專利名稱：分析熒光顆粒的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種顆粒分析儀，更具體而言，本發(fā)明涉及分析顆粒如生物顆粒的方法和裝置。
背景技術(shù)：
生物化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的多種現(xiàn)代技術(shù)都是以分析生物顆粒如細(xì)胞為基礎(chǔ)。與顆粒的類型和種類，以及顆粒的狀態(tài)如活力相關(guān)的多種參數(shù)都屬于常規(guī)被研究的參數(shù)和性質(zhì)。關(guān)于細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)的進(jìn)一步信息也經(jīng)常被檢測(cè)。在本領(lǐng)域中，冷光檢測(cè)法，如熒光檢測(cè)法， 已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，主要?dú)w因于其固有的特異性及靈敏度。對(duì)材料，例如生物材料的光致發(fā)光分析是基于以給定波長(zhǎng)的光(激發(fā)光)照射樣品，并在另一基本上不同的波長(zhǎng)處收集從該樣品、該樣品某部分或組分發(fā)射出來(lái)的光(發(fā)射光)。激發(fā)光和發(fā)射光之間的波長(zhǎng)差(通常稱作斯托克斯位移)是被分析樣品的一種特性，更概括地說(shuō)是樣品中存在的光致發(fā)光分子的特性。如果斯托克位移大到足以使激發(fā)光和發(fā)射光基本上光學(xué)分離，則可以應(yīng)用光致發(fā)光法對(duì)材料進(jìn)行分析。光致發(fā)光的發(fā)射光(如磷光或熒光)往往比激發(fā)光強(qiáng)度低，通常低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。發(fā)射光是在“黑暗”下檢測(cè)的事實(shí)使該方法更為適用，因?yàn)樵S多市售檢測(cè)器對(duì)“黑暗”的反應(yīng)性低而對(duì)撞擊檢測(cè)器的光(如光子)的反應(yīng)性相當(dāng)高。盡管如此，靈敏度提升，例如表示為發(fā)射光增加，往往是一種有利的特性，因此目前在現(xiàn)有技術(shù)中存在著大量實(shí)現(xiàn)該目的的方法。產(chǎn)生發(fā)射光的幾率與和光致發(fā)光分子相互作用的光子數(shù)量成比例，因此增加激發(fā)光強(qiáng)度通常會(huì)使發(fā)射光的量增加。一種常用的增加激發(fā)強(qiáng)度的方法是使用激光，激光可以用在某些發(fā)射光的量很強(qiáng)大的裝置中，這不僅因?yàn)榘l(fā)射光的量(例如表示為能流)相當(dāng)大， 而且因?yàn)閬?lái)自激光的光易于聚焦在小范圍上，從而產(chǎn)生高的光密度(例如表示為單位面積的發(fā)射能量)。另一種用于照射光致發(fā)光材料的方法是使用分散光源，例如燈或發(fā)光二極管。此類光源的優(yōu)點(diǎn)是它們發(fā)射出分散光，可以照射相當(dāng)大的面積。這些光源的一個(gè)共同的缺點(diǎn)往往是在獲得很高程度的效率同時(shí)，該樣品材料的均勻照射度相對(duì)較差，該效率由撞擊該樣品材料的發(fā)射光分?jǐn)?shù)所限定。通常優(yōu)選用于生物分析的設(shè)備是顯微鏡，為了獲得不同放大率通常配備兩個(gè)或更多個(gè)物鏡。此外，熒光檢測(cè)需要特定波長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射濾光器。顯微鏡操作在一定程度上是自動(dòng)化的，主要是實(shí)施圖像分析。然而，即便有了這種自動(dòng)化，顯微鏡的操作主要還是人工作業(yè)，需充分培訓(xùn)操作人員。自動(dòng)化流式細(xì)胞儀也用于分析諸如細(xì)胞等的顆粒。流式細(xì)胞儀是一大類設(shè)備的統(tǒng)稱，它們的特征在于分析處于流動(dòng)條件下的顆粒，這些條件通?？梢悦看畏治鲆粋€(gè)單個(gè)顆粒。某些類型的流式細(xì)胞儀可對(duì)能獲取的生物顆粒進(jìn)行復(fù)雜的分析，但是流式細(xì)胞儀因?yàn)椴僮魍ǔＲ蟛僮魅藛T相當(dāng)多的技能而難以使用。本發(fā)明中的裝置和方法也涉及細(xì)胞活力領(lǐng)域。細(xì)胞活力的測(cè)定對(duì)評(píng)估如藥品、環(huán)境污染物、溫度、離子極值和輻射等對(duì)細(xì)胞和組織的影響非常重要。細(xì)胞膜完整性通常被用作細(xì)胞活力的指標(biāo)。膜完整性缺失的一個(gè)特征是形成了允許低分子量分子(MW <小于2000 道爾頓)進(jìn)出細(xì)胞的孔。滲透性增強(qiáng)是許多細(xì)胞活力分析的基礎(chǔ)。最常用的活力測(cè)量方法有51Cr釋放法、臺(tái)盼藍(lán)拒染法以及不同熒光染料結(jié)合，以檢測(cè)活細(xì)胞和死細(xì)胞。美國(guó)專利 No. 6，403, 378描述了一種基于膜完整性的方法，該方法使用兩種熒光染料，一種標(biāo)記細(xì)胞膜受損的所有死細(xì)胞，而另一種標(biāo)記所有活細(xì)胞。為了使用兩種染料法獲得不同細(xì)胞群和密度的可靠結(jié)果，關(guān)鍵是小心控制每種染料的用量以及用于使細(xì)胞染色的培養(yǎng)時(shí)間。活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中不存在碘化丙錠(PI)和溴化乙錠(EB)，因此它們被認(rèn)為是最常用的死細(xì)胞染色熒光示蹤物。相反，吖啶橙(AO)和Hoechst-33342容易被活細(xì)胞吸收，因此常被用作活細(xì)胞染色的熒光探針。 吖啶橙(IUPAC名稱=N, N, N，，N-四甲基吖啶-3,6- 二胺，同義名堿性橙3RN、 Euchrysine、Aridine Orange NO、Rhodulin Orange NO、Waxoline Orange 等)是一禾中核酸選擇性熒光陽(yáng)離子染料，其通過(guò)嵌入或靜電吸引與DNA和RNA相互作用。當(dāng)與雙鏈DNA和RNA結(jié)合時(shí)，吖啶橙的最大激發(fā)在502nm，最大發(fā)射在525nm。當(dāng)它與單鏈核酸結(jié)合時(shí)，最大激發(fā)轉(zhuǎn)移到460nm，最大發(fā)射轉(zhuǎn)移到650nm。也已知不同形式的吖啶橙顯示吸光度和熒光特性的改變。溶液中的單體染料顯示綠色熒光，而以多聚體結(jié)構(gòu)存在的堆疊的吖啶橙則發(fā)射出紅光(Kapuscinski et al.，1982 luminescence of the solid complexes of acridine orange with RNA. Cytometry 2, pp. 201-211)。這禾中變化是由于單個(gè)吖啶橙分子間共振能量轉(zhuǎn)移的濃度依賴性增加，而溶液中吖啶橙濃度增加將引起綠光發(fā)射的逐漸淬滅(Millot et al. , 1997 =Characterization of Acidic Vesicles in Multidrug-resistant and Sensitive Cancer Cells by Acridine Orange Staining and Confocal Microspectrofluorometry. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45(9) :pp. 1255-U64)。吖啶橙也可進(jìn)入酸性腔室如溶酶體中并被質(zhì)子化和被螯合。在這些低PH條件下，當(dāng)用藍(lán)光照射時(shí)，染料會(huì)發(fā)射出紅光?？偠灾?，這顯示了吖啶橙的熒光發(fā)射光譜受到許多因素影響，包括多核苷酸的總體二級(jí)結(jié)構(gòu)、PH和吖啶橙的濃度。
DAPI或4 ‘，6- 二脒基_2_苯基吲哚是另一種熒光染料，其已被描述為細(xì)胞滲透性的并且可用于活細(xì)胞的染色(如Betty I. Tarnowski ；Francis G. Spinale James H， Nicholson. 1991. Biotechnic and Histochemistry，66 :296-302)。然而，經(jīng)我們實(shí)驗(yàn)室認(rèn)真研究顯示，DAPI滲透細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)相當(dāng)慢。因此，通過(guò)控制濃度和培養(yǎng)時(shí)間，DAPI可以用作無(wú)活力細(xì)胞染色的探針并因此可以用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。DAPI優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA 并連接到小溝的AT簇上。當(dāng)結(jié)合到雙鏈DNA時(shí)，它的最大吸收是在358nm，并且它的最大發(fā)射是在461nm。當(dāng)DAPI結(jié)合DNA時(shí)產(chǎn)生的熒光增強(qiáng)了 20倍。DAPI也可結(jié)合RNA，只是結(jié)合的模式不同。DAPI/RNA復(fù)合物的發(fā)射峰紅移到約500nm，且其量子產(chǎn)量只有DAPI/DNA復(fù)合物的20%。先前沒(méi)有提出或證實(shí)吖啶橙與DAPI的結(jié)合可適用于細(xì)胞活力的同步或雙色熒光分析。本發(fā)明的裝置和方法還涉及轉(zhuǎn)染領(lǐng)域。轉(zhuǎn)染，將外源核酸(DNA或RNA)引入到真核細(xì)胞中，是研究活細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)功能的一種常用且重要的實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的可用方法有很多，如將核酸與DEAE右旋糖苷或磷酸鈣形成復(fù)合物，通過(guò)胞吞作用或電穿孔被細(xì)胞攝取，電穿孔是采用電壓脈沖在質(zhì)膜上形成核酸可以進(jìn)入的孔。然而，多數(shù)轉(zhuǎn)染方法都包括形成核酸和陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合物，然后與細(xì)胞融合并將DNA/RNA傳遞到胞質(zhì)中。盡管是常規(guī)方法，轉(zhuǎn)染仍需要優(yōu)化分析條件用于不同的細(xì)胞類型。測(cè)定細(xì)胞種群轉(zhuǎn)染效率的方法有很多。大多是監(jiān)測(cè)熒光、冷光或比色報(bào)告基因的表達(dá)。報(bào)告基因可與目的基因存在于同一載體中，或者在分開(kāi)的載體中。常用于測(cè)量轉(zhuǎn)染效率的報(bào)告基因是自動(dòng)熒光蛋白，如分離自水母Aequorea victoria的綠色熒光蛋白(GFP)和由海葵Discosoma striata產(chǎn)生的紅色熒光蛋白(RFP)，二者均可用于活細(xì)胞分析且其熒光的產(chǎn)生不需要基質(zhì)。當(dāng)被藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP發(fā)射綠光；而當(dāng)被綠光激發(fā)時(shí)，RFP發(fā)射橙/紅光。此外，GFP與適用的染料相結(jié)合可用于多元分析以評(píng)估例如活力、細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。另一種監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率的方法采用熒光標(biāo)記的核酸如Cy5_標(biāo)記的si-RNA作為報(bào)告子，以優(yōu)化RNAi沉默實(shí)驗(yàn)。在一種分析方法中，用DACM和碘化丙錠(PI)培養(yǎng)GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。DACM與硫醇反應(yīng)，以在活細(xì)胞中產(chǎn)生藍(lán)色熒光產(chǎn)物，而其反應(yīng)水平在垂死/死亡的細(xì)胞中很低。相反，PI 只能滲透膜受損的細(xì)胞，因此只能標(biāo)記死細(xì)胞的DNA。以DACM標(biāo)記的細(xì)胞是通過(guò)UV/紫光激發(fā)并測(cè)量藍(lán)光來(lái)檢測(cè)，而用PI標(biāo)記的細(xì)胞是通過(guò)綠光激發(fā)并測(cè)量發(fā)射的紅光來(lái)檢測(cè)。表達(dá)GFP的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染細(xì)胞)是通過(guò)藍(lán)光激發(fā)并測(cè)量綠光來(lái)監(jiān)測(cè)。從這些數(shù)據(jù)中可以提取有關(guān)轉(zhuǎn)染效率以及例如活力的信息。在另一種分析方法中，用DACM和吖啶同源二聚體培養(yǎng)RFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。吖啶同源二聚體只能滲透膜受損的細(xì)胞，因此只能標(biāo)記死細(xì)胞。以DACM標(biāo)記的活細(xì)胞是通過(guò)UV/紫光激發(fā)并測(cè)量藍(lán)光來(lái)檢測(cè)，而用吖啶同源二聚體標(biāo)記的死細(xì)胞是通過(guò)藍(lán)光激發(fā)并測(cè)量發(fā)射的綠光來(lái)檢測(cè)。表達(dá)RFP的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染細(xì)胞)是通過(guò)綠光激發(fā)并測(cè)量紅光來(lái)監(jiān)測(cè)。從這些數(shù)據(jù)中可以獲得有關(guān)轉(zhuǎn)染效率以及例如活力的信息。在第三種分析方法中，用DACM和PI來(lái)培養(yǎng)用si_RNA轉(zhuǎn)染、以綠色熒光團(tuán)如FITC 標(biāo)記的細(xì)胞。用DACM標(biāo)記的活細(xì)胞是通過(guò)UV/紫光激發(fā)并測(cè)量藍(lán)光來(lái)檢測(cè)，而用PI標(biāo)記的死細(xì)胞是通過(guò)綠光激發(fā)并測(cè)量發(fā)射的紅光來(lái)檢測(cè)。含有si-RNA的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染細(xì)胞)是通過(guò)藍(lán)光激發(fā)并測(cè)量綠光來(lái)監(jiān)測(cè)。從這些數(shù)據(jù)中可以提出有關(guān)轉(zhuǎn)染效率以及例如活力的信肩、ο先前沒(méi)有提出或者證實(shí)在核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種群中，硫醇-反應(yīng)試劑與細(xì)胞不滲透性的DNA染色劑相結(jié)合可同時(shí)用于轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性分析。本發(fā)明的裝置和方法還涉及細(xì)胞周期領(lǐng)域。細(xì)胞周期代表真核細(xì)胞中最基本且重要的過(guò)程。事件的有序集合，以細(xì)胞生長(zhǎng)并分裂為兩個(gè)子細(xì)胞為終點(diǎn)，細(xì)胞周期通過(guò)多種細(xì)胞周期調(diào)控因子的確定的時(shí)間和空間表達(dá)、定位及破壞而受到嚴(yán)格的調(diào)控。細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是主要的細(xì)胞周期控制開(kāi)關(guān)，促使細(xì)胞從G1期到S期或從&期到M期運(yùn)轉(zhuǎn)。在某一給定種群中，細(xì)胞分布在細(xì)胞周期的三個(gè)主要時(shí)期=G1Aitl期 (每個(gè)細(xì)胞有一套配對(duì)的染色體)，S期(DNA合成，帶有不同的DNA量)，以及G/M期(細(xì)胞分裂前，每個(gè)細(xì)胞有兩套配對(duì)的染色體)。最常用的確定細(xì)胞周期階段的方法是以測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的DNA含量為基礎(chǔ)。DNA含量可用熒光、DNA選擇性染色劑來(lái)測(cè)定，它們展示了與DNA質(zhì)量成比例的發(fā)射信號(hào)。細(xì)胞內(nèi)的熒光通過(guò)流式細(xì)胞儀、圖像或激光掃描細(xì)胞儀測(cè)量。這種分析通常是用一種細(xì)胞不滲透性
19的核酸染色劑在滲透化或固定化的細(xì)胞上進(jìn)行，但也可使用活細(xì)胞和細(xì)胞滲透性的核酸著色劑。因?yàn)槟[瘤形成中常常發(fā)生細(xì)胞周期失調(diào)，因此從中開(kāi)發(fā)新抗癌劑以及改進(jìn)治療方法成為了強(qiáng)烈關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)胞周期分析已經(jīng)應(yīng)用到眾多生命科學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域， 包括腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞凋亡分析、藥物篩選和測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物的健康狀態(tài)，如生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物。DAPI是一種出色的用于測(cè)量細(xì)胞周期階段的染料。然而，DAPI的激發(fā)需要紫外光源，而標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞儀通常不具有紫外光源，阻礙了 DAPI的應(yīng)用。本發(fā)明的裝置和方法還涉及細(xì)胞死亡領(lǐng)域。細(xì)胞死亡可通過(guò)兩種不同的機(jī)制發(fā)生，壞死或凋亡。當(dāng)細(xì)胞暴露在嚴(yán)酷的物理或化學(xué)脅迫(如低溫，缺氧)下會(huì)出現(xiàn)壞死，而細(xì)胞凋亡是一種受到嚴(yán)格控制的生化過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程使細(xì)胞消除，且細(xì)胞積極地參與了其自身的終結(jié)過(guò)程(“細(xì)胞自殺”)。凋亡是多種主要程序化細(xì)胞死亡中的一種，發(fā)生在多細(xì)胞器官中并以一系列導(dǎo)致多種形態(tài)學(xué)改變的事件為特征，包括形成水泡、細(xì)胞核破裂、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜失去對(duì)稱性以及膜磷脂酰絲氨酸(PQ從質(zhì)膜的內(nèi)葉遷移到外葉。凋亡是非常復(fù)雜且非常重要的過(guò)程，凋亡機(jī)制的失調(diào)可導(dǎo)致非常嚴(yán)重的疾病。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，即便并非所有類型的腫瘤，但絕大多數(shù)腫瘤都具有抗凋亡的特性。此外，凋亡信號(hào)途徑的缺陷引起腫瘤細(xì)胞的藥物抗性。另一方面，凋亡過(guò)程過(guò)度活化也可能導(dǎo)致疾病，如見(jiàn)于帕金森氏癥和阿爾茨海默氏病等神經(jīng)退行性疾病，其中細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是細(xì)胞死亡和神經(jīng)元不斷損失的主要原因。由于細(xì)胞凋亡在包括胚胎形成、衰老和多種疾病的眾多生物過(guò)程中扮演了非常重要的角色，這種程序性細(xì)胞死亡成為了很多研究的課題，因此期望開(kāi)發(fā)容易檢測(cè)和分析細(xì)胞凋亡的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及一種檢測(cè)樣品的熒光的裝置，所述裝置包括一可使樣品設(shè)在其上的樣品板，一包括至少一個(gè)照射樣品的光源的激發(fā)光單元以及一包括至少一個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)單元，該檢測(cè)器具有至少100，000種活性檢測(cè)元件以檢測(cè)樣品的熒光信號(hào)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種照射樣品的裝置，所述裝置包括一具有照射區(qū)的樣品板，樣品排列于該照射區(qū)上；一具有產(chǎn)生激發(fā)光光源的激發(fā)光單元；一包括透鏡裝置的光學(xué)系統(tǒng)，具有微透鏡陣列，其中該微透鏡陣列包括以二維形式排列的多個(gè)透鏡，以接收激發(fā)光和生成朝向照射區(qū)的照射光；其中，透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，以高的照射效率被投射到樣品板的照射區(qū)上。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，闡述了一種用于照射樣品的方法。該方法包括將樣品排列于具有至少0. 5mm2照射區(qū)的樣品板上；用帶光源的激發(fā)單元產(chǎn)生激發(fā)光；以及用透鏡單元產(chǎn)生朝向照射區(qū)的照射光，該透鏡單元包括微透鏡陣列，具有以二維形式排列的多個(gè)透鏡；其中，透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，以高的照射效率被投射到樣品板的照射區(qū)上。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了一種用于檢測(cè)來(lái)自樣品的熒光的方法。所述方法包括將樣品排列于樣品板上，用具有至少一個(gè)光源的激發(fā)光單元，以激發(fā)光照射樣
20品，以及用包括至少一個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)單元檢測(cè)來(lái)自樣品的熒光信號(hào)，該檢測(cè)器至少具有 100，000種活性檢測(cè)元件。


從以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以更好地理解本發(fā)明的實(shí)施方式及其優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示一種照射樣品的光源及現(xiàn)有的將照射光聚焦在樣品材料上的裝置系統(tǒng)；圖2顯示一種用微透鏡陣列照射樣品材料的系統(tǒng)；圖3顯示兩種照射樣品材料的方法的對(duì)比；圖4顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式；圖5顯示本發(fā)明的照明區(qū)的大??；圖6顯示本發(fā)明的微透鏡陣列元件；圖7顯示A) —種裝置的排列，其中各單元排列在、或基本上排列在光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸上，優(yōu)選的排列方式是照射光直接朝向成像系統(tǒng)的檢測(cè)器單元；以及B) —種排列，其中各單元基本上是偏離光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸排列，優(yōu)選的排列方式是包括一雙色鏡，其將照射光沿著成像系統(tǒng)的軸反射到樣品上；圖8顯示A)由該裝置QX放大率)生成的Jurkat、HEK293、S2和Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物的圖像。每板顯示相同細(xì)胞的圖像左，AO;右，DAPI ；以及B)由該裝置QX放大率)生成的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)物的圖像。每板顯示相同細(xì)胞的圖像上，AO;中，DAPI ；下，上述兩個(gè)圖像的疊加；圖9顯示Jurkat細(xì)胞用DAPI著色并用UV帶通濾光器以40 X放大率顯微成像的熒光顯微圖。每板顯示相同細(xì)胞的圖像左，相位差；右，DAPI ；圖10顯示Jurkat細(xì)胞以20 X放大率顯微成像的熒光顯微圖。A)相差，B) PI染色細(xì)胞(綠色長(zhǎng)通濾波器)，C) DAPI染色細(xì)胞(UV帶通濾光器)；圖11顯示由該裝置QX放大率)生成的分離的原代小鼠脾細(xì)胞、小鼠骨髓細(xì)胞和人血細(xì)胞的圖像。每板顯示相同細(xì)胞的圖像左A0 ；右DAPI ；圖12顯示A)顯示了用DACM染色的HEK293細(xì)胞。B)顯示了用CMV-RFP融合蛋白轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。C)圖像A和B的結(jié)合，色標(biāo)藍(lán)色DACM，紅色RFP ；圖13顯示A)用PI染色的MCF-7EC3細(xì)胞。B)用DACM染色的MCF-7EC3細(xì)胞。 C)表達(dá)GFP的MCF-7EC3細(xì)胞。D)圖A、B和C的結(jié)合(色標(biāo)紅色PI，藍(lán)色DACM，綠色 GFP)；圖14顯示GFP轉(zhuǎn)染的與未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的混合物。色標(biāo)紅色PI (綠色長(zhǎng)通)，綠色=GFP (藍(lán)色帶通)和藍(lán)色=DACM (UV帶通)；圖15顯示用本發(fā)明的裝置和FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA的定量。MCF-7細(xì)胞用乙醇固定后，用RNA酶A處理，并用碘化丙錠染色，之后用所述裝置(A+B)和流式細(xì)胞儀(C)分析。A)所述裝置QX放大率)捕獲的圖像；B)由所述裝置獲得的DNA含量柱狀圖，其顯示熒光強(qiáng)度為細(xì)胞數(shù)的函數(shù)；C)由FACSCalibur獲得的DNA含量柱狀圖；圖16顯示用本發(fā)明的裝置對(duì)DAPI和PI染色的細(xì)胞內(nèi)DNA定量的對(duì)比。DNA含量柱狀圖由所述裝置獲得，其顯示熒光強(qiáng)度為細(xì)胞數(shù)的函數(shù)；上板在用所述裝置分析前，用乙醇固定后，用RNA酶A處理，并用碘化丙錠染色的JM細(xì)胞。下板在用所述裝置分析前， 用乙醇固定后，并用DAPI染色的JM細(xì)胞。圖17顯示用不同藥物處理的JM細(xì)胞DNA柱狀圖。細(xì)胞內(nèi)DNA含量分別用本發(fā)明的裝置(灰色柱狀圖)和FACSCaliburTM(白色柱狀圖)測(cè)量；圖18顯示酵母細(xì)胞Gchizosaccharomyces pombe)的DNA柱狀圖。細(xì)胞內(nèi)DNA 含量分別用本發(fā)明的裝置(灰色柱狀圖)和FACSCaliburTM(白色柱狀圖)測(cè)量。A)Eg892， 在無(wú)氮條件下于36°C培養(yǎng)4小時(shí)。B)EgM4，在無(wú)氮條件下于30°C培養(yǎng)3小時(shí)。C)Eg892， 在有氮條件下于36°C培養(yǎng)4小時(shí)。D)Eg816，在有氮條件下于36°C培養(yǎng)4小時(shí)(與A-C相比刻度不同)；圖19顯示左用AlexaFluor 488-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V染色的凋亡細(xì)胞。右用 PI染色的無(wú)活力的細(xì)胞。圖像是用本發(fā)明的裝置以2X放大率捕獲；圖20顯示是用喜樹(shù)堿處理并用AF-488標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白以及PI染色的Jurkat細(xì)胞的熒光顯微圖和相差。細(xì)胞是在40X放大率下顯微成像；圖21顯示用不同藥物處理的CHO細(xì)胞(左板)和JM細(xì)胞(右板)的DNA柱狀圖。 CHO細(xì)胞和JM細(xì)胞分別在諾考達(dá)唑和喜樹(shù)堿存在或不存在的條件下生長(zhǎng)。細(xì)胞用DAPI染色，并且用本發(fā)明的裝置對(duì)DNA含量進(jìn)行定量。處于M期和S期的細(xì)胞如圖所示。含有片段化DNA (少于2C DNA含量)的細(xì)胞標(biāo)記為Sub-G1細(xì)胞；圖22顯示用本發(fā)明的裝置，以2X數(shù)碼和2X光學(xué)放大率捕獲的圖像。細(xì)胞用 AF594-膜聯(lián)蛋白V綴合物染色(凋亡細(xì)胞，紅色)，以及用DACM (活細(xì)胞，藍(lán)色)和SYTOX 綠(無(wú)活力的細(xì)胞，綠色)共染色。A)未處理的Jurkat細(xì)胞；少于10% AF594-膜聯(lián)蛋白 V綴合物陽(yáng)性細(xì)胞。B)經(jīng)諾考達(dá)唑處理的Jurkat細(xì)胞；約40% AF594-膜聯(lián)蛋白V綴合物陽(yáng)性細(xì)胞。C)和D)結(jié)果框分別顯示未處理和經(jīng)諾考達(dá)唑處理的細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞的百分比、無(wú)活力的細(xì)胞數(shù)以及總細(xì)胞數(shù)；圖23顯示用本發(fā)明的裝置以8X放大率捕獲的圖像。細(xì)胞用DACM(活細(xì)胞，藍(lán)色)、SR-VAD-FMK多聚caspase FLICA (凋亡細(xì)胞，紅色)以及SYTOX綠(無(wú)活力的細(xì)胞，綠色)染色。左欄顯示未經(jīng)處理的CHO細(xì)胞，右欄顯示經(jīng)諾考達(dá)唑處理的細(xì)胞；圖M顯示用JC-I和DAPI染色的Jurkat細(xì)胞。細(xì)胞分別在不存在(左上)或者存在10 μ M喜樹(shù)堿(CPT)(右上)的條件下于37°C生長(zhǎng)5小時(shí)。細(xì)胞用2. 5 μ g/ml JC-I于 37°C染色10分鐘，用PBS沖洗，重懸于PBS+lyg/ml DAPI中，并用本發(fā)明的裝置進(jìn)行分析。 在該實(shí)施例中，未處理的Jurkat細(xì)胞中20%的去極化/凋亡，而CPT-處理的Jurkat細(xì)胞有60%的去極化/凋亡(A)。DAPI陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示兩種樣品的細(xì)胞活力相似，接近96% ⑶。(C)顯示CTP-處理的樣品中獲得的圖像；以及圖25顯示A)來(lái)自人血的⑶3陽(yáng)性T細(xì)胞的反差圖像，用R-藻紅蛋白(PE) 二級(jí)綴合物標(biāo)記(紅色/粉紅色)。為了觀察到所有活細(xì)胞，細(xì)胞樣品用DACM(藍(lán)色)共染色。 B)柱狀圖顯示PE陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。C)結(jié)果框中總結(jié)了所獲得的信息，包括陽(yáng)性細(xì)胞的百分比、總細(xì)胞數(shù)、PE平均熒光強(qiáng)度、標(biāo)準(zhǔn)差和總數(shù)(main number) 0所有數(shù)據(jù)均是用本發(fā)明的裝置及相關(guān)軟件獲得。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明參考詳細(xì)說(shuō)明并結(jié)合所提供的附圖，本發(fā)明的目的和優(yōu)勢(shì)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員本來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于分析樣品的裝置包括其上可放置樣品的樣品板，；包括至少一個(gè)照射樣品的光源的激發(fā)光單元；以及包括至少一個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)單元， 該檢測(cè)器具有至少100，000個(gè)活性檢測(cè)元件以檢測(cè)來(lái)自樣品的熒光信號(hào)。被分析的樣品可以是固體、或基本上是固體，或者是液體樣品。樣品包含顆粒，所述顆粒選自動(dòng)物細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和魚(yú)細(xì)胞，選自真菌細(xì)胞，如酵母菌細(xì)胞，以及選自細(xì)菌。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒本身、顆粒上或內(nèi)部包含的材料具有光致發(fā)光活性，當(dāng)樣品被激發(fā)光照射時(shí)能產(chǎn)生熒光信號(hào)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒用光致發(fā)光活性材料，優(yōu)選熒光材料標(biāo)記。用來(lái)自光源的激發(fā)光照射樣品或樣品的某一部分，光源通常是發(fā)射基本上很窄的波長(zhǎng)帶的光。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于照射樣品的光源包括發(fā)光二極管和/或激光二極管。光源也可選自固態(tài)光源和熱光源。固態(tài)光源的一個(gè)被高度推崇的特性是它相當(dāng)高的照射效力，特別是當(dāng)在一個(gè)限定的光帶進(jìn)行照射時(shí)。這在熒光分析中是很典型的，其中優(yōu)選90%或更高的照射光在小于50nm的波長(zhǎng)帶發(fā)射，例如40nm或更小，更優(yōu)選在小于20nm 的波長(zhǎng)帶，例如IOnm或更小，或者5nm或更小。特別地，優(yōu)選的是激光和激光二極管波長(zhǎng)帶小于5nm，如波長(zhǎng)帶為2nm或更小，更優(yōu)選波長(zhǎng)帶為Inm或更小。固態(tài)光源的另一個(gè)被高度推崇的特性是其運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)，如有效運(yùn)轉(zhuǎn)壽命長(zhǎng)。例如，發(fā)光二極管和激光二極管的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間超過(guò)2000小時(shí)，如4000小時(shí)或更高，優(yōu)選8000小時(shí)或更高。光源可以選自分散光源、發(fā)光二極管、激光二極管、激光、熱光源以及固態(tài)光源。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，激發(fā)光單元包括多個(gè)發(fā)射不同波長(zhǎng)光的光源，包括如至少兩個(gè)不同的光源，如四個(gè)不同的光源，如至少六個(gè)不同的光源，如至少八個(gè)不同的光源，如至少10個(gè)不同的光源。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，以一種方式照射被分析的樣品或樣品某一部分，使得照射強(qiáng)度的變化小于預(yù)定值，而同時(shí)照射效率卻高于預(yù)定值，照射效率定義為來(lái)自光源的發(fā)射光照射到被分析樣品或樣品部分的分?jǐn)?shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用具有微透鏡陣列的透鏡單元照射樣品，其中微透鏡陣列包括以二維方式排列的多個(gè)透鏡，以接收激發(fā)光并且產(chǎn)生朝向樣品板的照射區(qū)的照射光。透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，被以高的照射效率投射到樣品板的照射區(qū)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，聚焦于微透鏡陣列上的激發(fā)光的發(fā)散角為0. Imrad或更小，優(yōu)選0. 05mrad或更小，更優(yōu)選0. 02mrad或更小。微透鏡陣列的多個(gè)透鏡中的每個(gè)透鏡產(chǎn)生與分析樣品區(qū)尺寸相似的圖像，優(yōu)選地，產(chǎn)生的圖像基本上是矩形的。微透鏡陣列的多個(gè)透鏡包括至少4個(gè)透鏡，優(yōu)選多于4個(gè)透鏡，更優(yōu)選多于50個(gè)透鏡元件，更優(yōu)選多于 100個(gè)透鏡。這些透鏡是成排排列的半球形透鏡，優(yōu)選地將兩個(gè)所述排設(shè)為一系列，從而形成透鏡的陣列。透鏡的尺寸為0.5至3mm，優(yōu)選1至2mm。微透鏡陣列的尺寸小于20mm，該尺寸是透鏡陣列在垂直于激發(fā)樣品光軸方向上的直徑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，透鏡單元包括第一微透鏡陣列，相對(duì)的方向上有第二微透鏡陣列。第一微透鏡陣列和第二微透鏡陣列的選擇是基于加強(qiáng)照射效率和/或減小照射變化和/或?qū)为?dú)的光學(xué)元件的光學(xué)特征整合到透鏡陣列的光學(xué)效果中。微透鏡陣列封裝在盒子中，該盒子包括用于排列和固定微透鏡陣列的工具。該盒子通常是用鑄型聚合物制作而成。透鏡的形式優(yōu)選與激發(fā)光束的形狀相似。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，照射區(qū)至少比光源發(fā)射面積大兩倍。僅將需要檢測(cè)的照射區(qū)暴露在照射光下，從而避免熒光信號(hào)的減弱。不檢測(cè)的樣品基本上不被暴露在照射光下，特別是當(dāng)照射會(huì)引起樣品的化學(xué)和/或物理性質(zhì)改變時(shí)，如熒光信號(hào)的減弱。為了獲得用于照射光致發(fā)光樣品材料的高效率且變化小的照射光，光源的結(jié)構(gòu)， 尤其是光源的發(fā)光部分是極為重要的。因此，本發(fā)明的多種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式都使用帶有均勻發(fā)射元件的“功率型LED”光源，如許多市售半導(dǎo)體光源(如LedEgin的LZ1-00G105， Cree 的 XLamp 7090 LEDs, Lumiled 的 Luxeon K2, Nichia 的 NS6B083T 或者 Osram 的 Golden Dragon(LD w51M))0總而言之，本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包含選自分散光源、發(fā)光二極管、激光二極管和激光的光源，優(yōu)選地，發(fā)射元件的尺寸較大，如大于0. 5mm2或者大于 1. Omm20研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用光發(fā)射元件具有不同結(jié)構(gòu)的光源時(shí)，如燈或發(fā)光二極管(即 LED)，或在聚焦時(shí)形成圖像或構(gòu)像的普通光源中，有可能照射相當(dāng)大的樣品材料，同時(shí)維持發(fā)射光的高度均勻照射以及良好效率。均勻照射是通過(guò)穿過(guò)樣品材料的照射能的變化來(lái)定義。照射效率是通過(guò)照射光和發(fā)射光的比率來(lái)定義。本發(fā)明提供了光致光發(fā)(如熒光顯微鏡)的多種應(yīng)用的實(shí)質(zhì)性改進(jìn)。通過(guò)產(chǎn)生樣品材料的強(qiáng)的均勻照射，可以更為快捷且簡(jiǎn)便的方式進(jìn)行高質(zhì)量的光致發(fā)光分析，因此可使用更簡(jiǎn)單及耐用的儀器設(shè)備。分散光源，如LED，幾乎向所有方向發(fā)射光。為了在諸如熒光顯微鏡的領(lǐng)域中使用這種光源，有必要將光聚焦到樣品材料上。這種聚焦將產(chǎn)生光源的圖像，其尺寸可能與顯微鏡的視野不相上下。另一方面，發(fā)射光的強(qiáng)度在視野中是光源的圖像，因此即使可以高效地照射樣品材料，照射強(qiáng)度在樣品材料的一個(gè)部分與另一部分之間也有很大差別。本發(fā)明的一種常用的優(yōu)選實(shí)施方式使用多個(gè)透鏡聚焦來(lái)自分散光源的光。通常優(yōu)選的是，這些透鏡為多個(gè)基本上相同的透鏡，優(yōu)選排列成透鏡陣列如微透鏡陣列的透鏡。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式使用兩組基本上相同的微透鏡陣列，其以相對(duì)的方向成對(duì)排列， 而其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方式使用單一元件，包括在兩個(gè)相反表面上的微透鏡陣列。在使用單一元件的微透鏡陣列的實(shí)施方式中，該單一元件優(yōu)選是以模塑的方法，通過(guò)模塑一種基本上光學(xué)透明的材料，如玻璃或聚合物而制備。透過(guò)微透鏡陣列的光的一個(gè)優(yōu)選的性質(zhì)是高度平行的光，因此本發(fā)明的多種優(yōu)選實(shí)施方式包括一個(gè)或多個(gè)透鏡元件，如微透鏡陣列，其增強(qiáng)了離開(kāi)光源并進(jìn)入微透鏡陣列的光的平行度。本發(fā)明使用微透鏡陣列元件的多種優(yōu)選實(shí)施方式中，兩方的微透鏡陣列元件基本上形式相同，并且優(yōu)選位置也相同，而其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，微透鏡陣列元件的形式和/或位置基本上不同，優(yōu)選地，所述差異增強(qiáng)照射效率和/或減小照射變化和/或?qū)为?dú)的光學(xué)元件(如透鏡)的光學(xué)特征整合到微透鏡陣列元件的光學(xué)效果中。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，由透鏡產(chǎn)生的光源的圖像基本上與樣品材料被檢測(cè)的區(qū)域相似，優(yōu)選地非常接近被檢測(cè)的光致發(fā)光區(qū)域或圖像的高度/比率。當(dāng)使用很多相同的透鏡時(shí)，通常優(yōu)選的是將這些透鏡排列成單一元件，如微透鏡陣列。除了使用微透鏡陣列外，本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)透鏡，優(yōu)
24選地，所述一個(gè)或多個(gè)透鏡的目的是為了使來(lái)自光源的光變準(zhǔn)直和/或增加立體角度，通過(guò)該角度收集來(lái)自光源的光。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，提供了用于接收激發(fā)光并生成準(zhǔn)直的激發(fā)光的準(zhǔn)直單元。所述準(zhǔn)直單元包括透鏡或透鏡的陣列。所述準(zhǔn)直單元使立體角度增加，通過(guò)該角度收集來(lái)自激發(fā)單元的激發(fā)光。使用多個(gè)相同透鏡或透鏡元件(如微透鏡陣列)的一個(gè)通常優(yōu)選的性質(zhì)是可以去除光源中任何結(jié)構(gòu)(如燈泡的燈絲)的成像。如果這類結(jié)構(gòu)在樣品材料上成像，則照射光的強(qiáng)度將根據(jù)光源的成像結(jié)構(gòu)而改變。這些結(jié)構(gòu)無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的成像鏡片去除，因此往往需要諸如光的散焦或漫射等的方法，而這些方法的結(jié)果一般會(huì)導(dǎo)致照射效率的降低。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括由單一元件組成的微透鏡陣列，優(yōu)選地，所述元件是通過(guò)在模具中澆鑄光學(xué)透明材料，優(yōu)選聚合物材料來(lái)生產(chǎn)。當(dāng)通過(guò)澆鑄聚合物材料來(lái)生產(chǎn)微透鏡陣列元件時(shí)，通常優(yōu)選使用相當(dāng)小的厚度。 這種小厚度通常是通過(guò)使用小的透鏡元件來(lái)獲得，如直徑為3mm或更小的透鏡元件，如直徑為2mm或更小，甚至是Imm或更小，如0. 5mm或更小。通常這種微透鏡陣列元件的厚度小于10mm，如8mm或更小，如5mm或更小，甚至是3mm或更小。根據(jù)生產(chǎn)用于澆鑄的模具的方法，通常有利的是使用某些直徑的透鏡，如直徑0. 5mm或更大的透鏡，如Imm或更大，如2mm 或更大，如3mm或更大。因此通常優(yōu)選的是透鏡的直徑在0. 5至3mm之間，更優(yōu)選1至2mm 之間。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，微透鏡陣列的尺寸小于20mm，如15mm或更小，如 IOmm,在某些實(shí)施方式中甚至更小，如8mm或更小，如5mm或更小，所述尺寸是透鏡陣列在垂直于照射的主軸方向上的直徑。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式使用單一的光源，如使用發(fā)光二極管、激光二極管或激光作為光源，而其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中使用兩個(gè)或更多個(gè)光源，優(yōu)選地是一體式裝配(single assembly)。在許多這樣的實(shí)施方式中，優(yōu)選的是所述兩個(gè)或更多個(gè)光源就光學(xué)性質(zhì)而言是相同的，而在同樣優(yōu)選的其他實(shí)施方式中，至少兩個(gè)光源就光學(xué)性質(zhì)而言是不同的。通常兩個(gè)或更多個(gè)相同的光源可以產(chǎn)生更大的光流，而就諸如發(fā)射光的波長(zhǎng)等的性質(zhì)而言，兩個(gè)或更多個(gè)光源可以增加光的靈活性。本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，兩個(gè)或更多個(gè)光源的排列與裝置中至少一個(gè)其他單元和/或與樣品板相對(duì)應(yīng)。這樣的排列包括將光源向至少一個(gè)其他單元和/或樣品板相對(duì)移動(dòng)Imm或更小。這樣的排列影響照射區(qū)上的照射光的均勻性，優(yōu)選地，一種理想的排列是產(chǎn)生最小的照射變化。 本發(fā)明多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括用于生產(chǎn)的方法，該方法可將光源放置在與至少一個(gè)光學(xué)組件相對(duì)應(yīng)的位置上，以這種方式可以獲得滿意的照射效率和/或照射強(qiáng)度變化。這優(yōu)選地是通過(guò)以下工具獲得，該工具包括允許光源放置在與照射區(qū)平面平行的面上(光源面/光源板)，定位的精確度優(yōu)于1mm，如優(yōu)于0. 5mm,或者優(yōu)于0. 2mm,如精確度的偏差為0. Imm或更小。還有多個(gè)實(shí)施方式包括用于生產(chǎn)的方法，該方法可以將光源與至少一個(gè)光學(xué)元件放置在彼此對(duì)應(yīng)的位置，平行于照射光的主要方向。這優(yōu)選地是通過(guò)以下工具獲得，該工具包括將光源和/或至少一個(gè)光學(xué)元件放置在彼此對(duì)應(yīng)的位置，定位的精確度優(yōu)于0. Imm,如優(yōu)于0. 5mm,或者優(yōu)于0. 2mm,如精確度為0. Imm或更好。通常，優(yōu)選的是在照射工具中包括一波長(zhǎng)分離單元，如濾光器，優(yōu)選的目的是限定照射光的波長(zhǎng)區(qū)域或偏光性。波長(zhǎng)分離單元是一種光譜過(guò)濾工具，選自干擾濾光器、吸收濾光器和激發(fā)濾光器。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將光源放置在靠近被分析的樣品材料的地方。這樣可以形成小型光學(xué)系統(tǒng)，因?yàn)檎丈涔ぞ?，包括光源和光學(xué)組件在沿著該系統(tǒng)光軸上的長(zhǎng)度可以短于100mm，優(yōu)選短于60mm，更優(yōu)選短于40mm，更優(yōu)選短于20mm，如短于15mm。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式在光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸上或基本上在該光軸上排列有照射工具優(yōu)選的排列方式是照射光流的大體方向是朝向成像系統(tǒng)的檢測(cè)器系統(tǒng)。本發(fā)明其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方式的照射工具基本上偏離成像系統(tǒng)的光軸排列，優(yōu)選的排列方式包括用雙色鏡將照射光沿著成像系統(tǒng)軸反射到樣品上。本發(fā)明實(shí)施方式的一個(gè)通常優(yōu)選的性質(zhì)是，在沒(méi)有使用漫射器(光擴(kuò)散器)或散焦元件/組件的情況下，可以以均勻的光高效地照射樣品材料。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在沒(méi)有對(duì)照射工具的各單元進(jìn)行實(shí)質(zhì)性散焦的條件下獲得該照射效率和照射變化。本發(fā)明實(shí)施方式的一個(gè)通常優(yōu)選的性質(zhì)是，不進(jìn)行分析的樣品區(qū)域基本上不會(huì)暴露于照射中。這是一種令人滿意的特性，特別是當(dāng)照射的結(jié)果會(huì)改變樣品材料的化學(xué)和/ 或物理性質(zhì)時(shí)，如熒光信號(hào)的減弱。包括有至少第一檢測(cè)器的檢測(cè)單元收集來(lái)自樣品的熒光信號(hào)，顯示圖像。第一檢測(cè)器檢測(cè)來(lái)自樣品的信號(hào)，從而獲得樣品的圖像。檢測(cè)器是圖像感應(yīng)器件，如電荷耦合器件 (CDD)或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CM0Q器件。檢測(cè)器的優(yōu)選特征是活性區(qū)域的優(yōu)選尺寸， 活性檢測(cè)元件的優(yōu)選數(shù)目(如像素)和優(yōu)選的響應(yīng)性(如對(duì)檢測(cè)光的靈敏度)。該裝置優(yōu)選使用一個(gè)或多個(gè)透鏡來(lái)生成樣品的圖像，這些透鏡的排列決定了系統(tǒng)的聚焦和光學(xué)放大率。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)器包括活性檢測(cè)元件的陣列。這些活性檢測(cè)元件優(yōu)選地是以二維方式排列，從而可以同時(shí)獲得被分析樣品的空間信息。檢測(cè)器優(yōu)選包括檢測(cè)元件的陣列，例如至少100，000個(gè)活性檢測(cè)元件，如400，000個(gè)活性檢測(cè)元件或更多， 如1，000，000個(gè)活性檢測(cè)元件或更多，優(yōu)選2，000，000個(gè)活性元件或更多。當(dāng)對(duì)樣品的分析包括測(cè)定樣品中生物顆粒的空間信息時(shí)，通常優(yōu)選的是這樣高數(shù)目的活性檢測(cè)元件。當(dāng)對(duì)樣品的分析包括測(cè)定樣品中生物顆粒的空間信息時(shí)，本發(fā)明的多種優(yōu)選實(shí)施方式包括尺寸小于10 μ m的活性檢測(cè)元件，該尺寸是檢測(cè)元件的長(zhǎng)度、寬度或高度，優(yōu)選活性檢測(cè)元件的尺寸為5μπι或更小，優(yōu)選3μπι或更小。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述裝置包括一用于將激發(fā)光聚焦在樣品上的第一聚焦單元/工具。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該裝置包括一用于將熒光信號(hào)聚焦在檢測(cè)單元上的第二聚焦單元/工具。第一聚焦單元和第二聚焦單元通常是透鏡或透鏡的陣列。本發(fā)明的許多優(yōu)選實(shí)施方式中，聚焦是通過(guò)移動(dòng)第一聚焦單元和/或第二聚焦單元中的一個(gè)或多個(gè)透鏡來(lái)完成。聚焦還保持了基本上固定的裝置長(zhǎng)度，也就是，從樣品所處的焦平面到檢測(cè)單元所處的圖像平面之間的距離。優(yōu)選地，聚焦是通過(guò)記錄預(yù)定結(jié)構(gòu)的一系列圖像來(lái)完成，其中聚焦的點(diǎn)是由那些預(yù)定結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)決定，如尺寸或強(qiáng)度。優(yōu)選地，所述裝置的特征是可以在考慮聚焦變化后再確定或估算視野的面積。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中，第一聚焦單元和第二聚焦單元提供固定的40Χ或更小的光學(xué)放大率，優(yōu)選 20 X或更小，更優(yōu)選IOX或更小。
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本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的是，即使在具有以下多種光學(xué)分析的性能如透射或散射顯微鏡中可變的波長(zhǎng)、熒光顯微鏡中可變的激發(fā)光/發(fā)射光波長(zhǎng)、放大率或聚焦的情況下，該裝置的物理長(zhǎng)度基本上是相同的。以這種方式構(gòu)建的裝置具有相當(dāng)好的機(jī)械優(yōu)勢(shì)，例如更簡(jiǎn)單的生產(chǎn)以及改進(jìn)的機(jī)械穩(wěn)健性。這可以通過(guò)使用一種或多種優(yōu)選設(shè)計(jì)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如光學(xué)組件的選擇，如關(guān)于厚度和/或曲率方面。當(dāng)生產(chǎn)物理長(zhǎng)度固定的裝置時(shí)，通常優(yōu)選的是可以通過(guò)沿光路方向上移動(dòng)一個(gè)光學(xué)組件(如透鏡)來(lái)調(diào)節(jié)聚焦。是否聚焦優(yōu)選是通過(guò)測(cè)量系統(tǒng)中一個(gè)或多個(gè)可視物體的成像性質(zhì)來(lái)確定，例如測(cè)量一個(gè)或多個(gè)物體的圖像的尺寸。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括具有固定光學(xué)放大率的裝置，優(yōu)選低光學(xué)放大率，如小于10倍，如6倍或更小，如4倍或更小，如2倍或更小。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括這樣的裝置，其產(chǎn)生基本上沒(méi)有放大的圖像，換而言之是一比一的圖像。當(dāng)被分析的顆粒尺寸約為20 μ m或更小時(shí)，通常優(yōu)選低光學(xué)放大率。其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，光學(xué)放大率為10倍或更高，如15倍或更高，如20倍或更高。當(dāng)分析小顆粒和/或當(dāng)從顆粒檢測(cè)的信號(hào)很低時(shí)，例如當(dāng)顆粒上可檢測(cè)位點(diǎn)的數(shù)目相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，通常優(yōu)選這些光學(xué)放大率。在這些分析中通常優(yōu)選的光學(xué)放大率介于10和40 倍之間，如15和30倍之間。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，裝置的光學(xué)放大率通過(guò)檢測(cè)器上目標(biāo)的尺寸和目標(biāo)的圖像來(lái)限定，是一個(gè)預(yù)定的量級(jí)。放大率可通過(guò)改變裝置中一個(gè)或多個(gè)單元的位置而改變。優(yōu)選地，通過(guò)移動(dòng)一個(gè)或多個(gè)透鏡來(lái)改變放大率。優(yōu)選地，改變放大率而基本上不改變裝置的長(zhǎng)度，也就是，樣品所處的焦平面到檢測(cè)單元所處的圖像平面之間的距離。裝置通常提供40X或更小的放大率，優(yōu)選20X或更小，更優(yōu)選IOX或更小。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，將激發(fā)光濾光器插到從至少一個(gè)光源發(fā)出的激發(fā)光路中，使激發(fā)光在照射到樣品之前被分成多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)帶。激發(fā)光路是激發(fā)光束的中心到樣品板的路徑。相似地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，將發(fā)射光濾光器插到指向至少一個(gè)檢測(cè)器的發(fā)射光路中，使對(duì)檢測(cè)單元熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)之前，將熒光信號(hào)分離成多個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)帶。發(fā)射光路是指樣品板到檢測(cè)單元的路徑。用于分離激發(fā)光和熒光信號(hào)的激發(fā)光濾光器和發(fā)射光濾光器選自干擾濾光器、吸收濾光器、低通濾光器、高通濾光器和帶通濾光器。在多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，濾光器可以是高通濾光器，即，基本上傳輸大波長(zhǎng)的光而攔截小波長(zhǎng)的光的濾波器，通常優(yōu)選作為熒光顯微鏡的發(fā)射濾光器；低通濾光器，即，基本上傳輸小波長(zhǎng)的光而攔截大波長(zhǎng)的光的濾波器， 通常優(yōu)選作為熒光顯微鏡的激發(fā)濾光器。幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括帶通濾光器，如基本上傳輸一個(gè)波長(zhǎng)帶的光，而更高或更低的波長(zhǎng)都被攔截，當(dāng)被檢測(cè)的系統(tǒng)包含多重激發(fā)和/或發(fā)射可能性時(shí)，通常熒光顯微鏡中優(yōu)選此類濾光器。本系統(tǒng)的多個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，波長(zhǎng)分離工具有助于分析顆粒的兩個(gè)或更多個(gè)性質(zhì)，如鑒別顆?；蚍蛛x兩組或更多組顆粒。優(yōu)選地，根據(jù)波長(zhǎng)性質(zhì)進(jìn)行的此類鑒別或分離，是通過(guò)記錄相同樣品的兩個(gè)或更多個(gè)圖像來(lái)完成，而樣品和樣品的顆粒在所述兩個(gè)或更多個(gè)圖像中基本上是相同的幾何結(jié)構(gòu)，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)圖像反映不同或基本上不同的波長(zhǎng)性質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，波長(zhǎng)分離工具，如濾波器，有助于分析顆粒的兩個(gè)或更多個(gè)性質(zhì)，如鑒別顆?；蚍蛛x兩組或更多組顆粒。優(yōu)選地，根據(jù)波長(zhǎng)性質(zhì)進(jìn)行的此類鑒別或分離，是通過(guò)記錄相同樣品的兩個(gè)或更多個(gè)圖像來(lái)完成，而樣品和樣品的顆粒在所述兩個(gè)或更多個(gè)圖像中基本上是相同的幾何結(jié)構(gòu)，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)圖像反映不同或基本上不同的波長(zhǎng)性質(zhì)。樣品是通過(guò)選擇發(fā)射光濾光器和激發(fā)光濾光器，用兩種或更多種激發(fā)和發(fā)射波帶的組合進(jìn)行分析。這些組合允許至少一個(gè)激發(fā)或發(fā)射光濾光器分別在兩種或更多種組合中使用。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選地，當(dāng)記錄熒光信息時(shí)，發(fā)射光濾光器是設(shè)在被分析樣品與激發(fā)光源相對(duì)的那面。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式包括用于熒光分析的光學(xué)系統(tǒng)，其中激發(fā)單元和檢測(cè)單元分別放置在樣品板兩側(cè)，如傳輸熒光；相反的排列方式是將激發(fā)光裝置和檢測(cè)裝置位于樣品板同側(cè)，并通過(guò)鏡子和/或透鏡將激發(fā)光和發(fā)射光傳輸?shù)綐悠飞希缏渖錈晒怙@微鏡系統(tǒng)。多個(gè)實(shí)施方式中優(yōu)選這種傳輸熒光系統(tǒng)，其通常提供更簡(jiǎn)單的機(jī)械和/或光學(xué)設(shè)置。雖然通常優(yōu)選的是將激發(fā)源和檢測(cè)器直接對(duì)齊排列，也可以實(shí)施其他實(shí)施方式，包括基本上對(duì)齊排列，例如與平行排列的線相比發(fā)散大致小于10度。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)記錄兩個(gè)或更多個(gè)圖像來(lái)分析產(chǎn)生多種空間信息的樣品，如多種波長(zhǎng)的熒光的發(fā)射，其中每個(gè)記錄的圖像基本上包含了所有考慮之中的波長(zhǎng)，但優(yōu)選以不同的強(qiáng)度。獲得上述效果的一個(gè)優(yōu)選方式是在光路上采用空間調(diào)節(jié)工具， 優(yōu)選采用干涉儀，如Michelson干涉儀。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中包括將光分離成兩個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)組分的工具，所述工具包括調(diào)節(jié)光的工具，如Michelson和/或Fabry-Perrot干涉儀。多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式還包括調(diào)節(jié)工具，如干涉儀，所述調(diào)節(jié)通過(guò)改變光程差產(chǎn)生。優(yōu)選所述光程差很小，如小于 800 μ m，如400 μ m或更小，優(yōu)選200 μ m或更小，更優(yōu)選IOOym或更小。本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，基于有限的波長(zhǎng)分辨率，調(diào)節(jié)工具的光程差小于 100 μ m，如80 μ m或更小，優(yōu)選40 μ m或更小。本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，基于適度的波長(zhǎng)分辨率，光程差為20 μ m至200 μ m,優(yōu)選40 μ m至100 μ m。在多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用調(diào)節(jié)工具可獲得的波長(zhǎng)分辨率不大于10nm，如20nm或更小，如40nm，或小到80nm ；分辨率被定義為能被充分分離的最小波長(zhǎng)差。優(yōu)選的分離光的調(diào)節(jié)工具可以在幾乎任何光程差下獲得調(diào)節(jié)光的圖像，當(dāng)表示調(diào)節(jié)工具的光程差時(shí)，優(yōu)選地，定位的準(zhǔn)確度和分辨率優(yōu)于1 μ m，如0. 5 μ m或更好，優(yōu)選 0. 1 μ m或更好，更優(yōu)選0. 02 μ m或更好。在任意給定的光程差下，調(diào)節(jié)工具可以基本上將光程差維持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，優(yōu)選維持的時(shí)間與檢測(cè)器的暴露時(shí)間差不多，如基本上將光程差維持在Ims或更大，如IOms或更大，優(yōu)選50ms或更大，更優(yōu)選IOOms或更大。在被檢測(cè)光的強(qiáng)度很低的實(shí)施方式中，優(yōu)選調(diào)節(jié)工具可基本上將光程差維持在 200ms或更大，如400ms或更大，優(yōu)選600ms或更大，更優(yōu)選800ms或更大。當(dāng)調(diào)節(jié)工具中包括用于移動(dòng)一個(gè)或多個(gè)光學(xué)組件的工具時(shí)，如鏡子或分束器，優(yōu)選用一個(gè)或多個(gè)壓電致動(dòng)器來(lái)實(shí)現(xiàn)所述移動(dòng)。當(dāng)用調(diào)節(jié)工具測(cè)定光的波長(zhǎng)性質(zhì)時(shí)，在不同調(diào)節(jié)下記錄的圖像數(shù)量與感興趣的不
28同波長(zhǎng)帶數(shù)量相當(dāng)，優(yōu)選圖像數(shù)量大于不同波長(zhǎng)帶的數(shù)量，如是波長(zhǎng)帶數(shù)的2倍，優(yōu)選為波長(zhǎng)帶數(shù)的3或4倍。本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，不同調(diào)節(jié)下記錄的圖像數(shù)量是感興趣的波長(zhǎng)帶數(shù)的4倍以上，如8倍或更大，優(yōu)選10倍或更大。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，使用致動(dòng)器來(lái)移動(dòng)樣品板和/或至少一個(gè)單元以調(diào)節(jié)樣品發(fā)射的光。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，記錄了相同樣品的兩個(gè)或更多個(gè)圖像，顯示了不同的光譜性質(zhì)，如熒光的發(fā)射，其中被記錄的圖像中物體所處位置在所述至少兩個(gè)圖像中大致是相同的。當(dāng)在不同光譜波長(zhǎng)下記錄圖像時(shí)，如當(dāng)記錄熒光強(qiáng)度時(shí)，通過(guò)結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)代表了不同或基本上不同光譜波長(zhǎng)的圖像信息，可以使不同的光譜信息與特定物體或顆粒聯(lián)系起來(lái)。使用濾波器分離光譜波長(zhǎng)時(shí)，難以獲得這種特征，除非在濾波器的定位和準(zhǔn)直上下大功夫，因?yàn)檎凵渎什煌ǔ?dǎo)致偏差，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式采用濾波器選擇工具，其操作準(zhǔn)確度高，優(yōu)選地是通過(guò)采用小公差的機(jī)械工具獲得。一種優(yōu)選的抵消光譜偏差的方法是以一種預(yù)定方式改變一個(gè)或多個(gè)光學(xué)組件(如透鏡或檢測(cè)器)或樣品的位置，從而在記錄代表兩個(gè)或更多個(gè)光譜性質(zhì)的圖像時(shí)，減少或抵消位置的改變。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，使用圖像準(zhǔn)直單元。圖像準(zhǔn)直單元將顯示不同光譜信息的多個(gè)圖像生成一準(zhǔn)直的圖像，這些圖像得自于不同或基本上不同的發(fā)射條件下獲得的樣品的多個(gè)熒光信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該裝置進(jìn)一步包括至少兩種不同的發(fā)射濾光器，可以過(guò)濾顆粒向檢測(cè)器發(fā)射的信號(hào)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中，該裝置包括至少4 個(gè)不同發(fā)射濾光器，如至少6個(gè)不同發(fā)射濾光器，如至少10個(gè)不同發(fā)射濾光器，如至少15 個(gè)不同發(fā)射濾光器，如至少20個(gè)不同發(fā)射濾光器。當(dāng)用兩種或更多種發(fā)射或傳輸波帶分析同一樣品或樣品材料時(shí)，優(yōu)選包括圖像準(zhǔn)直方法。圖像準(zhǔn)直在兩種不同或基本上不同的發(fā)射條件下生成樣品或樣品材料的準(zhǔn)直圖像，其中所述準(zhǔn)直圖像中物體位置的差異小于10像素，如8像素或更小，如4像素或更小， 優(yōu)選甚至是2像素或更小，以物體位置的平均差異來(lái)測(cè)定。圖像準(zhǔn)直可以通過(guò)對(duì)收集的圖像進(jìn)行預(yù)定轉(zhuǎn)換，將收集到的圖像轉(zhuǎn)換為準(zhǔn)直圖像來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述預(yù)定轉(zhuǎn)換是通過(guò)測(cè)量包含物體的圖像從而使收集的圖像中產(chǎn)生可鑒別的結(jié)構(gòu)來(lái)導(dǎo)出，，其中所述物體在所述不同發(fā)射條件下收集的圖像中是可見(jiàn)的，并且在獲得代表所述不同發(fā)射條件的兩個(gè)或更多個(gè)圖像期間，會(huì)維持它們的位置或相對(duì)位置。不準(zhǔn)直相對(duì)簡(jiǎn)單一點(diǎn)，如主要是位置移動(dòng)，優(yōu)選使用與圖像的兩個(gè)坐標(biāo)中的每一個(gè)相關(guān)的變量，如移動(dòng)變量。然而，如果不準(zhǔn)直包括放大率的變化，通常優(yōu)選使用與兩個(gè)坐標(biāo)中的每一個(gè)相關(guān)的單獨(dú)的變量，如一個(gè)方向上是一放大率因子，另一個(gè)方向上是另一放大率因子。其它同樣優(yōu)選的實(shí)施例進(jìn)一步包括與兩個(gè)方向都相關(guān)的變量，如根據(jù)圖像中的位置而確定的反映移動(dòng)和/或放大率的變量。通常，轉(zhuǎn)換基本上是指移動(dòng)轉(zhuǎn)換，優(yōu)選地所述轉(zhuǎn)換可以表示為圖像水平和/或垂直方向上確定數(shù)量的像素的移動(dòng)。移動(dòng)轉(zhuǎn)換中移動(dòng)的程度基本上取決于其在圖像中的位置，優(yōu)選地其中水平和/ 或垂直移動(dòng)定義為恒定的移動(dòng)，而變化的移動(dòng)被確定為圖像像素指數(shù)的一部分。將水平和 /或垂直方向上的移動(dòng)程度表示為圖像像素指數(shù)的多項(xiàng)式函數(shù)。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，使用控制單元將樣品板/樣品支架移動(dòng)到與檢測(cè)視野相對(duì)應(yīng)的預(yù)定位置上。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，激發(fā)光單元和檢測(cè)單元放置在樣品板的兩側(cè)。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，激發(fā)光單元和檢測(cè)單元放置在樣品板的同一側(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)單元連接了一個(gè)處理器，以接收來(lái)自檢測(cè)單元的熒光信號(hào)的信號(hào)數(shù)據(jù)，處理該信號(hào)數(shù)據(jù)，將該信號(hào)數(shù)據(jù)與要評(píng)估的參數(shù)相關(guān)聯(lián)，并對(duì)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估。該裝置進(jìn)一步包括一種工具，用于控制獲得相同體積的樣品至少兩個(gè)圖像，其中所述兩個(gè)圖像的信息代表不同的光譜波長(zhǎng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供對(duì)含有液體樣品的樣品支架的可變厚度的補(bǔ)償，優(yōu)選當(dāng)樣品的厚度對(duì)所進(jìn)行的分析的結(jié)果產(chǎn)生影響時(shí)，如測(cè)定單位樣品體積的顆粒數(shù)量。這可以這樣完成對(duì)樣品支架、或與樣品支架相連接的部分進(jìn)行標(biāo)識(shí)，或者以任何形式將與樣品支架的物理尺寸相關(guān)的信息與樣品支架中樣品的每次測(cè)量相關(guān)聯(lián)。尤其是，對(duì)樣品支架中兩個(gè)或更多個(gè)分離的或部分分離的位置進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選地，可能要考慮分離位置的厚度差異。測(cè)定每單位體積樣品的顆粒數(shù)量時(shí)，需要確定被分析樣品的體積。因此，本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方式包括一工具，用于記錄信息和/或測(cè)定與樣品支架的至少一個(gè)尺寸相關(guān)的特性，特別是樣品支架中面向檢測(cè)器方向上的樣品厚度。厚度相關(guān)的信息的記錄優(yōu)選地包括讀取反映尺寸特性(如厚度)預(yù)定值的標(biāo)識(shí)。優(yōu)選地，可以通過(guò)裝置中一個(gè)或多個(gè)感應(yīng)器讀取所述標(biāo)識(shí)，通常所述標(biāo)識(shí)是一種信息表示模式，如二進(jìn)制碼或條型碼信息。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式可以對(duì)樣品支架的兩個(gè)或更多個(gè)部分進(jìn)行分析，優(yōu)選地是為了增加分析的總量和/或獲得被分析的樣品的更好表征，再優(yōu)選地，該標(biāo)識(shí)能反映樣品支架兩個(gè)或更多個(gè)部分的物理尺寸。本發(fā)明另外的實(shí)施方式包括用于測(cè)定樣品支架的物理尺寸的工具，優(yōu)選地可以在樣品支架的一個(gè)或多個(gè)預(yù)定位置進(jìn)行所述測(cè)定。本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式使用一第一標(biāo)識(shí)檢測(cè)器讀取標(biāo)識(shí)和/或測(cè)定物理尺寸，所述第一標(biāo)識(shí)檢測(cè)器優(yōu)選與用于檢測(cè)樣品圖像以分析顆粒的檢測(cè)器相同。優(yōu)選至少一個(gè)記錄的或測(cè)定的參數(shù)具有最小刻度，并且，當(dāng)表示為所述參數(shù)典型值的分?jǐn)?shù)時(shí)，刻度的等級(jí)為10%或更小，優(yōu)選8%或更小，更優(yōu)選6% 或更小，更優(yōu)選4 %或更小，更優(yōu)選2 %或更小。在多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述刻度是等分等級(jí)，在其它同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述刻度實(shí)質(zhì)上是非等分的，如等級(jí)大小基本上與所述參數(shù)相關(guān)的相對(duì)尺寸相同。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供能夠測(cè)定含有被分析樣品的樣品支架的類型的工具。優(yōu)選所述測(cè)定是通過(guò)讀取識(shí)別所述樣品支架類型的標(biāo)識(shí)和/或檢測(cè)所述樣品支架的形狀、大小或其它物理特性來(lái)完成。所述檢測(cè)優(yōu)選用一第二標(biāo)識(shí)檢測(cè)器完成，優(yōu)選所述第二標(biāo)識(shí)檢測(cè)器與用于檢測(cè)樣品圖像以分析顆粒的檢測(cè)器相同。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種樣品支架，其適用于支撐兩種或更多種不同類型的樣品器具，而很少調(diào)整或者不用調(diào)整。所述樣品器具之一是傳統(tǒng)的顯微鏡載玻片、 或血球計(jì)數(shù)室，如BUchner計(jì)數(shù)室。優(yōu)選地，將不同樣品器具放置在同一樣品器具支架上或內(nèi)，優(yōu)選的樣品器具支架是可移動(dòng)的，且所述樣品器具支架的移動(dòng)是由控制工具控制，控制工具能夠根據(jù)使用的樣品器具的類型引導(dǎo)該樣品器具支架。本發(fā)明另一實(shí)施方式中，樣品支架由控制單元控制，使用檢測(cè)單元來(lái)監(jiān)測(cè)或感應(yīng)與被分析樣品和/或使用的樣品器具相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)信息。優(yōu)選地，感應(yīng)的信息是識(shí)別樣品中的顆?；驑悠分蓄w粒的特性和/或樣品支架或樣品支架的特性的信息。優(yōu)選地，控制單元將樣品支架移動(dòng)到與檢測(cè)單元視野相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)預(yù)定位置，從而可以感應(yīng)一個(gè)或多個(gè)信息。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，被感應(yīng)的信息是靜態(tài)信息，也就是說(shuō)在整個(gè)分析過(guò)程中該信息不會(huì)發(fā)生改變，例如標(biāo)志的讀數(shù)，其表示樣品支架的預(yù)定尺寸特性。然而，在其它實(shí)施方式中，被感應(yīng)的信息是動(dòng)態(tài)信息，例如樣品的運(yùn)動(dòng)或樣品支架某部分的運(yùn)動(dòng)，或?qū)悠返哪骋换瘜W(xué)和/或物理性質(zhì)的指示。本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，加強(qiáng)了通過(guò)檢測(cè)單元檢測(cè)到的熒光信號(hào)的分辨率，其中被測(cè)熒光信號(hào)的分辨率是用來(lái)代表被測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的顯著不同的間隔數(shù)。通過(guò)對(duì)樣品中實(shí)質(zhì)上只是兩個(gè)或更多個(gè)圖像所代表的差異有信號(hào)敏感性的這兩個(gè)或更多個(gè)圖像進(jìn)行記錄， 本發(fā)明可以檢測(cè)分辨率比檢測(cè)單元(包括電檢測(cè)工具)的標(biāo)稱分辨率更高的信號(hào)，優(yōu)選地通過(guò)改變暴露時(shí)間和/或收集的信號(hào)的電性放大，然后將這兩個(gè)或更多個(gè)圖像以一種方式合并成一個(gè)或多個(gè)圖像來(lái)獲得，其代表著樣品的圖像具有的分辨率比兩個(gè)或更多個(gè)收集的圖像中的每一個(gè)都要高。因此，通過(guò)在至少兩個(gè)圖像中提供不同信號(hào)靈敏度來(lái)加強(qiáng)被測(cè)信號(hào)的分辨率。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種評(píng)估顆粒的系統(tǒng)，所述評(píng)估包括兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的任務(wù)，其中所述任務(wù)以預(yù)設(shè)方式執(zhí)行，并且該預(yù)定方式包括多個(gè)指令。優(yōu)選地所述指令可以以靈活的方式結(jié)合，使該系統(tǒng)適于執(zhí)行兩種或更多種類型的顆粒評(píng)估，其中類型的不同優(yōu)選地反映性質(zhì)的不同，如時(shí)間、激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)的選擇。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種裝置，包括鑒別被分析樣品并存儲(chǔ)所收集的圖像的方法，以及操作圖像記錄系統(tǒng)的方法。存儲(chǔ)的圖像可排列在數(shù)據(jù)庫(kù)里，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索以便生成報(bào)告和/或基于一種或多種性質(zhì)來(lái)選擇一個(gè)或多個(gè)收集的圖像。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述裝置的樣品器具可以是一種瓶狀容器，有助于通過(guò)測(cè)定單位體積的細(xì)胞數(shù)(總數(shù)和無(wú)活力的細(xì)胞數(shù))從大量培養(yǎng)的細(xì)胞和原代細(xì)胞中測(cè)定細(xì)胞懸浮液的活力。通過(guò)按壓活塞將細(xì)胞懸浮液的樣品引入樣品器具中，以便測(cè)定細(xì)胞活力。樣品器具的內(nèi)部用熒光染料吖啶橙和4'，6 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/DAPI的取代變體包被， AO和DAPI/DAPI的取代變體二者的終濃度為2. 5 μ g/ml。AO對(duì)所有的細(xì)胞群染色，而DAPI/ DAPI的取代變體染色無(wú)活力的細(xì)胞。將樣品器具放置在該裝置上，測(cè)定細(xì)胞數(shù)和活力。吖啶橙和DAPI的組合適用于測(cè)定細(xì)胞和組織的活力，因?yàn)檫@兩種DNA染料在任何情況下都不會(huì)顯示重疊的光譜。在一種分析方法中，用這兩種熒光染料培養(yǎng)懸浮液中的細(xì)胞。吖啶橙滲透群落中的所有細(xì)胞而DAPI只滲透膜損傷的細(xì)胞。用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞通過(guò) UV激發(fā)并測(cè)量藍(lán)光來(lái)檢測(cè)，而吖啶橙標(biāo)記的細(xì)胞則通過(guò)藍(lán)光激發(fā)并測(cè)量發(fā)射的綠光來(lái)檢測(cè)。以這種方式，可以從數(shù)據(jù)中獲得絕對(duì)細(xì)胞數(shù)和活力百分比。另外，檢測(cè)吖啶橙發(fā)射的紅光可進(jìn)一步獲得關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)、活力和完整性的信息。本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，也可使用其他吖啶染色劑，如3，6_ 二氨基吖啶鹽酸鹽、6，9_ 二氨基-2-乙氧基-吖啶乳酸鹽、喹吖因二鹽酸鹽、雙-N-甲基吖啶-硝酸鹽、 10-十二烷基-吖啶橙溴、氮芥喹丫因、鹽酸氮蒽黃和9-異硫氰酸-10-甲基吖啶酯三氟甲磺酸鹽(9-isothiocyanato-10-methyl acridinium triflate)、以及 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/DAPI的取代變體，組合濃度為2. 5 μ g/ml。本發(fā)明的另一方面，提供一種用上述裝置檢測(cè)受試細(xì)胞的活力的方法。所述方法包括將受試細(xì)胞與4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/或DAPI的取代變體混合；使
31細(xì)胞染色一段時(shí)間，最多為60分鐘，如30分鐘、如20分鐘，如最多10分鐘；獲得染色的細(xì)胞樣品，其中只有無(wú)活力的細(xì)胞被染色；將被染色的受試細(xì)胞暴露于激發(fā)光；檢測(cè)來(lái)自被染色的受試細(xì)胞的熒光信號(hào)；以及處理熒光信號(hào)以鑒別該受試細(xì)胞是否無(wú)活力。本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，受試細(xì)胞也包括多種細(xì)胞。通過(guò)使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/或DAPI的取代變體，鑒別多種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和無(wú)活力性。受試細(xì)胞選自培養(yǎng)的細(xì)胞和原代細(xì)胞。受試細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系，如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。在可控的環(huán)境下制備受試細(xì)胞，如實(shí)施例中材料和方法部分所示。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，將吖啶橙染料與4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 染料/DAPI的取代變體混合，組合濃度為2. 5 μ g/ml。用AO染料與DAPI染料/DAPI的取代變體的組合對(duì)樣品器具進(jìn)行包被，試驗(yàn)樣品注入/裝入樣品器具中?？纱婊畹氖茉嚰?xì)胞和無(wú)活力的受試細(xì)胞均用吖啶橙染料染色。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，用活塞將受試細(xì)胞注入/裝入樣品器具中。激發(fā)光來(lái)自光源，光源選自熱光源，如鹵素?zé)?、或氣體燈，如氙氣燈、發(fā)光二極管、 激光或激光二極管或如上文裝置部分所述的任何其它光源。熒光信號(hào)是通過(guò)分析細(xì)胞中無(wú)活力的細(xì)胞數(shù)的熒光信號(hào)來(lái)處理。此方法是用一種標(biāo)記受試細(xì)胞的裝置來(lái)進(jìn)行。所述裝置包括一樣品器具，且至少部分樣品器具用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/DAPI的取代變體包被，其中 DAPI/DAPI的取代變體只能染色無(wú)活力的細(xì)胞；一受試細(xì)胞注入單元，用于將受試細(xì)胞裝入樣品器具；一激發(fā)單元，用于將注入的受試細(xì)胞暴露在激發(fā)光下；一檢測(cè)單元，用于將檢測(cè)裝入的受試細(xì)胞所發(fā)射的熒光信號(hào)；以及一處理器，用于處理熒光信號(hào)以評(píng)估該試驗(yàn)物是否無(wú)活力。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種利用上述照射裝置和檢測(cè)裝置提供有關(guān)細(xì)胞信息的方法。所述方法包括用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸轉(zhuǎn)染該細(xì)胞；向轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入巰基反應(yīng)分子以獲得細(xì)胞溶液；將細(xì)胞溶液暴露在激發(fā)光下；檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞溶液的發(fā)射光；以及處理發(fā)射光以獲得有關(guān)細(xì)胞的信息。此方法使用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸，結(jié)合巰基反應(yīng)分子，如馬來(lái)酰亞胺(如， DACM)和細(xì)胞不滲透性DNA染色劑(如，碘化丙啶)，以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率，并且同時(shí)提供有關(guān)細(xì)胞群的活力和細(xì)胞毒性水平的信息。信息通常包括轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和毒性水平，即檢測(cè)無(wú)活力的細(xì)胞。細(xì)胞選自培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞。細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系，如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。此方法進(jìn)一步包括混合細(xì)胞不滲透性DNA染色劑。細(xì)胞不滲透性DNA染色劑可以是碘化丙啶和吖啶同源二聚體。核酸選自熒光蛋白和小干擾RNA。巰基反應(yīng)分子是馬來(lái)酰亞胺，如DACM。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞包括多種細(xì)胞。另外，用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸以及巰基反應(yīng)分子相結(jié)合來(lái)鑒別有關(guān)多種細(xì)胞的信息。激發(fā)光來(lái)自光源，光源選自熱光源，如鹵素?zé)?、或氣體燈，如氙氣燈、發(fā)光二極管、激光或激光二極管或如上文裝置部分所述的任何其它光源。本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)以碘化丙啶作為細(xì)胞不滲透性DNA染色劑時(shí)，檢測(cè)無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光是綠光而發(fā)射光是紅光。而當(dāng)以吖啶同源二聚體作為細(xì)胞不滲透性DNA 染色劑時(shí)，檢測(cè)無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光是藍(lán)光而發(fā)射光是綠光。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)用UV或紫光激發(fā)時(shí)表達(dá)BFP的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光；當(dāng)用紫光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)表達(dá)CFP的細(xì)胞發(fā)出青光；當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)表達(dá)GFP的細(xì)胞發(fā)出綠光； 當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)表達(dá)YFP的細(xì)胞發(fā)出黃光；當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)表達(dá)dsRed或其變體的細(xì)胞發(fā)出紅光；當(dāng)用UV或紫光激發(fā)時(shí)含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光；當(dāng)用紫光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出青光；當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出綠光；當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出黃光；而當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出紅光。檢測(cè)包括在至少一個(gè)檢測(cè)器上接收發(fā)射光，而處理包括分析發(fā)射光以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性水平。用一種裝置實(shí)施上述方法，該裝置用于測(cè)定有關(guān)細(xì)胞的信息。所述裝置包括一轉(zhuǎn)染單元，用于以熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞；一混合單元，用于將巰基反應(yīng)分子加入到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中以獲得細(xì)胞溶液；一激發(fā)單元，用于將細(xì)胞溶液暴露在激發(fā)光下；一檢測(cè)單元，用于檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞溶液的發(fā)射光電；以及一處理器，用于處理發(fā)射光以獲得有關(guān)細(xì)胞的信息。本發(fā)明的裝置和方法是用于分析樣品中的顆粒。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快捷且靈活的裝置用于在低放大率下分析細(xì)胞，據(jù)此表征細(xì)胞、檢測(cè)細(xì)胞、計(jì)數(shù)細(xì)胞以及測(cè)定細(xì)胞活力、能動(dòng)性、代謝活性、代謝量、細(xì)胞分裂、增殖、健康、壓力水平、凋亡、壞死、細(xì)胞的其它情況或形態(tài)。此類分析的多種實(shí)施例如下文所示，以更好地了解本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1、使用傳統(tǒng)裝置聚焦照射光(參考圖1)圖IA是一種虛擬光源，顯示了光發(fā)射元件(101)的主要結(jié)構(gòu)，包括4個(gè)方形的均勻發(fā)光區(qū)域，被無(wú)源元件(10 分隔并包圍，無(wú)源元件發(fā)出的光不可檢測(cè)。光源大小 1 X Imm,其發(fā)射光角度為+40至-40度(deg)。圖IB顯示了一種模仿使用光源(103，與101相同)照射樣品材料的排列方式。 圖中顯示雙凸非球面透鏡(104)，其焦距為f = 8. 5mm和直徑D = 12mm(可以購(gòu)自Melles Griot LAG000)。該系統(tǒng)進(jìn)一步包括濾光器元件(105)，通常用于熒光分析，以便去除預(yù)期的發(fā)射光波長(zhǎng)之處的光。最后該系統(tǒng)包括平凸透鏡(106)，其焦距為f = 12mm和直徑D = 12mm(可以購(gòu)自Edmund Optice part no 45084)，最后是被照射的樣品材料(107)。圖IB顯示隨機(jī)選擇的數(shù)種射線并顯示這些射線通過(guò)該系統(tǒng)的路徑。圖IC顯示會(huì)出現(xiàn)在樣品材料上的光源的模擬圖像。圖IC顯示的光源與圖IA高度相似，其發(fā)射結(jié)構(gòu)易于鑒定。如果要抑制或消除所述結(jié)構(gòu)，必須使用擴(kuò)散工具，例如使用漫射器。這會(huì)影響圖像的大小并產(chǎn)生“模糊”，導(dǎo)致照射范圍擴(kuò)大從而損失有效光和/或降低照射光的均勻性。實(shí)施例2、用微透鏡陣列聚焦照射光(參考圖2)圖2A顯示與實(shí)施例1的系統(tǒng)相似的一種模擬照射樣品材料的排列方式，其中增加了微透鏡陣列006)。該系統(tǒng)包括與圖IA相同的光源001)，雙凸非球面透鏡002)，濾波器元件003)，平凸透鏡004)，最后是被照射的樣品材料005)。
微透鏡陣列Q06)的直徑為12mm，并且外接方形(12 X 12mm)被劃分成60X44的矩形相鄰的對(duì)稱的雙凸透鏡元件，透鏡厚度為1. 191mm，透鏡半徑分別為0. 4mm和-0. 4mm, 每個(gè)單個(gè)透鏡元件產(chǎn)生一個(gè)光源的小圖像，并且當(dāng)所有單個(gè)的小圖像疊加到樣品上時(shí)，則呈現(xiàn)一個(gè)均勻照射的矩形形狀。用該系統(tǒng)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的模擬，結(jié)果如圖2B所示，其中顯示了樣品材料的照射。圖2B中光源結(jié)構(gòu)基本上被去除，基本上沒(méi)有因擴(kuò)大照射而引起照射效率的損失。當(dāng)進(jìn)行光致發(fā)光分析，如熒光分析時(shí)，高度優(yōu)選這些特性。實(shí)施例3、照射的比較(參考圖3)圖3顯示當(dāng)使用具有復(fù)雜照射結(jié)構(gòu)的光源時(shí)，簡(jiǎn)單照射和本發(fā)明照射之間的區(qū)別。比較是基于上述實(shí)施例1和2的結(jié)果。圖3顯示如實(shí)施例1和實(shí)施例2所發(fā)現(xiàn)且如圖IC和圖2B所示，沿著圖中箭頭表示的橫線的照射強(qiáng)度。實(shí)施例1的照射用線條301表示，實(shí)施例2的照射用線條302表示。線條303表示由光系統(tǒng)的放大率限定的照射范圍。圖中顯示，線條302超越范圍303的程度小于線條301，它將產(chǎn)生更高的照射效率。 此外，從光源發(fā)射結(jié)構(gòu)考慮，線條302在范圍303內(nèi)的變化顯著小于線條301的變化，變化表現(xiàn)為中心照射明顯下降且朝向范圍邊界的強(qiáng)度也顯著下降。實(shí)施例4、本發(fā)明的實(shí)施方式(參考圖4)圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式。它顯示了光學(xué)系統(tǒng)，包括光源001)， 如 MLlOl J17-01 (Mitsubishi,日本)，LZ1-00X X 005 或 LZ1-00X X 03 (LedEngin, USA)， 具體地，光源的選擇取決于所期望的波長(zhǎng)區(qū)域和強(qiáng)度。此外，它包括準(zhǔn)直透鏡002)，如 LAG000 (Melles Griot, USA)；微透鏡的陣列003)，如雙面透鏡陣列元件；光譜濾波器工具 004)，通常是干擾和/或吸收濾光器，在熒光分析中將該濾光器稱為激發(fā)濾光器；最后還包括聚焦組件G05)，如有效焦距在2和20mm之間的PCXXog DCX透鏡，其中改變焦距會(huì)影響光源的照射區(qū)域。最后還顯示了照射板G06)，優(yōu)選以相對(duì)高的照射效率將來(lái)自光源的相對(duì)均勻的光投射到照射板上，如照射區(qū)上。圖4B是本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其中畫出模擬光線，表明該系統(tǒng)的光學(xué)操作。實(shí)施例5、照射區(qū)的改變(參考圖5)圖5顯示了本發(fā)明照射工具的照射。圖5A和圖5B的區(qū)別顯示了減小聚焦元件 (圖4中的405)的焦距從而影響照射區(qū)的有效尺寸的作用。實(shí)施例6、微透鏡元件(參考圖6)圖6顯示了本發(fā)明的微透鏡陣列元件。圖6A顯示的元件是一種熱塑型的，包括用于排列和固定元件的工具(601)，此處是環(huán)狀邊緣的形式，以及兩個(gè)微透鏡陣列(602)，其中未顯示底部的那個(gè)陣列。每個(gè)微透鏡陣列由多個(gè)半徑為1. 7mm的1. 2X0. 9mm的透鏡組成，間隔約5mm，這也是微透鏡元件的厚度。微透鏡的模式是13X9網(wǎng)格，如圖6B所示，大體上呈圓形形狀，優(yōu)選類似光束的形狀，通過(guò)從每個(gè)角落去除5個(gè)透鏡，減小物理尺寸。實(shí)施例7、光學(xué)模塊的排列(參考圖7)本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方式包括兩個(gè)或更多個(gè)光學(xué)模塊，圖7顯示了這些模塊的排列。該模塊是照射模塊(701)，樣品或樣品室(702)，檢測(cè)模塊(703)和光鏡(704)。圖7A顯示一種優(yōu)選的實(shí)施方式，包括照射、樣品和檢測(cè)模塊，其中所有模塊以相互之間軸平行的方式排列。照射模塊，通常包括光源、聚焦光學(xué)器件和波長(zhǎng)分離工具(這些物件均未在圖中顯示)，使光照射于樣品室上，其中樣品通常排列在垂直于調(diào)節(jié)模塊的發(fā)射光的主光軸方向上。通常樣品室以全方位發(fā)射信號(hào)，但其中的部分信號(hào)會(huì)被檢測(cè)模塊收集， 檢測(cè)模塊位于或基本上位于與照射模塊和樣品室相同的軸上。圖7B顯示本發(fā)明另一種同樣優(yōu)選的實(shí)施方式，通過(guò)光鏡將來(lái)自樣品室的信號(hào)導(dǎo)向檢測(cè)模塊。本實(shí)施方式使檢測(cè)模塊位于在照射和樣品室模塊之間形成的光軸之外，如圖 7B所示，檢測(cè)模塊是以垂直方式排列。由于圖7只是顯示了不同模塊的大體定位，而不是不同元件的位置，顯然對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，當(dāng)用光鏡引導(dǎo)光偏離光軸時(shí)，通常有利的是在檢測(cè)模塊中包括一光學(xué)組件，如在樣品室和光鏡之間的一個(gè)或多個(gè)透鏡。通常此類排列的作用是確保從樣品室發(fā)射的、在檢測(cè)模塊中檢測(cè)的光更為平行，使更為均勻的光反應(yīng)呈現(xiàn)波長(zhǎng)依賴特征，如過(guò)濾，和/ 或通過(guò)在靠近圖像處放置一個(gè)收集光學(xué)器件，增加檢測(cè)模塊的有效光圈。本發(fā)明的實(shí)施方式包括兩個(gè)或更多個(gè)檢測(cè)模塊，例如通過(guò)將圖7A和B中所示的排列相結(jié)合。這通常是通過(guò)包括一個(gè)帶有波長(zhǎng)依賴性反射特性的光鏡來(lái)完成，使得波長(zhǎng)不同， 反射/透射特性顯著不同。此類實(shí)施方式可同時(shí)檢測(cè)樣品室模塊中的樣品的兩種或更多種光學(xué)特性。實(shí)施例8、懸浮液中細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性Jurkat(JM)細(xì)胞(一種T淋巴細(xì)胞系)(參考圖8、9和10)材料與方法、將Jurkat (JM)細(xì)胞用 RPMI Qnvitogen, #61870)補(bǔ)以 10% 熱-失活的胎牛血清anvitogen，#10108-165)，于37 °C、含5 % (X)2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。 Jurkat(JM)細(xì)胞(細(xì)胞密度為1.4X106，用所述裝置測(cè)得活力為98% )上樣到含有熒光染料吖啶橙(AO)和4'，6 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的樣品器具中。樣品器具置于該裝置中，并用該裝置進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。為了展示DAPI具有染色死細(xì)胞且只能染色死細(xì)胞的功能，將細(xì)胞的碘化丙啶(PI)染色與DAPI—起使用。PI是膜不滲透性的因此被排除于活細(xì)胞之外。用Olympus 1X50熒光顯微鏡分析染色的細(xì)胞。用Lumenera CXD照像機(jī)及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件捕獲圖像。用U-MNUA2(UV帶通，330-385nm)濾光塊(Olympus)檢測(cè)DAPI熒光，并用U-MWG2 (綠色長(zhǎng)通)濾光塊(Olympus)檢測(cè)PI熒光。結(jié)果、AO和DAPI都可快速使Jurkat細(xì)胞染色，分別染色所有細(xì)胞和無(wú)活力的細(xì)胞，從而可以測(cè)定細(xì)胞群的活力。用DAPI和PI雙重染色顯示它們可以對(duì)相同的細(xì)胞染色， 從而確定DAPI可以用作無(wú)活力細(xì)胞的染色劑。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)期間(15分鐘以上) DAPI也可以使部分PI陰性種群染色。另外，在熒光顯微鏡中在相差和UV濾波器下觀察細(xì)胞，檢測(cè)DAPI染色的細(xì)胞，清楚顯示了相差下看似死亡的細(xì)胞也是呈DAPI陽(yáng)性的，因此為死細(xì)胞。實(shí)施例9、粘附細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力；HEK293細(xì)胞(一種人胚胎腎細(xì)胞系)(參考圖8A)材料與方法、HEK293細(xì)胞用DMEMQnvitogen, #31966)補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清anvitogen，#10108-165)，于37°C、含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下生長(zhǎng)。當(dāng)克隆率為50%時(shí)用0. 5ml胰蛋白酶(Invitogen, #25300)收獲并用5ml培養(yǎng)基(DMEM+10% FCS)中和。細(xì)胞上樣到含有熒光染色劑吖啶橙(AO)和4'，6 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的樣品器具，并且將盒子置于裝置中。用該裝置及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。益里、相對(duì)于Jurkat細(xì)胞，HEK293細(xì)胞立即被AO和DAPI染色，它們分別使所有細(xì)胞群和無(wú)活力細(xì)胞染色，從而測(cè)定細(xì)胞群的活力。實(shí)施例10、昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力；S2和Sf9細(xì)胞系(參考圖8A)Drosophila melanogaster Schneider-2 (S2)細(xì)胞系最初來(lái)自 Drosophila胚胎晚期，Sf9細(xì)胞系最初來(lái)自Fall armyworm Spodoptera frugiperdar的蛹卵巢組織。材料與方法、S2和Sf9細(xì)胞分別在khneider的Drosophila培養(yǎng)基(Invitogen, #21720)和Grace的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(Invitogen, #11605)中，補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清 (Invitogen, #10108-165)，于下不振蕩生長(zhǎng)。細(xì)胞上樣到位于裝置中的樣品器具上。 用該裝置進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。結(jié)果、相對(duì)于懸浮和粘附細(xì)胞系，在Vial-Cassette中昆蟲(chóng)細(xì)胞系同樣立刻被AO 和DAPI染色，說(shuō)明Vial-Cassette同樣可用于測(cè)定昆蟲(chóng)細(xì)胞的活力。實(shí)施例11、原代細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力；鼠脾細(xì)胞、鼠骨髓細(xì)胞和人血細(xì)胞(參考圖11)材料與方法、將來(lái)自C57BL/6小鼠的脾臟放在冰冷的PBS里，并用無(wú)菌注射器的末端溫和研磨。懸浮液在300g下離心10分鐘；將顆粒重懸于Iml 0.83% NH4Cl中以裂解紅細(xì)胞并在冰上孵育3分鐘。將細(xì)胞加入Hml PBS并在300g下離心10分鐘。脾細(xì)胞重懸于 RPMI (Invitogen，#61870)中，補(bǔ)以 10%熱-失活的胎牛血清(Invitogen,#10108-165), 100U/ml青霉素和ΙΟΟμ g/ml鏈霉素(Invitogen，#15140-122)。細(xì)胞團(tuán)被沉淀并用移液管移走，剩下的單一細(xì)胞懸浮液用于分析。骨髓細(xì)胞在層流凈化罩中進(jìn)行無(wú)菌收獲。將雙邊徑骨和股骨無(wú)菌去除，取下周圍的軟組織并放于含有IOml 70%乙醇的皮氏培養(yǎng)皿中。兩分鐘后轉(zhuǎn)移到冰冷的PBS中。然后，用連接有27號(hào)針頭的5ml注射器吸取5ml冷PBS沖洗牛骨髓腔，收集各骨頭的細(xì)胞。 細(xì)胞在300g下離心10分鐘，丟棄上清液，并沖洗細(xì)胞兩次。第二次沖洗之后將細(xì)胞顆粒重懸于RPMI 1640 (Invitogen, #61870)中，補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清Qnvitogen, #10108-165)、100U/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素 Qnvitogen, #15140-122)。用針從指尖處取少量人靜脈血作為樣品。用PBS將血樣稀釋5倍后用于分析。將各種原代細(xì)胞樣品(鼠脾細(xì)胞、鼠骨髓細(xì)胞和人血細(xì)胞)上樣到樣品器具中并用裝置進(jìn)行分析。結(jié)果、與懸浮、粘附和昆蟲(chóng)細(xì)胞系相比，在Vial-Cassette中原代細(xì)胞(鼠脾細(xì)胞、 鼠骨髓細(xì)胞和人血細(xì)胞)同樣立刻被AO和DAPI染色，它們分別使所有細(xì)胞群和死細(xì)胞群染色。這說(shuō)明Vial-Cassette同樣可用于測(cè)定原代細(xì)胞的活力。實(shí)施例12、使用DACM測(cè)定表達(dá)RFP細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞計(jì)數(shù)(參考圖12)HEK293是一種人胚胎腎細(xì)胞系，在本實(shí)施例中用融合了 CMV啟動(dòng)子的RFP(源于 dsRed的mRFPl)轉(zhuǎn)染(EC41)。用DACM使所有活細(xì)胞染色并用RFP檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率(轉(zhuǎn)染效率)很容易測(cè)定。材料與方法、HEK293細(xì)胞用RPMI (InvitoRen, #61870)補(bǔ)以10%熱-失活的胎
36牛血清anvitogen，#10108-165)，于37°C、含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。分別向 190 μ 1轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293細(xì)胞的混合物中加入10 μ 1溶解于DMSO的DACM(N-(7- 二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-馬來(lái)酰亞胺，WAKO Pure Chemical Industries, CAS no. 55145-14-7) (200 μ g DACM/ml DMSO)并用移液管混合。細(xì)胞上樣到 NucleoCassette 中 (不包含碘化丙啶或其它染色劑)。NucleoCassette放置在裝置中并用該裝置進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。皿、測(cè)得所有活細(xì)胞(基于以DACM染色的細(xì)胞，圖5)的濃度為2. 4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。測(cè)得表達(dá)RFP的細(xì)胞濃度為1.7X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，則轉(zhuǎn)染效率為71.5%。當(dāng)轉(zhuǎn)染涉及熒光蛋白時(shí)，巰基反應(yīng)探針如DACM可以用于分析中來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。實(shí)施例13、使用DACM和PI的表達(dá)GFP細(xì)胞的活力、細(xì)胞計(jì)數(shù)和轉(zhuǎn)染效率(參考圖 13和圖14)MCF-7是一種乳腺癌癌細(xì)胞系，在本實(shí)施例中用融合了 CMV啟動(dòng)子的GFP轉(zhuǎn)染。用碘化丙啶(PI)染色無(wú)活力細(xì)胞，DACM染色所有活細(xì)胞并用GFP檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率、 細(xì)胞活力和細(xì)胞計(jì)數(shù)很容易被測(cè)定。材料與方法、穩(wěn)定表汰GFP 的 MCF-7 細(xì)胞(MCF-7EC3)用 RPMI (Invitogen, #61870) 補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清anvitogen，#10108-165)，于37 °C、含5 % CO2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。向190μ1 MCF-7EC3細(xì)胞中加入10μ 1溶解于DMSO的DACM(N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-馬來(lái)酰亞胺，WAKO Pure Chemical Industries, CAS no. 55145-14-7) (200 μ g DACM/ml DMSO)并用移液管混合。細(xì)胞上樣到含有DNA染色劑碘化丙啶(PI)的NucleoCassette中。PI是膜不滲透性的因此被排除在活細(xì)胞外。 NucleoCassette放置在裝置中并用該裝置進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。還使用了 Olympus 1X50 熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究，用Lumenera CCD照像機(jī)及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件捕獲圖像。分別用U-MNUA2 (綠色長(zhǎng)通，510-550nm)、U-MNUA2 (UV帶通，330_385nm)和(藍(lán)色長(zhǎng)通)濾光塊 (Olympus)檢測(cè) PI、DACM 禾口 GFP 熒光。結(jié)果、小部分細(xì)胞被PI染餼(圖6A)且裝置測(cè)定出無(wú)活力細(xì)胞的濃度為1.2X105 個(gè)細(xì)胞/ml。測(cè)得活細(xì)胞(DACM染色的細(xì)胞，圖6B)濃度為2. 7X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。在此基礎(chǔ)上，樣品中細(xì)胞的活力為95.6%。測(cè)得表達(dá)GFP的細(xì)胞濃度為2. 6X IO6個(gè)/ml，則轉(zhuǎn)染效率為96%。用熒光顯微鏡研究轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的混合物(圖7)。該圖是由使用不同濾光塊檢測(cè)DACM(UV帶通)、GFP(藍(lán)帶通)和PI (綠長(zhǎng)通)捕獲的相同細(xì)胞的圖像重疊而成。從圖中可看出，DACM染色表達(dá)GFP的活細(xì)胞，而死細(xì)胞只被PI染色。巰基反應(yīng)探針如DACM可以用于分析測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，且結(jié)合不滲透性染色劑如PI，還可獲得有關(guān)細(xì)胞活力的信息。實(shí)施例14、用DAPI或碘化丙錠(PI)量化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA含量(參考圖15 和圖16)DAPI染色細(xì)胞的整體熒光強(qiáng)度與DNA的含量有化學(xué)計(jì)量關(guān)系。DAPI優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA，而DAP I/RNA復(fù)合物的總量只有DAP I /DNA復(fù)合物的20 %。因此，使用DAPI，在進(jìn)行 DNA含量測(cè)定之前不需要用RNA酶處理以去除RNA。這是使用其它常用染料如PI進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定的前提條件。DAPI通過(guò)連接到DNA小溝的AT簇上而與雙鏈DNA相互作用。 當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，它的最大吸收是在358nm，最大發(fā)射是在461nm。DAPI與DNA結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度增加了 20倍。在本實(shí)施例中，使用DAPI或碘化丙啶(PI)作為DNA染色劑以測(cè)量粘附細(xì)胞系、 MCF-7、懸浮細(xì)胞系，JM (源自Jurkat的細(xì)胞系)中的DNA含量。材料與方法、MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI+10% FCS到克隆率為80-90%，用PBS沖洗細(xì)胞一次，使胰蛋白酶化并離心收集，之后用乙醇固定。JM細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI+10%FCS到密度為5. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml。離心收集細(xì)胞并用PBS沖洗一次后用乙醇固定。MCF-7和JM細(xì)胞充分重懸在0.5ml BPS中，并且向各細(xì)胞懸液中加入4.5ml冰凍的70%乙醇固定劑。用 DAPI或PI染色之前細(xì)胞于固定劑中至少保持兩小時(shí)。PI染餼、以200 Xg離心所收集的細(xì)胞5分鐘并用PBS沖洗一次。再一次離心后將細(xì)胞重懸于PI染色溶液(100ml含0. 1 % (V/V) Triton X-100的PBS中加入20mg無(wú)DNA 酶的RNA酶A和2mg碘化丙錠)并于37°C下孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞儀以及本發(fā)明的裝置進(jìn)行分析。DAPI染餼、以200 Xg離心所收集的細(xì)胞5分鐘并用PBS沖洗一次。再一次離心后將細(xì)胞重懸于DAPI染色溶液(100ml含0. (V/V) Triton X-100的PBS中加入0. Img 4'，6 二脒基-2-苯基吲哚；DAPI)并用本發(fā)明的裝置直接進(jìn)行分析。MS、用本發(fā)明的裝置和標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀分析RNA酶A處理的和PI染色的MCF-7 細(xì)胞。如圖15所示，本發(fā)明的裝置提供了準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)DNA含量數(shù)據(jù)，其與流式細(xì)胞儀，這種最常用于DNA定量的方法所獲得的數(shù)據(jù)相當(dāng)。下一步，來(lái)源于同一培養(yǎng)物的MCF-7 細(xì)胞直接用DAPI染色(無(wú)需RNA酶處理)并用本發(fā)明的裝置進(jìn)行分析。如圖16所示，分別用PI和DAPI染色的細(xì)胞內(nèi)DNA含量柱狀圖幾乎相同。因此，使用本發(fā)明的裝置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA定量時(shí)，PI和DAPI兩種染色劑均可使用。實(shí)施例15、藥物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA含量的影響(參考圖17)用碘化丙啶作為DNA染色劑測(cè)定以不同藥物處理的JM細(xì)胞的DNA含量。材料與方法、JM細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI+10 % FCS中到密度為4. 7 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，然后用血清饑餓或用以下藥物處理20小時(shí)
1.諾考達(dá)唑(G2-M中止)0.5μΜ
2.L-含羞草堿(Gl)0.5mM
3.羥基脲，HU(S)2mM
4.喜樹(shù)堿，CPT(S)5μΜ
5.依托泊苷(S)20μΜ
6.未處理對(duì)照離心收集細(xì)胞并用PBS沖洗一次后用乙醇固定。細(xì)胞充分重懸于0.5ml PBS中并向各細(xì)胞懸浮液加入4. 5ml冰凍的乙醇固定劑。用PI染色前細(xì)胞至少在固定劑中保持兩個(gè)小時(shí)。PI染餼、以200 Xg離心所收集的細(xì)胞5分鐘并用PBS沖洗一次。再一次離心后將細(xì)胞重懸于PI染色溶液(100ml含0. 1 % (V/V) Triton X-100的PBS中加入20mg無(wú)DNA酶的RNA酶A和2mg碘化丙錠)并于37°C下孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞儀以及本發(fā)明的裝置進(jìn)行分析。皿、用本發(fā)明的裝置和標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀分析用影響細(xì)胞周期的不同時(shí)期的藥物處理的JM細(xì)胞。如圖17所示，本發(fā)明的裝置提供了準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)DNA含量數(shù)據(jù)，其與流式細(xì)胞儀獲得的數(shù)據(jù)相當(dāng)。因此本發(fā)明的裝置能用于細(xì)胞內(nèi)DNA的定量并可用于評(píng)估不同藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。實(shí)施例16、用碘化丙錠進(jìn)行酵母細(xì)胞中DNA的定量(參考圖18)用碘化丙錠作為DNA染色劑測(cè)量酵母細(xì)胞(Schizosaccharomyces pombe)的DNA 含量。使用以下兩種菌株1. Eg544(CM_SP4)，IT Amat2,32. Eg816(CM_SP7)，IT cdc25_22 leu 1-323. Eg892(CM-SP72)，h+ cdcl0_V50 ura4_D18Cdc細(xì)胞(Eg816和Eg892)在25°C下于EMM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到密度為5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，然后于36°C (cdc突變體的限制性溫度)下孵育4小時(shí)后進(jìn)行收集并用70%乙醇固定。在有氮和無(wú)氮(EMM-N)條件下于限制性溫度培養(yǎng)CdclO細(xì)胞。野生型細(xì)胞(EgM4)在30°C下于EMM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到密度為5X IO6個(gè)/ml，然后轉(zhuǎn)移至EMM和EMM-N(缺氮)中并于30°C下孵育3小時(shí)后收集并用70%乙醇固定。限制性溫度條件下的不同cdc突變體以及缺氮下的細(xì)胞的預(yù)期中止點(diǎn)1. Cdcl0-V50 = G1中止生長(zhǎng)于限制性溫度下的cdcl0-V50細(xì)胞將在中止于G1，含一套(IC)DNA含量。cdcl0-V50等位基因滲漏且該種群中小量細(xì)胞仍然會(huì)分裂。要獲得完全G1中止，必須使cdcl0-V50細(xì)胞氮饑餓。2. Cdc25-22 = G2中止=生長(zhǎng)于限制性溫度下的Cdc25_22細(xì)胞將中止于( 期，含
兩套DNA含量。3.氮饑餓細(xì)胞=G1中止。4.營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的野生型細(xì)胞(EgM4)大部分時(shí)間處于細(xì)胞周期的( 期，因此該種群中大部分細(xì)胞具有2套DNA含量。當(dāng)?shù)囸I時(shí)，野生型細(xì)胞將中止于G1期且含一套DNA含量。完全處于G1期需氮饑餓很多小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞只饑餓3小時(shí)因此只有少量細(xì)胞中止于G1期且含一套DNA含量。DNA含量分析、約3X IO6乙醇固定的細(xì)胞經(jīng)RNA酶處理(50mM檸檬酸鈉中加入 0. lmg/ml RNA酶A，pH 7. 0，37°C過(guò)夜)，碘化丙錠染色(50mM檸檬酸鈉中加入4 μ g/ml的 ΡΙ,ρΗ 7.0)，超聲降解10秒鐘并用流式細(xì)胞儀(用Bection-Dickinson FACSCalibur計(jì)數(shù) 10000個(gè)細(xì)胞)和本發(fā)明的裝置分析。MS、用本發(fā)明的裝置和標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀分析處于細(xì)胞周期的不同時(shí)期的酵母細(xì)胞。如圖18所示，所述裝置提供了準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)DNA含量數(shù)據(jù)，其與流式細(xì)胞儀獲得的數(shù)據(jù)相當(dāng)。因此所述裝置可用于酵母細(xì)胞的DNA含量的定量且可用于研究如細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。實(shí)施例17、Annexin V的細(xì)胞凋亡分析(參考圖19和圖20)早期凋亡的檢測(cè)是基于一個(gè)事實(shí)，即健康的、未凋亡細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸(PS)主要位于面向細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)葉。細(xì)胞膜在凋亡過(guò)程的早期還是完整的，但PS遷移到
39膜的外層。Armexins是以鈣依賴性方式結(jié)合磷脂的細(xì)胞內(nèi)一組蛋白，以及該組中的一個(gè)成員，Armexin V已被證實(shí)是檢測(cè)凋亡細(xì)胞的有用工具，因?yàn)樗鼉?yōu)先結(jié)合帶負(fù)電荷的磷酸脂如 PS，但顯示極少與卵磷脂和神經(jīng)鞘髓磷脂結(jié)合。通過(guò)將熒光標(biāo)記與Armexin V偶聯(lián)，可以鑒定以及定量凋亡細(xì)胞。Armexin V也可結(jié)合凋亡晚期和壞死細(xì)胞的PS，但由于此類細(xì)胞的細(xì)胞膜已失去完整性，可以使用不滲透性染料如PI或DAPI使之與凋亡早期的細(xì)胞相區(qū)分。在此，用本發(fā)明的裝置分析熒光標(biāo)記的Armexin V，以染色凋亡和壞死的細(xì)胞，并且用PI區(qū)分早期和晚期凋亡/壞死細(xì)胞。材料與方法、Jurkat(JM)細(xì)胞用 RPMI (Invitogen, Cat. No. 61870)補(bǔ)以 10 % 熱-失活的胎牛血清(Invitogen, Cat. No. 10108-165)，于37°C、含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。向細(xì)胞中加入3μΜ喜樹(shù)堿(Sigma，Cat.No.C-9911)以誘引凋亡。培養(yǎng)3小時(shí)后 (37°C,5%C02)用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)收集細(xì)胞并根據(jù)Vybrant Apoptosis Assay試劑盒#2的生產(chǎn)商操作說(shuō)明用AlexaFluor 488-標(biāo)記的Annexin V(分子探針，V13M1)染色。 將染色細(xì)胞上樣到含有PI的盒子里。該盒子置于本發(fā)明的裝置中并用所述裝置及內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。還用Olympus 1X50熒光顯微鏡研究染色細(xì)胞。用Lumenera C⑶照像機(jī)及內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件捕獲圖像。用U-MWIBA3(藍(lán)色帶通)濾光塊(Olympus)檢測(cè) AF488熒光，用U-MWG2(綠色長(zhǎng)通)濾光塊(Olympus)檢測(cè)PI熒光。MS、用與本發(fā)明的裝置相關(guān)的軟件，測(cè)得凋亡細(xì)胞(ArmexinV偶聯(lián)結(jié)合細(xì)胞)的濃度為2. 6X 105，而無(wú)活力細(xì)胞的濃度為4. 5X IO4(如圖19所示)。用熒光顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)了以下三種細(xì)胞只出現(xiàn)在相差中的細(xì)胞(活細(xì)胞)；對(duì)PI和熒光標(biāo)記的Armexin V均顯陽(yáng)性的細(xì)胞(晚期凋亡或壞死細(xì)胞)；最后還有不包括PI但對(duì)熒光標(biāo)記的Armexin V顯陽(yáng)性的細(xì)胞(早期凋亡細(xì)胞)(如圖20所示)。替代方法、一種測(cè)定凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比率的替代方法是將上沭實(shí)施例17中的方法結(jié)合一種針對(duì)所有細(xì)胞的染色劑，如吖啶橙(AO)或一種只染色活細(xì)胞的染色劑，如 DACM。比如，將所有細(xì)胞用AO或另一種能使所有細(xì)胞染色的化合物染色，結(jié)合熒光標(biāo)記的 Annexin V以染色凋亡細(xì)胞，以及結(jié)合不滲透性染色劑，染色無(wú)活力的細(xì)胞，或者將所有活細(xì)胞用DACM或另一種巰基反應(yīng)探針染色，結(jié)合熒光標(biāo)記的Armexin V以染色凋亡細(xì)胞，以及結(jié)合不滲透性染色劑，染色無(wú)活力的細(xì)胞。實(shí)施例18、通過(guò)監(jiān)測(cè)線粒體膜電位的變化檢測(cè)早期凋亡凋亡中非常早期的一個(gè)事件是線粒體膜電化學(xué)梯度崩解，隨后是呼吸鏈解偶聯(lián)。 為了區(qū)分健康和凋亡細(xì)胞，基于這個(gè)現(xiàn)象的一種簡(jiǎn)單分析是，用陽(yáng)離子染料如5，5 ‘，6， 6'-四氯_1，1' ,3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC-I)或四甲基羅丹明甲酯高氯酸鹽或其它在兩種種群中顯示不同熒光的化合物來(lái)染色細(xì)胞。其中一個(gè)例子是發(fā)現(xiàn)JC-I 在健康的、未凋亡細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中形成紅色熒光聚合體。然而線粒體膜電位下降時(shí) (例如與凋亡有關(guān))，該染料則恢復(fù)成單體形式，與之相關(guān)的是大部分發(fā)射轉(zhuǎn)為綠色。為了分析線粒體膜電位變化和由此產(chǎn)生的凋亡，用選定的陽(yáng)離子染料(如JC-1) 培養(yǎng)細(xì)胞并用本發(fā)明的裝置在相關(guān)的波長(zhǎng)下進(jìn)行分析。例如，如果使用JC-1，則要對(duì)紅色到綠色的轉(zhuǎn)變進(jìn)行定量以測(cè)定凋亡細(xì)胞群。可包含細(xì)胞不滲透性DNA染料(如DAPI)以染色壞死細(xì)胞。
實(shí)施例19、基于半胱天冬酶(Caspase)的分析(參考圖23)凋亡的另一個(gè)早期標(biāo)志是半胱天冬酶的活性。半胱天冬酶是半胱天冬氨酸特異性蛋白酶家族。半胱天冬酶介導(dǎo)細(xì)胞死亡并在細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥中扮演重要角色。半胱天冬酶的調(diào)節(jié)發(fā)生在翻譯后水平，因此可以被迅速激活。半胱天冬酶的識(shí)別位點(diǎn)是三個(gè)或四個(gè)氨基酸后接著一個(gè)天冬氨酸殘基，斷裂出現(xiàn)在天冬氨酸鹽后。通過(guò)前體的蛋白酶水解來(lái)活化半胱天冬酶，由于前體的斷裂位點(diǎn)與半胱天冬酶的特異性相匹配，因此可以通過(guò)活化的半胱天冬酶來(lái)使前體相繼激活。一種測(cè)量不同種類半胱天冬酶活性的方法是使用一種包含目的半胱天冬酶的識(shí)別位點(diǎn)的多肽基質(zhì)與探針相連接，當(dāng)天冬氨酸殘基斷裂后，使熒光特性發(fā)生改變。一個(gè)重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子是半胱天冬酶-3 (CPP32，apopain, YAMA)，可放大啟動(dòng)半胱天冬酶如半胱天冬酶-8的信號(hào)。半胱天冬酶-3的熒光基質(zhì)的實(shí)例是乙酰 Asp-Glu-Val-Asp (乙酰-DEDV) 7-氨基-4-甲基香豆素，其斷裂生成熒光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)部分。因此半胱天冬酶的活性可通過(guò)測(cè)量熒光來(lái)定量。同理也可測(cè)定其它半胱天冬酶的活性。以此方法用本發(fā)明的裝置對(duì)半胱天冬酶的活性進(jìn)行定量，細(xì)胞被滲透化/裂解并用與目的半胱天冬酶相對(duì)應(yīng)的熒光基質(zhì)孵育。孵育之后，用所述裝置測(cè)定細(xì)胞熒光，并用于衡量半胱天冬酶的活性。另一種基于半胱天冬酶的細(xì)胞凋亡的分析方法是FLICA (帶熒光素的半胱天冬酶抑制劑分析)。這種分析法采用與熒光探針連接的半胱天冬酶特異性抑制劑序列，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活化的半胱天冬酶。非細(xì)胞毒性的半胱天冬酶特異性抑制劑是細(xì)胞滲透性的并可穿過(guò)完整的細(xì)胞質(zhì)膜，且可在活化的半胱氨酸異質(zhì)二聚體的大亞基處與反應(yīng)性半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合。沒(méi)有結(jié)合的半胱天冬酶特異性抑制劑擴(kuò)散出細(xì)胞外并被沖走，因此不存在前體半胱天冬酶或未活化酶形式的干擾。因此，測(cè)量熒光相當(dāng)于直接測(cè)量整個(gè)活細(xì)胞中活化的半胱天冬酶量。用FLCA定量半胱天冬酶活性，用選定的與熒光探針連接的半胱天冬酶特異性抑制劑序列孵育被測(cè)細(xì)胞。沖洗細(xì)胞以去除未結(jié)合的抑制劑并用本發(fā)明的裝置測(cè)定細(xì)胞的熒光，從而可以測(cè)量單個(gè)細(xì)胞水平上的半胱天冬酶活性。用于活細(xì)胞/所有細(xì)胞的染色劑如 DACM或AO和/或無(wú)活力細(xì)胞的染色劑如DAPI/PI也可用于本分析。材料與方法、CHO細(xì)胞用RPMI anvitogen，Cat, No. 61870)補(bǔ)以10%熱-激活的胎牛血清(Invitogen, Cat. No. 10108-165)，于37°C，含5 % CO2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。 當(dāng)克隆率為80%時(shí)，將細(xì)胞用IyM諾考達(dá)唑(Sigma，Cat. no. M1404)處理，或者不作處理。細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)收集并用SR-VAD-FMK多聚半胱天冬酶 FLICA(Immunochemistry Technologies,#91)按照生產(chǎn)商的操作說(shuō)明染色。染色后，將所有活細(xì)胞用DACM((N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-馬來(lái)酰亞胺，WAKO Pure Chemical Industries, CAS no. 55145-14-7))共染色，而無(wú)活力的細(xì)胞用 SYTOX 綠(Invitogen, S7020)染色。將染色的細(xì)胞置于NC-Slide中。將NC-Slide置于本發(fā)明的裝置中，并用所述裝置及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。還用Olympus 1X50熒光顯微鏡研究染色細(xì)胞。用U-MWG2(綠色長(zhǎng)通)濾光塊(Olympus)檢測(cè)紅色熒光(凋亡陽(yáng)性)細(xì)胞，用 U-MNUA2 (UV帶通)濾波塊(Olympus)檢測(cè)DACM陽(yáng)性細(xì)胞，用U-MWIBA3 (藍(lán)色帶通)濾波塊(Olympus)檢測(cè)SYTOX綠色熒光。結(jié)果、用與所沭裝置相關(guān)的軟件，基于半胱天冬酶的活件-檢測(cè)諾考汰唑處理和未處理的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的濃度?；旧?，與未處理的細(xì)胞相比，更多的諾考達(dá)唑處理過(guò)的細(xì)胞顯示強(qiáng)烈的紅色熒光(如圖23所示)。此結(jié)果得到熒光顯微鏡目視觀察結(jié)果的支持。實(shí)施例20、TUNEL細(xì)胞凋亡晚期的一個(gè)特征是核染色質(zhì)斷裂，其導(dǎo)致大量3’ -羥基DNA末端產(chǎn)生。 因此常用于檢測(cè)凋亡晚期的方法是TUNEL(轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記)。TUNEL法包括用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶將生物素-dUTP或熒光標(biāo)記的dUTP轉(zhuǎn)移到斷裂的DNA的鏈斷裂處。使用生物素-dUTP時(shí)，生物素-標(biāo)記的斷裂位點(diǎn)進(jìn)一步與熒光偶聯(lián)的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素(如FITC抗生物素蛋白)反應(yīng)從而對(duì)DNA的降解及由此引起的凋亡進(jìn)行檢測(cè)和定量。這可以直接用熒光標(biāo)記-dUTP完成。由于未凋亡細(xì)胞中不存在暴露的3’ -羥基DNA末端，未凋亡細(xì)胞與標(biāo)記的dUTP結(jié)合水平低。由于末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶必須進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，因此酶反應(yīng)前必須先將細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行滲透化處理。為了避免因此導(dǎo)致的DNA片段丟失，滲透化處理前細(xì)胞先用甲醛或戊二醛固定。該固定使DNA與其它細(xì)胞內(nèi)組分交聯(lián)并阻止其在滲透化期間被抽走。因此用本發(fā)明的裝置檢測(cè)凋亡晚期的程序如下固定被測(cè)細(xì)胞然后滲透化。然后用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶和dUTP-標(biāo)記的優(yōu)選標(biāo)記物(生物素，熒光探針或抗體)孵育細(xì)胞。孵育期間末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶催化dUTP與DNA的3’-羥基末端結(jié)合。染色細(xì)胞沖洗之后用所述裝置進(jìn)行研究， 從而可以在單個(gè)細(xì)胞水平上測(cè)量凋亡。用于所有細(xì)胞的染色劑如DAPI，PI或AO可用于本分析(由于細(xì)胞被滲透化處理，滲透性以及不滲透性的染色劑都適用)。實(shí)施例21、細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖是測(cè)定培養(yǎng)基中分裂的細(xì)胞數(shù)量。快速且準(zhǔn)確的評(píng)估細(xì)胞增殖是許多實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)的基本要求，對(duì)于評(píng)估如化合物對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞毒性、誘變或癌致作用，以及對(duì)于評(píng)估細(xì)胞倍增時(shí)間和驗(yàn)證細(xì)胞培養(yǎng)物的健康狀況非常有用。評(píng)估這些參數(shù)的一種方法是測(cè)定生長(zhǎng)曲線，然而，這不僅乏味且耗時(shí)間。分析細(xì)胞增殖的第二種方法是把DNA合成作為增殖的標(biāo)記物。這些分析中，都對(duì)摻入DNA中的核酸-類似物進(jìn)行定量。核酸-類似物摻入 DNA中能直接與培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂數(shù)量成比例。在一種分析方法中，在細(xì)胞孵育的最后2 M小時(shí)加入溴脫氧尿苷(Brd U)進(jìn)行孵育。Brd U將摻入分裂中的細(xì)胞DNA中并可用抗-Brd U抗體進(jìn)行檢測(cè)和定量。為了便于抗體與摻入的Brd U相結(jié)合，細(xì)胞被滲透化且用一步固定/降解溶液使DNA變性。抗體孵育之后未結(jié)合的抗體被沖洗走，并加入識(shí)別抗Brd U抗體的熒光偶聯(lián)第二抗體(如FITC標(biāo)記的抗體)。未結(jié)合的第二抗體被沖洗走，并用本發(fā)明的裝置對(duì)細(xì)胞內(nèi)的熒光進(jìn)行檢測(cè)和定量。熒光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞中摻入的Brd U量成比例。除了評(píng)估細(xì)胞增殖外，可以在單細(xì)胞水平上從同一樣品中獲得如細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞內(nèi)抗原等信息。第三種分析細(xì)胞增殖的方法包括用熒光染料標(biāo)記細(xì)胞，所述熒光染料將留在細(xì)胞中但不影響細(xì)胞功能。細(xì)胞每分裂一輪，熒光強(qiáng)度減半。在一種分析方法中，用可自由向細(xì)胞內(nèi)彌散的胺激活二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(通常稱SE)孵育細(xì)胞。該熒光染料與細(xì)胞內(nèi)蛋白以及細(xì)胞表面上的蛋白反應(yīng)。一旦反應(yīng)，熒光染料與蛋白共價(jià)連接并留在細(xì)胞內(nèi)。用本發(fā)明的裝置對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光進(jìn)行檢測(cè)和定量，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)熒光強(qiáng)度隨之減半。除了評(píng)估細(xì)胞增殖以外，可以在單細(xì)胞水平上從同一樣品中獲得如細(xì)胞數(shù)量、活力和細(xì)胞內(nèi)抗原等信息。如細(xì)胞不滲透DNA染色劑(如DAPI)可用于本分析以測(cè)定死細(xì)胞比例。實(shí)施例22、熒光蛋白的檢測(cè)和定量，以下稱FRET分析現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出多種熒光蛋白變體，其熒光發(fā)射光譜幾乎跨度整個(gè)可視光譜范圍。分離自水母Aequorea victoria的原始綠色熒光蛋白的突變產(chǎn)生新的熒光探針，其顏色從藍(lán)色到黃色是生物研究中最常用的體外報(bào)告分子。已經(jīng)從海蓮Discosoma striate和珊瑚蟲(chóng) (Anthozoa)類的珊瑚礁中開(kāi)發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的發(fā)橙色和紅色光譜的熒光蛋白。本發(fā)明的裝置可用于檢測(cè)已知的熒光蛋白，包括 BFP、CFP、GFP、GFP-uv、YFP、HcRed 1、KFP1、mRFP 1、mCherry 和源于dsRED的其他變體。在一個(gè)分析方法中，熒光蛋白的編碼區(qū)域與目的基因啟動(dòng)子(或增強(qiáng)子)相連接。 融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到寄主細(xì)胞中，用所述裝置很容易對(duì)所產(chǎn)生的熒光蛋白發(fā)出的熒光進(jìn)行檢測(cè)和定量。熒光信號(hào)強(qiáng)度與熒光蛋白表達(dá)水平成比例，這也是對(duì)目的基因的活性測(cè)量。因此本方法可用于研究不同生長(zhǎng)條件下，目的基因的轉(zhuǎn)錄活性。在第二個(gè)分析方法中，熒光蛋白的編碼區(qū)域與目的基因的編碼區(qū)或部分編碼區(qū)相連接。所述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到寄主細(xì)胞中，用本發(fā)明的裝置很容易對(duì)所產(chǎn)生的熒光蛋白發(fā)出的熒光進(jìn)行檢測(cè)和定量。熒光信號(hào)強(qiáng)度與熒光蛋白表達(dá)水平成比例，這也是對(duì)目的蛋白質(zhì)水平的測(cè)量。本方法可用于研究不同生長(zhǎng)條件下，目的蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)，如測(cè)量蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的半衰期。用熒光蛋白可以研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白反應(yīng)的分子動(dòng)力學(xué)。一種檢測(cè)分子相互反應(yīng)的方法包括利用兩種熒光蛋白之間或一種熒光蛋白與第二熒光團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。比如說(shuō)，YFP和CFP可以作為FRET的供體受體，其中供體(青色)分子的激發(fā)引起受體(黃色)分子的發(fā)射，只要蛋白質(zhì)間接近到足以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。因此FRET可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞中EYFP和ECFP融合蛋白之間直接的蛋白-蛋白相互作用。在一種分析方法中，青色熒光蛋白(CFP)的編碼區(qū)與一種目的基因的編碼區(qū)或部分編碼區(qū)相連接。同樣，黃色熒光蛋白(YFP)的編碼區(qū)與第二目的基因的編碼區(qū)或部分編碼區(qū)相連接。兩種融合蛋白在寄主細(xì)胞中共表達(dá)。用紫外光激發(fā)CFP并檢測(cè)和定量YFP發(fā)出的黃色光。實(shí)施例23、用FISH進(jìn)行DNA和RNA標(biāo)記物的檢測(cè)和定量熒光原位雜交(FISH)中，使用低放大率的熒光顯微鏡對(duì)獲得準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的有關(guān)細(xì)胞群內(nèi)基因擴(kuò)增和RNA標(biāo)記物的表達(dá)水平的信息很有用。在一種分析方法中，細(xì)胞被滲透化且DNA用一步固定/降解溶液變性，有助于與特定核酸探針雜交，如熒光(如FITC標(biāo)記抗體)標(biāo)記的DNA、RNA、PNA和LNA。雜交后，未結(jié)合的熒光偶聯(lián)探針被沖洗走并用本發(fā)明的裝置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光檢測(cè)和定量。熒光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)存在的DNA或RNA標(biāo)記物的量成比例。本方法可用于DNA擴(kuò)增，如HER2和TOP，以及RNA水平，如TERT mRNA的檢測(cè)和定量。除了評(píng)估NDA和RNA標(biāo)記物外，還可以在單細(xì)胞水平上從同一樣品中獲得有關(guān)細(xì)胞數(shù)量、DNA含量和抗原等的信息。實(shí)施例M、藥物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA含量的影響(參考圖21)以DAPI作為DNA染色劑測(cè)定諾考達(dá)唑(M期抑制劑)處理的CHO細(xì)胞以及喜樹(shù)堿 (S期抑制劑)處理的JM細(xì)胞的DNA含量。
材料與方法、CHO細(xì)胞牛長(zhǎng)于RPMI+10%FCS到克降率為80_90%時(shí)用0. 5 μ M諾考達(dá)唑處理對(duì)小時(shí)。細(xì)胞用PBS沖洗一次，使胰蛋白酶化并離心收集后用乙醇固定。JM細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI+10% FCS到濃度為5. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)用5 μ M喜樹(shù)堿處理16小時(shí)。離心收集細(xì)胞并用PBS沖洗一次后用乙醇固定。CHO和JM細(xì)胞充分重懸于0.5ml BPS中，并向各細(xì)胞懸液加入4. 5ml冰凍70%乙醇固定劑。細(xì)胞在固定劑中至少保持兩小時(shí)后用DAPI 染色。DAPI染色細(xì)胞于200 Xg離心5分種后收集，并用PBS沖洗一次。再一次離心后細(xì)胞重懸于 DAPI 染色溶液(100ml 含 0. (V/V)Triton X-100 的 PBS 中加入 0. Img 4'，6 二脒基-2-苯基吲哚；DAPI)并直接用本發(fā)明的裝置進(jìn)行分析。益果、用所述裝置分析用影響不同細(xì)胞周期的藥物處理的CHO和JM細(xì)胞的DNA含量。如圖21所示，所述裝置提供了準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)DNA含量數(shù)據(jù)，可用于評(píng)估不同藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。另外，所述裝置可用于鑒別帶DNA碎片的細(xì)胞(稱Sub-G1細(xì)胞)。DNA 片段化是凋亡細(xì)胞死亡的一個(gè)標(biāo)志。實(shí)施例25、凋亡分析Annexin V(參考圖22)在此本發(fā)明的裝置用于分析熒光標(biāo)記的armexin V，以染色凋亡和壞死細(xì)胞；以及 SYTOX綠，區(qū)分凋亡/壞死細(xì)胞的早期或晚期。另外，DACM用于染色所有活細(xì)胞。材料與方法、Turkat細(xì)胞用 RPMlGnvitogen, Cas. No. 61870)補(bǔ)以 10%熱-激活的胎牛血清(Invitogen, Cas. No. 10108-165)，于37°C、含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞用ΙμΜ諾考達(dá)唑(Sigma，Cat. No. M1404)處理，或者未作處理。孵育(37 °C， 5% CO2) 16小時(shí)后，細(xì)胞用冰BPS收集并用AlexaFluor 594-標(biāo)記的annexin V(分子探針， A-13203)按生產(chǎn)商的操作說(shuō)明染色。Armexin V使所有活細(xì)胞染色后，用DACM(N_(7_ 二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-馬來(lái)酰亞胺，WAKO Pure Chemical Industries, CAS no. 55145-14-7)共染色，無(wú)活力細(xì)胞用SYTOX綠Qnvitogen, S7020)染色。將染色的細(xì)胞上樣至NC-Slide內(nèi)。NC-Slide置于本發(fā)明的裝置中，并用所述裝置及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析。還用Olympus 1X50熒光顯微鏡分析染色細(xì)胞。用U-MWIBA3 (藍(lán)帶通)濾光塊(Olympus)檢測(cè)SYTOX綠色熒光，用U-MWG2 (綠長(zhǎng)通)濾光塊(Olympus)檢測(cè) Annexin VAF594 共軛物，用 U-MNUA2 (UV 帶通)濾光塊(Olympus)檢測(cè) DACM。結(jié)果、用與所述裝置相關(guān)的軟件測(cè)定諾考達(dá)嗶處理和未處理細(xì)胞中凋亡細(xì)胞 (Annexin V偶聯(lián)細(xì)胞)的濃度?；赟YTOX綠染色計(jì)算無(wú)活力細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)活細(xì)胞的分析顯示，對(duì)照組細(xì)胞中小于10%是Armexin V陽(yáng)性，諾考達(dá)唑處理細(xì)胞中有40%是Armexin V陽(yáng)性(見(jiàn)圖22)，而活細(xì)胞幾乎不受影響。本結(jié)果得到熒光顯微鏡目視觀察結(jié)果的支持。實(shí)施例沈、通過(guò)監(jiān)測(cè)線粒體膜電位變化檢測(cè)凋亡早期(參考圖已知線粒體膜電位的損失是凋亡和化學(xué)-缺氧-誘導(dǎo)壞死的前奏。親脂性陽(yáng)離子染料JC-1(5，5' ,6,6'-四氯_1，1' ,3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)在線粒體中呈現(xiàn)電位依賴性聚集，從而提供一種簡(jiǎn)便的基于熒光的方法以區(qū)分健康和凋亡細(xì)胞。在健康細(xì)胞中，完整線粒體細(xì)胞膜形成的負(fù)電荷性電位有利于JC-I在線粒體基質(zhì)中的聚集。 濃度高時(shí)JC-I形成聚合體并變成紅色熒光。在凋亡細(xì)胞中的線料體電位崩解，JC-I以單體綠色熒光形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞不滲透的DNA染色劑(如DAPI)可用于染色壞死和凋亡晚期細(xì)胞。材料與方法、Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI+10% FCS至濃度為5. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml，并
44用10 μ M喜樹(shù)堿(誘導(dǎo)凋亡藥物)處理5小時(shí)。于37°C下用2. 5 μ g/ml JC-I使細(xì)胞染色 10分鐘，用PBS沖洗，重懸于PBS+1 μ g/ml DAPI并用本發(fā)明的裝置分析。益果、用所述裝置分析JC-I和DAPI染色的Jurkat細(xì)胞(圖。對(duì)紅色和綠色熒光定量以鑒別凋亡細(xì)胞(圖24A)。通過(guò)計(jì)數(shù)DAPI (藍(lán)色)陽(yáng)性細(xì)胞以評(píng)估壞死/凋亡晚期的細(xì)胞數(shù)量(圖MB)。如圖對(duì)所示，所述裝置可用于鑒別線粒體膜電位崩解的細(xì)胞和鑒別處于凋亡早期的細(xì)胞。實(shí)施例27、抗原的檢測(cè)和定量(參考圖25)放大率低的熒光顯微鏡對(duì)從細(xì)胞種群中獲得準(zhǔn)確且精準(zhǔn)的有關(guān)抗原(如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面蛋白)表達(dá)水平的信息很有用。這種實(shí)施例如下所述。細(xì)胞用識(shí)別抗原的一級(jí)抗體孵育。抗體孵育后，未結(jié)合的抗體被沖洗走，并向溶液中加入識(shí)別一級(jí)抗體的熒光偶聯(lián)的二級(jí)抗體(如FITC或PE標(biāo)記的抗體)。未結(jié)合的二級(jí)抗體被沖洗走并用本發(fā)明的裝置檢測(cè)和定量細(xì)胞內(nèi)熒光。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的抗原量成比例。此方法可用于檢測(cè)和定量不同的細(xì)胞內(nèi)抗原，如HER2、 EGFR、VGFR、Ura和⑶分子包括⑶3、⑶4和⑶8。除了評(píng)估抗原，還可以在單細(xì)胞水平上獲得如細(xì)胞數(shù)量、活力和DNA含量等信息。通過(guò)類似的方法，將細(xì)胞進(jìn)行固定和滲透化處理后用抗體孵育，可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原如癌癥標(biāo)記TERT、TOP和Survivin。細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的檢測(cè)不是與活力測(cè)定相結(jié)合，它可以與定量如DNA含量，以及細(xì)胞周期描述相結(jié)合。材料與方法、桉牛產(chǎn)商的操作說(shuō)明通過(guò)陽(yáng)件詵擇以抗-CD3微球(Miltenyi Biotec)，從含有淋巴細(xì)胞部分的淋巴細(xì)胞分離劑(Axis-Siield，#111妨44)分離的血塊黃層中純化CD3+陽(yáng)性T細(xì)胞。然后將細(xì)胞用一級(jí)CD3特異性抗體染色，并且在孵育30分鐘后沖洗細(xì)胞，然后用R-藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二級(jí)抗體(抗體購(gòu)自BD Biosciences)染色。 孵育30分鐘后再次沖洗細(xì)胞并用DACM ((N- (7- 二甲氨基_4_甲基-3-豆香素)-馬來(lái)酰亞胺，WAKO Pure Chemical Industries, CAS no. 55145-14-7))共染色所有的活細(xì)胞。將染色的細(xì)胞裝入NC-Slide。將NC-Slide置于本發(fā)明的裝置中，并用所述裝置及其內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和研究。皿、用所述裝置分析使用CD3-選擇性微球純化的細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)95%的細(xì)胞被 PE偶聯(lián)抗體染色，說(shuō)明所有細(xì)胞中有95%表達(dá)CD3 (如圖2 。這與通過(guò)微球純化進(jìn)行陽(yáng)性篩選的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀正常得到的數(shù)據(jù)一致。本說(shuō)明書(shū)提到的“一個(gè)實(shí)施方式”或“一種實(shí)施方式”是指本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式中包括了與所述實(shí)施方式相關(guān)的特定的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或特征。因此，在此強(qiáng)調(diào)并需要理解的是，本說(shuō)明書(shū)中不同部分提到的兩個(gè)或多個(gè)“一個(gè)實(shí)施方式”或“一種實(shí)施方式”或“一種替代實(shí)施方式”不一定全部指相同實(shí)施方式。此外，特定的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或特征可適當(dāng)?shù)卦诒景l(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中相結(jié)合。綜上所述，為了解釋說(shuō)明，已經(jīng)列出大量具體細(xì)節(jié)以便充分理解本發(fā)明。然而，很明顯對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在沒(méi)有這些具體細(xì)節(jié)的情況下也可以實(shí)施本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明的范圍和精神應(yīng)該由所附權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品熒光的裝置，所述裝置包括一樣品板，樣品排列于樣品板上；一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)用于照射樣品的光源；和一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)檢測(cè)器，其中檢測(cè)器至少具有100,000個(gè)活性檢測(cè)元件以檢測(cè)樣品的熒光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中樣品包含顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中顆粒或者顆粒上或內(nèi)部所含物質(zhì)有光致發(fā)光活性，當(dāng)樣品被照射時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。
4.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中用一光致發(fā)光活性材料標(biāo)記顆粒，光致發(fā)光活性材料優(yōu)選熒光材料。
5.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中顆粒選自動(dòng)物細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)細(xì)胞，選自真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞和選自細(xì)菌。
6.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一樣品支架，其適于支撐至少兩種不同類型的樣品器具，如樣品板、顯微鏡載玻片或血球計(jì)數(shù)室。
7.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一讀取標(biāo)志的工具，所述標(biāo)志代表樣品支架的預(yù)定尺寸性質(zhì)。
8.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中光源選自分散光源、發(fā)光二極管、激光二極管、激光、熱光源和固態(tài)光源。
9.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中激發(fā)光單元包括多個(gè)光源。
10.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中多個(gè)光源包括至少四個(gè)不同的光源，如至少六個(gè)不同的光源，如至少八個(gè)不同的光源，如至少十個(gè)不同的光源。
11.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中多個(gè)光源發(fā)出不同波長(zhǎng)的光。
12.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中檢測(cè)器以其活性區(qū)的尺寸、活性檢測(cè)元件的數(shù)量和反應(yīng)性為特征。
13.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中檢測(cè)單元包括優(yōu)選具有至少400，000 個(gè)活性檢測(cè)元件的至少一個(gè)檢測(cè)器，更優(yōu)選至少1，000，000個(gè)活性檢測(cè)元件，更優(yōu)選 2，000, 000個(gè)活性檢測(cè)元件。
14.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中活性檢測(cè)元件在尺寸上小于ΙΟμπι，優(yōu)選5 μ m，更優(yōu)選3 μ m或更小。
15.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一組以二維方式排列、可同時(shí)獲得樣品光譜信息的檢測(cè)器。
16.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括用于將激發(fā)光聚焦到樣品的第一聚焦單元。
17.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括用于將熒光信號(hào)聚焦到檢測(cè)單元的第二聚焦單元。
18.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中第一聚焦單元和第二聚焦單元選自透鏡和透鏡的陣列。
19.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中第一聚焦單元和第二聚焦單元提供 40X或更低的固定光放大率，優(yōu)選20X或更低，更優(yōu)選IOX或更低。
20.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一激發(fā)光濾光器，其插入來(lái)自至少一個(gè)光源的激發(fā)光光路中，在照射樣品前將激發(fā)光分離成多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)帶。
21.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一發(fā)射光濾光器，其插入朝向至少一個(gè)檢測(cè)器的發(fā)射光光路中，在檢測(cè)單元檢測(cè)熒光信號(hào)之前將熒光信號(hào)分離成多個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)帶。
22.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中激發(fā)光濾光器和發(fā)射光濾光器選自干擾濾光器、吸收濾光器、低通濾光器、高通濾光器和帶通濾光器，其中激發(fā)光濾光器優(yōu)選低通濾光器而發(fā)射光濾光器優(yōu)選高通濾光器。
23.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一干涉儀，用于調(diào)節(jié)樣品發(fā)出的熒光信號(hào)。
24.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一致動(dòng)器，用于移動(dòng)樣品板和/ 或至少一個(gè)單元以調(diào)節(jié)樣品發(fā)射的光。
25.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一圖像準(zhǔn)直單元，用于將顯示不同光譜信息的多個(gè)圖像生成一準(zhǔn)直圖像，其中所述多個(gè)圖像獲自在不同或?qū)嵸|(zhì)上不同的發(fā)射條件下獲得的樣品的多個(gè)熒光信號(hào)。
26.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括一控制單元，用于使樣品板/樣品支架移動(dòng)到與檢測(cè)單元視野對(duì)應(yīng)的預(yù)定位置上。
27.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中激發(fā)光單元和檢測(cè)單元位于樣品板的兩側(cè)。
28.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中激發(fā)光單元和檢測(cè)單元位于樣品板的同側(cè)。
29.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括與檢測(cè)單元相連的處理器，用于接收來(lái)自檢測(cè)單元的熒光信號(hào)以處理信號(hào)數(shù)據(jù)，使信號(hào)數(shù)據(jù)與被評(píng)估的參數(shù)相聯(lián)系并評(píng)估參數(shù)。
30.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)的第一檢測(cè)器；一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述裝置進(jìn)一步包括至少兩個(gè)不同的發(fā)射濾光器，它們能夠過(guò)濾顆粒向檢測(cè)器發(fā)射的信號(hào)。
31.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，進(jìn)一步包括至少4個(gè)不同的發(fā)射濾光器，如至少6個(gè)不同的發(fā)射濾光器，如至少10個(gè)不同的發(fā)射濾光器，如至少15個(gè)不同的發(fā)射濾光器，如至少20個(gè)不同的發(fā)射濾光器。
32.—種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器；一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述裝置進(jìn)一步包括用于控制獲得同體積樣品的至少兩個(gè)圖像的工具。
33.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，包括一圖像準(zhǔn)直單元，用于準(zhǔn)直所述至少兩個(gè)圖像。
34.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中來(lái)自所述兩個(gè)圖像的信息代表不同的光譜波長(zhǎng)。
35.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中被檢測(cè)信號(hào)的分辨率是通過(guò)在所述至少兩個(gè)圖像中提供不同的信號(hào)靈敏度而增強(qiáng)的。
36.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括 一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器；一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述裝置進(jìn)一步包括一適于支撐至少兩種不同樣品器具的樣品支架。
37.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中所述樣品支架是由一能夠指引樣品支架的控制單元控制。
38.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括 一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器；一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述檢測(cè)器包括一組檢測(cè)元件，所述組包括至少100，000個(gè)檢測(cè)元件。
39.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括 一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器； 一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述裝置包括一光學(xué)系統(tǒng)，該光學(xué)系統(tǒng)具有固定的顆粒光學(xué)放大率，如小于40倍的固定放大率。
40.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括 一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器； 一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述裝置進(jìn)一步包括一用于讀取標(biāo)志的工具，所述標(biāo)志反映所述樣品器具中樣品室的預(yù)定尺寸性質(zhì)。
41.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中所述樣品室的預(yù)定尺寸性質(zhì)是指樣品室的厚度。
42.一種分析樣品中的顆粒的裝置，所述裝置包括一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)光源；一樣品板，用于放置樣品；一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)用于檢測(cè)樣品信號(hào)從而獲得樣品圖像的第一檢測(cè)器；一聚焦工具，用于將信號(hào)聚焦到檢測(cè)工具；和一處理器，與檢測(cè)器相連用于接收來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)，其中所述第一激發(fā)光單元包括至少兩個(gè)不同的光源。
43.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中所述第一激發(fā)光單元包括至少4個(gè)不同光源，如至少6個(gè)不同光源，如至少8個(gè)不同光源，如至少10個(gè)不同光源。
44.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中不同光源發(fā)射不同波長(zhǎng)的光。
45.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，包括一具有透鏡單元的光學(xué)系統(tǒng)，其中透鏡單元具有一微透鏡陣列，該微透鏡陣列包括多個(gè)以二維方式排列的透鏡，用于接收激發(fā)光并產(chǎn)生朝向樣品板的照射光；其中透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，該照射光以高的照射效率被投射到樣品板的照射區(qū)上。
46.一種檢測(cè)樣品熒光的方法，所述方法包括將樣品排列在樣品板上；用具有至少一個(gè)光源的激發(fā)光單元以激發(fā)光照射樣品；和用包括至少一個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)單元檢測(cè)樣品的熒光信號(hào)，其中檢測(cè)器具有至少 100，000個(gè)活性檢測(cè)元件。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中樣品包含顆粒。
48.根據(jù)權(quán)利要求46-47任一項(xiàng)所述的方法，其中顆?；蛘哳w粒上或內(nèi)部所含的物質(zhì)具有光致發(fā)光活性，當(dāng)樣品被照射時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。
49.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用光致發(fā)光活性材料標(biāo)記顆粒，該光致發(fā)光活性材料優(yōu)選熒光材料。
50.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中顆粒選自動(dòng)物細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)細(xì)胞，選自真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞和選自細(xì)菌。
51.根據(jù)權(quán)利要求46-50中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在樣品支架上放置至少兩種不同類型的樣品器具，如樣品板、顯微鏡載玻片或血球計(jì)數(shù)室。
52.根據(jù)權(quán)利要求46-51中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括讀取代表樣品支架預(yù)定尺寸性質(zhì)的標(biāo)志。
53.根據(jù)權(quán)利要求46-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中光源選自發(fā)光二極管、激光二極管、激光、熱光源和固態(tài)光源。
54.根據(jù)權(quán)利要求46-53中任一項(xiàng)所述的方法，其中激發(fā)光單元包括多個(gè)光源。
55.根據(jù)權(quán)利要求46-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)器以其活性區(qū)的尺寸、活性檢測(cè)元件的數(shù)量以及反應(yīng)性為特征。
56.根據(jù)權(quán)利要求46-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)單元包括至少一個(gè)具有至少400，000個(gè)活性檢測(cè)元件的檢測(cè)器，更優(yōu)選至少1，000, 000個(gè)活性檢測(cè)元件，更優(yōu)選 2，000, 000個(gè)活性檢測(cè)元件。
57.根據(jù)權(quán)利要求46-56中任一項(xiàng)所述的方法，其中活性檢測(cè)元件的尺寸小于10μ m， 優(yōu)選5 μ m，更優(yōu)選3 μ m或更小。
58.根據(jù)權(quán)利要求46-57中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以二維方式排列一組檢測(cè)器，以同時(shí)獲得樣品的光譜信息。
59.根據(jù)權(quán)利要求46-58中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括設(shè)置第一聚焦單元，用于使激發(fā)光聚焦到樣品上。
60.根據(jù)權(quán)利要求46-59中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括設(shè)置第二聚焦單元，用于使熒光信號(hào)聚焦到檢測(cè)單元上。
61.根據(jù)權(quán)利要求46-60中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一聚焦單元和第二聚焦單元選自透鏡和一組透鏡。
62.根據(jù)權(quán)利要求46-61中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一聚焦單元和第二聚焦單元提供40X或更低的固定放大率，優(yōu)選20X或更低，更優(yōu)選IOX或更低。
63.根據(jù)權(quán)利要求46-62中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在來(lái)自至少一個(gè)光源的激發(fā)光光路上插入一激發(fā)濾光器，用于在照射樣品前將激發(fā)光分離成多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)帶。
64.根據(jù)權(quán)利要求46-63中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在朝向至少一個(gè)檢測(cè)器的發(fā)射光光路上插入一發(fā)射濾光器，用于在檢測(cè)單元檢測(cè)熒光信號(hào)之前將熒光信號(hào)分離成多個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)帶。
65.根據(jù)權(quán)利要求46-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器選自干擾濾光器、吸收濾光器、低通濾光器、高通濾光器和帶通濾光器，其中激發(fā)濾光器優(yōu)選低通濾光器而發(fā)射濾光器優(yōu)選高通濾光器。
66.根據(jù)權(quán)利要求46-65中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)分別選擇激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器的組合，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)帶和發(fā)射波長(zhǎng)帶的組合進(jìn)行分析。
67.根據(jù)權(quán)利要求46-66中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用干涉儀調(diào)節(jié)樣品發(fā)出的熒光信號(hào)。
68.根據(jù)權(quán)利要求46-67中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用致動(dòng)器移動(dòng)樣品板和/ 或至少一個(gè)單元以調(diào)節(jié)樣品發(fā)射的光。
69.根據(jù)權(quán)利要求46-68中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用圖像準(zhǔn)直單元將顯示不同光譜信息的樣品的多個(gè)圖像生成一個(gè)準(zhǔn)直圖像，所述多個(gè)圖像獲取自在不同或?qū)嵸|(zhì)上不同條件下獲得的多個(gè)熒光信號(hào)。
70.根據(jù)權(quán)利要求46-69中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用控制單元將樣品板/樣品支架移動(dòng)到與檢測(cè)單元視野對(duì)應(yīng)的預(yù)定位置上。
71.根據(jù)權(quán)利要求46-70中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將激發(fā)光單元和檢測(cè)單元放置在樣品板的兩側(cè)。
72.根據(jù)權(quán)利要求46-71中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將激發(fā)光單元和檢測(cè)單元放置在樣品板的同側(cè)。
73.根據(jù)權(quán)利要求46-72中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括處理從檢測(cè)單元接收的熒光信號(hào)的信號(hào)數(shù)據(jù)；將信號(hào)數(shù)據(jù)與待評(píng)估的參數(shù)相聯(lián)系；以及評(píng)估該參數(shù)。
74.一種照射樣品的裝置，所述裝置包括一具有照射區(qū)的樣品板，其中樣品放置于照射區(qū)上； 一具有產(chǎn)生激發(fā)光光源的激發(fā)光單元；和一具有微透鏡陣列的透鏡單元，其中微透鏡陣列包括以二維形式排列的多個(gè)透鏡，用于接收激發(fā)光并產(chǎn)生朝向照射區(qū)的照射光；其中，透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，該照射光以高照射效率被投射到樣品板的照射區(qū)上。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的裝置，其中照射區(qū)為至少0.5mm2。
76.根據(jù)權(quán)利要求74-75中任一項(xiàng)所述的裝置，其中照射區(qū)比光源發(fā)射區(qū)面積大至少2倍。
77.根據(jù)權(quán)利要求74-76中任一項(xiàng)所述的裝置，其中樣品包含顆粒。
78.根據(jù)權(quán)利要求74-77中任一項(xiàng)所述的裝置，其中顆?；蛘哳w粒上面或內(nèi)部所含的物質(zhì)具有光致發(fā)光活性，當(dāng)被照射光照射時(shí)產(chǎn)生熒光。
79.根據(jù)權(quán)利要求74-78中任一項(xiàng)所述的裝置，其中顆粒用熒光活性材料標(biāo)記，優(yōu)選熒光材料。
80.根據(jù)權(quán)利要求74-79中任一項(xiàng)所述的裝置，其中顆粒選自動(dòng)物細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)細(xì)胞，選自真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞和選自細(xì)菌。
81.根據(jù)權(quán)利要求74-80中任一項(xiàng)所述的裝置，其中只將研究的照射區(qū)暴露在照射光下，從而避免熒光信號(hào)衰減。
82.根據(jù)權(quán)利要求74-80中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，未研究的樣品基本上不暴露于照射光中，優(yōu)選地，照射引起樣品的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的變化，如熒光信號(hào)的衰減。
83.根據(jù)權(quán)利要求74-82中任一項(xiàng)所述的裝置，其中光源選自分散光源、發(fā)光二極管、 激光二極管和激光。
84.根據(jù)權(quán)利要求74-83中任一項(xiàng)所述的裝置，其中光源包括一發(fā)射元件，其發(fā)射面積大于0. 5mm2，優(yōu)選大于1. Omm20
85.根據(jù)權(quán)利要求74-84中任一項(xiàng)所述的裝置，其中光源放置在與照射區(qū)平面平行的光源板上，相對(duì)于光源平板的定位精確度偏差為Imm或更小。
86.根據(jù)權(quán)利要求74-85中任一項(xiàng)所述的裝置，其中激發(fā)單元包括多個(gè)光源，優(yōu)選一體式裝配。
87.根據(jù)權(quán)利要求74-86中任一項(xiàng)所述的裝置，其中光源相對(duì)于至少一個(gè)其它單元和/ 或樣品板來(lái)排列。
88.根據(jù)權(quán)利要求74-87中任一項(xiàng)所述的裝置，其中排列方式包括使光源向至少一個(gè)其它單元和/或樣品板相對(duì)移動(dòng)Imm或更小。
89.根據(jù)權(quán)利要求74-88中任一項(xiàng)所述的裝置，其中排列方式影響照射區(qū)上照射光的均勻性，優(yōu)選理想排列方式產(chǎn)生最小的照射變化。
90.根據(jù)權(quán)利要求74-89中任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包括一準(zhǔn)直單元，以接收激發(fā)光并產(chǎn)生準(zhǔn)直的激發(fā)光。
91.根據(jù)權(quán)利要求74-90中任一項(xiàng)所述的裝置，其中準(zhǔn)直單元包括一組透鏡。
92.根據(jù)權(quán)利要求74-91中任一項(xiàng)所述的裝置，其中準(zhǔn)直單元增加空間角度，通過(guò)該空間角度來(lái)收集來(lái)自激發(fā)單元的激發(fā)光。
93.根據(jù)權(quán)利要求74-92中任一項(xiàng)所述的裝置，其中微透鏡陣列增加照射光的平行度。
94.根據(jù)權(quán)利要求74-93中任一項(xiàng)所述的裝置，其中聚焦到微透鏡陣列上的激發(fā)光的發(fā)散角為0. Imrad或更小，優(yōu)選0. 05mrad或更小，更優(yōu)選0. 02mrad或更小。
95.根據(jù)權(quán)利要求74-94中任一項(xiàng)所述的裝置，其中微透鏡陣列的多個(gè)透鏡中每個(gè)透鏡產(chǎn)生與被分析的樣品區(qū)域尺寸相似的圖像，優(yōu)選地產(chǎn)生的圖像實(shí)質(zhì)上是矩形的。
96.根據(jù)權(quán)利要求74-95中任一項(xiàng)所述的裝置，其中多個(gè)透鏡包括至少4個(gè)透鏡，優(yōu)選多于4個(gè)透鏡，更優(yōu)選多于50個(gè)透鏡元件，更優(yōu)選多于100個(gè)透鏡元件。
97.根據(jù)權(quán)利要求74-96中任一項(xiàng)所述的裝置，其中透鏡是排列成組的半球形透鏡，優(yōu)選兩個(gè)所述組排成一系列從而形成透鏡陣列。
98.根據(jù)權(quán)利要求74-97中任一項(xiàng)所述的裝置，其中透鏡的尺寸在0.5 3mm之間，優(yōu)選在1 2mm之間。
99.根據(jù)權(quán)利要求74-98中任一項(xiàng)所述的裝置，其中微透鏡陣列的尺寸小于20mm，所述尺寸是透鏡陣列在垂直于激發(fā)-樣品軸方向上的直徑。
100.根據(jù)權(quán)利要求74-99中任一項(xiàng)所述的裝置，其中透鏡單元包括第一透鏡陣列，相反方向上有第二透鏡陣列。
101.根據(jù)權(quán)利要求74-100中任一項(xiàng)所述的裝置，其中第一透鏡陣列和第二透鏡陣列的選擇是基于增強(qiáng)照射效率和/或減小照射變化和/或?qū)为?dú)的光學(xué)元件的光學(xué)特征整合到透鏡陣列的光學(xué)效果中。
102.根據(jù)權(quán)利要求74-101中任一項(xiàng)所述的裝置，其中微透鏡陣列封裝在包括有用于排列和固定微透鏡陣列的工具的盒子中。
103.根據(jù)權(quán)利要求74-102中任一項(xiàng)所述的裝置，其中盒子是以鑄型用聚合物制成。
104.根據(jù)權(quán)利要求74-103中任一項(xiàng)所述的裝置，其中透鏡的模式優(yōu)選與激發(fā)光束的形狀相似。
105.根據(jù)權(quán)利要求74-104中任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包括一波長(zhǎng)分離單元，用于接收照射光并限定波長(zhǎng)帶和照射光的極性。
106.根據(jù)權(quán)利要求74-105中任一項(xiàng)所述的裝置，其中波長(zhǎng)分離單元是選自干涉濾光器、吸收濾光器和激發(fā)濾光器的光譜濾光工具。
107.根據(jù)權(quán)利要求74-106中任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包括一聚焦單元，用于將照射光聚焦到樣品板的照射區(qū)。
108.根據(jù)權(quán)利要求74-107中任一項(xiàng)所述的裝置，其中聚焦單元選自一個(gè)透鏡和一組透鏡。
109.根據(jù)權(quán)利要求74-108中任一項(xiàng)所述的裝置，其中裝置的尺寸在沿激發(fā)-樣品軸方向上的長(zhǎng)度小于100mm，優(yōu)選小于60mm，更優(yōu)選小于40mm，更優(yōu)選甚至小于20mm，如小于 15mm。
110.根據(jù)權(quán)利要求74-109中任一項(xiàng)所述的裝置，其中單元排列在或基本上排列在光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸上，優(yōu)選的排列方式是照射光直接朝向成像系統(tǒng)的檢測(cè)單元。
111.根據(jù)權(quán)利要求74-110中任一項(xiàng)所述的裝置，其中單元基本上偏離光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸排列，優(yōu)選的排列方式包括一雙色鏡，該雙色鏡將照射光沿著成像系統(tǒng)的光軸反射到樣品上。
112.根據(jù)權(quán)利要求74-111中任一項(xiàng)所述的裝置，其中照射效率高于75%，優(yōu)選高于 80 %，更優(yōu)選高于85 %，更優(yōu)選高于90 %，甚至更優(yōu)選高于95 %。
113.根據(jù)權(quán)利要求74-112中任一項(xiàng)所述的裝置，其中照射的均勻性以樣品材料成像區(qū)的照射變化定義，該照射均勻性小于0. 50，優(yōu)選小于0. 40，更優(yōu)選小于0. 30，更優(yōu)選小于 0. 20，更優(yōu)選小于0. 15，更優(yōu)選小于0. 10，更優(yōu)選小于0. 05。
114.根據(jù)權(quán)利要求74-113中任一項(xiàng)所述的裝置，其中照射效率和照射變化是在未使用擴(kuò)散元件的條件下獲得的。
115.根據(jù)權(quán)利要求74-114中任一項(xiàng)所述的裝置，其中照射效率和照射偏差是在實(shí)質(zhì)上未使照射工具單元散焦的條件下獲得的。
116.一種照射樣品的方法，所述方法包括 將樣品放置在一具有照射區(qū)的樣品板上； 用具有光源的激發(fā)單元產(chǎn)生激發(fā)光；和用包括微透鏡陣列的透鏡單元產(chǎn)生投向照射區(qū)的照射光，微透鏡陣列具有以二維方式排列的多個(gè)透鏡；其中透鏡單元產(chǎn)生均勻的照射光，該照射光以高照射效率被投射到樣品板的照射區(qū)上。
117.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中照射區(qū)至少為0.5mm2。
118.根據(jù)權(quán)利要求116-117中任一項(xiàng)所述的方法，其中照射區(qū)比光源發(fā)射區(qū)尺寸大至少2倍。
119.根據(jù)權(quán)利要求116-118中任一項(xiàng)所述的方法，其中樣品包含顆粒。
120.根據(jù)權(quán)利要求116-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中顆?；蛘哳w粒上或內(nèi)部所含的物質(zhì)具有光致發(fā)光活性，當(dāng)被照射光照射時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光。
121.根據(jù)權(quán)利要求116-120中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用光致發(fā)光材料標(biāo)記顆粒，優(yōu)選熒光材料。
122.根據(jù)權(quán)利要求116-121中任一項(xiàng)所述的方法，共中顆粒選自動(dòng)物細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)細(xì)胞，選自真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞和選自細(xì)菌。
123.根據(jù)權(quán)利要求116-122中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將照射區(qū)暴露在照射光下。
124.根據(jù)權(quán)利要求116-123中任一項(xiàng)所述的方法，其中光源選自發(fā)散光源、發(fā)光二極管、激光二極管和激光。
125.根據(jù)權(quán)利要求116-1M中任一項(xiàng)所述的方法，其中光源包括一發(fā)射區(qū)面積大于 0. 5mm2的發(fā)射元件，優(yōu)選大于1. 0mm2。
126.根據(jù)權(quán)利要求116-125中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將光源放置在與照射區(qū)平面平行的光源板上，該照射區(qū)平面相對(duì)于光源平板的定位精確度偏差為Imm或更小。
127.根據(jù)權(quán)利要求116-1 中任一項(xiàng)所述的方法，其中激發(fā)單元包括多個(gè)光源，優(yōu)選一體式裝配。
128.根據(jù)權(quán)利要求116-127中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將光源相對(duì)于至少一個(gè)其它單元和/或樣品板進(jìn)行排列。
129.根據(jù)權(quán)利要求116-1 中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括為了排列而將光源相對(duì)于至少一個(gè)其它單元和/或樣品板移動(dòng)Imm或更小。
130.根據(jù)權(quán)利要求116-1 中任一項(xiàng)所述的方法，其中該排列方式影響照射區(qū)上的照射光均勻性，優(yōu)選地，理想的排列產(chǎn)生最小的照射變化。
131.根據(jù)權(quán)利要求116-130中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括從激發(fā)光用準(zhǔn)直單元產(chǎn)生朝向透鏡單元的準(zhǔn)直激發(fā)光。
132.根據(jù)權(quán)利要求116-131中任一項(xiàng)所述的方法，其中準(zhǔn)直單元包括一組透鏡。
133.根據(jù)權(quán)利要求116-132中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括增加立體角度，通過(guò)該立體角度收集來(lái)自激發(fā)單元的激發(fā)光。
134.根據(jù)權(quán)利要求116-133中任一項(xiàng)所述的方法，其中聚焦于微透鏡陣列上的準(zhǔn)直激發(fā)光的發(fā)散角為0. Imrad或更小，優(yōu)選0. 05mrad或更小，更優(yōu)選0. 02mrad或更小。
135.根據(jù)權(quán)利要求116-134中任一項(xiàng)所述的方法，其中微透鏡陣列的多個(gè)透鏡中每個(gè)透鏡產(chǎn)生與被分析的樣品區(qū)尺寸相似的圖像，優(yōu)選產(chǎn)生的圖像實(shí)質(zhì)上是矩形的。
136.根據(jù)權(quán)利要求116-135中任一項(xiàng)所述的方法，其中多個(gè)透鏡包括至少4個(gè)透鏡，優(yōu)選多于4個(gè)透鏡，更優(yōu)選多于50個(gè)透鏡元件，更優(yōu)選多于100個(gè)透鏡元件。
137.根據(jù)權(quán)利要求116-136中任一項(xiàng)所述的方法，其中透鏡是半球形的。
138.根據(jù)權(quán)利要求116-137中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將透鏡排列成組，優(yōu)選兩個(gè)所述組排成一系列從而形成透鏡陣列。
139.根據(jù)權(quán)利要求116-138中任一項(xiàng)所述的方法，其中透鏡的尺寸在0.5 3mm之間， 優(yōu)選在1 2mm之間。
140.根據(jù)權(quán)利要求116-139中任一項(xiàng)所述的方法，其中微透鏡陣列的尺寸小于20mm， 所述尺寸是該透鏡陣列垂直于激發(fā)-樣品軸方向上的直徑。
141.根據(jù)權(quán)利要求116-140中任一項(xiàng)所述的方法，其中透鏡單元包括第一微透鏡陣列，相反方向有第二微透鏡陣列。
142.根據(jù)權(quán)利要求116-141中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括基于增強(qiáng)照射效率和/ 或降低照射變化和/或?qū)为?dú)的光學(xué)元件的光學(xué)特征整合到透鏡陣列的光學(xué)效果中來(lái)選擇第一微透鏡陣列和第二微透鏡陣列。
143.根據(jù)權(quán)利要求116-142中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將微透鏡陣列封裝在一盒子中，該盒子包括用于排列和固定微透鏡陣列的工具。
144.根據(jù)權(quán)利要求116-143中任一項(xiàng)所述的方法，其中盒子是以鑄型用聚合物制成。
145.根據(jù)權(quán)利要求116-144中任一項(xiàng)所述的方法，其中透鏡的模式優(yōu)選與激發(fā)光束的形狀相似。
146.根據(jù)權(quán)利要求116-145中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用一波長(zhǎng)分離單元限定照射光的波長(zhǎng)帶和極性。
147.根據(jù)權(quán)利要求116-146中任一項(xiàng)所述的方法，其中波長(zhǎng)分離單元是選自干涉濾光器、吸收濾光器和激發(fā)濾光器的光譜濾波工具。
148.根據(jù)權(quán)利要求116-147中任一項(xiàng)所述的方法，其中波長(zhǎng)分離是用兩個(gè)或更多個(gè)濾光器來(lái)獲得，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)濾光器之間的變化產(chǎn)生圖像位置的有限移動(dòng)，優(yōu)選通過(guò)轉(zhuǎn)換函數(shù)抵消任何移動(dòng)，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)換函數(shù)是預(yù)定的轉(zhuǎn)換函數(shù)。
149.根據(jù)權(quán)利要求116-148中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)換實(shí)質(zhì)上是移動(dòng)轉(zhuǎn)換，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)換可以表示為圖像的水平和/或垂直方向上限定的像素?cái)?shù)的移動(dòng)。
150.根據(jù)權(quán)利要求116-149中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)換是一移動(dòng)轉(zhuǎn)換，移動(dòng)程度實(shí)質(zhì)上取決于圖像中的位置，優(yōu)選將水平和/或垂直的移動(dòng)定義為由圖像像素指數(shù)的分?jǐn)?shù)來(lái)確定的恒定移動(dòng)和可變移動(dòng)。
151.根據(jù)權(quán)利要求116-150中任一項(xiàng)所述的方法，其中水平和/或垂直方向的移動(dòng)程度表示為圖像像素指數(shù)的多項(xiàng)式函數(shù)。
152.根據(jù)權(quán)利要求116-151中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用聚焦單元將照射光聚焦到樣品板的照射區(qū)。
153.根據(jù)權(quán)利要求116-152中任一項(xiàng)所述的方法，其中聚焦單元選自一個(gè)透鏡和一組透鏡。
154.根據(jù)權(quán)利要求116-153中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用微透鏡陣列增加進(jìn)入聚焦單元的照射光平行度。
155.根據(jù)權(quán)利要求116-1M中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將單元排列在或?qū)嵸|(zhì)上排列在光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸上，優(yōu)選的排列方式是照射光直接朝向成像系統(tǒng)的檢測(cè)單元。
156.根據(jù)權(quán)利要求116-155中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將單元實(shí)質(zhì)上偏離光致發(fā)光成像系統(tǒng)的光軸排列，優(yōu)選的排列方式包括一雙色鏡，該雙色鏡將照射光沿著成像系統(tǒng)的光軸反射到樣品上。
157.根據(jù)權(quán)利要求116-156中任一項(xiàng)所述的方法，其中照射效率高于75%，優(yōu)選高于 80 %，更優(yōu)選高于85 %，更優(yōu)選高于90 %，甚至更優(yōu)選高于95 %。
158.根據(jù)權(quán)利要求116-157中任一項(xiàng)所述的方法，其中照射的均勻性是以樣品材料成像區(qū)的照射變化定義，小于0. 50，優(yōu)選小于0. 40，更優(yōu)選小于0. 30，更優(yōu)選小于0. 20，更優(yōu)選小于0. 15，更優(yōu)選小于0. 10，更優(yōu)選小于0. 05。
159.根據(jù)權(quán)利要求116-158中任一項(xiàng)所述的方法，其中照射效率和照射偏差是在未使用擴(kuò)散元件的條件下獲得的。
160.根據(jù)權(quán)利要求116-159中任一項(xiàng)所述的方法，其中照射效率和照射偏差是在實(shí)質(zhì)上未使單元散焦的條件下獲得的。
161.一種檢測(cè)受試細(xì)胞活力的方法，所述方法包括將受試細(xì)胞與4'，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料或DAPI的取代變體混合；使細(xì)胞染色一段時(shí)間，最多60分鐘，如30分鐘，如20分鐘，如最多10分鐘；獲得染色的細(xì)胞樣品，其中只有無(wú)活力細(xì)胞被染色；將染色的受試細(xì)胞暴露于激發(fā)光下；檢測(cè)染色受試細(xì)胞的熒光信號(hào)；和對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以鑒別受試細(xì)胞是否無(wú)活力。
162.根據(jù)權(quán)利要求161所述的方法，其中受試細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。
163.根據(jù)權(quán)利要求161-162中任一項(xiàng)所述的方法，其中用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)染料或DAPI的取代變體進(jìn)行多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)和無(wú)活力鑒別。
164.根據(jù)權(quán)利要求161-163中任一項(xiàng)所述的方法，其中受試細(xì)胞選自培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞。
165.根據(jù)權(quán)利要求161-164中任一項(xiàng)所述的方法，其中受試細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。
166.根據(jù)權(quán)利要求161-165中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用以下的組合以 2. 5μ g/ml的組合濃度包被樣品器具吖啶橙染料、或其它吖啶染色劑，如3，6-二氨基吖啶鹽酸鹽、6，9_ 二氨基-2-乙氧基-吖啶乳酸鹽、喹吖因二鹽酸鹽、雙-N-甲基吖啶硝酸鹽、 10-十二烷基吖啶橙溴、氮芥喹丫因二鹽酸鹽、鹽酸氮蒽黃或9-異硫氰酸-10-甲基吖啶酯三氟甲基磺酸鹽；與4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/DAPI的取代變體。
167.根據(jù)權(quán)利要求161-166中任一項(xiàng)所述的方法，其中吖啶橙染料使活的受試細(xì)胞和無(wú)活力的受試細(xì)胞染色。
168.根據(jù)權(quán)利要求161-167中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在受控環(huán)境下制備受試細(xì)胞。
169.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述在受控環(huán)境下制備受試細(xì)胞包括在37°C含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下用RPMI培養(yǎng)基補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞以獲得受試細(xì)胞。
170.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中在受控環(huán)境下制備受試細(xì)胞包括在37°C含5% CO2的濕潤(rùn)空氣條件下用DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞；和當(dāng)克隆率達(dá)到50%時(shí)用0. 5ml胰蛋白酶收集培養(yǎng)的細(xì)胞； 用5ml培養(yǎng)基(DMEM+10% FCS)中和收集的細(xì)胞以獲得受試細(xì)胞。
171.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中在受控環(huán)境下制備包括使細(xì)胞在下于補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以獲得受試細(xì)胞。
172.根據(jù)權(quán)利要求171所述的方法，其中培養(yǎng)基包sDrosophila培養(yǎng)基或Grace’ s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基。
173.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中在受控環(huán)境下制備包括 將脾臟置于冰冷的PBS中并輕輕研磨以形成懸浮液；將懸浮液于300g下離心10分鐘以分離顆粒；將顆粒重懸于Iml 0. 83% NH4Cl中以裂解細(xì)胞中的紅細(xì)胞；將裂解的紅細(xì)胞在冰上孵育3分鐘；將孵育的細(xì)胞加到Hml PBS中并在300g下離心10分鐘；將脾細(xì)胞重懸于補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中，形成細(xì)胞團(tuán)；使細(xì)胞團(tuán)沉淀并且用移液管移走，剩下的單一細(xì)胞懸液為受試細(xì)胞。
174.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中在受控環(huán)境下制備包括 在層流凈化罩中無(wú)菌收集骨髓細(xì)胞；無(wú)菌去除雙邊的脛骨和股骨以獲得干凈的骨髓細(xì)胞；將干凈的骨髓細(xì)胞置于含IOml 70%乙醇的皮氏培養(yǎng)皿中以獲得細(xì)胞溶液；兩分鐘后將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到冰冷的PBS中；用5ml冷PBS從細(xì)胞溶液沖洗牛骨髓腔來(lái)進(jìn)行處理；收集來(lái)自每個(gè)骨頭的處理后的細(xì)胞；將收集的細(xì)胞在300g下離心10分鐘；丟棄上清液并沖洗細(xì)胞顆粒至少一次；將細(xì)胞顆粒重懸于補(bǔ)以10%熱-失活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μ g/ml鏈霉素的RPMI中以獲得受試細(xì)胞。
175.根據(jù)權(quán)利要求161-168中任一項(xiàng)所述的方法，其中在受控環(huán)境下制備包括 取少量人靜脈血樣品；和用PBS將血樣稀釋至少5倍以獲得受試細(xì)胞。
176.根據(jù)權(quán)利要求161-175中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括用活塞將受試細(xì)胞注射到樣品器具中。
177.根據(jù)權(quán)利要求161-176中任一項(xiàng)所述的方法，其中激發(fā)光源選自熱光源如鹵素?zé)?、或氣體燈如氙氣燈、發(fā)光二極管、激光或激光二極管。
178.根據(jù)權(quán)利要求161-177中任一項(xiàng)所述的方法，其中處理包括分析熒光信號(hào)以計(jì)算細(xì)胞中無(wú)活力細(xì)胞的數(shù)量。
179.—種標(biāo)記受試細(xì)胞的裝置，所述裝置包括一樣品器具，至少部分被4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料或DAPI取代變體包被，其中DAPI/DAPI取代變體只使無(wú)活力細(xì)胞染色；一受試細(xì)胞注射單元，用于將受試細(xì)胞裝載到樣品器具中； 一激發(fā)單元，用于將注射的受試細(xì)胞暴露于激發(fā)光中； 一檢測(cè)單元，用于檢測(cè)裝載的受試細(xì)胞發(fā)出的熒光信號(hào)；和一處理器，用于處理熒光信號(hào)以評(píng)估受試細(xì)胞是否無(wú)活力。
180.根據(jù)權(quán)利要求179所述的裝置，其中受試細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。
181.根據(jù)權(quán)利要求179-180中任一項(xiàng)所述的裝置，其中用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)染料/DAPI取代變體進(jìn)行多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)和無(wú)活力鑒別。
182.根據(jù)權(quán)利要求179-181中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞選自培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞。
183.根據(jù)權(quán)利要求179-182中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。
184.根據(jù)權(quán)利要求179-183中任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包括一包被單元，用于使樣品器具內(nèi)表面至少部分被4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/DAPI取代變體包被。
185.根據(jù)權(quán)利要求179-184中任一項(xiàng)所述的裝置，其中用以下的組合以2.5 μ g/ml的組合濃度包被樣品器具吖啶橙染料、或其它吖啶染色劑，如3，6_ 二氨基吖啶鹽酸鹽、6， 9- 二氨基-2-乙氧基-吖啶乳酸鹽、喹吖因二鹽酸鹽、雙-N-甲基吖啶硝酸鹽、10-十二烷基吖啶橙溴、氮芥喹丫因二鹽酸鹽、鹽酸氮蒽黃或9-異硫氰酸-10-甲基吖啶酯三氟甲基磺酸鹽；與4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) /DAPI的取代變體。
186.根據(jù)權(quán)利要求179-185中任一項(xiàng)所述的裝置，其中吖啶橙染料使活的受試細(xì)胞和無(wú)活力的受試細(xì)胞染色。
187.根據(jù)權(quán)利要求179-186中任一項(xiàng)所述的裝置，其中受試細(xì)胞裝載單元包括一活
188.根據(jù)權(quán)利要求179-187中任一項(xiàng)所述的裝置，其中激發(fā)單元包括至少一個(gè)光源， 該光源選自熱光源如商素?zé)?、或氣體燈如氙氣燈、發(fā)光二極管、激光或激光二極管。
189.根據(jù)權(quán)利要求179-188中任一項(xiàng)所述的裝置，其中檢測(cè)單元包括至少一個(gè)具有多個(gè)檢測(cè)元件的檢測(cè)器。
190.根據(jù)權(quán)利要求179-189中任一項(xiàng)所述的裝置，其中處理器包括一分析熒光信號(hào)以計(jì)算無(wú)活力細(xì)胞數(shù)量的分析儀。
191.一種提供細(xì)胞信息的方法，所述方法包括 用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞；向轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入巰基反應(yīng)分子以獲得細(xì)胞溶液； 將細(xì)胞溶液暴露在激發(fā)光下； 檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞溶液的發(fā)射光；和對(duì)發(fā)射光進(jìn)行處理以獲得關(guān)于細(xì)胞的信息。
192.根據(jù)權(quán)利要求191所述的方法，其中信息包括轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性水平。
193.根據(jù)權(quán)利要求191-192中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞選自培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞。
194.根據(jù)權(quán)利要求191-193中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。
195.根據(jù)權(quán)利要求191-194中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括添加和混合細(xì)胞不滲透性的DNA染色劑。
196.根據(jù)權(quán)利要求191-195中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞不滲透性的DNA染色劑選自碘化丙錠和吖啶同源二聚體。
197.根據(jù)權(quán)利要求191-196中任一項(xiàng)所述的方法，其中核酸選自熒光蛋白和小干擾RNA。
198.根據(jù)權(quán)利要求191-197中任一項(xiàng)所述的方法，其中巰基反應(yīng)分子選自馬來(lái)酰亞胺，如DACM。
199.根據(jù)權(quán)利要求191-198中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)巰基反應(yīng)分子是DACM時(shí)，測(cè)定活細(xì)胞的激發(fā)光為紫外光/紫光而發(fā)射光為藍(lán)光。
200.根據(jù)權(quán)利要求191-199中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)?shù)饣V用作細(xì)胞不滲透性染色劑時(shí)，測(cè)定無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光為綠光而發(fā)射光為紅光；和當(dāng)吖啶同源二聚體用作細(xì)胞不滲透性染色劑時(shí)，測(cè)定無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光為藍(lán)光而發(fā)射光為綠光。
201.根據(jù)權(quán)利要求191-200中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)用紫外光或紫光激發(fā)時(shí)，表達(dá)BFP的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光； 當(dāng)用紫光或藍(lán)光激光時(shí)，表達(dá)CFP的細(xì)胞發(fā)出青光； 當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)，表達(dá)GFP的細(xì)胞發(fā)出綠光； 當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)，表達(dá)YFP的細(xì)胞發(fā)出黃光； 當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)，表達(dá)dsRed或其變體的細(xì)胞發(fā)出紅光； 當(dāng)用紫外光或紫光激發(fā)時(shí)，含有SiRNA的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光； 當(dāng)用紫光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出青光； 當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出綠光； 當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出黃光； 當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出紅光。
202.根據(jù)權(quán)利要求191-201中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。
203.根據(jù)權(quán)利要求191-202中任一項(xiàng)所述的方法，其中用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸與巰基反應(yīng)分子相結(jié)合鑒別關(guān)于多個(gè)細(xì)胞的信息。
204.根據(jù)權(quán)利要求191-203中任一項(xiàng)所述的方法，其中激發(fā)光來(lái)自選自熱光源如鹵素?zé)?、或氣體燈如氙氣燈、發(fā)光二極管、激光或激光二極管的光源。
205.根據(jù)權(quán)利要求191-204中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)包括在至少一個(gè)檢測(cè)器接收發(fā)射光。
206.根據(jù)權(quán)利要求191-205中任一項(xiàng)所述的方法，其中處理包括分析發(fā)射光以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性水平。
207.一種測(cè)定細(xì)胞信息的裝置，所述裝置包括一轉(zhuǎn)染單元，用于以熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞； 一混合單元，用于向轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入巰基反應(yīng)分子以獲得細(xì)胞溶液； 一激發(fā)單元，用于使細(xì)胞溶液暴露在激發(fā)光下； 一檢測(cè)單元，用于檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞溶液的發(fā)射光；和一處理器，用于對(duì)發(fā)射光進(jìn)行處理以獲得關(guān)于細(xì)胞的信息。
208.根據(jù)權(quán)利要求207所述的裝置，其中信息包括轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性水平。
209.根據(jù)權(quán)利要求207-208中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞選自培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞。
210.根據(jù)權(quán)利要求207-209中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系懸浮液、昆蟲(chóng)細(xì)胞系如Drosophila melanogaster khneider-2、人胚胎細(xì)胞系、原代細(xì)胞和人血細(xì)胞。
211.根據(jù)權(quán)利要求207-210中任一項(xiàng)所述的裝置，其中混合單元用于添加細(xì)胞不滲透性的DNA染色劑。
212.根據(jù)權(quán)利要求207-211中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞不滲透性的DNA染色劑選自碘化丙錠和吖啶同源二聚體。
213.根據(jù)權(quán)利要求207-212中任一項(xiàng)所述的裝置，其中核酸選自熒光蛋白和小干擾RNA。
214.根據(jù)權(quán)利要求207-213中任一項(xiàng)所述的裝置，其中巰基反應(yīng)分子選自馬來(lái)酰亞胺，如DACM。
215.根據(jù)權(quán)利要求207-214中任一項(xiàng)所述的裝置，其中當(dāng)巰基反應(yīng)分子是DACM時(shí)，測(cè)定活細(xì)胞的激發(fā)光為紫外光/紫光而發(fā)射光為藍(lán)光。
216.根據(jù)權(quán)利要求207-215中任一項(xiàng)所述的裝置，其中當(dāng)?shù)饣V用作細(xì)胞不滲透性染色劑時(shí)，測(cè)定無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光為綠光而發(fā)射光為紅光；和當(dāng)吖啶同源二聚體用作細(xì)胞不滲透性染色劑時(shí)，測(cè)定無(wú)活力細(xì)胞的激發(fā)光為藍(lán)光而發(fā)射光為綠光。
217.根據(jù)權(quán)利要求207-216中任一項(xiàng)所述的裝置，基中 當(dāng)用紫外光或紫光激發(fā)時(shí)，表達(dá)BFP的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光；當(dāng)用紫光或藍(lán)光激光時(shí)，表達(dá)CFP的細(xì)胞發(fā)出青光； 當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)，表達(dá)GFP的細(xì)胞發(fā)出綠光； 當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)，表達(dá)YFP的細(xì)胞發(fā)出黃光； 當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)，表達(dá)dsRed或其變體的細(xì)胞發(fā)出紅光； 當(dāng)用紫外光或紫光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)光； 當(dāng)用紫光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出青光； 當(dāng)用藍(lán)光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出綠光； 當(dāng)用藍(lán)光或綠光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出黃光； 當(dāng)用綠光激發(fā)時(shí)，含有siRNA的細(xì)胞發(fā)出紅光。
218.根據(jù)權(quán)利要求207-217中任一項(xiàng)所述的裝置，其中細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。
219.根據(jù)權(quán)利要求207-218中任一項(xiàng)所述的裝置，其中用熒光蛋白或熒光標(biāo)記的核酸與巰基反應(yīng)分子相結(jié)合鑒別關(guān)于多個(gè)細(xì)胞的信息。
220.根據(jù)權(quán)利要求207-219中任一項(xiàng)所述的裝置，其中激發(fā)單元包括選自熱光源如鹵素?zé)?、或氣體燈如氙氣燈、發(fā)光二極管、激光或激光二極管的至少一個(gè)光源。
221.根據(jù)權(quán)利要求207-220中任一項(xiàng)所述的裝置，其中檢測(cè)單元包括至少一個(gè)具有多個(gè)檢測(cè)元件的檢測(cè)器。
222.根據(jù)權(quán)利要求207-221中任一項(xiàng)所述的裝置，其中數(shù)據(jù)處理器包括一分析發(fā)射光以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性水平的分析儀。
223.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，包括權(quán)利要求1-45和74-115中一個(gè)或多個(gè)特征。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，公開(kāi)了檢測(cè)樣品熒光的裝置。該裝置包括一樣品板，樣品排列于樣品板上；一激發(fā)光單元，包括至少一個(gè)用于照射樣品的光源；和一檢測(cè)單元，包括至少一個(gè)檢測(cè)器，其中檢測(cè)器至少具有100,000個(gè)活性檢測(cè)元件以檢測(cè)樣品的熒光信號(hào)。
文檔編號(hào)G01N33/58GK102257379SQ200980151834
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者弗蘭斯·拉文, 梅特·埃琳娜·絲金德索, 索倫·克加拉夫, 赫勒·弗羅博斯·索倫森, 馬丁·格倫斯畢爾吉 申請(qǐng)人:克莫麥特公司