專利名稱：使用pigf-2和pigf-3標(biāo)志物確定先兆子癇風(fēng)險的方法
使用PIGF-2和PIGF-3標(biāo)志物確定先兆子癇風(fēng)險的方法
背景技術(shù)：
全世界每年至少有1億2千6百萬婦女生孩子。她們中超過2千萬會遭受妊娠相關(guān)的并發(fā)癥或疾病。例如，高血壓癥，比如先兆子癇(PE)影響了所有孕婦的10%以上，是母親死亡的主要原因。充分的產(chǎn)前保健降低了這樣的并發(fā)癥和疾病未被發(fā)現(xiàn)的機(jī)會。雖然如此，但目前對于使用母體樣品早期檢測先兆子癇尚沒有采用例行篩查。如果能夠較早檢測到PE、特別是早發(fā)型PE的發(fā)生的話，有可能在很多病例中得到較好的結(jié)果，包括降低嚴(yán)重度和甚至復(fù)原。妊娠早期或后期期間，對于PE發(fā)生風(fēng)險評估或評估PE存在的可靠方法，將降低孕婦、嬰兒或兩者的負(fù)面健康結(jié)果的可能。存在于母體樣品中的許多生物標(biāo)志目前被認(rèn)為與先兆子癇有關(guān)。目前建議將胎盤生長因子(PlGF)用于評估孕婦發(fā)生PE的風(fēng)險(Akolekar等Q008)maternal serum placental growth factor at 11+0 to 13+6 weeks of gestation in the prediction of pre-eclampsia.(妊娠11+0至13+6周的母體血清胎盤生長因子對于先兆子癇的預(yù)測) Ultrasound Obstet Gynecol 32 :732-739)。雖然PlGF作為先兆子癇的可靠標(biāo)志已經(jīng)得到了一些認(rèn)可，但希望有以更高的特異性和預(yù)測功效為特征的備選方案和其他的標(biāo)志。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述的發(fā)明在一個方面提供了用于確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法。方法包括測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在一個實施方案中，測定P1GF-2的水平。在這種情況下，樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品的增加指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在一個實施方案中，測定P1GF-3的水平。在這種情況下，對象樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在不同的實施方案中，使用PlGF同工型的組合。例如，在確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險時，可以使用P1GF-2和P1GF-3。其它示例性的PlGF同工型組合包括P1GF-2和 PlGF-I ；P1GF-3 和 P1GF-1 ；P1GF-1、P1GF-2 和 P1GF3。在其它實施方案中，當(dāng)確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險時，使用生化標(biāo)志物的比。在一個具體的實施方案中，確定P1GF-2/P1GF-3的比。在另一個實施方案中，確定P1GF-2/ PlGF-I的比。在這兩個例子中，對象樣品中相對于對照樣品的比的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在另外的實施方案中，P1GF-2和/或P1GF-3可以與先兆子癇、高血壓、胎盤紊亂等等的一種或多種生化標(biāo)志物組合使用。在具體的實施方案中，使用選自PAPP-A、PAI-1、 PAI-2、PlGF-U P1GF-4、PP13、VEGF165b和ADAM-12的一種或多種生化標(biāo)志物?？捎糜跈z測先兆子癇的其它生化標(biāo)志物也可與P1GF-2、P1GF-3和P1GF-2與P1GF-3兩者組合使用。作為具體的例子，當(dāng)在這樣的組合中使用PlGF-I時，對象樣品中的PlGF-I相對于對照樣品的水平指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在另一個實施方案中，確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險的方法包括使用孕婦的一種或多種生物物理標(biāo)志。將測得的生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中孕婦每種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在一個實施方案中，生物物理標(biāo)志是血壓。在另一個實施方案中，生物物理標(biāo)志是子宮動脈的搏動指數(shù)。本文描述的確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法，可以使用從婦女的妊娠前三個月或中三個月期間獲得的樣品來實施。在具體的實施方案中，樣品在前三個月期間獲得。在另一個實施方案中，在第二個三個月期間獲得樣品。在一個實施方案中，可以從婦女的一個或多個妊娠階段獲得一個或多個樣品。還通過本文描述的發(fā)明提供了確定孕婦是否患有先兆子癇的方法。方法包括測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自 P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中對象樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇。在本方法的一個實施方案中，得到至少一種以下觀察結(jié)果從對象獲得的樣品中 P1GF-2水平相對于對照樣品中P1GF-2的水平增加；和/或從對象獲得的樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品中P1GF-3的水平降低。在一個實施方案中，從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-1的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在另一個實施方案中，從對象獲得的樣品中P1GF-2/ P1GF-3的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。在一個實施方案中，一個或多個樣品可以從妊娠前三個月和/或第二個三個月的孕婦獲得，比如在妊娠20-40周之間。本文描述的發(fā)明進(jìn)一步提供了計算機(jī)程序，其在電腦上運(yùn)行時，引起計算機(jī)執(zhí)行確定孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的過程。所述過程可以包括輸入通過下述方式獲得的至少一種生物標(biāo)志i)分析從孕婦獲得的樣品的一種或多種生化標(biāo)志物，其中至少一種生化標(biāo)志物選自P1GF-2和P1GF-3 ；ii)將樣品中所述一種或多種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇；和iii)根據(jù)比較結(jié)果確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。在一個實施方案中，計算機(jī)程序可以進(jìn)一步包括使用至少一種另外的生化標(biāo)志物。在具體的實施方案中，所述一種或多種生化標(biāo)志物可以選自PAPP-A、PAI-U PAI-2、 PlGF-I、VEGF165b、P1GF-4 和 ADAM-12。在又一個實施方案中，計算機(jī)程序可以包括輸入通過測定對象的一種或多種生物物理標(biāo)志獲得的至少一種生物標(biāo)志的測量值；將對象的一種或多種生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中對象中一種或多種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加；和根據(jù)所比較的一種或多種生化標(biāo)志物和所比較的一種或多種生物物理標(biāo)志的結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。在具體實施方案中，生物物理標(biāo)志可以選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。
在一個計算機(jī)程序的實施方案中，過程還可以包括確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價，其包括使用多變量分析確定先兆子癇的似然性，其中多變量分析包括使用來源于一組對照參考數(shù)據(jù)的生化標(biāo)志物和分布參數(shù)的水平。在一個實施方案中，多變量分析是多變量高其jf (Gaussian)分析。本文描述的技術(shù)還提供了存儲上面描述的計算機(jī)程序的計算機(jī)程序記錄介質(zhì)。本文描述的發(fā)明包括用于評估孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的試劑盒或商業(yè)包裝。在一個實施方案中，試劑盒提供了 i)至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體，其中每種可檢測的結(jié)合配偶體與選自PlGF-I、P1GF-2和P1GF-3的單個PlGF同工型特異性結(jié)合。在一個具體實施方案中，試劑盒提供i)與P1GF-2特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體；和ii)與選自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。在另一個具體實施方案中，試劑盒提供i)與P1GF-3特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體；和ii)與選自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。在實施方案中，可檢測的結(jié)合配偶體是抗體或其抗原結(jié)合片段。在又一個具體的實施方案中，試劑盒提供i)至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其與選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合；和ii)在測定中使用抗體或抗原結(jié)合片段的說明書。在一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段與PlGF同工型的環(huán)3結(jié)構(gòu)結(jié)合。在一個具體的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段與成熟P1GF-2中的IM至144位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 6)結(jié)合，或與成熟P1GF-3中的114至185位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 7)結(jié)合。在具體實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段與選自HSPGRQSPDMP⑶FRADA(SEQ ID NO 8)和 PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的 P1GF-3 序列結(jié)合。在下文中，本發(fā)明將借助于詳細(xì)說明并參考一些工作例來進(jìn)一步描述。附圖簡述

圖1顯示了妊娠13至37周時母體血清中P1GF_2、P1GF_3以及P1GF_1、P1GF_2和 P1GF-3組合的水平。圖2描述了相匹配的病例-對照研究的結(jié)果，其中取自無先兆子癇的妊娠女性的樣品(對照，在圖中通過三角形表示)和取自后來在妊娠中發(fā)生先兆子癇的妊娠女性的樣品(病例，在圖中通過交叉形表示)，用檢測P1GF-2同工型的方法來測量。圖3描述了相匹配的病例-對照研究的結(jié)果，其中取自無先兆子癇的妊娠女性的樣品(對照，在圖中通過三角形表示)和取自后來在妊娠中發(fā)生先兆子癇的妊娠女性的樣品(病例，在圖中通過交叉形表示)，用檢測P1GF-3同工型的方法來測量。圖4描述了 PlGF家族和親緣物的氨基酸序列；在前體中的1至18位氨基酸代表信號序列(下劃線)；在前體中的214至234位氨基酸、在P1GF-2中的IM至144位氨基酸、和在P1GF-4中的196至216位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(斜體)；在前體中的132至 204位氨基酸、在P1GF-3中的114至185位氨基酸、和在P1GF-4中的114至185位氨基酸代表未知功能的結(jié)構(gòu)域(粗體)。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及確定孕婦先兆子癇發(fā)生風(fēng)險的方法，確定孕婦是否患有先兆子癇的方法，以及用于評估先兆子癇的風(fēng)險或存在的抗體和試劑盒。本發(fā)明還提供了用于這些確定的計算機(jī)程序。本文描述的是利用選擇性檢測同工型P1GF-2和P1GF-3的至少一種，任選與包括 PlGF同工型比如PlGF-I和P1GF-4在內(nèi)的其它生化標(biāo)志物一起檢測，并將所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與從對照樣品獲得的值進(jìn)行比較。樣品中生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示該婦女中先兆子癇的風(fēng)險或存在。在值的水平上，取決于具體測試的生物標(biāo)志，所述差異可以增加或減少。以前出版的研究已經(jīng)顯示，較低水平的PlGF-I指示先兆子癇的發(fā)生。在這些研究中使用的測量方法看起來主要檢測了 PlGF-I，但在至少一些病例中，與其它PlGF同工型有顯著的交叉反應(yīng)性(參見實施例幻。在按照本文描述選擇性測定同工型P1GF-2和P1GF-3 的水平時，意外發(fā)現(xiàn)，樣品中的P1GF-2水平相對于對照樣品增加。另外發(fā)現(xiàn)，樣品中P1GF-3 的水平相對于對照樣品降低。如本文的描述，現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識到，測量母體樣品中特定的同工型PlGF可用于較好確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險。在實驗室測試中，分析靶PlGF同工型可以提供更特異性的結(jié)果，因為可以減少或消除由于存在非靶PlGF同工型產(chǎn)生的背景信號。因此，相對于采用非選擇性PlGF檢測的實驗室測試，通過檢出率增加和假陽性率降低，將改進(jìn)篩查性能。還認(rèn)識到，對象樣品中PlGF同工型的比、例如P1GF-2/P1GF-3和/或P1GF-2/P1GF-1相對于對照樣品的差異，可以用作發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加的指示。如果需要，也可以使用PlGF 同工型例如P1GF-2或PlGF與另一種生化標(biāo)志物的比。同工型P1GF-2和/或P1GF-3的選擇性檢測，任選與另一種PlGF同工型、例如 PlGF-I或P1GF-4或兩者一起檢測，可以與任何其它合適的生化標(biāo)志物或用于評估先兆子癇發(fā)生風(fēng)險的其它指示物相組合。這樣的生化標(biāo)志物，例如，選自PAPP-A、PAI-U PAI-2、 PlGF-I、P1GF-4、PP13、VEGF165b 和 ADAM-12。同工型P1GF-2和/或P1GF-3的選擇性檢測，任選與另一種PlGF同工型一起檢測， 還可以與任何其它合適的用于評估先兆子癇發(fā)生風(fēng)險的生物物理標(biāo)志相組合。這樣的生化標(biāo)志物是，例如，血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。在本文使用時，術(shù)語“先兆子癇”是指部分以妊娠高血壓和蛋白尿為特征的妊娠病。對于以前血壓正常的婦女，PE典型被定義為有蛋白尿的妊娠高血壓，嚴(yán)重的PE典型定義為嚴(yán)重的有蛋白尿的妊娠高血壓。對于長期高血壓的婦女，疊加PE典型定義為新發(fā)生的蛋白尿?？捎糜谧鞒鯬E診斷的PE的方面可以根據(jù)不同的醫(yī)療組織設(shè)定的方針來分類。例如，根據(jù)國際妊娠高血壓研究協(xié)會(International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy)的方針(Davey 等，Am. J. Obstet Gynecol ；158 ；892098, 1988)，妊娠高血壓被描述為在相隔至少4h的兩次記錄中，舒張壓在90mmHg以上，嚴(yán)重的高血壓被描述為在相隔至少4h的兩次記錄中，舒張壓至少IlOmmHg,或一次記錄舒張壓至少 120mmHg。蛋白尿經(jīng)常被描述為在24h中排出300mg或更高，或者如果沒有24h收集的話，在中段或?qū)Ч苣驑颖镜脑嚰埛治鲋?，兩次讀數(shù)為更高。婦女一般在妊娠20周之前，被分類為以前血壓正?；蛴虚L期高血壓。了解先兆子癇并在本文中應(yīng)該被定義為包含在和屬于先兆子癇病的范疇內(nèi)，所述范疇包括胎盤功能不全、胎兒宮內(nèi)生長遲緩、早期流產(chǎn)、早產(chǎn)、 死胎和子癇。雖然不希望受到理論制約，但已經(jīng)提出了胎兒宮內(nèi)生長遲緩反映了孕婦身體對于應(yīng)對先兆子癇狀況的適應(yīng)，這樣允許胎兒存活。另一方面，早期流產(chǎn)和早產(chǎn)可以反映出孕婦身體對于應(yīng)對先兆子癇狀況的適應(yīng)，這樣允許孕婦存活。在這種情形下，宮內(nèi)死亡是這種適應(yīng)的失效。因此，本文描述的用于確定先兆子癇風(fēng)險的方法包括、并且也可以用來確定先兆子癇范疇上先兆子癇病的風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法，包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。根據(jù)本公開內(nèi)容的用于確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險或患有先兆子癇的方法，是一種體外方法。這是指該方法在孕婦(本文也稱為患者或?qū)ο?的身體外進(jìn)行。在使用本文描述的方法確定了妊娠個體發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加的情況下，所述個體可以從保健提供者接受治療或生活方式建議。雖然先兆子癇沒有廣泛使用的療法，但各種研究已經(jīng)顯示了用例如抗高血壓藥物諸如硫酸鎂、阿司匹林、地西泮和苯妥英、以及營養(yǎng)增補(bǔ)劑諸如維生素D、鈣和硒治療的益處?？捎糜趯嵤┍疚拿枋龅姆椒ǖ臉悠吠ǔ０ㄆ渲写嬖赑lGF同工型的組織和流體。樣品可以是包含選定的生化標(biāo)志物的任何體液或組織樣品。便于獲得的典型樣品是體液，例如從孕婦獲得的血液和它的級分諸如血清和血漿、痰或尿。也可以使用從孕婦獲得的組織樣品，或從孕婦獲得的細(xì)胞，包括已經(jīng)置于細(xì)胞培養(yǎng)或在細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增的細(xì)胞?？捎糜诒疚拿枋龅姆椒ǖ钠渌纠陨飿悠钒ㄑ蛩?、絨毛膜絨毛活檢組織、胎盤活檢組織和宮頸陰道液。另外，已經(jīng)保存、例如通過冷凍或干燥(例如在血卡格式上)的樣品，適合用于本文描述的方法中。實施例1描述了血清形式的母體血液的使用。樣品的選擇經(jīng)常取決于檢驗標(biāo)志的量的具體臨床實驗室可用的分析形式。例如，一些分析形式缺乏分析全血所需的靈敏度，使得臨床實驗室選擇測試血液的級分，例如血清，或使用干血。在某些情況中，生物樣品可以不止一次從孕婦收集，例如，當(dāng)她的高血壓和/或胎盤病癥需要監(jiān)測先兆子癇由于先驗的風(fēng)險而發(fā)生、顯示出癥狀和/或其它因素時。本文描述的確定先兆子癇風(fēng)險的方法，還可以用于監(jiān)測正在經(jīng)歷高血壓和/或胎盤病癥的療法或治療的妊娠個體。如果需要，生化和/或生物物理標(biāo)志的測試可以在家庭環(huán)境下實施，例如通過使用試紙生化測試形式和家用自動血壓器。可以在妊娠的前三個月或第二個三個月期間、或在這兩個三個月期間，執(zhí)行PlGF 同工型和其它生化標(biāo)志物的測定。然而，能夠在妊娠的前12周內(nèi)檢測發(fā)生先兆子癇的高風(fēng)險，將為保健提供者提供更多的來提供孕婦的防護(hù)策略。在妊娠早期完成風(fēng)險評估往往是理想的，有時間進(jìn)行衡量以防止或延遲PE病癥在女性中發(fā)生。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在妊娠的前三個月期間取樣。這通常是指在妊娠的1至13周。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，在妊娠的第二個三個月取樣。這通常是指在妊娠的14至沈周。先兆子癇可以早在妊娠20周發(fā)生，當(dāng)它在妊娠大約32-34周之前發(fā)生時，通常被視為“早期先兆子癇”，而當(dāng)它在妊娠大約32-34周后發(fā)生時，為“晚期先兆子癇”。早期先兆子癇與發(fā)病率增加相關(guān)，因此被認(rèn)為是更重型的先兆子癇。本文描述的確定PE風(fēng)險的方法可用于篩查“早期先兆子癇”和“晚期先兆子癇”。如本文所述，例如在實施例1中，在不到妊娠22周(含)、并且甚至不到妊娠13周期間，確定先兆子癇風(fēng)險的方法是有效的。因此，為了在檢測先兆子癇的方法中使用，可以在妊娠大約11至37周(含)、包括大約11至 20周(含)之間收集樣品，更通常在大約20周之前、大約10周后前三個月之內(nèi)、第二個三個月之內(nèi)和第三個三個月之內(nèi)。雖然從公眾健康的遠(yuǎn)景而言，盡早測試往往是有益的策略， 但要理解，樣品采集有時可能受實際情況的影響，例如女性耽擱到她的保健提供者處就診， 直至相對較晚的妊娠周數(shù)。在一個實施方案中，本文描述的方法可以包括測定個體的血壓?？梢允褂萌焉飩€體的收縮血壓、舒張血壓和平均動脈血壓中的一種或多種。平均動脈壓(MAP)是指在一個心動周期中的平均血壓，其使用規(guī)定的程序，通過心輸出量(CO)、全身血管阻力(SVR)和中央靜脈壓(CVP)來測定。保健提供者可以使用任何方法測量妊娠個體的血壓，包括，例如觸診法、聽診法和示波法。也可以使用血壓自動測量儀器。在一個實施方案中，本文描述的方法也可以包括測定子宮動脈搏動指數(shù)(PI)?！白訉m動脈搏動指數(shù)”是指動脈血流速波形指數(shù)，其用來量化波形的搏動或振蕩。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在有舒張期逆流、即雙向流的臨床病例中，PI 特別有用。妊娠個體的PI可以使用任何已知的方法測量。例如，可以通過經(jīng)陰道或經(jīng)腹途徑執(zhí)行子宮動脈多普勒超聲檢查法。子宮動脈是第一個借助于顏色多普勒超聲檢查法鑒別的。然后可以使用脈沖波多普勒超聲檢查法獲得波形。然后可以計算各種指標(biāo)。例如，PI 可以按照峰值收縮流量減去終末期舒張流量除以平均流量來計算。雖然不希望受到理論制約，但有證據(jù)說明先兆子癇是母體螺旋動脈的滋養(yǎng)細(xì)胞不良浸潤的后果。多普勒超聲可以評估母體子宮動脈中的血流模式，并鑒別孕婦有滋養(yǎng)細(xì)胞不良浸潤。本文描述的方法包括測定樣品中PlGF同工型的水平或量。縮寫“P1GF”是指胎盤生長因子。PlGF在1991年首次從人類妊娠期胎盤cDNA文庫中克隆。其它組織例如心臟、肺、肌肉和脂肪組織中也已經(jīng)檢測到P1GF。PlGF屬于蛋白質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (VEGF)家族。它與VEGF-A具有大約50%的中等序列相似性?？勺兗艚赢a(chǎn)生了大小不同的四種同工型，其中PlGF-I和P1GF-2被認(rèn)為是主要同工型。PlGF-I (SEQ ID NO 2)包含131 個氨基酸(MW 單體 14. 7kDa, 二聚體 29. 4kDa)。P1GF-2 (SEQ ID NO :3)包含 PlGF-I 而且插入了 21個氨基酸的肝素結(jié)合位點(diǎn)(MW單體17. 3kDa，二聚體34. 6kDa)。因此，全長P1GF-2 蛋白質(zhì)的長度是152個氨基酸。P1GF-3(SEQ ID NO 4)包含PlGF-I和在C-端附近插入的 72個氨基酸(MW =單體22. 8kDa, 二聚體45. 6kDa)。因此，全長P1GF-3蛋白質(zhì)的長度是203 個氨基酸。P1GF-4(SEQ ID NO 5)包含P1GF-3和插入的21個氨基酸的肝素結(jié)合位點(diǎn)(MW =單體26. 2kDa, 二聚體52. 4kDa)。因此全長P1GF-4的長度是2 個氨基酸。圖4歸納了 PlGF家族和親緣物的氨基酸序列。在前體SEQ ID N0:1(登記號 P49763)中，1至18位氨基酸代表信號序列，132至203位氨基酸代表未知功能的結(jié)構(gòu)域， 和前體中的214至234位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在P1GF-2(SEQ ID N0:3)中，1 至144位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :6)。在P1GF_3(SEQ ID NO 4)中，114至 185位氨基酸代表未知功能的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :7)，本文稱為“環(huán)3”。在P1GF_4(SEQ ID NO 5)中，114至185位氨基酸代表環(huán)3，196至216位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?！皽y定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型”是指選定的同工型通過特異性評估從孕婦獲得的樣品和對照樣品中所提到的同工型水平的方法來測定。樣品中存在的生化標(biāo)志物的水平或量可以使用適于測量生物樣品中蛋白質(zhì)的任何分析形式來測定。用于該目的的通用分析形式是免疫分析，包括，例如酶免疫分析(EIA)諸如酶放大免疫分析技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、IgM抗體捕獲ELISA (MAC ELISA)和微粒子酶免疫分析(MEIA)；毛細(xì)管電泳免疫分析(CEIA)；放射免疫分析(RIA)；免疫放射分析(IRMA)；熒光偏振免疫分析 (FPIA)；解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?DELFIA)和化學(xué)發(fā)光分析(CL)。本發(fā)明的方法在本文中通過使用同工型特異性的DELFIA夾心免疫分析作舉例說明。DELFIA是非均相時間分辨熒光分析法，其在使用增強(qiáng)步驟的方案中包括測量發(fā)自鑭系元素螯合物的信號。該方法用于測量特定同工型P1GF-1、P1GF_2和P1GF-3。所述分析中的捕獲抗體是生物素化的，檢測抗體是銪標(biāo)記的。在這些分析中可以使用PlGF同工型特異性抗體，可以是商業(yè)單克隆抗體或定制的抗體。為了制備識別P1GF-3并且基本上不識別 PlGF-I或P1GF-2的抗體，將動物用包含肽的抗原免疫，所述肽含有選自P1GF-3的環(huán)3的氨基酸序列(氨基酸 HSPGRQSPDMPGDFRADAPSFLPraRSLPMLFRMEWGCALTGSQSAVWPSSPVPEEIPRMH PGRNGKKQQRK ；SEQ ID NO :7)。產(chǎn)生 P1GF-3 選擇性抗體(相對于 P1GF-2 和 P1GF-3)的具體氨基酸序列包括 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO :8)和 PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO: 9)。市場上可買到的P1GF-1、P1GF_2或P1GF-3蛋白質(zhì)可以用作PlGF同工型標(biāo)準(zhǔn)品。測量可以通過時間分辨熒光計，采用廠家設(shè)定的DELFIA方案來執(zhí)行測定樣品中多肽和其它生物標(biāo)志的量的典型分析形式包括使用對照多肽，尤其當(dāng)對這些多肽的量的水平進(jìn)行定量時。市場上可買到的蛋白質(zhì)，例如P1GF-1、P1GF-2、P1GF_3 和其它生物標(biāo)志，可以在測量生化標(biāo)志物水平的分析中用作標(biāo)準(zhǔn)品。或者，用于例如在原核和真核生物體系中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法、和合成多肽的方法是眾所周知的。全長蛋白質(zhì)和其片段可以用作標(biāo)準(zhǔn)品來定量測定從孕婦獲得的樣品中生物標(biāo)志的水平。PlGF同工型的核苷酸序列是已知的，并在科學(xué)論文中公開=PlGF-I =Maglione等1991. Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor (編碼與血管通透因子相關(guān)的蛋白的人類胎盤cDNA的分離)；P1GF-2 =Hauser等，A heparin-binding form of placental growth factor(P1GF-2) is expressed in human umbilical vein endothelial cells and in placenta(13^ ^^ ^^Inii^feixISi1 (P1GF-2)在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和胎盤中表達(dá))；P1GF-3 :Cao等(1997) Placental growth factor-identification and characterization of a novel isoform generated by RNA alternative splicing(胎盤生長因子通過RNA可變剪接產(chǎn)生的新的同工型的鑒別和表征)。這些序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了表達(dá)PlGF多肽的指導(dǎo)，供本文描述的方法使用。“對照樣品”在這里是指在妊娠的相同三個月期或孕齡時從對象獲得的樣品，其中所述妊娠被證實有涉及先兆子癇的特定結(jié)果。典型地，“對照樣品”已被證實沒有發(fā)生先兆子癇(參見本文實施例)，但是可以使用被證實發(fā)生了先兆子癇的對照樣品。該術(shù)語在這里被定義成包括一個或多個樣品，以便對照樣品可以是從群體獲得的一組樣品。妊娠對照的選擇可以通過生物物理參數(shù)、例如母體年齡、體重指數(shù)、種族和孕齡，與先兆子癇病例匹配。“發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加”是指對象(孕婦)發(fā)生先兆子癇的似然性在高于未發(fā)生PE的孕婦對照組的水平上。簡單地說，本文描述的確定孕婦先兆子癇風(fēng)險的方法的示例性版本可以通過從所述孕婦取得血樣來執(zhí)行。需要的話，可以處理血液，制備血漿或血清。對選定的PlGF亞單位的分析將使用對于PlGF同工型、例如P1GF-2或P1GF-3有選擇性的抗體，采用標(biāo)準(zhǔn)免疫分析進(jìn)行。實例是利用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中在試樣中的顯色強(qiáng)度與存在的標(biāo)志物濃度成正比。根據(jù)該測試，可以計算PlGF同工型的水平。需要的話，這種水平可以獨(dú)立用于風(fēng)險算法，或與其它標(biāo)志物的水平相結(jié)合。為了設(shè)計風(fēng)險算法，可以使用對假定的PE 的％發(fā)病率進(jìn)行調(diào)節(jié)的數(shù)據(jù)集的標(biāo)準(zhǔn)邏輯回歸分析。為了確定生化標(biāo)志物的量是否大于或小于正常值，要測定存在于來自相關(guān)群體的母體生物樣品中的生化標(biāo)志的正常量。相關(guān)的群體可以根據(jù)可以影響標(biāo)志的正常(未受患的)量的任何特征來定義。為了確定先兆子癇的風(fēng)險，可以在先兆低風(fēng)險的基礎(chǔ)上建立相關(guān)的群體。一旦知道了正常的標(biāo)志量，可以將測定的標(biāo)志進(jìn)行比較，并使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計方法確定差異的顯著性。當(dāng)在測定的標(biāo)志量和正常量之間的差異有統(tǒng)計顯著性時，被測個體將有發(fā)生先兆子癇的顯著風(fēng)險。將樣品中選定的生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較。樣品中生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇的風(fēng)險增加。差異是指所述值的統(tǒng)計顯著性差異。存在任何同工型的“水平增加或降低”是指任何特定同工型的水平統(tǒng)計上顯著地偏離對照樣品中同樣同工型的水平，高于或低于對照樣品中的水平。為了在先兆子癇的例行篩查中分析單個樣品的測量結(jié)果，首先需要對照群體的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)通過測量許多樣品、優(yōu)選每一孕周100個以上樣品的選定的PlGF同工型而獲得。 選定的同工型的實測濃度然后優(yōu)選進(jìn)行IoglO轉(zhuǎn)變，來制作高斯生物差異的分布。隨后，針對對照數(shù)據(jù)的每一孕周確定每種選定的同工型的中位數(shù)濃度和標(biāo)準(zhǔn)差。然后，任何單個樣品的結(jié)果可以與適當(dāng)?shù)闹形粩?shù)濃度相比，以確定選定的同工型的濃度是否不同于它們的正常值。這種比較可以用作計算患者先兆子癇風(fēng)險的基礎(chǔ)或作為作出先兆子癇診斷的基礎(chǔ)。還可以進(jìn)行匹配的病例-對照研究，以證明生化標(biāo)志物例如PlGF同工型的性能。 在這樣的研究中，使用生理參數(shù)與先兆子癇病例群體匹配的對照群體。因此，可以使用稍有不同的方法來計算這樣的研究與例行篩查相比的結(jié)果。這種研究在實施例1中舉例說明。根據(jù)本公開內(nèi)容，如果得到至少一種以下觀察結(jié)果，則孕婦發(fā)生PE的風(fēng)險增加1.樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品增加；2.對象樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品降低；3.確定P1GF-2/P1GF-3的比，觀察對象樣品中的比相對于對照樣品的差異。典型地，所述比是增加的；4.確定P1GF-2/P1GF-1的比，觀察對象樣品中的比相對于對照樣品的差異。典型地，所述比是增加的。特別是在妊娠的第二個三個月期間，觀察到所述比增加。本文描述的方法可以與測定一種或多種生化標(biāo)志物相組合，所述標(biāo)志選自 PAPP-A, PAI-1、PAI-2、P1GF-1、P1GF-4、ADAM-12, PP13 和 VEGF165b。在本文使用時，術(shù)語“PAPP-A”是指鋅結(jié)合金屬蛋白酶(metzincin metalloproteinase)，其已知被稱為妊娠相關(guān)的血漿蛋白A并具有與GenBank登錄號 AAH78657同源的氨基酸序列。在本文使用時，術(shù)語“PP13”是指胎盤蛋白13，亦稱半乳糖凝集素-13，其具有與GenBank登錄號NP_037400同源的氨基酸序列。在本文使用時，術(shù)語“PAI-1”是指纖溶酶原激活物抑制劑1，亦稱PAI和內(nèi)皮纖溶酶原激活物抑制劑，并與 UniProt登錄號P05121同源的氨基酸序列。在本文中使用時，術(shù)語“PAI-2”是指纖溶酶原激活物抑制劑2，亦稱胎盤纖溶酶原激活物抑制劑、單核細(xì)胞精氨酸-絲氨酸蛋白酶抑制劑和尿激酶抑制劑，并具有與UniProt登錄號P05120同源的氨基酸序列。在本文中使用時， 術(shù)語ADAM-12是指含解整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白12，亦稱解聯(lián)蛋白酶-α，并具有與UniProt登錄號043184同源的氨基酸序列。在本文中使用時，術(shù)語“VEGF 16 ”是指血管內(nèi)皮生長因子剪接變體165b，并具有與UniProt登錄號P15692-8同源的氨基酸序列。當(dāng)一種或多種生化標(biāo)志物與對照對象的相同生化標(biāo)志物相比較時，孕婦生化標(biāo)志物的測量值相對于對照增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。本文描述的方法也可以與測定一種或多種生物物理標(biāo)志相組合，所述生物物理標(biāo)志選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。當(dāng)一種或多種生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較時，孕婦生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。本文描述的檢測方法也可以用于診斷先兆子癇。證實孕婦患有先兆子癇典型地可以在妊娠第二個三個月或第三個三個月期間進(jìn)行，例如在妊娠的20至40周，在一些情況下甚至在20周之前。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了確定孕婦是否患有先兆子癇的方法，方法包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中對象樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇。根據(jù)本公開內(nèi)容，如果得到至少一種以下觀察結(jié)果，則孕婦患有PE 1.從對象獲得的樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品中P1GF-2的水平增加；2.從對象獲得的樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品中P1GF-3的水平降低；3.觀察到從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-1的比相對于對照樣品有差異；4.觀察到從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-3的比相對于對照樣品有差異。典型地，在從對象獲得的樣品中，P1GF-2/P1GF-1的比和P1GF-2/P1GF-3的比相對于對照樣品均增加。確定孕婦是否患有PE在妊娠20-40周期間進(jìn)行。確定孕婦是否患有先兆子癇的方法可以與選自PAPP-A、PAI-I、PAI-2、PP13、 VEGF165b, PlGF-I和P1GF-4的一種或多種生化標(biāo)志物相組合。本文描述的方法也可以與測定一種或多種生物物理標(biāo)志相組合，所述生物物理標(biāo)志例如血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了計算機(jī)程序，其在電腦上運(yùn)行時，引起計算機(jī)執(zhí)行確定孕婦是否有發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險或確定所述病癥存在的過程，其中所述過程包括輸入通過下列方法獲得的至少一種生化標(biāo)志物的測量值1)分析從孕婦獲得的樣品中的一種或多種生化標(biāo)志物，其中至少一種生化標(biāo)志物
13選自 P1GF-2 和 P1GF-3 ；ii)將樣品中所述一種或多種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較，其中樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇；和iii)根據(jù)比較結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。計算機(jī)程序還可以包括分析選自PAPP-A、PAI-l、PAI-2、ADAM-12、PP13、VEGF165b、 PlGF-I和P1GF-4的至少一種生化標(biāo)志物。計算機(jī)程序還可以包括輸入通過測定對象的一種或多種生物物理標(biāo)志獲得的至少一種生物標(biāo)志的測量值；將對象的一種或多種生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中對象中所述一種或多種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照增加或降低， 指示發(fā)展先兆子癇的風(fēng)險增加。根據(jù)所比較的一種或多種生化標(biāo)志物和所比較的一種或多種生物物理標(biāo)志的結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。計算機(jī)程序還可以包括使用選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)的生物物理標(biāo)志。確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價包括使用多變量分析確定先兆子癇的似然性。多變量分析包括使用來源于對照參考數(shù)據(jù)組的生化標(biāo)志物和分布參數(shù)的水平。多變量分析優(yōu)選是多高斯變量分析。本發(fā)明還提供存儲本文描述的計算機(jī)程序的計算機(jī)程序記錄介質(zhì)。本發(fā)明提供用于評估孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險或先兆子癇的存在的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含i)至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體，其中每種可檢測的結(jié)合配偶體與選自P1GF-1、P1GF-2和P1GF-3的單個PlGF同工型特異性結(jié)合。在另一個實施方案中，試劑盒可以包括i)與P1GF-2特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體；和ii)與選自PlGF-I 和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。在又一個實施方案中，試劑盒可以包括i)與P1GF-3特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體；和ii)與選自PlGF-I和P1GF-2 的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。用于本文描述的試劑盒的可檢測結(jié)合配偶體可以是，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段。也可以使用用于檢測蛋白-蛋白相互作用的其它結(jié)合配偶體。本發(fā)明還提供評估孕婦發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險或先兆子癇的存在的試劑盒。試劑盒可以包括i)至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其與選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合；和ii)在測定中使用抗體或抗原結(jié)合片段的說明書。說明書是指如何使用抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)行測定的方針。說明書中可以提供試劑體積、溫育時間、反應(yīng)條件等?？贵w或其抗原結(jié)合片段可以與同工型的特定結(jié)構(gòu)結(jié)合，所述特定結(jié)構(gòu)可以是其中的氨基酸的線性序列、折疊多肽的氨基酸序列、和任何翻譯后修飾。在一個實施方案中，對 P1GF-2有選擇性的抗體或抗原結(jié)合片段可以與成熟P1GF-2中IM至144位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 6)結(jié)合。在一個實施方案中，對P1GF-3有選擇性的抗體或抗原結(jié)合片段可以與成熟P1GF-3中114至185位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 7)結(jié)合。本文描述的方法涉及使用實驗室測試程序選擇性檢測PlGF的同工型。這樣的測試將使用能夠選擇性檢測PlGF同工型的試劑。這樣的試劑不會顯著檢測非靶PlGF同工型、完整PlGF和其它分子。能夠選擇性檢測PlGF同工型的示例性試劑是對mGF-1、P1GF-2、P1GF-3, P1GF-4或其它PlGF同工型有選擇性的抗體。選定的同工型水平的評估使用例如免疫方法進(jìn)行，其中抗體與選定的同工型特異性結(jié)合?？梢赃x擇性產(chǎn)生針對完整同工型的抗體，并選擇特異性針對同工型的特定結(jié)構(gòu)例如環(huán)3結(jié)構(gòu)的那些抗體?；蛘?，可以產(chǎn)生針對每種同工型的同工型特定結(jié)構(gòu)、例如環(huán)3結(jié)構(gòu)的抗體。制備和表征抗體的方法在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的(參見，例如Harlow和Lane，1988 Harlow, Ε. & Lane, D. Antibodies :A Laboratory Manual.(抗體實驗室手冊)Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，1988，pl4 (在此引為參考)。生成mAbs的方法通常沿著與制備多克隆抗體相同的路線開始。簡單說，多克隆抗體通過用一種或多種PlGF蛋白同工型免疫動物、并從該免疫動物收集抗血清來制備?？梢允褂么蠓秶膭游锓N類來生產(chǎn)抗血清。典型的用于生產(chǎn)抗血清的動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。MAbs容易通過使用公知的技術(shù)制備，例如在美國專利No. 4，196，265中例舉的那些技術(shù)，在此引為參考。 典型地，所述技術(shù)包括用選定的免疫原組合物免疫合適的動物。免疫組合物以有效刺激產(chǎn)生抗體細(xì)胞的方式施用。嚙齒類動物例如小鼠和大鼠是普遍使用的動物，但是，使用兔子、綿羊或蛙細(xì)胞也是可能的。本文描述的是能夠?qū)⑻囟ㄍば拖嗷^(qū)分開的具體PlGF 同工型特異性抗體。妊娠個體發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險可以根據(jù)在患者群體研究中收集的臨床數(shù)據(jù)，使用統(tǒng)計分析從生化標(biāo)志物的量來確定。有多種統(tǒng)計方法用于將表征妊娠個體的參數(shù)、例如生化標(biāo)志物的量進(jìn)行組合，以獲得風(fēng)險評價。似然法O^alomaki和Haddow，Am. J. Obstet. Gynecol. 156,460-3(1987))和線性判別函數(shù)法(Norgarrd-Pedersen 等 Clin. Genet. 37， 35-43(1990))通常用于這一目的。因而，本文描述的用于確定風(fēng)險的方法可以基于使用眾所周知的統(tǒng)計方法，其中截止值或MoM用于確定風(fēng)險。為了概述風(fēng)險確定的示例性方法，似然法的基本原理在于參數(shù)(例如生化標(biāo)志物的量)的群體分布對于'未患的'和'患的'組是已知的。因此，對于任何給定的參數(shù)(標(biāo)志的量和血壓讀數(shù))，可以計算'未患的'和'患的'的成員的似然性。根據(jù)群體平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，似然性作為參數(shù)的高斯高度計算。,似然比'是使用'未患的'和'患的'群體參數(shù)計算的高度比，并且相對于先前的風(fēng)險，是患病風(fēng)險增加的表示。利用通過使用已知方法的臨床種群研究衍生的公式，可以計算女性具有先兆子癇或懷有染色體異常的胎兒的先驗似然性(其是與先前的風(fēng)險相關(guān)的統(tǒng)計表示，在下文中描述)。這些先驗似然性可以使用似然比修改，以導(dǎo)出可以用于先兆子癇風(fēng)險評價的后驗似然性。使用似然法預(yù)測胎兒有染色體異常的風(fēng)險的詳細(xì)說明可以應(yīng)用于預(yù)測先兆子癇的風(fēng)險，并且在例如"Screening for Down' s Syndrome (唐氏綜合征篩查)，“J. G. Grudzinskas，T. Chard，M. Chapman 和 H. Cuckle編著；Cambridge University Press出版，1994)中闡述。也可以使用本文描述的方法，使用觀察到的似然比分布來確定風(fēng)險(參見，例如，Spencer等Arm. Clin. Biochem.， 29,506-18(1992))ο作為確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法的例子，可以從已知已經(jīng)患有先兆子癇的婦女群體收集樣品。分析這些樣品以確定一種或多種PlGF同工型的水平。所測定的 PlGF同工型水平然后將典型地變?yōu)樘囟ㄡ槍ν瑯釉旋g、母體重量、種族、吸煙狀態(tài)、受孕方法和同等性的妊娠的多個預(yù)期正態(tài)中位數(shù)(MoM)。然后使用眾所周知的統(tǒng)計回歸方法用于風(fēng)險計算(參見，例如Draper等Applied Regression Analysis (3th ed.)(應(yīng)用回
15歸分析)Wiley :New York, NY, 1998 ；禾P Cuckle HS 等，Estimating a woman s risk of having a pregnancy associated with Down' s syndrome using her age and serum alphafetoprotein level (使用女性的年齡和血清甲胎蛋白水平評價其妊娠具有與唐氏綜合征有關(guān)的風(fēng)險).Br. J Obstet Gynacol 1987 ;94 :387-402 ；和上面的其它參考文獻(xiàn))。以前的報告表明，母體血液中的PlGF水平可以用作唐氏綜合征的預(yù)報因子。因此預(yù)計檢測母體樣品中一種或多種特定的PlGF同工型，可以用于檢測胎兒染色體異常。下列編號的段落各簡明地界定了本發(fā)明的一種或多種示例性變體1.確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法，包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。2.根據(jù)1的方法，其中測定P1GF-2的水平，并且其中樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品的增加指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。3.根據(jù)1或2的方法，其中測定P1GF-3的水平，并且其中對象樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。4.根據(jù)1至3任一項的方法，其中確定P1GF-2/P1GF-3的比的差異，并且其中從對象樣品中的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。5.根據(jù)1至4任一項的方法，其中測定P1GF-3的水平，并且其中對象樣品中 P1GF-3的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。6.根據(jù)1至5任一項的方法，其中測定P1GF-2的水平，并且其中對象樣品中 P1GF-2的水平相對于對照樣品的增加指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。7.根據(jù)1至6任一項的方法，其中至少一種生化標(biāo)志物選自PAPP-A、PAI_1、 PAI-2、PlGF-I 和 ADAM-12。
8.根據(jù)1至7任一項的方法，其中測定PlGF-I的水平，并且其中對象樣品中 PlGF-I的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。9.根據(jù)1至8任一項的方法，其中確定P1GF-2/P1GF-1的比，并且其中對象樣品中的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。10.根據(jù)1至9任一項的方法，其中樣品從對象的妊娠前三個月期間獲得。11.根據(jù)1至10任一項的方法，其中樣品從對象的妊娠第二個三個月期間獲得。12.根據(jù)至11任一項的方法，還包括測定孕婦的一種或多種生物物理標(biāo)志，將一種或多種生物物理標(biāo)志中的每一種與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中孕婦每種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照的增加或降低，指示發(fā)展先兆子癇的風(fēng)險增加。13.根據(jù)1至12任一項的方法，其中生物物理標(biāo)志選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。14.確定孕婦是否患有先兆子癇的方法，包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中對象樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇。15.根據(jù)14的方法，其中進(jìn)行至少一種下列觀察從對象獲得的樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品中P1GF-2的水平增加；和從對象獲得的樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品中P1GF-3的水平降低。16.根據(jù)14或15的方法，其中從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-1的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。17.根據(jù)14至16任一項的方法，其中從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-3的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。18.根據(jù)14至17任一項的方法，其中樣品在孕婦妊娠的20_40周期間獲得。19.計算機(jī)程序，其在電腦上運(yùn)行時，引起計算機(jī)執(zhí)行確定孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的過程，所述過程包括輸入通過下列方法獲得的至少一種生化標(biāo)志物的測量值1)分析從孕婦獲得的樣品中的一種或多種生化標(biāo)志物，其中至少一種生化標(biāo)志物選自 P1GF-2 和 P1GF-3 ；ii)將樣品中所述一種或多種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較，其中樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇；和iii)根據(jù)比較結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。20.根據(jù)19的計算機(jī)程序，還包括分析選自PAPP-A, PAI-U PAI-2、PlGF-I和 ADAM-12的至少一種生化標(biāo)志物。21.根據(jù)19或20的計算機(jī)程序，還包括輸入通過測定對象的一種或多種生物物理標(biāo)志獲得的至少一種生物標(biāo)志的測量值；將對象的一種或多種生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中對象中一種或多種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照的增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加；和根據(jù)比較的一種或多種生化標(biāo)志物和比較的一種或多種生物物理標(biāo)志的結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。22.根據(jù)19至21任一項的計算機(jī)程序，其中生物物理標(biāo)志選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。23.根據(jù)19至22任一項的計算機(jī)程序，其中確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價包括使用多變量分析確定先兆子癇的似然性，并且其中多變量分析包括使用來源于對照參考數(shù)據(jù)組的生化標(biāo)志物和分布參數(shù)的水平。24.根據(jù)19至23任一項的計算機(jī)程序，其中所述多變量分析是多變量高斯分析。25.計算機(jī)程序記錄介質(zhì)，其存儲根據(jù)19至M任一項的計算機(jī)程序。26.評價孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的試劑盒，其包含i)至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體，其中每種可檢測的結(jié)合配偶體與選自P1GF-1、 P1GF-2和P1GF-3的單個PlGF同工型特異性結(jié)合。
27.根據(jù)沈的試劑盒，其包含i)與P1GF-2特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體，和ii)與選自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。28.根據(jù)26或27的試劑盒，其包含i)與P1GF-3特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體，和ii)與選自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。29.根據(jù)沈至觀任一項的試劑盒，其中可檢測的結(jié)合配偶體是抗體或其抗原結(jié)合片段。30.評價孕婦中先兆子癇的風(fēng)險和存在的試劑盒，其包含i)至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其與選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合；ii)在測定中使用抗體或抗原結(jié)合片段的說明書。31.根據(jù)沈至30任一項的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與PlGF同工型的環(huán)3結(jié)構(gòu)結(jié)合。32.根據(jù)沈至31任一項的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與成熟P1GF-2中的IM至144位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 6)結(jié)合，或與成熟P1GF-3中的114至185 位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 7)結(jié)合。33.根據(jù)沈至32任一項的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與選自 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO 8)和PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的P1GF-3序列結(jié)合。
實施例實施例1本實施例描述母體血清中P1GF-2的水平在發(fā)生先兆子癇的對象中增加，同時母體血清中P1GF-3的水平在發(fā)生先兆子癇的對象中降低。為了測量(a)PlGF-2 ;(b)PlGF-3 ；和(C)P1GF_1、P1GF_2 和 P1GF-3 的組合，建立了 PlGF同工型專門的DELFIA夾心分析。在從后來發(fā)生先兆子癇的孕婦和未患先兆子癇的孕婦獲得的血清中，測量PlGF 同工型。從每位婦女兩次抽取血樣一次在妊娠的前三個月期間，第二次在第二個三個月期間。將血液管離心并收集和等分血清。這些等分樣儲存在_20°C。選擇的未受患的妊娠對照組通過生物物理參數(shù)例如母體年齡、體重指數(shù)、種族和孕齡與先兆子癇妊娠病例進(jìn)行匹配。P1GF-2和P1GF-3濃度在分開的分析中從八個不同的先兆子癇病例樣品和16個匹配的對照樣品中測量。從這些結(jié)果完成統(tǒng)計分析。在這些分析中，PlGF同工型特異性抗體是商業(yè)單克隆抗體或定制抗體。分析中的捕獲抗體是生物素化的，檢測抗體用DELFIA銪螯合物標(biāo)記。在200 μ 1體積中0. 2 μ g生物素化的同工型特異性抗體在鏈親和素包被的微量滴定板中25°C溫育30min。洗滌后，添加 100 μ 1血清妊娠樣品或者PlGF標(biāo)準(zhǔn)品，溫育2小時。PlGF標(biāo)準(zhǔn)品是商業(yè)P1GF-1、P1GF-2 或P1GF-3蛋白。孔再次洗滌并添加在200 μ 1體積中的0. 2 μ g Eu-抗P1GF，溫育1小時。 孔洗滌后，添加增強(qiáng)溶液，產(chǎn)生Eu信號。通過時間分辨熒光計(Victor 2)，使用廠家設(shè)定的DELFIA Eu方案，在615nm執(zhí)行測量。圖1 顯示的濃度中，(a)PlGF-2 為“X”; (b)P1GF-3 為正方形；和(c)P1GF-1、P1GF_2 和P1GF-3為三角形。在各例中測量的PlGF同工型濃度(pg/ml血清)，在未患先兆子癇的女性中隨著妊娠發(fā)展而增加，直至大約30周，然后濃度最終開始減少。圖2描述了相匹配的病例-對照研究的結(jié)果，其中取自妊娠的、無先兆子癇的女性的樣品(對照，在圖中通過三角形表示)和取自后來在妊娠中發(fā)生先兆子癇的妊娠女性的樣品(病例，在圖中通過交叉形表示)，用檢測P1GF-2同工型的方法來測量。選擇的對照通過她們的生物物理參數(shù)(母體年齡，體重指數(shù)，種族和孕齡)與病例匹配。目測檢查的結(jié)果表明，在妊娠的第一個和第二個三個月期間，從病例樣品測量的濃度與對照樣品相比升高。圖3描述了相匹配的病例-對照研究的結(jié)果，其中取自無先兆子癇的妊娠女性的樣品(對照，在圖中通過三角形表示)和取自后來在妊娠中發(fā)生先兆子癇的妊娠女性的樣品(病例，在圖中通過交叉形表示)，用檢測P1GF-3同工型的方法來測量。選擇的對照通過她們的生物物理參數(shù)(母體年齡，體重指數(shù)，種族和孕齡)與病例匹配。目測檢查的結(jié)果表明，從病例樣品測量的濃度在妊娠的前三個月期期間與對照樣品相比基本相同，但在妊娠
的第:
.水個月期期間與對照樣品相比明顯較低。當(dāng)分析匹配的病例對照研究的結(jié)果時，P1GF-2和P1GF-3同工型的測量濃度經(jīng) Iogltl轉(zhuǎn)變，以作出生物變異的高斯分布。然后，分別計算前三個月(孕齡1-13周)和第二個三個月(孕齡1446周)在先兆子癇病例和對照群體的樣品中P1GF-2和P1GF-3同工型的Iogltl濃度的中位數(shù)、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。最后，計算先兆子癇病例群體的中位數(shù)與對照群體的中位數(shù)的差異是對照群體的標(biāo)準(zhǔn)差的多少倍。這些計算的結(jié)果歸納在表1A(P1GF_2) 和 lB(PlGF-3)中。表 IA
權(quán)利要求
1.確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法，包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型； )將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測定P1GF-2的水平，并且其中樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品的增加指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
3.權(quán)利要求2的方法，其中測定P1GF-3的水平，并且其中對象樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
4.權(quán)利要求1的方法，其中確定P1GF-2/P1GF-3比的差異，并且其中對象樣品中的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
5.權(quán)利要求1的方法，其中測定P1GF-3的水平，并且其中對象樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
6.權(quán)利要求5的方法，其中測定P1GF-2的水平，并且其中對象樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品的增加指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中至少一個生化標(biāo)志物選自PAPP-A，、ΡΑΙ-1、ΡΑΙ-2、 PlGF-I 禾口 ADAM-12。
8.權(quán)利要求7的方法，其中測定PlGF-I的水平，并且其中對象樣品中PlGF-I的水平相對于對照樣品的降低指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
9.權(quán)利要求1的方法，其中確定P1GF-2/P1GF-1的比，并且其中在對象樣品中所述比相對于對照樣品的差異指示發(fā)展先兆子癇的風(fēng)險增加。
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中從妊娠前三個月期間的對象獲得樣品。
11.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中從妊娠第二個三個月期間的對象獲得樣品。
12.權(quán)利要求1的方法，還包括測定孕婦的一種或多種生物物理標(biāo)志，將一種或多種生物物理標(biāo)志中的每一種與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中孕婦每種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照的增加或降低，指示發(fā)展先兆子癇的風(fēng)險增加。
13.權(quán)利要求12的方法，其中生物物理標(biāo)志選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。
14.確定孕婦是否患有先兆子癇的方法，包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，其中至少一種生化標(biāo)志物是選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型； )將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；其中對象樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇。
15.權(quán)利要求14的方法，其中進(jìn)行至少一種下列觀察從對象獲得的樣品中P1GF-2的水平相對于對照樣品中P1GF-2的水平增加；和從對象獲得的樣品中P1GF-3的水平相對于對照樣品中P1GF-3的水平降低。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-1的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
17.權(quán)利要求14或15的方法，其中從對象獲得的樣品中P1GF-2/P1GF-3的比相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。
18.權(quán)利要求14-17任一項的方法，其中從妊娠20-40周期間的孕婦獲得樣品。
19.計算機(jī)程序，其在電腦上運(yùn)行時，引起計算機(jī)執(zhí)行確定孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的過程，所述過程包括輸入通過下列方法獲得的至少一種生物標(biāo)志物的測量值；1)分析從孕婦獲得的樣品中的一種或多種生化標(biāo)志物，其中至少一種生化標(biāo)志物選自 P1GF-2 和 P1GF-3 ； )將樣品中所述一種或多種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較，其中樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示先兆子癇；和iii)根據(jù)比較結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。
20.權(quán)利要求19的計算機(jī)程序，還包括分析選自PAPP-A、PAI-UPAI-2、PlGF-I和 ADAM-12的至少一種生化標(biāo)志物。
21.權(quán)利要求19或20的計算機(jī)程序，還包括輸入通過測定對象的一種或多種生物物理標(biāo)志獲得的至少一種生物標(biāo)志的測量值；將對象的一種或多種生物物理標(biāo)志與對照對象的相同生物物理標(biāo)志相比較，其中對象中一種或多種生物物理標(biāo)志的測量值相對于對照的增加或降低，指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加；和根據(jù)比較的一種或多種生化標(biāo)志物和比較的一種或多種生物物理標(biāo)志的結(jié)果，確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價。
22.權(quán)利要求21的計算機(jī)程序，其中生物物理標(biāo)志選自血壓和子宮動脈搏動指數(shù)。
23.權(quán)利要求19至22任一項的計算機(jī)程序，其中確定先兆子癇風(fēng)險的定量評價包括使用多變量分析確定先兆子癇的似然性，并且其中多變量分析包括使用來源于對照參考數(shù)據(jù)組的生化標(biāo)志物和分布參數(shù)的水平。
24.權(quán)利要求22的計算機(jī)程序，其中所述多變量分析是多變量高斯分析。
25.計算機(jī)程序記錄介質(zhì)，其存儲權(quán)利要求19至M任一項的計算機(jī)程序。
26.評價孕婦中先兆子癇的風(fēng)險或存在的試劑盒，其包含i)至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體，其中每種可檢測的結(jié)合配偶體與選自P1GF-1、 P1GF-2和P1GF-3的單個PlGF同工型特異性結(jié)合。
27.權(quán)利要求沈的試劑盒，其包含i)與P1GF-2特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體，和ii)與選自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。
28.權(quán)利要求沈的試劑盒，其包含i)與P1GF-3特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體，和ii)與選自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特異性結(jié)合的可檢測結(jié)合配偶體。
29.根據(jù)權(quán)利要求沈至觀任一項的試劑盒，其中可檢測的結(jié)合配偶體是抗體或其抗原結(jié)合片段。
30.評價孕婦中先兆子癇的風(fēng)險和存在的試劑盒，其包含i)至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其與選自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特異性結(jié)合； )抗體或抗原結(jié)合片段在測定中的使用說明書。
31.根據(jù)權(quán)利要求沈或30的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與PlGF同工型的環(huán) 3結(jié)構(gòu)結(jié)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求沈或31的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與成熟P1GF-2中的 IM至144位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 6)結(jié)合，和/或與成熟P1GF-3中的114至185 位氨基酸之間的序列(SEQ ID NO 7)結(jié)合。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的試劑盒，其中抗體或其抗原結(jié)合片段與選自 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO 8)和PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的P1GF-3序列結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定孕婦發(fā)生先兆子癇風(fēng)險的方法。所述方法包括i)測定從孕婦獲得的樣品中一種或多種生化標(biāo)志物的水平，和ii)將樣品中所述至少一種生化標(biāo)志物的水平與對照樣品中相同生化標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較。樣品中生化標(biāo)志物的水平相對于對照樣品的差異指示發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險增加。同工型生化標(biāo)志物優(yōu)選是PlGF-2和PlGF-3。本發(fā)明還涉及確定孕婦是否患有先兆子癇的方法，以及評價先兆子癇的風(fēng)險或存在的試劑盒。另外，本發(fā)明還涉及用于這些確定的計算機(jī)程序。
文檔編號G01N33/68GK102224422SQ200980146549
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者喬納森·B·卡米歇爾, 佩蒂·胡爾斯凱寧, 塔加·阿霍拉, 海尼·弗朗, 緹姆·科皮瑪吉, 馬克·N·波布羅 申請人:Ntd實驗室公司, 沃萊克公司, 珀金埃爾默健康科學(xué)公司