專利名稱：組合的尿鈉肽檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用尿鈉肽作為診斷和預(yù)后的標(biāo)記物質(zhì)。交叉引用本申請(qǐng)主張于2008年12月8日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)，號(hào)碼61/120，795的優(yōu)選權(quán)， 在此作為全文引用成本本發(fā)明的一部分。
背景技術(shù)：
以下關(guān)于發(fā)明背景技術(shù)的討論僅僅為了幫助閱讀者更好的理解本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的描述，也不能被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的描述。尿鈉肽是一組自然產(chǎn)生的物質(zhì)，他們存在于身體內(nèi)來對(duì)抗身體內(nèi)的腎臟-血管緊張素系統(tǒng)的活動(dòng)。在最近幾年，尿鈉肽的測(cè)量已經(jīng)引人注目地改變了心臟病的診斷和管理， 包括心衰和急性冠狀綜合癥。特別的，B型尿鈉肽(BNP-human precursor Swiss-ProtA 蛋白數(shù)據(jù)庫P 16860)以及來源于人類前-BNP (Pro-BNP)的一些多肽都被用來診斷心衰，檢測(cè)心衰的嚴(yán)重性和用來評(píng)估心衰的預(yù)后癥狀。存在三種尿鈉肽心房尿鈉肽(ANP)，B型尿鈉肽(BNP)和C型尿鈉肽(CNP)。 成熟的人類的B型尿鈉肽(BNP)(又稱為腦鈉肽)具有32個(gè)氨基酸，分子量為4千道爾頓GkDa)的氨基酸序列，它主要參于尿鈉肽系統(tǒng)中來調(diào)節(jié)血壓和體液平衡(Bonow， R. 0. , Circulation 93:1946-1950,1996)。BNP的前體由108個(gè)氨基酸分子的合成，稱為前體BNP(Pro-BNP)，它可以被水解成帶有氮末端的76個(gè)氨基酸(氨基酸1_76)，稱為“NT-proBNP “，和32個(gè)成熟32-氨基酸，稱為尿鈉肽(BNP-32)或尿鈉肽32 (氨基酸 77-108)。已經(jīng)表明NT-pro-BNP，BNP-32，和BNP前體(pre-pro_BNP)以及它們的一些片段胃以^^入^！白勺^青巾 !^。(Tateyama et ah, Biochem. Biophys. Res. Commun. 185 760-7，1992 ；Hunt et ah,Biochem. Biophys. Res. Commun. 214 :1175-83,1995)；以及國際專利公開號(hào)碼W004/094459和W004094460，它們中的每一個(gè)都被全部引入到本申請(qǐng)作為本發(fā)明的一部分。另外，BNP1-108和BNP77-108的第一位置的2個(gè)殘基可以通過水解或蛋白水解去掉，從BNP的前體(proBNP)生成BNP3-108分子，從NT-proBNP生成BNP3-76分子，從 BNP生成BNP79-108分子。檢測(cè)和可以特異結(jié)合這些斷列的構(gòu)體的抗體可以被產(chǎn)生；例如， 檢測(cè)可以測(cè)定BNP3-108，而不能測(cè)定proBNP (BNP1-108)；檢測(cè)可以測(cè)定BNP3-76但是不能測(cè)定NT-proBNP (BNP1-76)；和檢測(cè)可以測(cè)定BNP79-108，而不能測(cè)定BNP77-108。人類108個(gè)氨基酸的BNP前體proBNP(BNP1-108)的序列如下，下畫線為成熟的 BNP(BNP77-108)序列HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV 50 WKSREVATEGIRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL 100GCKVLRRH108(序列1).BNP1-108由更大的前體pre-pro-BNP合成，該前體的序列如下(“前體”的學(xué)列序列為粗體字母表示)MDPQTAPSRA LLLLLFLHLA FLGGRS HPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL 50QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVffKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA 100PRSPKMVQGS GCFGRKMDRI SSSSGLGCKV LRRH134(序列2).另外，尿鈉肽在患者中的水平可能被認(rèn)為與腎功能障礙相關(guān)。為了響應(yīng)心室的舒張而被釋放的BNP可以引起血管舒張、阻止腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，和阻止腎臟分泌腎素 (或高血壓蛋白原酶或血管緊張肽原酶)。術(shù)語“心腎綜合征”是指心臟與腎臟之間的生理關(guān)系，當(dāng)主體遭受心臟衰竭的時(shí)候，這種生理關(guān)系表現(xiàn)出腎臟與心臟的緊密關(guān)系。雖然這些綜合征仍然還不被完全理解，反饋回路循環(huán)已經(jīng)被包含在神經(jīng)系統(tǒng)(和，這些特殊的尿鈉肽)，炎癥反應(yīng)、結(jié)構(gòu)和功能的肖弱組織器官中，同時(shí)產(chǎn)生的回路循環(huán)使對(duì)心臟和腎臟的功能更為惡化。最近關(guān)于心腎綜合征的討論可以在法國發(fā)表的文章中找到，題目劇烈代謝失調(diào)的心衰心腎綜合征“列副臨床期刊，2006年73期(S2)8-13頁("Acute decompensated heart failure :The cardiorenal syndrome, " Clev.Clinic J. Med.73(S2) :S8_S13, 2006)。另外，在患有靜脈血栓栓塞疾病(VTED)的患者中尿鈉肽的水平也可能會(huì)被改變。 靜脈血栓栓塞疾病(VTED)表現(xiàn)出系列的型譜特征，他包括嚴(yán)重的靜脈血栓癥(DVT)和肺栓塞(PE)。通過年度跟蹤調(diào)查，預(yù)計(jì)每年在10萬人中有117人可能患有靜脈血栓栓塞疾病。年發(fā)病率在60歲或者更老的人群中更高，這些年齡階段的年發(fā)病率與年紀(jì)在85歲左右的人的發(fā)病率一樣高，其中，85歲年紀(jì)的年發(fā)病率為10萬人中有900人患有靜脈血栓栓塞疾病。思里沃爾泰等，國際醫(yī)藥期刊，1998年，158期，583-93頁(Silverstein et ah, Arch. Intern. Med. 158 :585-93,1998)。導(dǎo)致靜脈血栓栓塞疾病(VTED)發(fā)病的危險(xiǎn)因素包括年紀(jì)的增長，長期臥床不起，手術(shù)，惡性腫瘤、懷孕、含有雌性激素藥物治療(例如口服的口服避孕藥物，激素治療和三苯氧胺，它莫西芬(一種抗雌激素，用于治療婦女乳腺癌或不育癥)等)，沖血性心臟衰竭、同型半胱氨酸、以及改變血液粘性的一些疾病(比如紅血球增多(癥)，鐮狀細(xì)胞(貧血)病或鐮刀形紅細(xì)胞(貧血)病(sickle cell disease), 多發(fā)性骨髓瘤)、遺傳性血栓形成缺陷。大約有75%的VTED患者被確定具有以上至少一個(gè)危險(xiǎn)因素。海特等，國際醫(yī)藥期刊，2002年，162期，1M5-48頁(Heit et al，Arch. Intern. Med. 162 1245-48，2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明關(guān)于使用尿鈉肽的檢測(cè)從肺栓患者中區(qū)分出腎功能障礙和/或心衰患者。 具有這些情況或疾病的人常常具有類似的明顯癥狀，例如都有呼吸困難、心痛、咳嗽、水腫等。通過組合檢測(cè)不同群體的與BNP相關(guān)的多肽獲得的兩個(gè)或更多的檢測(cè)結(jié)果，可以讓包括腎功能障礙和肺栓在內(nèi)的疾病進(jìn)行初步的鑒別診斷更為明確和清楚。本發(fā)明的第一方面，至少選自于由免疫檢測(cè)組成的檢測(cè)群體中的兩個(gè)對(duì)來自主題樣本的免疫檢測(cè)，該檢測(cè)群體包括以下免疫檢測(cè)被配置檢測(cè)BNP79-108和可選的檢測(cè)BNP 本身(就是BNP77-108)的免疫檢測(cè)；被配置檢測(cè)BNP3-76和可選的檢測(cè)BNP1-76本身，但是不檢測(cè)BNP，的免疫檢測(cè)；被配置檢測(cè)BNP3-108和可選的檢測(cè)BNP1-108，但是不檢測(cè)BNP，的免疫檢測(cè)。這些免疫檢測(cè)的結(jié)果被組合計(jì)算，組合計(jì)算的結(jié)果被用來診斷是否存在腎功能障礙，和/或是否存在肺栓，和/或是否存在心衰，和/或從心衰和/或肺栓的主體中區(qū)別出腎功能障礙。在以下更詳細(xì)的描述中，檢測(cè)是“被配置測(cè)試“一個(gè)特異的感興趣的標(biāo)記物質(zhì)， 如果哪個(gè)檢測(cè)產(chǎn)生一個(gè)可以被測(cè)試的信號(hào)來表示與生理學(xué)相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物質(zhì)濃度是否存在或者存在的量。這樣的檢測(cè)，可以是但不一定就必須是，特定檢測(cè)某一種尿鈉肽。因?yàn)橐环N抗體的抗原決定部位位于8個(gè)氨基酸上，所以免疫檢測(cè)可以測(cè)試其它的多肽(例如相關(guān)的標(biāo)記物質(zhì))，只要這些其它的多肽包括有結(jié)合到抗體上的位點(diǎn)。那也就是說，檢測(cè) BNP79-108 的檢測(cè)也可以檢測(cè) BNP，proBNP，和 BNP3-108。在一個(gè)具體的實(shí)施例子中，檢測(cè)BNP79-I08可以被配置為用兩個(gè)抗體來結(jié)合 BNP79-108序列上位點(diǎn)的三明治的免疫檢測(cè)。一種這樣的檢測(cè)可以利用特異結(jié)合從BNP分子上脫落殘基77和78位點(diǎn)后形成的構(gòu)體的第一抗體，利用既結(jié)合BNP又結(jié)合BNP79-108的第二抗體，這樣的分析檢測(cè)將不能檢測(cè)前體BNP (proBNP)，BNP3-108和BNP3-76，在這里定義為“BNP79-108檢測(cè)”。第二檢測(cè)可以利用兩個(gè)抗體，每一個(gè)抗體都結(jié)合BNP和BNP79-108 ； 這樣的檢測(cè)也可以檢測(cè)前體BNP和BNP3-108，這樣的檢測(cè)在這里定義為“BNP檢測(cè)”。在另一個(gè)具體的實(shí)施例子中，針對(duì)BNP3-76而不是BNP的檢測(cè)也為兩個(gè)抗體來結(jié)合BNP3-76序列上位點(diǎn)的三明治的免疫檢測(cè)。一種檢測(cè)利用特異結(jié)合從NT-proBNP分子上脫落殘基1和2位點(diǎn)后形成的構(gòu)體的第一抗體，可以同時(shí)結(jié)合NT-proBNP和BNP-76的第二抗體；這樣的檢測(cè)將不會(huì)檢測(cè)proBNP，BNP, BNP79-I08，和NT-proBNP，這樣的檢測(cè)被定義為 “BNP3-76檢測(cè)”。第二中檢測(cè)利用兩個(gè)抗體，每一個(gè)抗體都可以結(jié)合NT-proBNP和BNP3-76， 這樣的檢測(cè)也可以檢測(cè)proBNP and BNP3-108，這樣的檢測(cè)被定義為“NT-proBNP檢測(cè)”。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，針對(duì)BNP3-108而不是BNP的檢測(cè)也為兩個(gè)抗體來結(jié)合BNP3-108序列上位點(diǎn)的三明治的免疫檢測(cè)，其中至少其中一個(gè)抗體不會(huì)結(jié)合BNP。一種這樣的檢測(cè)利用特異結(jié)合從proBNP分子上脫落殘基1和2位點(diǎn)后形成的構(gòu)體的第一抗體，第二抗體可以同時(shí)結(jié)合proBNP和BNP3-108 ；這樣的檢測(cè)將不會(huì)檢測(cè)proBNP，BNP, BNP79-I08，和NT-proBNP，這樣的檢測(cè)被定義為“BNP3-108檢測(cè)”。第二中檢測(cè)利用兩個(gè)抗體，每一個(gè)抗體都可以結(jié)合proBNP和BNP-108，這樣的檢測(cè)將不會(huì)檢測(cè)BNP，這樣的檢測(cè)被定義為“proBNP檢測(cè)”。這樣的檢測(cè)按照這樣選擇，這樣一個(gè)結(jié)果至少可以從以下兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果的濃度而計(jì)算獲得可以實(shí)質(zhì)表明BNP或BNP79-108的濃度(每一個(gè)濃度在這里被定義為“BNP濃度”)；可以實(shí)質(zhì)表明proBNP或BNP3-108的濃度(每一個(gè)濃度在這里被定義為“proBNP 濃度”)或者度可以實(shí)質(zhì)表明NT-proBNP或BNP3-76的濃度(每一個(gè)濃度在這里被定義為 "NT-proBNP 濃度”)。使用的BNP或BNP79-108的“實(shí)質(zhì)表明”濃度意思是指這個(gè)濃度已經(jīng)通過去除 proBNP或BNP3-108，和NT-proBNP或BNP3-76對(duì)該濃度貢獻(xiàn)而被去卷積化(Deconvoluted) 而得來的。在一個(gè)例子中，“BNP79-108的檢測(cè)”的結(jié)果可以直接使用，這是因?yàn)閜roBNP， BNP3-108, NT-proBNP和BNP3-76不再對(duì)這樣分析結(jié)果做作貢獻(xiàn)。在另一個(gè)例子中，“BNP檢測(cè)”的結(jié)果可以通過減去“proBNP的檢測(cè)”結(jié)果而被使用，同樣，這也可以做proBNP貢獻(xiàn)給 BNP分析結(jié)果的校正。
同樣，使用的proBNP或BNP3-108的“實(shí)質(zhì)表明”濃度意思在這里是指這個(gè)濃度已經(jīng)通過去除BNP或BNP79-108，和NT-proBNP或BNP3-76對(duì)該濃度貢獻(xiàn)而被去卷積化(Deconvoluted)而得來的。使用的NT-proBNP或BNP3-76的“實(shí)質(zhì)表明”濃度意思是這個(gè)濃度已經(jīng)通過去除proBNP或BNP3-108和BNP79-108對(duì)濃度的貢獻(xiàn)而被去卷積化 (Deconvoluted)而得來的。然后，這些實(shí)質(zhì)濃度被組合來確定一個(gè)“組合的尿鈉肽結(jié)果”，它至少具有以下兩個(gè)實(shí)質(zhì)濃度的函數(shù)關(guān)系值一個(gè)“BNP濃度”，一個(gè)“proBNP濃度”和一個(gè)“NT-proBNP濃度”。在一個(gè)優(yōu)選的例子中，一個(gè)函數(shù)關(guān)系值為proBNP比BNP的比率，BNP比proBNP的比率，BNP比NT-proBNP的比率，NT-proBNP比BNP的比率，proBNP比NT-proBNP的比率，或者 NT-proBNP比proBNP的比率。這個(gè)比率，例如可以用來診斷是否存在PE，是否存在腎臟功能障礙，是否存在心衰，和/或者，從腎臟功能障礙中區(qū)分出心衰和/或PE。對(duì)本領(lǐng)域的人來講，這種組合的尿鈉肽結(jié)果可以通過多種方式被分析出來。例如， 被獲得的結(jié)果可以被用來與“正?！敝档谋容^，或者與表示具有特種疾病或結(jié)果的值進(jìn)行比較。特殊的診斷或預(yù)后可以基于每一個(gè)檢測(cè)結(jié)果與這樣的值比較，這樣的值它可以代表診斷或預(yù)后的“極限值”。對(duì)診斷或/預(yù)后的靈敏度和特異性的檢測(cè)不僅依靠每個(gè)檢測(cè)的 “質(zhì)量”如何，他們也依靠什么是非正常結(jié)果的定義。實(shí)際上，可接受的工作特征(Receiver Operating Characteristic)曲線或〃 R0C〃曲線是通過繪制可變的值相對(duì)于處于“正常” 和“生病”人群的頻率而獲得的。對(duì)于一些特殊的標(biāo)記物質(zhì)，對(duì)于主題存在或不存在疾病的標(biāo)記物質(zhì)水平的分布將可能重疊。在這種情況下，一個(gè)檢測(cè)將不可能具有100%的準(zhǔn)確率來區(qū)分是否是正?；蚴欠窬哂屑膊?。在重疊的地方就表明測(cè)試不能區(qū)分開正常和疾病。一個(gè)極限值就被選擇，高于極限值(或低于極限值，這也依靠一個(gè)標(biāo)記物質(zhì)如何隨著疾病而改變)的測(cè)試被認(rèn)為是不正常的，同時(shí)，低于極限值的測(cè)試結(jié)果被認(rèn)為是正常的。位于ROC 曲線下的區(qū)域用來衡量這種可能性，這樣該可接受的衡量將用來對(duì)一種情況的鑒別做出校正。這種方法是公知的方法，參見亨利等，X射線科學(xué)，1982年，143期，29-36頁(Hanley et al. , Radiology 143:29-36(1982))。一個(gè)可能的陽性比率、可能的陰性比率、比值比或者風(fēng)險(xiǎn)比可以被作為預(yù)報(bào)危險(xiǎn)或診斷疾病的一個(gè)測(cè)試能力的衡量。在可能為陽性比率的情況下，值為1表示陽性結(jié)果在 “患病”和“控制”人群中具有均等的機(jī)會(huì)出現(xiàn)，值大于1表示陽性結(jié)果更有可能存在于患病群體中，和值小于1表示陽性結(jié)果更有可能存在于控制群體中。在可能為陰性比率的情況下，值為1表示陰性結(jié)果在“患病”和“控制”人群中具有均等的機(jī)會(huì)存在，值大于1表示陰性結(jié)果更有可能存在于測(cè)試群體中，和值小于1表示陰性結(jié)果更有可能存在于控制群體中。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，一個(gè)極限值被選擇用來從腎臟功能障礙中區(qū)分PE和或心衰，該極限值可以是陽性或陰性可能比率至少大約為1. 5或更大，或者大約為0. 67或更??；更優(yōu)選的，至少大約為2或更大，或者大約為0. 5或更少；更優(yōu)選的，至少大約為5或更大，或者大約為0.2或更??；更優(yōu)選的，至少大約為10或更大，或者大約為0. 1或更??；最優(yōu)選的， 至少大約為20或更大，或大約為0. 005或更小。術(shù)語“大約”在本申請(qǐng)中指給定值的上下％ 5的范圍內(nèi)浮動(dòng)。在比值比(odds ratio)的情況下，值為1表示陽性結(jié)果在“患病”和“控制”人群中具有均等的機(jī)會(huì)出現(xiàn)，值大于1表示陽性結(jié)果更有可能存在于患病群體中，和值小于1表示陽性結(jié)果更有可能存在于控制群體中。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，一個(gè)極限值被選擇用來從腎臟功能障礙中區(qū)分PE和/或心衰，該比值比可以是至少大約為2或更大，或者大約為0. 5 或更少，更優(yōu)選的，至少大約為3或更大，或者大約為0. 33或更少，更優(yōu)選的，至少大約為4 或更大，或者大約為0. 25或更少，更優(yōu)選的，至少大約為5或更大，或者大約為0. 2或更少。 術(shù)語“大約”在本申請(qǐng)中指給定值的上下％ 5的范圍內(nèi)浮動(dòng)。在危險(xiǎn)比值(Hazard ratio)的情況下，值為1表示相對(duì)危險(xiǎn)的終點(diǎn)(例如死亡點(diǎn))在“患病”和“控制”人群中具有均等的機(jī)會(huì)出現(xiàn)，值大于1表示風(fēng)險(xiǎn)更有可能存在于患病群體中，和值小于1表示風(fēng)險(xiǎn)更有可能存在于控制群體中。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，一個(gè)極限值被選擇來從腎臟功能障礙中區(qū)分PE和/或心衰，該危險(xiǎn)比值可以是至少大約為1. 1 或更大，或者大約為0. 91或更少，更優(yōu)選的，至少大約為1. 25或更大，或者大約為0. 8或更少，更優(yōu)選的，至少大約為1. 5或更大，或者大約為0. 67或更少，更優(yōu)選的，至少大約為2. 5 或更大，或者大約為0. 4或更少。術(shù)語“大約”在本申請(qǐng)中指給定值的上下％ 5的范圍內(nèi)浮動(dòng)。一般技術(shù)人員能夠明白，診斷或預(yù)后的指示與診斷，或者與將來臨床結(jié)果的預(yù)后或診斷風(fēng)險(xiǎn)是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。例如，相對(duì)于那些標(biāo)記物質(zhì)的水平等于X或小于X的病人來講，標(biāo)記物質(zhì)的水平大于X可的患者可以提示更有可能遭受不利的結(jié)果，這些由統(tǒng)計(jì)水平的顯著性來決定。另外，標(biāo)記物質(zhì)濃度從基準(zhǔn)水平的改變可能反應(yīng)患者的預(yù)后，標(biāo)記物質(zhì)水平改變的程度可能與不利情況的嚴(yán)重程度相關(guān)。顯著性統(tǒng)計(jì)經(jīng)常通過比較兩個(gè)或更多的人群來確定，并且確定一個(gè)置信區(qū)間(confidence interval)或者a ρ值。參見多瓦德和威爾頓，統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，約漢·威力&孫，紐約，1983 (Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley& ;Sons，New York, 1983) 本發(fā)明的最好的置信區(qū)間為 90%，95%， 97. 5%,98%,99%,99. 5%，99. 9%和 99. 99%，同時(shí)最好的 ρ 值為 0. 1,0. 05,0. 025,0. 02， 0. 01,0. 005,0. 001，和 0. 0001。另一方面，本發(fā)明涉及一種選擇治療方案的方法。該方法優(yōu)選的包括執(zhí)行本發(fā)明描述的診斷或預(yù)后方法，通過減少與診斷聯(lián)系的一些不利后果來選擇一個(gè)或多個(gè)治療方案來提高患者的預(yù)后水平。本方法也可以被用來篩選一些可以如上描述提高患者預(yù)后水平的藥物試劑。另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種測(cè)試亞臨床動(dòng)脈硬化癥和或主體遭受亞臨床動(dòng)脈硬化癥的預(yù)后的試劑盒子或裝置。試劑盒子包括執(zhí)行本發(fā)明描述的這些檢測(cè)方法的裝置和試劑，和操作說明來指導(dǎo)如何檢測(cè)。同樣，試劑盒子可以包括轉(zhuǎn)換對(duì)于診斷或預(yù)后的標(biāo)記物質(zhì)的水平方式的一個(gè)或多個(gè)方式，比如一個(gè)參考的極限值來表示特殊的診斷或預(yù)后。這樣的盒子最好包括足夠的試劑來執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)這樣的測(cè)定，和/或FDA批準(zhǔn)的標(biāo)簽。


圖1. IA和IB描述的從個(gè)體尿鈉肽(proBNP，BNP,和NT-proBNP)檢測(cè)結(jié)果，和在正常和患病人群中計(jì)算出來的組合尿鈉肽檢測(cè)結(jié)果的ROC數(shù)據(jù)。圖1. 2A-2E描述的從個(gè)體尿鈉肽(proBNP，BNP,和NT-proBNP)的檢測(cè)，和在正常和患病人群中計(jì)算出來的組合尿鈉肽檢測(cè)結(jié)果從獲得的柱狀圖。在圖2A，2B，和2C中，在 Y軸上的數(shù)字為單位為pg/ml的proBNP的濃度。在圖2D和2E，Y軸上的數(shù)字表示BNP比proBNP的比值(圖2D)和NT-proBNP比proBNP的比值(圖2E)。本發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的描述，提供方法和試劑來進(jìn)行鑒別和使用與診斷、預(yù)后相關(guān)的標(biāo)記物質(zhì)，或者與BNP相關(guān)聯(lián)的不同情況的區(qū)分。至少兩種免疫檢測(cè)從以下檢測(cè)群中選擇，該檢測(cè)群包括配置檢測(cè)BNP79-108的免疫檢測(cè)；配置檢測(cè)BNP3-76，但是不檢測(cè)BNP的免疫檢測(cè)；和配置檢測(cè)BNP3-108，但是不檢測(cè)BNP的免疫檢測(cè)；這些檢測(cè)可以在來自主體的樣本上進(jìn)行。這些免疫檢測(cè)的結(jié)果被組合計(jì)算，和這些組合計(jì)算的結(jié)果被用來進(jìn)行是否存在腎臟功能障礙的診斷、和/或被用來進(jìn)行是否存在PE的診斷，和/或，被用來從PE的主體中區(qū)分出腎臟功能障礙的診斷。通過這里的描述，測(cè)試BNP79-108的檢測(cè)，例如用兩種結(jié)合存在于BNP79-108分子序列上的抗原決定位點(diǎn)的抗體的三明治免疫檢測(cè)，這種三明治免疫檢測(cè)方法也可以測(cè)試其他與BNP79-108相關(guān)的標(biāo)記物質(zhì)。一抗體的抗原決定基/決定位點(diǎn)位于8個(gè)氨基酸上，因此，免疫測(cè)定將可以測(cè)試其它的多肽(比如相關(guān)的標(biāo)記物質(zhì))，只要該其它的多肽具有必須結(jié)合用來檢測(cè)的抗體上的抗原決定位點(diǎn)。因此，這樣的測(cè)試也可以，但不一定必須是，測(cè)試 BNP,proBNP,BNP3-108以及一些可以提供抗體結(jié)合位點(diǎn)特性的片段。例如，一種檢測(cè)，可以利用特異結(jié)合從BNP上脫落的77和78位點(diǎn)的殘基的第一抗體，和可以既結(jié)合BNP有又結(jié)合 BNP79-108的第二抗體，但是這種檢測(cè)將不測(cè)試proBNP，BNP3-108, NT-proBNP和BNP3-76。 利用兩種抗體的檢測(cè)，其中每一種抗體既結(jié)合BNP又結(jié)合BNP79-108，這種檢測(cè)也可以測(cè)試 proBNP和BNP3-108。每一個(gè)檢測(cè)就是“檢測(cè)BNP79-108的檢測(cè)”。同樣，測(cè)試BNP3-76，但不是BNP的檢測(cè)，例如，用兩種結(jié)合存在于BNP3-76序列上的位點(diǎn)的抗體的三明治免疫方法，也可以，但并不是必須的，測(cè)試其他與BNP3-76相關(guān)的，可以提供抗體結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記物質(zhì)。在一個(gè)例子中，一種檢測(cè)，用一種可以特異結(jié)合從 NT-proBNP上脫落的1和2位點(diǎn)的殘基的第一抗體，用可以結(jié)合NT-proBNP和BNP3-76的第二種抗體；這樣的檢測(cè)不可以測(cè)試proBNP，BNP，BNP79-108和NT-proBNP。在另一個(gè)例子中，利用兩種抗體的檢測(cè)，其中每一種抗體可以結(jié)合NT-proBNP和BNP3-76，這樣的檢測(cè)也可以測(cè)試proBNP和BNP3-108。每一個(gè)檢測(cè)就是“測(cè)試BNP3-76而不是BNP的檢測(cè)”。同樣，測(cè)試BNP3-108，但不是BNP的檢測(cè)，例如，用兩種結(jié)合存在于BNP3-108序列上的位點(diǎn)的抗體的三明治免疫方法，但是至少有一種抗體不結(jié)合BNP，這種抗體也可以，但并不是必須的，測(cè)試其他與BNP3-108相關(guān)的，可以提供抗體結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記物質(zhì)。在一個(gè)這樣的檢測(cè)中，用一種可以特異結(jié)合從proBNP分子上脫落的1和2位點(diǎn)的殘基的第一抗體，用可以同時(shí)結(jié)合NT-proBNP和BNP3-76的第二抗體；但是這樣的檢測(cè)可以不測(cè)試BNP， BNP79-108和NT-proBNP。在第二種檢測(cè)中，利用兩種抗體來測(cè)試，其中每一種抗體可以結(jié)合proBNP和BNP3-108，但是這樣的檢測(cè)不可以測(cè)試BNP和BNP79-108。每一個(gè)檢測(cè)就是 “測(cè)試BNP3-108而不是BNP的檢測(cè)”。用這樣的這些檢測(cè)，一個(gè)“實(shí)質(zhì)表示"BNP或者BNP79-108的濃度可以被計(jì)算出。在一個(gè)例子中，“BNP79-108的檢測(cè)”結(jié)果可以被直接使用，因?yàn)閜roBNP，BNP3-108，NT-proBNP 和BNP3-76的濃度不會(huì)對(duì)該檢測(cè)結(jié)果有貢獻(xiàn)。在另一例子中，包括了 proBNP和BNP3-108的濃度貢獻(xiàn)的“BNP的檢測(cè)”結(jié)果可以通過減去檢測(cè)BNP3-108而不是BNP的檢測(cè)結(jié)果，同樣， 這樣可以做與proBNP關(guān)聯(lián)的對(duì)BNP檢測(cè)結(jié)果的貢獻(xiàn)的校正，這樣就是“去卷積化”的BNP檢測(cè)。在這里，“實(shí)質(zhì)表示” BNP或者BNP79-108檢測(cè)結(jié)果被定義為“BNP的濃度”。同樣，一個(gè)“實(shí)質(zhì)表示” proBNP或者BNP3-108的濃度可以被計(jì)算出。在一個(gè)例子中，“BNP3-108的檢測(cè)”結(jié)果可以被直接使用，因?yàn)锽NP，BNP79-108, NT-proBNP和BNP3-76 的濃度不會(huì)對(duì)該檢測(cè)結(jié)果有貢獻(xiàn)。在另一例子中，包括了 NT-proBNP和BNP3-76的濃度貢獻(xiàn)的“BNP1-108的檢測(cè)”的結(jié)果可以通過減去檢測(cè)BNP3-76而不是BNP的檢測(cè)結(jié)果，同樣，這樣可以做與NTproBNP關(guān)聯(lián)的對(duì)BNP1-108檢測(cè)結(jié)果的貢獻(xiàn)的校正。在這種方式中， “實(shí)質(zhì)表示”proBNP或者BNP3-108檢測(cè)結(jié)果被定義為“proBNP的濃度”。和，一個(gè)“實(shí)質(zhì)表示”NT-proBNP或者BNP3-76的濃度可以被直接測(cè)量或通過從檢測(cè)每一個(gè)尿鈉肽形式的檢測(cè)結(jié)果中去除ProBNP或BNP3-108，和BNP或BNP79-108對(duì)該檢測(cè)結(jié)果的貢獻(xiàn)而計(jì)算出來。 在這種方式中，“實(shí)質(zhì)表示”NTproBNP或者BNP3-76檢測(cè)結(jié)果被定義為“NTproBNP的濃度”。這些實(shí)質(zhì)濃度然后被用來成為一個(gè)“組合的尿鈉肽結(jié)果”，它為以下至少兩個(gè)濃度的函數(shù)值一個(gè)“BNP的濃度”，一個(gè)“proBNP濃度”和一個(gè)“NTproBNP濃度”。在一些優(yōu)選的方式中，這樣的函數(shù)值可以是proBNP比BNP的一個(gè)比率，BNP比proBNP的一個(gè)比率，BNP比 NT-proBNP的一個(gè)比率，NT-proBNP比BNP的一個(gè)比率，proBNP比NT-proBNP的一個(gè)比率， 或者NT-proBNP比proBNP的一個(gè)比率.同本領(lǐng)域內(nèi)至少的標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)一樣，這些組合的尿鈉肽結(jié)果可以作為診斷或預(yù)后的標(biāo)記物質(zhì)。定義術(shù)語“標(biāo)記物質(zhì)”在這里指蛋白，多肽，磷脂或者從主體上獲得樣本中的目的小分子。在本發(fā)明中，作為標(biāo)記物質(zhì)的“蛋白或多肽”可以包括任何他們的片段，特別的，可以用免疫分析方法分析的，可被檢測(cè)的任何片段。例如在“組合尿鈉肽結(jié)果”的情況下，“標(biāo)記物質(zhì)”可以起源于對(duì)一些單獨(dú)的標(biāo)記物質(zhì)的測(cè)量。術(shù)語“關(guān)聯(lián)標(biāo)記物質(zhì)”在這里是指某個(gè)特殊標(biāo)記物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)片段，或者生物合成某個(gè)特殊標(biāo)記物質(zhì)的父母物質(zhì)，這些父母物質(zhì)可以作為該標(biāo)記物質(zhì)本身的替代物，或者作為單獨(dú)的標(biāo)記物質(zhì)。例如，人類BNP是起源于前體108個(gè)氨基酸蛋白分子水解而來的， 在以下都指BNP1-108。成熟的BNP或者“BNP尿鈉肽”或“BNP32”為32個(gè)氨基酸，代表前體蛋白分子上77-108位點(diǎn)之間的氨基酸序列，它可以表示為BNP77-108。這些剩余的1_76 在這些被稱為BNP1-76。這里大部分標(biāo)記物質(zhì)都是由更大的前體分子合成的，這些分子又被處理來提供成熟的標(biāo)記物質(zhì)，和/或在循環(huán)中以標(biāo)記物質(zhì)的片段的形式存在。這樣，與這里描述的標(biāo)記物質(zhì)的“關(guān)聯(lián)標(biāo)記物質(zhì)”可以被區(qū)分識(shí)別，也可以與上面描述的BNP的類似物質(zhì)使用。另外，關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物質(zhì)可以是母標(biāo)記物質(zhì)經(jīng)過共價(jià)修飾的結(jié)果，例如通過蛋氨酸，甲硫氨酸殘基，泛素化(ubiquitination)等的氧化作用。術(shù)語“樣本”在這里是指為了診斷、預(yù)后或評(píng)估使用而從主體，例如病人，上獲得的體液樣本。在一些實(shí)施方式中，樣本可以為了測(cè)定正在發(fā)生的情況或針對(duì)情況進(jìn)行治療的結(jié)果為目的而被獲得。優(yōu)選的樣本為全血，血清，血漿，腦脊髓液，尿液體，唾液，談液，胸腔積水。另外，任何一個(gè)本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都可以認(rèn)識(shí)到，一些樣本都可以經(jīng)過分離，純化過程而被獲得，例如從全血中分析血漿或血清。在這里使用的“多數(shù)”是指至少兩個(gè)。優(yōu)選的，多數(shù)是指至少3個(gè)或，更優(yōu)選的為至少5，甚至更多為至少10，甚至至少為15，最優(yōu)選的為至少20。在一個(gè)更優(yōu)選的方式中， 多數(shù)代表更大的數(shù)量，例如至少為100。
術(shù)語“主體”在這里是指人類或非人類的有機(jī)體。這樣，本發(fā)明的方法和試劑都可以在人類或動(dòng)物疾病中運(yùn)用。進(jìn)一步，盡管一個(gè)優(yōu)選的方式中的主體最好為活體有機(jī)體，當(dāng)然本發(fā)明也可以被使用在死后的尸體檢測(cè)中。優(yōu)選的“主體”為病人或患者，例如活著的接受藥物治療的人類。這也包括為了病理學(xué)信息而被調(diào)查的沒有明顯疾病的人。在本發(fā)明的一個(gè)案例中，優(yōu)選的主體為了評(píng)估是否存在亞臨床的動(dòng)脈硬化癥一些個(gè)體，他們并不表現(xiàn)出臨床癥狀，最優(yōu)選的，這些個(gè)體不表現(xiàn)出胸痛或EGG改變，沒有穩(wěn)定的絞痛反應(yīng)，不穩(wěn)定的絞痛反應(yīng)和/或心肌梗塞。優(yōu)選的主體為了那些為了預(yù)兆性評(píng)估的個(gè)體，他們不表現(xiàn)出臨床癥狀，最優(yōu)選的不具有胸痛或EGG改變，不表現(xiàn)出穩(wěn)定的絞痛，不穩(wěn)定的絞痛和/或不表現(xiàn)心肌梗塞，但是他們可以被用來進(jìn)行亞臨床的動(dòng)脈硬化癥診斷。術(shù)語“診斷”在這里是指一些方法，普通的一般技術(shù)人員可以通過該方法來進(jìn)行評(píng)估或決定一個(gè)患者是否遭受給定的疾病或情況。該熟練的技術(shù)人員經(jīng)常安排一些針對(duì)一個(gè)或多個(gè)診斷指示劑的診斷，例如標(biāo)記物質(zhì)，存在，不存在，數(shù)量或數(shù)量的變化，這些可以反應(yīng)該情況是否存在，以及嚴(yán)重程度。同樣，“預(yù)后”指一種給定的結(jié)果或過程發(fā)生的可能性。這經(jīng)常通過檢查一個(gè)或多個(gè)預(yù)后指示試劑來測(cè)定。這些標(biāo)記物質(zhì)，在患者中(從患者中的樣本上)存在的數(shù)量或是否存在，提供一個(gè)信號(hào)的可能性來表示給定的過程或結(jié)構(gòu)是否會(huì)發(fā)生。例如，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)從患者中取出的樣本中的預(yù)后指示試劑達(dá)到一個(gè)足夠高的水平的時(shí)候，該信號(hào)特征指示該患者，相對(duì)于那些底水平的患者來講，有更大的可能性來體驗(yàn)將來的打擊。預(yù)后指示試劑的水平或水平的改變，它又反過來與不健康或死亡的可能性聯(lián)系，是指作為“對(duì)于不利結(jié)果具有更容易患病的體質(zhì)相聯(lián)系”。術(shù)語“校正”，作為診斷或預(yù)后標(biāo)記物質(zhì)的參考，在這里指把患者的標(biāo)記物質(zhì)的存在或數(shù)量與那些已經(jīng)知道遭受給定情況，或已經(jīng)知道處于危險(xiǎn)的人進(jìn)行比較，或者與那些已經(jīng)知道沒有給定情況的人進(jìn)行比較。如上面的討論，在一個(gè)患者樣本中的標(biāo)記物質(zhì)的水平可以與已經(jīng)知道與特殊診斷標(biāo)記物質(zhì)的水平進(jìn)行比較，也就是，普通的技術(shù)人員可以使用該標(biāo)記物質(zhì)的水平來確定患者是否需要特殊方式的診斷，以及響應(yīng)的反應(yīng)。可選的，該樣本中的標(biāo)記物質(zhì)的水平可以與已經(jīng)知道具有好的情況(例如不存在疾病等)的標(biāo)記物質(zhì)的水平進(jìn)行比較。術(shù)語“決定診斷”在這里指普通的技術(shù)人員通過這些方法可以決定患者是否存在某種疾病。術(shù)語“診斷”不是指100%的準(zhǔn)確決定是否存在某種疾病的能力，或者也不是指一個(gè)給定的過程或結(jié)果相對(duì)沒有的情況下更有可能發(fā)生的能力。相反，普通的技術(shù)人員可以理解該術(shù)語“診斷”是指某種疾病是否存在患者中的增加的可能性。一個(gè)優(yōu)選的方式中， 診斷表示一種疾病被增加了 5%的機(jī)會(huì)存在，大約10%的機(jī)會(huì)，大約15%的機(jī)會(huì)，大約20% 的機(jī)會(huì)，大約25 %的機(jī)會(huì)，大約30 %的機(jī)會(huì)，大約40 %的機(jī)會(huì)，大約50 %的機(jī)會(huì)，大約60 % 的機(jī)會(huì)，大約75%的機(jī)會(huì)，大約90%的機(jī)會(huì)和大約95%的機(jī)會(huì)存在。術(shù)語“大約”在本發(fā)明中指正負(fù)2%的范圍內(nèi)變化。同樣，術(shù)語“決定預(yù)后”在這里指普通的技術(shù)人員通過這些方法可以決定患者在將來可能出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)臨床結(jié)果的可能性。普通的技術(shù)人員可以理解該術(shù)語“預(yù)后”是指某種臨床結(jié)果在將來某天發(fā)生的被增加的可能性。一個(gè)優(yōu)選的方式中，預(yù)后表示一種臨床結(jié)果，相對(duì)于“控制”人群來講，被增加了 5%的機(jī)會(huì)，大約10%的機(jī)會(huì)，大約15%的機(jī)會(huì)，大約20 %的機(jī)會(huì)，大約25 %的機(jī)會(huì)，大約30 %的機(jī)會(huì)，大約40 %的機(jī)會(huì)，大約50 %的機(jī)會(huì)，大約60%的機(jī)會(huì)，大約75%的機(jī)會(huì)，大約90%的機(jī)會(huì)和大約95%的機(jī)會(huì)。術(shù)語“大約”在本發(fā)明中指正負(fù)2%的范圍內(nèi)變化。術(shù)語“腎衰竭”在這里指主體屬于或者在48小時(shí)內(nèi)有增加的危險(xiǎn)性具有劇烈的腎傷害程度的等級(jí)劃分，在梅思特等中(Mehta et al.，Crit. Care 11 :R31(doi :10. 1186. cc5713),2007)中有具體的描述，再次作為全部引用“階段1” 血清中肌氨酸酐增加到等于或大于0. 3mg/dL( > ；26. 4微摩爾/升沈.4 μ mol/L)，或者血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基線尿液的150% (1.5倍)以上，基線尿液輸出量一般在6小時(shí)內(nèi)少于0. 5毫升/小時(shí)?！半A段II”:血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基線尿液的200% 0倍)以上，基線尿液輸出量一般在12小時(shí)內(nèi)少于0. 5毫升/小時(shí)。。“階段III”:血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基線尿液的300% (3倍)以上，基線尿液輸出量一般在M小時(shí)內(nèi)少于0. 5毫升/小時(shí)或者無尿液達(dá)12小時(shí)。術(shù)語“心力衰竭”在這里是指一個(gè)主題屬于美國心臟病學(xué)院/美國心臟心力衰竭組織在關(guān)于它的分級(jí)表(亨式等人在“ACC/AHS2005”上發(fā)表的關(guān)于診斷和管理心力衰竭中)(Chronic Heart Failure in the Adult, “ Circulation 112(12) :el54_235 (doi : 10. 1161/CIRCULATI0NAHA. 105. 167586) ,2005 )階段A:患者在將來具有發(fā)生心力衰竭的高危險(xiǎn)性，但是沒有功能或結(jié)構(gòu)的失調(diào)。階段B 心臟結(jié)構(gòu)失調(diào)，但是在任何階段沒有征兆出現(xiàn)。階段C:在具有心臟結(jié)果問題下具有早期的或當(dāng)前的心力衰竭征兆，但是還是可以通過藥物治療。階段D 更高級(jí)的需要醫(yī)院基礎(chǔ)支持，心臟移植或減輕痛苦的疾病。術(shù)語“肺塞“這里所用的一個(gè)主題是指患了肺動(dòng)脈或者他的一個(gè)分之發(fā)生血管堵塞，通常發(fā)生時(shí)(血液從靜脈血栓)靜脈血栓成為趕出其形成和血栓化從而在肺部的一動(dòng)脈的血液供應(yīng)。所謂“不連續(xù)或離散“，在這里是指不連續(xù)表面的區(qū)域。也就是說，兩個(gè)區(qū)域是彼此分離開的，如果不屬于任何一個(gè)領(lǐng)域的一部分的邊界完全圍繞著這兩個(gè)區(qū)域。所謂“可以獨(dú)立尋址“這里所用的指的是從離散的表面區(qū)域可以獲得一個(gè)特定的信號(hào)。所謂“抗體“，是指在這里是指模仿或?qū)嵸|(zhì)上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因編碼的肽或多肽，以及他們的片段，這些抗體具有特異性結(jié)合抗原或抗原表位的能力。參見以下參考文獻(xiàn)W · E ·鮑威爾等的《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(第3版本)，紐約1993年Raven出版(Fundamental Immunology,3rd Edition, W. Ε. Paul, ed. , Raven Press, N. Y. (1993))； 威爾旬等的 1994 年的《免疫方法》175 卷:267-273 (Wilson (1994J J. Immunol. Methods 175 :267-273)；亞麻式的《生物生理學(xué)方法雜志》，1992年，25卷，85-97頁(Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25 :85-97.)。術(shù)語“抗體”包括抗原_結(jié)合部分，例如“抗原結(jié)合位點(diǎn)”(例如一些片段，或者子序列或一些具有結(jié)合抗原能力的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs))，包括(i)Fab片段，一個(gè)由VL，VH，CL and CHl區(qū)組成但價(jià)片段；(ii) 2個(gè)F (ab ‘)片段，一個(gè)二價(jià)的片段包括在鉸鏈區(qū)域通過二硫化合物連接的兩個(gè)片段；(iii)包括VH和CHl區(qū)域的 Fd片段；(iv)包括抗體單個(gè)臂狀VL和VH區(qū)域的Fv片段；(ν)包括有VH區(qū)域的dAb片段(Ward et al.，(1989) Nature 341 :544-546)和(vi)單獨(dú)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR).單鏈抗體物質(zhì)也被包括在本發(fā)明的術(shù)語所定義的“抗體”中。術(shù)語“特異性結(jié)合”沒有任何意圖表示一個(gè)抗體專有地結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)。更合適的， 如果抗體對(duì)于目標(biāo)物質(zhì)的親和力大約為5-4倍于該抗體與非目標(biāo)物質(zhì)的之間的親和力就認(rèn)為該抗體為“特異性地結(jié)合”。優(yōu)選的，相對(duì)與抗體與非目標(biāo)物質(zhì)的親和力而言，抗體與目標(biāo)物質(zhì)的親和力至少為5倍，優(yōu)選的為10倍，更優(yōu)選的為25倍，甚至更優(yōu)選的為50倍，最優(yōu)選的為100倍或更大。在有些優(yōu)選的方式中，抗體或其它結(jié)合物質(zhì)和抗原之間的特異結(jié)合意思是指他們之間至少為IO6M4結(jié)合親和力，優(yōu)選的大約為IO8M4與大約IO9M4之間；大約ΚΑΤ1與大約ΙΟ1、—1之間，或者大約ΙΟ、—1與大約IO11M-1之間。親和力通過如下公式計(jì)算Kd = k。ff/k。n(k。ff為分裂速度常數(shù)，k。n為結(jié)合速度常數(shù)和Kd為平衡常數(shù)).親和力可以通過在平衡狀態(tài)下測(cè)定不同濃度情況下被標(biāo)記的配合基的小片段結(jié)合數(shù)。該數(shù)據(jù)通過斯卡恰特(katchard equation)方程式做圖r/c = K(n-r)r =在平衡狀態(tài)下，被結(jié)合的配合基的摩爾數(shù)/接受體的摩爾數(shù)；c =在平衡狀態(tài)下的自由的配合基的濃度濃度；K =平衡常數(shù)；η =每一個(gè)接受分子所結(jié)合的配合基的數(shù)量通過作圖分析，r/c的值被繪制在Y軸上，r被繪制在X軸上，這樣就形成了斯卡恰特圖。親和力就是所做圖線條的負(fù)斜率(negative slope of the line), < 可以通過結(jié)合的標(biāo)記的配合基與非標(biāo)記的過量的配合基的競(jìng)爭(zhēng)而測(cè)試到(參見例如美國專利號(hào)碼 6，316，409)。對(duì)于目標(biāo)分子的目標(biāo)試劑的親和力至少為1χ10_6摩爾/升，更優(yōu)選的為至少大約1χ10_7摩爾/升，更優(yōu)選的為至少大約為1χ10_8摩爾/升。甚至更優(yōu)選的為至少大約1χ10_9摩爾/升和更優(yōu)選的為至少大約1x10,摩爾/升。通過斯卡恰特(katchard equation)方程式來測(cè)定抗體的親和力是本領(lǐng)域已知道的技術(shù)。參見皖易科等，免疫雜志， 1991 年，12 期425-43 (van Erp et al.，J. Immunoassay 12 :425-43,1991 ；)和納爾遜和勾威沃特，生物群計(jì)算機(jī)程序方法，1988年，27期65-8，(Nelson and GriswoId, Comput. Methods Programs Biomed. 27 :65-8)。衡量測(cè)試的準(zhǔn)確性可以參照非稀爾等的《重病特別護(hù)理》，2003年四期1043-51頁 (Fischer et al. ,Intensive Care Med.四1043_51，2003)上具體詳細(xì)的的方法和使用他來測(cè)試一個(gè)給定的標(biāo)記物質(zhì)或多個(gè)標(biāo)記物質(zhì)的效果。這些衡量包括特異性，靈敏性，先兆性預(yù)測(cè)價(jià)值以及相似的比率，診斷比值比和ROC曲線區(qū)域。正如上面的描述，最好的測(cè)試和檢測(cè)表現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)以下描述的結(jié)果至少有75%的靈敏度，同時(shí)具有75%的特異性；至少0. 6的ROC曲線區(qū)域，優(yōu)選的為0. 7，更優(yōu)選的為0. 8，更優(yōu)選的為至少0. 9， 更優(yōu)選的為至少0. 9和最優(yōu)選的為0. 95的ROC曲線區(qū)域；和/或陽性可能比率(靈敏度/ (1-特異性))至少為5，更優(yōu)選的至少為10，最優(yōu)選的至少為20，和陰性可能比率((1-靈敏度)/特異性)小于或等于0. 3，最好的為小于或等于0. 2，和最優(yōu)選的為小于或等于0. 1。分析測(cè)量策略各種各樣的方法和裝置都可以被運(yùn)用到本發(fā)明中來測(cè)試和分析標(biāo)記物質(zhì)。對(duì)于患者樣品中的多肽或蛋白，免疫分析裝置和方法被經(jīng)常使用到。這些參見美國專利 6，143，576 ；6，113，855 ；6，019，944 ；5，985，579 ；5，947，124 ；5，939，272 ；5，922，615 ； 5，885，527 ；5，851，776 ；5，824，799 ；5，679，526 ；5，525，524 ；和 5，480，792，以上所列舉的
每個(gè)在這里包括所有的表，圖和權(quán)利要求被全部引用并與本發(fā)明構(gòu)成一體。這些裝置和方法可以利用標(biāo)記的分子進(jìn)行三明治、競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式，產(chǎn)生一個(gè)與感興趣的被分析物質(zhì)存在或數(shù)量相關(guān)的信號(hào)。另外，這樣的方法和裝置，例如生物傳感器、光學(xué)免疫分析也可以被用來測(cè)試被分析物質(zhì)的存在或數(shù)量而不需要標(biāo)記分析。見美國專利5，631，171和 5，955，377，以上所列舉的每個(gè)專利的全部，包括所有的表，圖和權(quán)利要求，在這里被全部引用并與本發(fā)明構(gòu)成一體。本技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，一些自動(dòng)設(shè)備，包括但不局限于，貝殼曼設(shè)備(BECKMAN)，雅陪的AxSYM，羅式的ElecSys，寶林曼狀態(tài)系統(tǒng)(Stratus systems)都屬于免疫分析儀器，他們也可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所教導(dǎo)的免疫檢測(cè)。更好的，利用免疫法分析本發(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)和方法，更優(yōu)選的使用三明治方法，盡管其他的方法也是本領(lǐng)域知曉的(例如分析RNA水平的分析)。通常，一個(gè)標(biāo)記物質(zhì)的存在或數(shù)量使用特異結(jié)合每一個(gè)標(biāo)記物質(zhì)的抗體來測(cè)試特異的結(jié)合而檢測(cè)。任何合適的免疫分析都可以被使用，例如酶聯(lián)免疫(ELISA)，放射免疫方法(RLAs)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析以及類似的方法。特異結(jié)合抗體的免疫可以被直接或檢測(cè)的測(cè)試。直接的標(biāo)記包括熒光、發(fā)光元件，金屬，顏料，放射性核酸以及類似的直接與抗體連接。非直接的標(biāo)記包括本領(lǐng)域熟悉的酶類， 例如堿性的磷酸酶，辣根過氧化酶以及類似的。使用固定的特異結(jié)合抗體的方法在本發(fā)明也是可行的。這些抗體可以被固定在很多種支撐介質(zhì)，例如磁性或?qū)游鼍仃囄⒘?，測(cè)試盤子的表面(例如微孔)，或者固體基體材料上或膜上(例如塑料，尼龍或紙上)或者與他們類似的材料上。一分析試劑條可以通過處理抗體或多個(gè)抗體在固體表面上而被準(zhǔn)備。該試劑條然后可以被插入到樣本中，進(jìn)行快速的沖洗和檢測(cè)步驟來產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，例如一個(gè)帶有顏色的點(diǎn)。為了分開或連續(xù)檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)，合適的設(shè)備包括臨床使用的分析儀，例如 ElecSys (羅式)，the AxSym(雅培)，the Access (Beckman)，以及商標(biāo)為 ADVIA CENTAUR (Bayer)的免疫分析系統(tǒng)，商標(biāo)為 NICHOLS ADVANTAGE (Nichols Institute)的免疫分析系統(tǒng)等等。更優(yōu)選的設(shè)備使用單個(gè)檢測(cè)裝置來執(zhí)行多個(gè)標(biāo)記物質(zhì)的分析。特別的，使用具有不連續(xù)的，可以地址化的物理格式表面來進(jìn)行多種不同被分析物質(zhì)的檢測(cè)。這樣的設(shè)備可以包括蛋白微分析儀或“蛋白芯片“(例如參見Ng and Hag, J. Cell MoI. Med. 6 329-340(2002))和這樣的毛細(xì)裝置(見美國專利6，019，944)。在這些實(shí)施方式中，每一個(gè)不同的位置上的獨(dú)立的表面可以包括固定一個(gè)或多個(gè)被分析物質(zhì)(例如一標(biāo)記物質(zhì))的抗體來在每個(gè)位置上進(jìn)行測(cè)試。表面也可選的包括一個(gè)或多個(gè)不同的微粒(例如微粒子或納米粒子)，他們被固定在表面上的不同位置，這樣包括有抗體的微粒子可以為了測(cè)試而固定一個(gè)被分析物質(zhì)(例如標(biāo)記物質(zhì))。為了一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)，本發(fā)明的檢測(cè)裝置也包括被共扼到固體相上的第一抗體和被共扼有信號(hào)發(fā)生元件的第二抗體。如此的檢測(cè)裝置被利用來進(jìn)行三明治免疫分析一個(gè)或多個(gè)被分析物質(zhì)。這些裝置可以還包括一個(gè)樣本施加區(qū)域和從樣本施加區(qū)域流動(dòng)到第二個(gè)檢測(cè)裝置區(qū)域的流動(dòng)路徑，第二個(gè)檢測(cè)裝置區(qū)域包括被共扼到固體相上的第一抗體。隨著樣本沿著流動(dòng)路徑被驅(qū)使而被動(dòng)的流動(dòng)(例如通過毛細(xì)壓力，流體靜力學(xué)或其他的一旦樣本被施加就不需要再操作的壓力)，主動(dòng)的流動(dòng)(例如通過機(jī)械泵產(chǎn)生的壓力，電子泵，地心引力，被增加的空氣壓力等等)，或者被動(dòng)或主動(dòng)方式的結(jié)合的驅(qū)使壓力。 更優(yōu)選的，樣本被施加到樣本施加區(qū)域上，沿著流體路徑將接觸被共扼到固體相上的第一抗體和被共扼有信號(hào)發(fā)生元件的第二抗體(三明治檢測(cè)模式)。另外的，裝置還可以包括從全血中過濾分離血清或血漿，包括混合腔體等等，或者由于工藝要求而被包括到裝置上。 更優(yōu)選的裝置包括在《免疫測(cè)定手冊(cè)》的第41章，題目為“近患者測(cè)試商標(biāo)為Triage 的心臟病系統(tǒng)，作者戴維等等，自然出版集團(tuán)，2001 (Near Patient Tests =Triage Cardiac System,，，in The Immunoassay Handbook, 2nd ed. , David Wild, ed. , Nature Publishing Group, 2001) 該文章的全部作為本發(fā)明的一部分被引用。標(biāo)記物質(zhì)的分析可以通過不同的物理模式被檢測(cè)分析。例如，使用微量盤或者自動(dòng)控制可以被使用來加快檢測(cè)大量樣本的進(jìn)程?？蛇x的，單個(gè)樣本的模式也可以發(fā)展而被用來進(jìn)行快速治療或診斷，例如在緊急運(yùn)輸或急診室里。在另一個(gè)方式中，本發(fā)明也提供一個(gè)分析標(biāo)記物質(zhì)的試劑盒子。這樣的盒子包括裝置和為了分析至少一個(gè)測(cè)試樣本的試劑以及如何進(jìn)行檢測(cè)的說明書。當(dāng)然，該盒子也可以包括利用這些從標(biāo)記物質(zhì)面板上的免疫檢測(cè)而獲得的信息進(jìn)行某種治療的一個(gè)或多個(gè)手段?；蛘咂渌目梢詧?zhí)行本發(fā)明所描述方法的測(cè)定策略，包括層析(例如高效液相色譜分析HPLC)，質(zhì)譜測(cè)量，基于受體的檢測(cè)和以上方式的結(jié)合。檢測(cè)的臨床靈敏度被定義為這種檢測(cè)可以正確預(yù)測(cè)具有某種疾病的百分?jǐn)?shù)， 特異性被定義為這種檢測(cè)可以正確預(yù)測(cè)不具有某種疾病的百分?jǐn)?shù)(Tietz Textbook ofClinical Chemistry,2nd edition, Carl Burtis and Edward Ashwood eds., W. B. Saunders and Company，p. 496)。衡量測(cè)試的準(zhǔn)確性可以參見《重病特別護(hù)理》(Fischer et al. ,Intensive Care Med. 29 :1043_51，2003)所描述的方法而得到，也被用于來測(cè)定一個(gè)給定標(biāo)記物質(zhì)或多個(gè)標(biāo)記物質(zhì)的效力。這種測(cè)定包括靈敏度，特異性，先兆性值，可能的比率，診斷讓步比(diagnostic odds ratios)，和ROC曲線區(qū)域。正如上面的討論，優(yōu)選的測(cè)試和檢測(cè)表現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)如下不同測(cè)試的結(jié)果從主體具有腎功能衰竭從區(qū)分肺栓的能力，具有陽性或陰性讓步比分別為至少 1. 5或者更大，或者大約0. 67或更?。粌?yōu)選的，至少為2或更大；或大約0. 5或更?。蝗匀桓鼉?yōu)選的，至少為5或更大；或大約0. 2或更??；甚至更優(yōu)選的為至少10或更大；或大約0. 1 或更?。蛔顑?yōu)選的為至少20或更大；或大約0. 05或更小。術(shù)語“大約”在這里指正負(fù)給定測(cè)量值的5%上下浮動(dòng)。從主體具有腎功能衰竭從區(qū)分肺栓的能力，具有讓步比至少為2或者更大，或者大約0.5或更??；優(yōu)選的，至少為3或更大；或大約0. 33或更小；仍然更優(yōu)選的，至少為4或更大；或大約0. 25或更?。簧踔粮鼉?yōu)選的為至少5或更大；或大約0. 2或更??；最優(yōu)選的為至少10或更大；或大約0. 1或更小。術(shù)語“大約”在這里指正負(fù)給定測(cè)量值的5%上下浮動(dòng)。從主體具有腎功能衰竭從區(qū)分肺栓的能力，具有危險(xiǎn)率至少為1. 1或者更大，或者大約0. 91或更?。粌?yōu)選的，至少為1. 25或更大；或大約0. 8或更??；仍然更優(yōu)選的，至少為1. 5或更大；或大約0. 67或更??；甚至更優(yōu)選的為至少2或更大；或大約0. 5或更小；最優(yōu)選的為至少2. 5或更大；或大約0. 4或更小。術(shù)語“大約”在這里指正負(fù)給定測(cè)量值的 5%上下浮動(dòng)。
抗體的選擇抗體的選擇和產(chǎn)生可以采用多種方法。例如，一種方法就是純化感興趣的多肽或者合成感興趣的多肽。例如利用本領(lǐng)域知曉的固相氨基酸合成方法，例如參見M · D謝爾河等的《蛋白純化指南》，酶聯(lián)免疫方法(1990)，182卷(Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed.，Meth. Enzymo 1. Vol 182(1990)) ；G · B 菲爾德等的《氨基酸固相合成》，酶聯(lián)免疫方法(1997)，289 卷(Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed.，Meth. Enzymo 1. Vol 289(1997))；科所等的《醫(yī)藥化學(xué)雜志》(日本東京)(1990)，38 1192-99 (Kiso et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38 1192-99，1990)；莫思多等的《生物多肽，蛋白，核酸》(1995) 1 :255-60 (Mostafavi et al，Biomed. P印t. Proteins Nucleic Acids 1 =255-60,1995)；富基瓦等的《醫(yī)藥化學(xué)雜志》(日本東京)(1990)，38 =1192-99 (Fujiwara et a 1, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)44 :1326-31，1996)。選擇的多肽可以被注射到例如老鼠或兔子中去產(chǎn)生多克隆的或單克隆抗體。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員都可以知道很多公知的方法可以產(chǎn)生抗體，例如在愛底華·哈落，大衛(wèi)·蘭頓編寫的《抗體·實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(1998)，冷春海港，紐約(Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N. Y.)。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以知道抗體的結(jié)合片段或Fab片段的模仿也可以通過基因信息等制造(例如麗巴等的《抗體工程》牛津大學(xué)出版(1995)的實(shí)際操作指南免疫雜志，149，3914-3920) (Borrebaeck, C， ed.)，1995，Oxford University Press, Oxford ;J. Immunol.149，3914—3920(1992))。另外，也有很多種報(bào)告使用抗菌素顯示技術(shù)來生產(chǎn)和識(shí)別多肽文庫從而通過結(jié)合篩選出目標(biāo)抗體(參見 Cwirla et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA 87，6378-82，1990 ； Devlin et al. ，Science 249，404-6，1990，Scott and Smith,Science 249，386-88，1990 ; and Ladner et al.，U. S. Pat. No. 5，571，698.)?？咕仫@示技術(shù)的一個(gè)基本的理論就是建立編碼被篩選的多肽的DNA和該多肽的物理學(xué)聯(lián)系，這種物理聯(lián)系被抗菌素粒子提供，它顯示為作為衣殼部分的多肽，該衣殼又包括有編碼該多肽的衣殼。多肽和他們的基因物質(zhì)之間的物理關(guān)系允許同時(shí)大量篩選那些包括有不同多肽的抗菌素。顯示一個(gè)與目標(biāo)物質(zhì)具有親和力的多肽的抗菌素通過與目標(biāo)物質(zhì)的親和力而濃縮。從這些抗菌素顯示而鑒別的多肽可以從他們各自的特殊基因測(cè)定。使用這些方法，具有對(duì)設(shè)計(jì)特定目標(biāo)的結(jié)合親和力的多肽然后可以根據(jù)傳統(tǒng)的方法大量合成，參見美國專利號(hào)ο. 6，057，098的描述，該專利的所有圖表，權(quán)利要求等全部內(nèi)容與本發(fā)明內(nèi)容結(jié)合而為本發(fā)明的一部分。如果有必要，通過這些方法產(chǎn)生的這些抗體然后可以通過感興趣的純化的多肽進(jìn)行首次親和力和特異性篩選，然后與帶有用來排除結(jié)合多肽的抗體進(jìn)行親和力和特異性比較。篩選的方法可以固定純化的多肽在微孔板上。含有潛在的抗體或抗體群溶液被添加到每一個(gè)微孔板上，然后孵育30分鐘到2小時(shí)。然后，該微孔板被洗脫，標(biāo)記的第二抗體(例如帶有堿性磷酸酶的抗老鼠抗體的抗體，如果該抗體是由老鼠免疫產(chǎn)生的)被添加這些孔中，然后再孵育30分鐘，最后再次洗脫。底物被加入到孔中，如果具有與固定的多肽結(jié)合的抗體存在，將會(huì)發(fā)生顏色反應(yīng)。這些被篩選的抗體還可以進(jìn)一步的分析他們的親和力和特異性。在為了產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的抗體免疫分析過程中，純化的目標(biāo)蛋白作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，通過該標(biāo)準(zhǔn)來調(diào)節(jié)被選擇的抗體在免疫分析中的特異性和靈敏性。因?yàn)槎喾N具有親和力的抗體可能也不同，這些抗體對(duì)(在三明治檢測(cè)中)可能在空間結(jié)構(gòu)上相互影響等，執(zhí)行檢測(cè)的抗體可能需要更重要的測(cè)量，相對(duì)純粹的親和力和特異性的抗體而言。任何本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都可以認(rèn)識(shí)到很多方法可以用來生產(chǎn)抗體或結(jié)合片段，以及為了親和力和特異性來篩選和選擇可以結(jié)合各種多肽的抗體，但是這些方法并不能改變本發(fā)明的范圍。例子如下描述的例子只是舉例說明本發(fā)明。這些例子沒有任何企圖來限制本發(fā)明的范圍。例1 患者人群的描述正常這類人權(quán)群由明顯健康，正常的主體組成并作為新診斷測(cè)試的“控制”主體。正常人的標(biāo)準(zhǔn)包括(1)在登記注冊(cè)時(shí)為18-65歲和(2)有能力書寫書面知情同意書的人群。但不包括以下人群(1)具有急性或慢性疾病(例如高血壓，糖尿病，艾茲)；( 從登記注冊(cè) 30天內(nèi)需要抗體治療的急性(尿路感染)，(3)當(dāng)前有喝酒或吸毒證明的，年內(nèi)得過急性腫瘤，惡性皮膚癌除外，(5)最近3個(gè)月內(nèi)作過大型手術(shù)和(6)通過調(diào)查被認(rèn)為不合適的人群。心臟舒張功能障礙(DD)這類人群的標(biāo)準(zhǔn)為年紀(jì)大于18歲并具有中間或低可能性的胸痛，他們承認(rèn)到醫(yī)院胸痛科室去過(CPU)。為了更好的為了研究，那些具有心肌梗塞(myocardial infarction(MI))和曾經(jīng)作為CPU部分的心臟超聲波的負(fù)應(yīng)力病人也被排除在外。壓力回聲作為一個(gè)左心房(left ventricular (LV))噴門運(yùn)動(dòng)的一個(gè)客觀的證據(jù)，LV的厚度和心室舒張功能不良的多譜參數(shù)(Doppler parameters)。同時(shí)，排除的標(biāo)準(zhǔn)也包括具有初級(jí)評(píng)估/診斷表明具有心膜冠心疾病((CAD)或心肌梗塞，以及由于歷史心室舒張功能不良而導(dǎo)致的充血性心臟衰竭(CHF)。在超聲波檢測(cè)中具有心室舒張功能不良的患者也被排除在外。肺栓(PE)年紀(jì)包括大于或包括18歲的患者的人群被要求進(jìn)行PE的診斷，存在PE的標(biāo)準(zhǔn)為(1)肺部血管造影為陽性，或( 用高可能性的V/Q掃描，或者C3)較低級(jí)的極端雙陽性研究和高懷疑為PE(基于以下歷史性，身體檢查，動(dòng)脈血管空氣，胸片和心電圖(ECG)組合中的之一的臨床調(diào)查來確定在臨床上有接近80%的概率可能患有PE)，或(4)在不存在慢性肺病中具有不正常的超聲波心電圖的患者具有高臨床懷疑性，或( 陽性的螺旋CT血管造影。那些具有左心臟衰竭，和冠心病癥狀，或者腎臟功能衰竭(肌氨酸酐大于1. 5mg/dl) 的患者被排除在外。HF (心力衰竭)這一部分人群包括年紀(jì)大于18歲以上的并需要心力衰竭治療的患者。患者具有 (1)當(dāng)前具有心肌梗塞(MI (myocardial infarction))或具有1毫米的或更大的ST分離的ACS (嚴(yán)重的冠心病癥狀)，(2)需要透析的腎臟衰竭；(3)最近過去一月的血液透析，(4) 登記入冊(cè)(基線)Triage BNP檢測(cè)濃度=100pg/ml or或更小，(5)或者其他為了治療 HF而進(jìn)行藥物治療和實(shí)驗(yàn)性的治療都被排除在外。包括年紀(jì)在18或以上的人群，他們進(jìn)行
17過HF治療后處于穩(wěn)定時(shí)期的病人的人群也被排除在外。對(duì)亞人群的排除標(biāo)準(zhǔn)也包括那些不能給出正常的承諾，具有嚴(yán)重的肺炎病歷史，為了 COPD而進(jìn)行長時(shí)間的氧氣治療，原發(fā)性肺高血壓，要求透析的腎病歷史，具有肝病歷史，使用左心室輔助設(shè)備(LVADs)，撞擊過， MI, PTCA(percutaneous transluminal coronary artery angioplasty), CABG(coronary artery bypass graft)，或者最近1個(gè)月有咽絞痛，嚴(yán)重的主動(dòng)脈狹窄病歷史，嚴(yán)重的二尖瓣狹窄病歷史，壓縮性心包炎歷史的病人，具有心臟移植，階段1的心臟移植，最近1月具有非Q值波動(dòng)的MI的I⑶or DRG的病人，和具有輕微肺病的病人。RD (腎臟衰竭)這類人群具有血液透析的病人。這群病人包括年紀(jì)在18-96歲之間的男性或女性。在這里也可以指“RF”或腎臟衰竭。例子2檢測(cè)血液樣本被經(jīng)過培訓(xùn)的人收集在帶有作為抗凝試劑EDTA的標(biāo)準(zhǔn)血液收集試管中。通過離心從細(xì)胞中分離獲得血清，并冷凍并儲(chǔ)存在-20°C或者冷藏直到分析。血清被冷凍1小時(shí)。檢測(cè)通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測(cè)技術(shù)微流裝置。這種裝置實(shí)質(zhì)和《免疫測(cè)定手冊(cè)》 的第41章，題目為“近患者測(cè)試商標(biāo)為Triage 的心臟病系統(tǒng)所描述的裝置一樣，作者戴維等等，自然出版集團(tuán)，2001 (Near Patient Tests =Triage Cardiac System，” in The Immunoassay Handbook, 2nd ed. , David Wild, ed. , Nature Publishing Group,2001)。BNP檢測(cè)1 兩個(gè)結(jié)合BNP79-108序列上位點(diǎn)的抗體的BNP三明治免疫方法。除了 BNP夕卜，該檢測(cè)也可以測(cè)試BNP79-108，proBNP和BNP3-108.BNP檢測(cè)2 兩個(gè)結(jié)合BNP79-108序列上位點(diǎn)的抗體的BNP三明治免疫方法，其中一種特異結(jié)合從BNP上脫落77和78殘基后形成的構(gòu)體的抗體。這種抗體通過抗菌素顯示來篩選，在該方法中，老鼠被BNP79-108序列免疫后，產(chǎn)生的抗體在過量存在BNP的情況下篩選BNP79-108的抗體。過量的BNP可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合那些不特異結(jié)合BNP79-108的任何抗體。 該檢測(cè)不測(cè)試 BNP79-108，proBNP 和 BNP3-108.BNP前體(proBNP)檢測(cè)1 :BNP前體檢測(cè)通過這樣來檢測(cè)使用一種特異結(jié)合 BNP79-108序列上位點(diǎn)的抗體，另一種特異結(jié)合BNP3-76序列上位點(diǎn)的抗體。除了檢測(cè)BNP 前體外，該檢測(cè)還檢測(cè)BNP3-108。BNP前體(proBNP)檢測(cè)2 =BNP前體檢測(cè)通過這樣來檢測(cè)使用一種特異結(jié)合 BNP79-108序列上位點(diǎn)的抗體，另一種特異結(jié)合從BNP上脫落1和2位點(diǎn)殘基后形成的構(gòu)體的抗體。這種抗體通過抗菌素顯示來篩選，在該方法中，老鼠被BNP3-108序列免疫后，產(chǎn)生的抗體在過量存在BNP前體的情況下篩選BNP3-108的抗體。過量的BNP前體可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合那些不特異結(jié)合BNP3-108的任何抗體。該檢測(cè)不測(cè)試BNP，NT-proBNP，proBNP和BNP3-76.NT-BNP前體檢測(cè)1 :NT_BNP前體檢測(cè)通過這樣來檢測(cè)使用結(jié)合BNP3-76序列上位點(diǎn)的兩種抗體。除了檢測(cè)NT-BNP前體外，該檢測(cè)還檢測(cè)BNP前體，BNP3-108和BNP3-76。NT-BNP前體(NT-proBNP)檢測(cè)2 =NT-BNP前體檢測(cè)通過這樣來檢測(cè)使用一種特異結(jié)合BNP3-76序列上位點(diǎn)的抗體，另一種特異結(jié)合從BNP前體上脫落1和2位點(diǎn)殘基后形成構(gòu)體的抗體。這種抗體通過抗菌素顯示來篩選，在該方法中，老鼠被BNP3-108序列免疫后，產(chǎn)生的抗體在過量存在BNP前體的情況下篩選BNP3-108的抗體。過量的BNP前體可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合那些不特異結(jié)合BNP3-108的任何抗體。該檢測(cè)不測(cè)試BNP，NT-proBNP，proBNP和 BNP3-108.例子3 從腎功能障礙人群中區(qū)分出肺栓人群為了同時(shí)測(cè)量NT-proBNP和proBNP，一結(jié)合NT-proBNP中間位置的位點(diǎn)的抗體與一個(gè)可以被檢測(cè)的標(biāo)記(熒光能量轉(zhuǎn)移乳膠或者“FETL”)共扼連接，兩種抗體，一種為特異結(jié)合來自從proBNP上脫落1和2殘基后形成構(gòu)體的抗體，另一種結(jié)合BNP的抗體，他們沿著微流檢測(cè)裝置的測(cè)試通道被固定在分離的捕獲區(qū)域上，該微流檢測(cè)裝置實(shí)質(zhì)如《免疫測(cè)定手冊(cè)》的第41章，題目為“近患者測(cè)試商標(biāo)為Triage 的心臟病系統(tǒng)所描述的裝置一樣， 作者戴維等等，自然出版集團(tuán)，2001 (Near Patient Tests :Triage Cardiac System，” in The Immunoassay Handbook, 2nd ed. , David Wild,ed. , Nature Publishing Group，2001)。 “NT-proBNP”的分析檢測(cè)結(jié)果可以測(cè)試BNP3-76和BNP3-108，然而“proBNP”的檢測(cè)結(jié)果可以測(cè)量BNP3-108，但是不能測(cè)量BNP3-76。在通道上的兩個(gè)免疫檢測(cè)分析結(jié)果被同時(shí)用純化的重組proBNP，并且用含有 EDTA人血清稀釋的溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。這對(duì)來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的proBNP抗體的結(jié)果，在質(zhì)量濃度上，大約有4-5倍的特異性于來自細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的proBNP抗體。一旦樣本被檢測(cè)， 檢測(cè)分析結(jié)果被轉(zhuǎn)換成濃度值對(duì)proBNP的結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。NT-proBNP (BNP3-76)的濃度通過從NT-proBNP的檢測(cè)結(jié)果減去proBNP的濃度而獲得。為了同時(shí)測(cè)量BNP和proBNP，一結(jié)合BNP的抗體與一個(gè)可以被檢測(cè)的FETL共扼連接。兩種抗體，一種為結(jié)合BNP的抗體，另一種結(jié)合proBNP的抗體，他們沿著微流檢測(cè)裝置的測(cè)試通道被固定在分離的捕獲區(qū)域上。“BNP”檢測(cè)分析結(jié)果能夠測(cè)試BNP，proBNP和 BNP3-108，然而“proBNP “的檢測(cè)結(jié)果能夠測(cè)量proBNP和BNP3-108，但是不能測(cè)量BNP。免疫檢測(cè)分析結(jié)果被同時(shí)用純化的重組proBNP，并且用含有EDTA人血清稀釋的溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。這對(duì)來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的proBNP抗體的結(jié)果，在質(zhì)量濃度上，大約有 4-5倍的特異性于來自細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的proBNP抗體。一旦樣本被檢測(cè)，檢測(cè)分析結(jié)果被轉(zhuǎn)換成濃度值對(duì)proBNP的結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。NT-proBNP (BNP3-76)的濃度通過從NT-proBNP的檢測(cè)結(jié)果減去proBNP的檢測(cè)結(jié)果而獲得。BNP的濃度通過從BNP的檢測(cè)結(jié)果減去proBNP的檢測(cè)結(jié)果而獲得BNP的檢測(cè)中分離出來。在第二個(gè)檢測(cè)裝置上的“proBNP"檢測(cè)可以和在第一個(gè)檢測(cè)裝置上的“proBNP"檢測(cè)很好的相關(guān)性(秩相關(guān)系數(shù)(Spearman correlation) R = 0. 98，同時(shí)ρ < 0. 0001), 過巴步克拉衰退分析(P < 0. 01) (Passing-Bablok regression analysis)，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)更輕微大的結(jié)果BNP面板1上的proBN P檢測(cè)=1. 46 [NT-proBNP面板1上的proBNP檢測(cè)]-41.28pg/ml。95%的置信區(qū)間為1.41-1.52。測(cè)試結(jié)果的不同可以歸因于不同抗體的特異性不同。以下的統(tǒng)計(jì)描述是使用這些分析而獲得的測(cè)試值作為pg/mL proBNP而被報(bào)告
權(quán)利要求
1.一種實(shí)施對(duì)主體診斷的方法，包括實(shí)施選自免疫檢測(cè)群中的至少兩個(gè)免疫檢測(cè)， 其中，基于從主體上獲取的一個(gè)或多個(gè)樣本進(jìn)行的所述免疫檢測(cè)群包括測(cè)試BNP79-108的免疫檢測(cè)；測(cè)試BNP3-76,但是不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)；和測(cè)試 BNP3-108，但是不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)；從免疫檢測(cè)的結(jié)果獲得至少兩個(gè)濃度值；其中免疫檢測(cè)結(jié)果選自實(shí)質(zhì)指示BNP 或BNP79-108的NBP濃度；實(shí)質(zhì)指示proBNP或BNP3-108的proBNP濃度；和實(shí)質(zhì)指示 NT-proBNP 或 BNP3-76 的 NT-proBNP 濃度；獲得一個(gè)組合的尿鈉肽結(jié)果，該結(jié)果為以下至少兩種所屬濃度的函數(shù)BNP濃度， proBNP 濃度和 NT-proBNP 濃度；對(duì)主體診斷進(jìn)行組合的尿鈉肽結(jié)果的校正，其中診斷主體包括存在腎臟功能障礙的診斷，不存在腎臟功能障礙的診斷，存在肺栓的診斷和不存在肺栓的診斷。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述的方法包括區(qū)分腎臟功能障礙和肺栓的診斷。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP79-108的免疫檢測(cè)為用一特異結(jié)合從BNP 分子上脫落殘基77和78后形成的構(gòu)體的第一抗體和結(jié)合BNP和BNP79-108的第二抗體的三明治免疫檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP79-108的免疫檢測(cè)為兩種抗體的三明治免疫檢測(cè)，其中每一種抗體都結(jié)合BNP和BNP3-108。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP3-108但不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)為用一特異結(jié)合從proBNP分子上脫落殘基1和2后形成構(gòu)體的第一抗體和結(jié)合proBNP和BNP3-108 的第二抗體的三明治免疫檢測(cè)。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP3-108但不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)用為兩種抗體的三明治免疫檢測(cè)，其中每一種抗體都結(jié)合proBNP和BNP3-108。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP3-76但不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)為用一特異結(jié)合從proBNP分子上脫落殘基1和2后形成的構(gòu)體的第一抗體和結(jié)合proBNP和BNP3-76 的第二抗體的三明治免疫檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中用于測(cè)試BNP3-76但不測(cè)試BNP的免疫檢測(cè)用為兩種抗體的三明治免疫檢測(cè)，其中每一種抗體都結(jié)合proBNP和BNP3-76。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中BNP的濃度通過免疫檢測(cè)BNP79-108所獲得的濃度中去除一個(gè)或兩個(gè)proBNP和BNP3-108對(duì)BNP79-108濃度的貢獻(xiàn)而計(jì)算獲得的。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中proBNP的濃度通過免疫檢測(cè)BNP3-108所獲得的濃度中去除一個(gè)或多個(gè)BNP, BNP79-108, NP-proBNP和BNP3-76對(duì)BNP3-108濃度的貢獻(xiàn)而計(jì)算獲得的。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中NP-proBNP的濃度通過免疫檢測(cè)BNP3-76所獲得的濃度中去除一個(gè)或兩proBNP和BNP3-108對(duì)BNP3-76濃度的貢獻(xiàn)而計(jì)算獲得的。
12.如權(quán)利要求1的方法，其中該組合的尿鈉肽結(jié)果是以下至少兩個(gè)濃度的函數(shù)BNP 濃度，proBNP濃度和NT-proBNP濃度。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中該函數(shù)選自以下的比值JroBNP比BNP的比率，BNP比 proBNP 的比率，BNP 比 NT-proBNP 的比率，NT-proBNP 比 BNP 的比率，proBNP 比 NT-proBNP 的比率,和NT-proBNP比proBNP的比率。
14.如權(quán)利要求9的方法，其中proBNP比BNP的比率通過BNP的濃度來劃分proBNP的濃度計(jì)算獲得來提供組合的尿鈉肽結(jié)果。
15.如權(quán)利要求9的方法，其中NT-proBNP比proBNP的比率通過proBNP的濃度來劃分 NT-proBNP的濃度計(jì)算獲得來提供組合的尿鈉肽結(jié)果。
16.如權(quán)利要求2的方法，其中組合尿鈉肽的結(jié)果為NTproBNP對(duì)于proBNP的比率，該比率用實(shí)質(zhì)表示proBNP或BNP3-108的proBNP濃度和實(shí)質(zhì)表示NT-proBNP或BNP3-768的 NT-proBNP濃度計(jì)算獲得的，其中校正步驟包括將組合尿鈉肽的結(jié)果與選擇可以從腎功能障礙區(qū)分心臟衰竭的臨界值進(jìn)行比較。
17.如權(quán)利要求2的方法，其中組合尿鈉肽的結(jié)果為NTproBNP對(duì)于proBNP的比率，該比率用實(shí)質(zhì)表示proBNP或BNP3-108的proBNP濃度和實(shí)質(zhì)表示NT-proBNP或BNP3-76的 NT-proBNP濃度計(jì)算獲得的，其中校正步驟包括將組合尿鈉肽的結(jié)果與選擇的可以從腎功能障礙區(qū)分肺栓的臨界值進(jìn)行比較。
18.如權(quán)利要求2的方法，其中組合尿鈉肽的結(jié)果為NTproBNP對(duì)于proBNP的比率，該比率用實(shí)質(zhì)表示proBNP或BNP3-108的proBNP濃度和實(shí)質(zhì)表示NT-proBNP或BNP3-76的 NT-proBNP濃度計(jì)算獲得的，其中校正步驟包括將組合尿鈉肽的結(jié)果與選擇的可以從腎功能障礙區(qū)分肺栓和心臟衰竭的臨界值進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷和評(píng)估與BNP相關(guān)的疾病的方法。特別的，用患者的樣本為了分析是否存在多種尿鈉肽或尿鈉肽的含量和組合的尿鈉肽結(jié)果作為一個(gè)診斷標(biāo)記物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102334031SQ200980145621
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者李席元 申請(qǐng)人:美艾利爾圣地亞哥有限公司