(biāo)記的 VGKC與CASPR2有關(guān)，并提示LE/MoS抗體可能直接結(jié)合于CASPR2。類似地，使用Lgil抗體的沉淀反應(yīng)證明了對SDS敏感性比Kvl特異抗體的更好(圖5C)，提示了這種蛋白也是LE/ MoS抗體的潛在目標(biāo)。
某些LE/MoS血清抗體結(jié)合到CASPR2
為了直接查明LE/MoS抗體是否結(jié)合CASPR2，在細(xì)胞內(nèi)的C末端引入EGFP來標(biāo)記蛋白之后，我們在HEK細(xì)胞中表達(dá)了全長度人CASPR2。很多LE/MoS血清結(jié)合到這些細(xì)胞的表面，而不結(jié)合到僅用載體(Vector)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面(圖6A)。使用EGFP標(biāo)記的CASPR2的好處在于它能提供溶液中血清抗體的快速定量測定方法(如Waters等人，水通道蛋白4抗體 [16])。我們通過測量沉淀中的綠色熒光對188個血清免疫沉淀EGFP-CASPR2的能力進(jìn)行測試(圖6B)；這些血清比對照沉淀更多I125-α DTX標(biāo)記的兔皮層提取物。健康個體或其它神經(jīng)性疾病患者的血清未沉淀可測的熒光，且IOFU被認(rèn)為是cut-off值。總共18%的LE/MoS 血清是陽性，且每個血清沉淀的值在12-100FU之間。這些血清全都結(jié)合到CASPR2的細(xì)胞外區(qū)域(圖6A)。在對這種抗體呈陽性的患者中，結(jié)合到兔皮層提取物的VGKC與直接結(jié)合到 CASPR2之間存在非常緊密的聯(lián)系(圖6C)。為進(jìn)一步確認(rèn)抗體的特異性，我們用CASPR2表達(dá)的HEK細(xì)胞預(yù)吸附血清。這中止了 CASPR2-EGFP提取物中CASPR2的免疫沉淀反應(yīng)，同時也中止了取自兔皮層提取物的I125-α DTX-VGKC的免疫沉淀反應(yīng)(圖6D)?？笴ASPR2抗體的特性
許多引起疾病的自身抗體具有很高的親和性、IgG、補體激活和構(gòu)象依賴。用同種特異的第二抗體對CASPR2-EGFP表達(dá)HEK細(xì)胞免疫染色使得能夠測定CASPR2 IgG亞類的相對豐度(圖7A)。大部分的CASPR2抗體為IgGl和IgG4亞類，少量為IgG2，且?guī)缀鯖]有IgG3。我們還測試了有限量的單個患者的血清與不同濃度的CASPR2-EGFP的結(jié)合，并通過斯卡查德作圖(Scatchard plots)對結(jié)果進(jìn)行了分析。分析5個患者得出平均Kd為1. 2+/-0. 54X IO"8 (SD，圖7B)。使用蛋白質(zhì)印跡法，商品化的抗CASPR2抗體在CASPR2轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物中識別出一條分子量為ISOKDa的明顯條帶，但是被測的10個CASPR2抗體陽性患者未結(jié)合到該條帶上，這表明CASPR2抗體結(jié)合到構(gòu)象表位上，這些構(gòu)象表位是不存在于變性的CASPR2提取物中(圖7C)。少數(shù)VGKC抗體陽性血清結(jié)合到TAGl
我們最初沒有對很多血清測試其與TAGl的結(jié)合，因為抗TAGl抗體僅免疫沉淀小于10% 的取自腦提取物的I125-α DTX結(jié)合位點(圖5B)。圖8Α表明，TAGl轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞在其表面上具有TAG1，這被兔抗TAGl的結(jié)合得以證明。兩個患者血清的IgG結(jié)合顯示在圖8Β中。 血清結(jié)合到未滲透的TAGl轉(zhuǎn)染(EGFP共轉(zhuǎn)染)細(xì)胞的細(xì)胞外表面。在108個測試的血清中， 我們在4個中發(fā)現(xiàn)了 TAGl結(jié)合抗體。大部分LE/MoS血清結(jié)合到Lgi 1。我們在大部分血清中發(fā)現(xiàn)了血清IgG與Lgil轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合(見以下)。但是，這種結(jié)合不僅僅是在EGFP共轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的表面上(EGFP陽性，圖9A)，而且在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞周圍也檢測到了(圖9B)?？磥砗芸赡苁牵琇gil被分泌到培養(yǎng)基當(dāng)中，然后結(jié)合到所有HEK 細(xì)胞表面，這之前已被報道過同前]。為了查明是否是這種情況，我們?nèi)gil轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液，用未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞在室溫下孵育1小時。然后，通過查找血清中具有Lgil反應(yīng)活性的IgG的結(jié)合來測試這些未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Lgil的結(jié)合情況(圖9A)。取自于Lgil轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(圖10A)、而不是取自于表達(dá)其它抗原的細(xì)胞的上清液，例如MuSK(圖10B)，能轉(zhuǎn)移Lgil至HEK細(xì)胞的表面， 且該表面上已被Lgil陽性患者的血清Ig G所結(jié)合。這確認(rèn)并延續(xù)了先前的觀察，即Lgil被分泌出來且能附著在培養(yǎng)基中PC12細(xì)胞的細(xì)胞表面上(例如[M、25])。CASPR、TAGl和Lgi 1抗體的臨床相關(guān)性
為了建立我們的發(fā)現(xiàn)的臨床關(guān)聯(lián)性，我們測試了 108位帶VGKC抗體的患者的血清與表達(dá)這三種抗原的HEK細(xì)胞的結(jié)合。這些樣品包括88份用于常規(guī)分析的帶高含量VGKC抗體 (>400 pM)的血清，它們被認(rèn)為主要包括CNS (LE或MoS莫旺氏綜合征)疾病患者，和20份其它血清(13份來自神經(jīng)性肌強直患者和7份來自莫旺氏綜合征患者)。這些血清選自于我們保存的樣品，因為莫旺氏綜合征非常稀少，還因為神經(jīng)性肌強直患者通常具有低含量的結(jié)合到I125-Adtx-VGKC的抗體且不足以代表高滴定量的患者。與三種不同抗體有關(guān)的VGKC抗體滴定量如圖11中所示。這表明，滴定量在Lgil 陽性患者中最高，CASPR2陽性患者居中，TAGl陽性患者最低，包括1份血清I125- α DTX-VGKC 免役滴定量小于ΙΟΟρΜ。我們從指定神經(jīng)學(xué)家處得到了臨床信息，主要源自詳細(xì)的問卷(Oxford Research Ethics Committee A approval，07/Q160X/28)?；颊咧?5位患有邊緣葉腦炎(其中6位主要癥狀為癲癇)，12位患有莫旺氏綜合癥，25位患有神經(jīng)性肌強直，并且只有6位患有癲癇癥、肌張力障礙或驚嚇綜合征(startle syndrome)的，不直接歸入那些類別。這些患者很好地代表了已知的與VGKC抗體有關(guān)的疾病譜系。不同患者臨床分組的VGKC抗體滴定量的分布如圖12所示。如同依據(jù)單個患者之前的數(shù)據(jù)所預(yù)測的，邊緣葉腦炎最高，莫旺氏綜合癥較低，神經(jīng)性肌強直最低。后面一組包含常規(guī)檢查中對VGKC抗體呈陰性的8位患者。圖 13表示臨床綜合征、每組中的患者數(shù)量、具有非胸腺腫瘤證據(jù)的患者數(shù)量(這些是變化的， 僅2位在抽樣時是臨床活躍的)和具有胸腺惡性腫瘤的患者數(shù)量，胸腺惡性腫瘤是唯一通常與VGKC抗體有關(guān)的腫瘤類型M。圖14表示與這三種抗體之每一種相關(guān)的患者。值得注意的，Lgil抗體幾乎只能在邊緣葉腦炎患者中找到——39個Lgil陽性血清中僅3份來自具有其它癥狀的患者——且重要的是在胸腺惡性腫瘤患者中未能找到。相比較，在12位莫旺氏綜合癥患者中的10位和11位胸腺惡性腫瘤患者中的10位中找到了 CASPR2抗體。此外，在25位神經(jīng)性肌強直患者中的8位中也找到了 CASPR2抗體。TAGl抗體僅在4位患者中找到，但是其中3位患神經(jīng)性肌強直，1位對VGKC抗體呈陰性；還有1位TAGl陽性患者具有邊緣葉腦炎。討論
在先前被認(rèn)為具有指向中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的Kvl型鉀通道的患者中，我們描述CASPR2 為新的自身抗體目標(biāo)。此外，我們展示了大部分的其他患者具有Lgil抗體，少數(shù)具有TAGl 抗體，其中包括1位對VGKC抗體測試呈陰性的患者。這些抗體的存在與患者的不同臨床癥狀相關(guān)，且第一次地，這些結(jié)果證明，不同的臨床表型很可能取決于以神經(jīng)系統(tǒng)中不同VGKC Kvl復(fù)合蛋白為目標(biāo)的特定抗體的存在。我們這里定義的抗體代表65%的VGKC抗體陽性樣品。進(jìn)一步改進(jìn)抗體檢測分析方法可能提高該比例。α DTX對Kvl. 1、1. 2和1. 6這些哺乳動物大腦中最多的Kvl亞單位進(jìn)行標(biāo)記。對 LE和MoS IgG免疫沉淀α DTX標(biāo)記的腦蛋白的觀察已被假設(shè)來推定LE和MoS IgG與Kvl 蛋白的直接結(jié)合。通過對特別是Kvl. 2與患者血清的共同定位的說明，腦組織免疫組織化學(xué)對該設(shè)想提供了支持[4~3~17]。此外，一項研究已經(jīng)說明了 LE和MoS IgG與表達(dá)于一個異源哺乳動物細(xì)胞系中的Kvl的結(jié)合Μ。但是，LE或MoS血清對特定Kvl亞型的“偏愛”不能解釋為什么外周產(chǎn)生的抗Kvl抗體患者僅顯現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)表型。功能上地，NMT患者IgG的被動轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了電生理學(xué)上的改變，這種改變與神經(jīng)元過度興奮并發(fā)的鉀通道功能障礙相一致[1]。同樣地，LE和MoS患者表現(xiàn)出神經(jīng)元過度興奮的特征，例如癲癇、神經(jīng)性肌強直和神經(jīng)元丟失[2~18]；且Kvl. 1突變患者和Kvl. 1基因敲除小鼠形成癲癇[19~2°]。這些證據(jù)使得Kvl亞單位成為最可能的LE和MoS IgG的抗原目標(biāo)。 但是，尚無分子水平的方法令人信服地證實該設(shè)想。如果LE或MoS IgG結(jié)合Kvl. 1，則它們將被認(rèn)為會沉淀與抗Kvl. 1抗體沉淀的相同量的I125-aDTX。盡管我們有關(guān)抗Kvl. 1、1.2、1.4和1. 6沉淀的數(shù)據(jù)與先前的研究[14， 21]非常類似，但LE和MoS IgG沉淀Kvl亞群的量，不與任何單個的抗Kvl抗體相類似。這表明他們不結(jié)合任何一個Kvl蛋白。Kvl四聚合以在HEK細(xì)胞表面上形成功能性的、α DTX敏感通道。但是，我們既不能檢測電流抑制，也不能用免疫熒光法測量暴露到LE和MoS IgG后的表面結(jié)合。為了排除 IgG結(jié)合到Kvl細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的可能性，我們在模擬診斷分析的條件下增溶細(xì)胞，提取類似于存在于我們的腦組織中的Kvl亞單位的異聚體(heteromers)。使用這種模式，我們不能證明LE或MoS IgG沉淀了 I125-α DTX標(biāo)記的Kvl。因此，盡管Kvl功能障礙可能與LE和MoS 表型存在分子性關(guān)聯(lián)，且LE和MoS IgG沉淀用I125-Ci DTX標(biāo)記的哺乳動物腦勻漿來計算，但他們并不通過直接結(jié)合Kvl蛋白這樣做。因此，很可能它們共同沉淀另一種復(fù)合到腦組織中的Kvl的蛋白，這種蛋白并不存在與表達(dá)Kvl的HEK細(xì)胞中。這種設(shè)想因Kvl. 1/1. 2和 LE/MoS抗原間不同的SDS敏感度而被加強，而且也詳細(xì)地提供了他們與I125-Ci DTX結(jié)合腦復(fù)合物中單獨的、更外周的蛋白結(jié)合的證據(jù)。CASPR2是具有大的細(xì)胞外區(qū)域的Kvl共沉淀分子[9]。此外，CASPR2從α DTX復(fù)合物中的分離方式類似于LE和MoS患者的情況。使用增溶的CASPR2-EGFP的FIPA在32位 (18%)診斷分析陽性患者中產(chǎn)生了陽性值?？笴ASPR2抗體不存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自主神經(jīng)功能障礙或胸腺瘤的患者身上，這些患者在測試血清的診斷分析中呈陰性。所有抗 CASPR2 IgG與CASPR2的細(xì)胞外區(qū)域的表位結(jié)合。這些IgG在蛋白質(zhì)印跡中不能識別線性化的CASPR2，這表明它們與哺乳動物表達(dá)的CASPR2中存在的構(gòu)象表位結(jié)合?？笴ASPR2抗體主要為IgGl和4亞類。IgGl亞類可能在抗CASPR2抗體相關(guān)的疾病的發(fā)病機理中起到補體結(jié)合的作用。這些抗體有很高的親和性，類似于其它神經(jīng)性疾病中發(fā)現(xiàn)的抗體。CASPR2 抗體免疫吸附后的診斷分析中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的抗體以及抗CASPR2滴定量和診斷分析滴定量之間的線性關(guān)系強烈地表明，這些抗CASPR2是某些前面提到的電壓門控性鉀通道的抗體。CASPR2的唯一神經(jīng)表達(dá)確保了抗體介導(dǎo)的病變僅發(fā)生在神經(jīng)細(xì)胞的表面。這與觀察到的LE和MoS患者的臨床癥狀一致。CASPR2和Tag 1基因敲除小鼠表現(xiàn)了遍及它們的軸突的Kvl擴散的分布，這與見于野生型神經(jīng)細(xì)胞中的juxtaparanodal聚集 (juxtaparanodal-clustered)的Kvl相反[22]。類似地，具有CASPR2 C端截斷的人腦組織表現(xiàn)出比對照腦中所見更擴散的Kvl表達(dá)。這些患者形成癲癇，認(rèn)知功能障礙和腱反射缺失 [23]?？紤]到CASPR2在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的分布，這種遺傳模型與我們發(fā)現(xiàn)的在抗CASPR2 陽性患者中MoS代表比例過剩(MoS overrepresentation) 一致。抗CASPR2抗體可產(chǎn)生與預(yù)先簇集的Kvl相似的分散，主要機理有三i)補體結(jié)合和病灶組織損傷(focal tissue damage);ii)直接刺激或目標(biāo)蛋白的阻礙，和iii)目標(biāo)抗原的內(nèi)化。很有可能是抗CASPR2抗體通過i)和iii)來介導(dǎo)其行為。降低數(shù)量的Kvl可產(chǎn)生相對去極化的、過度興奮的隔膜。類似的考慮適用于指向Lgil或TAGl的抗體。Lgil主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是不表達(dá)CASPR2的那些區(qū)域，例如海馬的苔蘚纖維層。這可能解釋了為什么帶這些抗體的患者主要表現(xiàn)為邊緣葉腦炎，它與顳葉MRI高信號和顳葉癲癇癥有關(guān)[2]。此外，基因編碼 Lgil的突變被發(fā)現(xiàn)于在具有外側(cè)顳葉癲癇癥的家族中[28]，他們未表現(xiàn)出任何外周神經(jīng)功能障礙。相比之下，TAGl用Kvl. 1和Kvl. 2和CASPR2表達(dá)在郎維結(jié)處，那里它可以提供神經(jīng)性肌強直患者的抗體目標(biāo)，TAGl基因敲除小鼠表現(xiàn)了先前簇集的Kvl蛋白在CNS和PNS juxtapar陽極(juxtapar anodes)的散布te~27]。所有這些發(fā)現(xiàn)提供一種對與抗“VGKC”抗體有關(guān)的臨床異質(zhì)性的重要的新理解，并且今后將提供更加精確的患者的診斷和分類。我們這里所用的基于細(xì)胞的分析通常比依賴于溶液中標(biāo)記抗原的免疫沉淀反應(yīng)的分析更靈敏[11~16]。例如，在另一組14位神經(jīng)性肌強直患者中，我們在5位免疫分析中對VGKC抗體呈陰性的患者中發(fā)現(xiàn)了 CASPR2或TAGl抗體。因此，這些目標(biāo)的診斷，和分析方法的進(jìn)步， 不僅僅解釋了表型差異而且也提高了診斷結(jié)果。方法
臨床資料
血清樣品保藏于-20°C。臨床醫(yī)生提供臨床詳細(xì)資料，對患者再進(jìn)行分類。LE血清被分類為患有失憶癥和突發(fā)癲癇但無神經(jīng)性肌強直的血清。MoS血清具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥和自主神經(jīng)病癥以及神經(jīng)性肌強直。對照血清包括胸腺瘤患者(n=9)，亞急性發(fā)作的自主神經(jīng)疾病(n=34)，多發(fā)性硬化(n=14)，非I125- α DTX沉淀性腦病(11=50)和健康對照血清(11=10)。 選擇88份自具有中等至高VGKC抗體滴定量(全部MOOpM)的血清，忽略任何已知的臨床表型。為獲得詳細(xì)的臨床信息，向指定神經(jīng)學(xué)家發(fā)放了問卷并將這些信息整理到數(shù)據(jù)庫中 (Oxford Research Ethics Committee A approval, 07/Q160X/28)。這讓我們能夠識別三種主要的臨床表型。6位患者不是很符合這些分類4位只患有癲癇癥；1位患有肌張力失常和過度驚嚇(excessive startle) ；1位只患有過度驚嚇。增加另外20份取自已知的莫旺氏綜合癥患者(n=7)或神經(jīng)性肌強直患者(n=13)的血清以增加患者的數(shù)量，用于確認(rèn)我們的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。取自兔皮層的VGKC復(fù)合物的放射性免疫沉淀反應(yīng)
從在DTX緩沖液(IOOmM NaCl, 20mM Tris, 5mM KCl, pH調(diào)整為7. 12)中用2%洋地黃皂苷在37°C下增溶20分鐘的兔腦皮層隔膜(Calbiochem，USA)提取VGKC復(fù)合物。用PTX (0. 02M磷酸鹽緩沖液和0. 1% Triton X100)按1 2稀釋上清液，并用I125-α DTX (Perkin Elmer, USA)孵育。用 PTX稀釋提取物至 100 萬 cpm每毫升(1 million counts per minute (cpm) per ml)。對于分離試驗，室溫(RT)下向I125-α DTX標(biāo)記的提取物中加入十二烷基硫酸鈉(SDS) 2小時。用血清或商品化抗體(加入PTX至50 μ 1)對50 μ 1的I125- α DTX標(biāo)記的提取物4°C孵育過夜。室溫下按10 μ 1/1 μ 1血清加入第二抗體(抗人IgG (The Binding Site, UK))或抗山羊 IgG( Jackson Imniunoresearch Laboratories Inc, USA),持續(xù)90 分鐘。在0.5ml PTX中旋轉(zhuǎn)沉淀物，在PTX中洗滌得到的顆粒兩次，并在伽瑪計數(shù)器(Cobra2， Perkin Elmer)上讀數(shù)。但用具體的cpm表述時，結(jié)果已將健康對照數(shù)據(jù)減去。
質(zhì)粒構(gòu)建
克隆cDNA編碼的全長度人Kvl. 1,1. 2,1. 4,1. 6和 β 2至 pcDNA3. l-hygro( Invitrogen Ltd, CA, USA)中。全長度人MuSK-GFP的構(gòu)建先前已有描述[2]。用EcoRI酶切含有CASPR2 的 cDNA 的載體(Vector)pCR4-T0P0 (IMAGE: 7939625 來自 geneservice, Cambridge, England)。亞克隆該片斷到pcDNA3. 1 ( + ) (Invitrogen, UK)以提供在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的未標(biāo)記的CASPR2。 為了用EGFP標(biāo)記CASPR2，用XhoI和XmaI酶切(digest) pcDNA3. 1 ( + )- CASPR2質(zhì)粒。亞克隆該片斷到pEGFP-Nl (Clontech Laboratories, CA, USA)。對于人Lgi-1，cDNA購自Geneservice Ltd,并用下述引物進(jìn)行PCR擴增 FPLgilpcdna GATCGCTAGCCCACCATGGAATCAGAAAGAAGCAAAAGG
NheI ；
RPLgilpcdna GATCCTCGAGTCATGCGCTTAAGTCAACTATGACATG )(ho I。純化的產(chǎn)物被亞克隆到pGEM-Teasy。該克隆和Clontech的質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)用 Nhel和Biol酶切(digest)。片斷被連接到一起，構(gòu)建體被純化并被測序驗證。FPLgilpcdna: GATCGCTAGCCCACCATGGAATCAGAAAGAAGCAAAAGG Nhel ； RPLgilpcdna: GATCCTCGAGTCATGCGCTTAAGTCAACTATGACATG Xhol。人TAGl cDNA得自 Dr. D. KaragogeosCUniversity of Crete;見 )的饋贈。轉(zhuǎn)染和人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)
在 37°C、5%C02 條件下，HEK293 細(xì)胞在加入 10% 胎牛血清(FCS，TCS Cellworks Ltd, Buckingham, UK)和各 100 單位 /ml 的青霉素 G 和鏈霉素(Invitrogen, CA, USA)的 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)中培養(yǎng)。在6孔培養(yǎng)板上生長細(xì)胞進(jìn)行免疫吸附和毒素結(jié)合(toxi binding)試驗，在置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的13mm蓋玻片上進(jìn)行顯微鏡觀查，在175cm2的燒瓶中進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。使用聚乙烯亞胺(PEI)，細(xì)胞瞬時與Kvl. 1、 1. 2,1. 4,1. 6、β 2,EGFP (增強型綠色熒光蛋白)、MuSK_EGFP、CASPR2-EGFP, Lgil 或 TAGl cDNA共轉(zhuǎn)染。使用Axion 200倒置蔡斯熒光顯微鏡，EGFP的表達(dá)可見。免疫細(xì)胞化學(xué)
HEK細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后進(jìn)行熒光免疫染色。蓋玻片轉(zhuǎn)移至M孔培養(yǎng)板，并用小鼠抗 Kvl. 1細(xì)胞外域抗體(1:100，Dr J Trimmer, California饋贈)或用加入了 1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM-N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ - -乙磺酸)(HEPES)稀釋的患者血清(1 20-100)在室溫(RT)下孵育1小時。隨后在DMEM-HEPES緩沖液中洗滌細(xì)胞3次，室溫下用含 3%甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中固定(fix)15分鐘。如上洗滌細(xì)胞，并用(i)以1:750， 1%的BSA-DMEM-HEPES緩沖液，抗鼠IgG或抗人IgG Alexa Fluor 568標(biāo)記的第二抗體 (Invitrogen-Molecular probes, Paisley, UK)，或(ii)以 1 :50，1% BSA-DMEM-HEPES 緩沖液，鼠抗人IgGl、2、3或4 (Binding Site, Birmingham, UK)和隨后的山羊抗鼠同種型特異的 IgG-Alexa Fluor 568 標(biāo)記的抗體(Invitrogen-Molecular probes, Paisley, UK)，室溫下標(biāo)記45分鐘。對于細(xì)胞滲透化，細(xì)胞先用固定液(如上所述)孵育，再用含0. 1% Triton χ 100的全部溶液孵育。通過使用抗兔 IgG Alexa Fluor 568 標(biāo)記的第二抗體(Invitrogen-Molecularprobes, Paisley, UK)觀察兔抗Kvl. 1/1. 2 和 1. 6 抗體(1 500，Alamone, Israel)。隨后細(xì)胞在PBS中洗滌3次，裝到滴有含DAPI G’，6’-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽，1:1000) 的抗熒光淬滅劑(DakoCytomation, Cambridge, UK)的載玻片上。用具有MacProbe v4. 3 數(shù)字成像系統(tǒng)的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。為了亞類分析，由3位被遮盲的觀察者用事先確定的0-4的評分系統(tǒng)檢驗所有載玻片[11]。對于TAGl和Lgil，我們使用的鼠抗TAGl (IgGl) 是購自于 Developmental Studies Hybridoma Bank 用于學(xué)術(shù)研究目的(http://dshb. biology, uiowa. edu/ 上的，3. 1C12，)，山羊抗 Lgil, C19 (sc-9583)和 N18 (sc-9581)是購自于 Santa Cruz Biotechnology Inc.。電生理學(xué)
用Kvl. 1和GFP或Kvl. 6和GFP轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(同上)，并直接置于蓋玻片上進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。細(xì)胞電壓鉗記錄在含有(mM計)145 NaCl,6 KClU MgCl2UO HEPES, 2 CaCl2,和5葡萄糖，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7. 4的外部緩沖液的固定槽(stationary bath (lml體積))中進(jìn)行。 2-5ΜΩ抗阻的記錄電極(recording pipettes)由硼硅酸鹽毛細(xì)管玻璃制備(Harvard Apparatus)，并用含有(mM 計)150 KClUO EGTAU CaCl2U MgCl2 禾口 10 HEPES,以KOH調(diào)節(jié)至pH7. 4的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)液充滿。使用倒置熒光顯微鏡(Nikon)觀察細(xì)胞，且僅記錄GFP表達(dá)細(xì)胞。在室溫(20-M°C)下進(jìn)行記錄。使用CsCl內(nèi)液，初步試驗確認(rèn)，顯示的電流為鉀介導(dǎo)的(數(shù)據(jù)未示出)。記錄過程中α - DTX敏感電流通過α - DTX (1 μ m，Sigma-Aldrich)的直接同浴應(yīng)用(direct bath application)使得以證實；對照實驗中使用相同體積的緩沖溶液。血清樣品在使用前經(jīng)過外部記錄溶液滲析，且待用樣品緩慢地在培養(yǎng)基中稀釋(1 50-1 1000) 中。記錄過程中通過直接血清應(yīng)用，血清在表達(dá)的電流上的急性效應(yīng)得以確定，類似于添加 α - DTX0記錄前通過37°C下用Kvl轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞孵育1_3天，患者血清的慢性效應(yīng)得以確定。數(shù)據(jù)在IkHz低通過濾，在IOkHz獲取。使用Axopatch-ID放大器、Digidata 1320系列數(shù)字轉(zhuǎn)換器和用于脈沖發(fā)生、數(shù)據(jù)獲取和數(shù)據(jù)分析的pClamp程序套裝(Axon Instruments)進(jìn)行記錄。用于分析的細(xì)胞具有記錄中少于30%變化的低通道阻抗(low access resistance (Ra, < 20 ΜΩ ))、高輸入阻抗(high input resistance, Ri, _70mV (+ 10 mV階越電壓)> IGQ )、基線穩(wěn)定性和小泄漏電流(< -50 pA)。從-80mV的保持電位施加+40mV 300ms試驗脈沖進(jìn)行峰值電流測量。對活化和穩(wěn)態(tài)失活的電壓依賴性也進(jìn)行了分析(數(shù)據(jù)未示出)。用雙尾Mudent t-檢驗(two-tailed Student t-test)進(jìn)行單獨比較、用單因素方差分析(one-way ANOVAs)進(jìn)行多重比較檢驗來評估統(tǒng)計顯著性。蛋白質(zhì)提取和標(biāo)記
共轉(zhuǎn)染48小時后，用PBS洗滌融合的175cm2燒瓶，用含1 100蛋白酶抑制劑混合物 (Sigma- Aldrich, WO的洲洋地黃皂苷的DTX緩沖液進(jìn)行溶解。溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)動1小時，離心(13000rpm，5分鐘，4°C )并用如上I125- α DTX標(biāo)記。他們和GFP標(biāo)記的提取物(IOOfU/分析)都用5 μ 1的人血清或兔抗CASPR2 (Dr E Peles贈送)抗體進(jìn)行免疫沉淀。顆粒再懸浮于180μ1 PTX中，轉(zhuǎn)移到96孔板，并使用熒光分析儀(Gemini XS, Molecular Probes) 分析。這后一分析方法公知為熒光免疫沉淀分析(FIPA)。蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物與SDS類上樣緩沖液和還原劑(Invitrogen，CA, USA) 一起沸煮。 4-12% SDS聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen，UK)上每孔加入15 μ 1 (等同于蛋白質(zhì)濃度)的提取物中，在200mV下電泳90分鐘。凝膠在30mV下轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙上90分鐘。用PBS-0. 1% 吐溫(tween)、5%牛乳蛋白質(zhì)溶液封閉每一個條帶。隨后，用稀釋在封閉液(1:100)中的第一抗體孵育隔膜1小時，用PBS-0. 1%吐溫(tween)洗滌3次后，用稀釋在封閉液(1 200)中的HRP標(biāo)記的抗兔或抗人IgG第二抗體(DakoCytomation，UK)孵育30分鐘。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示印跡。
參考文獻(xiàn)Sinha S, Newsom-Davis J, Mills K, Byrne N, Lang B, Vincent A.
性神經(jīng)性肌強直(艾薩克綜合癥)的自身免疫性病因.Lancet. 1991，7，13; 338 (8759) :75-7.Vincent A, Buckley C, Schott Jl, Baker I, Dewar BK, Detert N, Clover L, Parkinson A, Bien CG, Omer S, Lang B, Rossor MN, Palace J.鉀通道抗體相關(guān)腦病 一種可能反應(yīng)于免疫療法的邊緣葉腦炎.Brain. 2004，3 ； 127 (Pt 3) 701—12Buckley C, Oger J, Clover L, Tuzun Ε, Carpenter K, Jackson Μ, et al.兩位患可逆性邊緣葉腦炎患者的鉀通道抗體.Ann Neurol. 2001， 7; 50(1) :73-8.Liguori R, Vincent A, Clover L, Avoni P, Plazzi G, Cortelli P, et al. 莫旺氏綜合征電壓門控性鉀通道抗體中外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟表現(xiàn).Brain. 2001 Dec;124 (Pt 12):2417-26.Hart IK, Waters C, Vincent A, Newland C, Beeson D, Pongs 0, et al.神經(jīng)性肌強直顯示表達(dá)的K+通道的檢測到的自身抗體.Armals of neurology. 1997，2; 41(2) :238-46.Shillito P, Molenaar PC, Vincent A, Leys K, Zheng W, van den Berg RJ, et al.獲得性神經(jīng)性肌強直外周神經(jīng)K+通道的自身抗體的證據(jù).Armals of neurology. 1995，11;38 (5):714-22.Tomimitsu H, Arimura K, Nagado Τ, Watanabe 0, Otsuka R, Kurono A, et al.獲得性神經(jīng)性肌強直中電壓門控性K+通道抗體的作用機理.Armals of neurology. 2004，9 ； 56 (3) :440-4.Kleopa ΚΑ, Elman LB, Lang B, Vincent A, Scherer SS.神經(jīng)性肌強直及邊緣葉腦炎血清以成熟Siaker K+通道為目標(biāo)亞單位特異性與臨床表現(xiàn)相關(guān).Brain. 2006, 6;129 (Pt 6) 1570-84.Poliak S, Gollan L, Martinez R, Custer A, Einheber S, Salzer JL, et al. Caspr2, neurexin超家族的一個新成員，定位于有髓鞘的軸突的juxtaparanode并與K+ 通道相關(guān)· Neuron. 1999，12 ； 24 (4) :1037-47.Schulte U, Thumfart JO, Klocker N, Sailer CA, Bildl W, Biniossek Μ, et al.癲癇癥相關(guān)的Lgil蛋白聚集在突觸前的KvI通道并抑制Kvbetal的失活.Neuron. 2006，3. 2;49 (5). -697-706.Leite MI, Jacob S, Viegas S, Cossins J, Clover L, Morgan BP, et al. “血清反應(yīng)陰性”的重癥肌無力中的乙酰膽堿受體的IgGl抗體.Brain. 2008, 5，31.[12]Nagado T, Arimura K, Sonoda Y, Kurono A, Horikiri Y, Kameyama A, et al.外周神經(jīng)過度興奮患者的鉀電流抑制.Brain. 1999 Nov; 122 (Pt 11) :2057-66.Hinson SR, Pittock SJ, Lucchinetti CF, Roemer SF, Fryer JP, Kryzer TJ, et al. IgG與視神經(jīng)脊髓炎中水通道外周區(qū)域結(jié)合的致病可能.2007，1 2;11;69(24):2221-31.Shamotienko OG, Parcej DN, Dolly JO.牛腦突觸膜中 K+通道 KvI 亞型的亞單位復(fù)合物· Biochemistry. 1997，7; 8;36(27) :8195-201.Kim E, Niethammer M, Rothschild A, Jan YN, Sheng Μ.通過與膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族相互作用的Shaker型K+通道的聚集.Nature. 1995 Nov 2; 378 (6552) :85-8.Waters P, Jarius S, Littleton Ε, Leite MI, Jacob S, Gray B, et al.視神經(jīng)脊髓炎以及長節(jié)段橫貫性脊髓炎中的水通道蛋白4抗體.Archives of Neurology. 2008，7;65 (7):913-9.Ances BM, Vitaliani R, Taylor RA, Liebeskind DS, Voloschin A, Houghton DJ, et al.通過神經(jīng)纖維網(wǎng)抗體鑒別的對治療有反應(yīng)的邊緣葉腦炎MRI和PET相關(guān)的. Brain. 2005，8;128 (Pt 8):1764- 77.Schott JM, Harkness K, Barnes J, della Rocchetta Al, Vincent A, Rossor MN.失憶癥、大腦萎縮和自身免疫.Lancet. 2003，4，12; 361 (9365) :1266.Zuberi SM, Eunson LH, Spauschus A, De Silva R, Tolmie J, Wood NW, et al.人電壓門控性鉀通道基因(Kv 1. 1)的一種新突變與發(fā)作性共濟(jì)失調(diào)1型、有時與部分性癲癇相關(guān).Brain. 1999，5; 122 ( Pt 5) :817-25.Smart SL, Lopantsev V, Zhang CL, Robbins CA, Wang H, Chiu SY, et al. K(V)Ll鉀通道的去除引起小鼠癲癇.Neuron. 1998，4; 20 (4) :809-19.Scott VE, Muniz ZM, Sewing S, Lichtinghagen R, Parcej DN, Pongs O, et al.不同Kv亞單位的特異抗體揭示牛腦中alpha-dendrotoxin敏感的K+通道的亞型的異低聚體基礎(chǔ)· Biochemistry. 1994，2，22; 33 (7): 1617-23.Poliak S, Salomon D, Elhanany H, Sabanay H, Kiernan B, Pevny L, et al. 有髓鞘的軸突中Shaker樣K+通道于juxtaparanodal的聚集取決于Caspr2和TAG-I. The Journal of cell biology. 2003，9，15;162 (6):1149-60.Strauss KA, Puffenberger EG, Huentelman MJ, Gottlieb S, Dobrin SE, Parod Jl, et al.癥狀逆行的局限型癲癇和突變體接觸蛋白相關(guān)的蛋白樣蛋白2. The New England journal of medicine. 2006, 3, 30；354 (13):1370-7.Sirerol-Piquer MS, Ayerdi-Izquierdo A, Morante-Redolat JM, Herranz-Perez V，F(xiàn)avell K, Barker PA, Perez-Tur J.癲癇基因LGIl編碼的分泌型糖蛋白與細(xì)胞表面結(jié)合· Hum MoI Genet. 2006，12，1; 15(23) 3436-45. Epub 2006 Oct 26.Fukata Y, Adesnik H, Iwanaga Τ, Bredt DS, Nicoll RA, Fukata Μ.. 癲癇相關(guān)的配體或受體復(fù)合物L(fēng)GIl和ADAM22調(diào)節(jié)突觸傳遞.kience. 2006, 9， 22;313 (5794) 1792-5.Pavlou O, Theodorakis K, FaIk J, Kutsche M, Schachner M, Faivre-Sarrailh C, Karagogeos D對粘附分子TAG-I和它與其它免疫球蛋白大家族成員的轄區(qū)相互作用的分析.MoICell Neurosci. 2002, 7 ； 20 (3) 367-81.Traka M, Goutebroze L, Denisenko N, Bessa M, Nifli A, Havaki S, Iwakura Y, Fukamauchi F, Watanabe K, Soliven B, Girault JA, Karagogeos D. TAG-I 禾口Caspr2 的關(guān)聯(lián)對髓鞘神經(jīng)纖維juxtaparanodal區(qū)域的分子組成有重要意義.J Cell Biol. 2003，9, 15; 162(6) 1161-72.Kalachikov S, Evgrafov O, Ross B, Winawer Μ, Barker-Cummings C, Martinelli Boneschi F, Choi C, Morozov P, Das K, Teplitskaya Ε, Yu A, Cayanis Ε, Penchaszadeh G, Kottmann AH, Pedley ΤΑ, Hauser WA, Ottman R, Gilliam TC. LGIl的變異引合并聽覺癥狀的常染色體顯性遺傳顳葉癲癇.Nat Genet. 2002, 3;30(3):335-41.
權(quán)利要求
1.一種診斷哺乳動物自身免疫神經(jīng)性紊亂的方法，包括步驟在哺乳動物體液樣品中檢測對于至少一種Kvl復(fù)合蛋白表位上的自身抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法包括步驟a)將所述體液與至少一種Kvl 復(fù)合蛋白或其抗原決定簇相接觸；和b)檢測抗體-抗原復(fù)合物，其由該至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其抗原決定簇與存在于體液中的抗體形成；其中，所述復(fù)合物的存在反映了自身免疫神經(jīng)性紊亂。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)一步包括評估哺乳動物臨床癥狀的步驟。
4.一種用于診斷哺乳動物自身免疫神經(jīng)性紊亂的分析試劑盒，包括至少一種Kvl復(fù)合蛋白的至少一種表位和使用該試劑盒的方法說明。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于制備校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
6.一種分離或純化的自身抗體或抗體片斷，其專門用于至少一種Kvl復(fù)合蛋白的表位。
7.一種分離或純化的抗體或抗體片斷，其專門用于抗Kvl復(fù)合蛋白自身抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體或抗體片斷，其進(jìn)一步包括標(biāo)記或標(biāo)簽。
9.如權(quán)利要求7或8所述的抗體或抗體片斷，其中，所述抗體是抗IgG抗體。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述的抗體在制備治療神經(jīng)性紊亂的藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括如權(quán)利要求7、8或9所述的抗體或抗體片斷。
12.—種治療患神經(jīng)性紊亂患者的方法，其包括向所述患者施用有效劑量的如權(quán)利要求7、8或9所述的抗體或抗體片段或至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位。
13.一種鑒別能夠緩解或治療神經(jīng)性紊亂的化合物的方法，其包括步驟在存在至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位的情況下，使候選化合物與能夠結(jié)合至少一種Kvl復(fù)合蛋白的抗體相接觸，其中，阻止所述抗體結(jié)合到至少一種Kvl復(fù)合蛋白或其表位的化合物是用于治療神經(jīng)性紊亂的候選化合物。
14.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、試劑盒、分離或純化的自身抗體或抗體片斷、 或應(yīng)用，其中，所述自身免疫神經(jīng)性紊亂選自邊緣葉腦炎、莫旺氏綜合征、神經(jīng)性肌強直和相關(guān)病癥。
15.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、試劑盒、分離或純化的自身抗體或抗體片斷、 或應(yīng)用，其中，所述體液選自血漿、血清、全血、尿液、汗液、淋巴液、糞便、腦脊髓液和乳頭抽吸液。
16.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、試劑盒、分離或純化的自身抗體或抗體片斷、 或應(yīng)用，其中，所述哺乳動物是人。
17.如權(quán)利要求1-3和12-16中任一項所述的方法，或如權(quán)利要求4-5中任一項所述的分析試劑盒，或如權(quán)利要求6-9中任一項所述的分離或純化的自身抗體或抗體片斷，或如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中，所述Kvl復(fù)合蛋白包括Kvl、CASPR2、Lgi 1和TAGl中的至少一種。
18.如權(quán)利要求17所述的方法、分析試劑盒、分離或純化的自身抗體或抗體片斷、或應(yīng)用，其中，所述Kvl復(fù)合蛋白包括CASPR2、Lgil和TAGl中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種診斷哺乳動物的自身免疫神經(jīng)性紊亂的方法，包括步驟在取自哺乳動物的體液樣品中檢測對于至少一種Kv1復(fù)合蛋白的表位上的自身抗體，以及相關(guān)的方法、分析試劑盒、分離或純化的自身抗體或抗體片斷，或其用途。
文檔編號G01N33/564GK102203613SQ200980141798
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月25日
發(fā)明者安琪拉·文森特 申請人:Isis創(chuàng)新有限公司