專利名稱：逆流色譜轉(zhuǎn)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括一種構(gòu)造方法、一種使用方法，以及一種用于逆流色譜(CCC)的螺旋管支架儀的改進(jìn)設(shè)計(jì)。
背景技術(shù)：
色譜是一種將物質(zhì)溶解于流動(dòng)相中，使其通過(guò)固定相，用以分離該物質(zhì)的技術(shù)，使得該物質(zhì)從多種物質(zhì)的復(fù)雜混合物中被純化或者被鑒定。該物質(zhì)包括但不限于(1)氣體，化學(xué)物質(zhì)，(3)生物材料比如DNA、碳水化合物、脂類、多肽、蛋白質(zhì)或者其組合，(4)分子，或者(5)以上所述物質(zhì)的任意組合。利用色譜法分離的物質(zhì)可通過(guò)多種可能連接到儀器上的檢測(cè)裝置進(jìn)行分析。已經(jīng)存在很多色譜法類型以及分離機(jī)理類型的變化并且在研究中經(jīng)常用到。逆流色譜基于液-液分離，其中，流動(dòng)相和固定相均為液態(tài)。該技術(shù)將在流動(dòng)液相中的化合物從固定液相中分離，固定相保持在盤管內(nèi)，并且處于(例如，在行星離心機(jī)中) 旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的力中。逆流色譜早在1970年代就存在了，并且已經(jīng)被成功應(yīng)用于分離化合物或者小分子物質(zhì)。美國(guó)專禾U 3，784，467,3, 775，309,6, 503，398,5, 770，083,5, 354, 473、 5，332，504以及5，215，664。根據(jù)物質(zhì)在兩相間的可溶性，試樣物質(zhì)被分離。溶劑可以以不同的體積比相混合，用以形成兩個(gè)穩(wěn)定的不混溶相，其中所述不混溶相包括色譜法用到的溶劑體系。逆流色譜提供了一種分離或者純化小分子物質(zhì)的通用方法；確實(shí)，現(xiàn)有技術(shù)主要限于小分子的分離、鑒定或者純化。雖然一些先前公開的技術(shù)涉及逆流色譜離心機(jī)，據(jù)稱可分離大分子物質(zhì)，但是那些技術(shù)不能做到像本發(fā)明那樣有效和那樣好。美國(guó)專利4，714，554 和 5，104，531。逆流色譜最早的實(shí)施方案包括一系列色譜柱，這些色譜柱直立安裝并通過(guò)的傳送管路相互連接，色譜柱一端帶有泵。美國(guó)專利3，784，467。試樣物質(zhì)溶解在另一色譜柱的多種固定相混合物中，所述另一色譜柱通過(guò)傳送管路與泵連接并且置于系列色譜柱的其它色譜柱前面。后來(lái)的發(fā)明顯示了如何在圍繞中心軸旋轉(zhuǎn)的螺旋管中裝配連續(xù)的管道用于溶劑的流入和流出，而無(wú)需旋轉(zhuǎn)密封。美國(guó)專利3，775，309。在一個(gè)改進(jìn)中，儀器以行星運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)相的混合，完成扭曲和解扭曲動(dòng)作。在該體系的單一改進(jìn)中，盤管內(nèi)填充了雙相溶劑，輕相移動(dòng)到一端(頭端)而重相移動(dòng)到另一端(尾端)，這依賴于(1)盤管的旋轉(zhuǎn)方向(順時(shí)針或逆時(shí)針)和(2)轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)方向(順時(shí)針或逆時(shí)針)。流動(dòng)相被泵入尾端，與固定相優(yōu)先流動(dòng)的方向相反；因此，處于平衡狀態(tài)的固定相維持在盤管總體積的40-80 %。多余的流動(dòng)相從另一端洗脫出，行星CCC離心機(jī)目前的實(shí)施方案或者應(yīng)用包括螺旋管的不同取向。美國(guó)專利 3，994，805,4, 430，216,4, 532，039 以及 4，714，554。近些年，螺旋管或者卷軸已經(jīng)被由稱為螺旋管支架的框架固定位置的螺旋組織管所取代。美國(guó)專利US2005/0M2040。目前，螺旋管支架的建構(gòu)緩慢而費(fèi)力。第一類型這種儀器通過(guò)將螺旋通道埋入光鋁中2英寸并使徑向通道固定Teflon 管來(lái)構(gòu)建，所述Teflon 管在一個(gè)平面內(nèi)纏繞四個(gè)螺旋。螺旋管支架的優(yōu)點(diǎn)在于(1)整個(gè)帶流道的夾層板沒(méi)有滲漏，及(2)由于管道直徑較小，對(duì)物質(zhì)具有較高的分辨率。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括逆流色譜儀，逆流色譜儀包括一個(gè)或多個(gè)第一表面，其中所述第一表面包括多個(gè)螺旋通道或者凹槽用來(lái)容納管道。第一表面選擇性地包含一個(gè)或多個(gè)徑向通道。第一表面包含入口或出口，或者管道的接入端口。此外該逆流色譜儀還可包括一個(gè)或多個(gè)以下改進(jìn)(1) 一個(gè)或多個(gè)彎曲的徑向通道，(2)通道或者凹槽中的一個(gè)或多個(gè)凸起，用來(lái)將管固定在適當(dāng)位置，(3) 一個(gè)或多個(gè)重物放置的空間，(4) 一個(gè)或多個(gè)可被彈簧鎖固定的壓緊螺釘組合(union)，(5) 一個(gè)或多個(gè)固定器支架(retainer support)，以及(6)—個(gè)或多個(gè)在外表面輔助引導(dǎo)流管(flow tubing)的環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“環(huán)” 包括其它形狀，其能將管道固定在第一外表面上，例如鉤子。徑向通道可在一端或者兩端朝任何方向彎曲。第一表面也可接受潤(rùn)滑劑在頂部的應(yīng)用或涂覆，潤(rùn)滑劑如=TeflorA聚對(duì)二苯甲基(Parylene)或者聚乙二醇液體，用來(lái)保護(hù)管道免受磨損。本發(fā)明也提供一種制造逆流色譜儀的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括一個(gè)或多個(gè)第一表面，其中所述第一表面包括多個(gè)螺旋通道或者凹槽。第一表面可通過(guò)成型工藝制成。優(yōu)選的方法使用三維原型機(jī)(three-dimensional prototyping machine)和容易鑄模的材料。其它可使用的可能的成型工藝包括任意種類的鑄造(molding)、鉆、機(jī)械加工原型(machining prototyping)，或者上述工藝的任意組合。容易鑄模的材料包括，但是不限于以下一種或多種(1)尼龍聚合物，(2)塑料，(3)聚四氟乙烯(Teflon )，(4)聚氯乙烯，(5)聚苯乙烯，(6)聚酰胺PA-220，(7)光敏聚合物，(8) FullCure 材料，(9) Polyjet 3D I^rinte/材料，(10)單體粉末，以及(11)包括金屬或者金屬組合物的顆?；蚍勰ＨS原型機(jī)可使用一種或多種工藝來(lái)形成包括第一表面的一層，例如激光燒結(jié)、紫外線照射、 鉆、機(jī)械加工，或者原型。該制造方法可進(jìn)一步被用來(lái)制造第一表面，包括一個(gè)或多個(gè)以下的改進(jìn)(1) 一個(gè)或多個(gè)直的徑向通道，(2)—個(gè)或多個(gè)彎曲的徑向通道，其中彎曲包括正弦形狀、“S”形、 反“S”形等等，例如，以便于管道的放置和安裝，例如，以避免管道中的彎曲與卷曲，(3)—個(gè)或多個(gè)入口或者出口，或者管道的接入端口，(4) 一個(gè)或多個(gè)重物放置的空間或儲(chǔ)存裝置； (5)—個(gè)或多個(gè)空間，穿過(guò)所述空間，第二表面可被附著，(6) —個(gè)或多個(gè)螺紋，可用來(lái)附著相對(duì)的表面，(7) 一個(gè)或多個(gè)環(huán)，用以固定管道，(8) 一個(gè)或多個(gè)壓緊螺釘組合，被用于固定壓緊螺釘組合的彈簧鎖附著，(9) 一個(gè)或多個(gè)固定器支架，以及(10) —個(gè)或多個(gè)齒輪，及其組合。通過(guò)組合是指具有這10種改進(jìn)類型之中多于一個(gè)的改進(jìn)類型，或者具有帶有單個(gè)改進(jìn)類型至少兩種功能的結(jié)構(gòu)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“齒輪”包括多個(gè)實(shí)施方案，其中一個(gè)或多個(gè)齒輪為(1)直接或者間接附著于一個(gè)或多個(gè)表面，(2)附著于中心軸上，(3)包括在軸承座里，或者(4)上述齒輪位置的任意或者所有組合。徑向通道可在一端或者兩端朝任何方向彎曲。此外，該制造方法可用來(lái)制造第一表面，第一表面包括中心空間，軸可穿過(guò)該中心空間放置。第一表面可包括外圍的壁，用來(lái)形成接受管道的空間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該制造方法可被用來(lái)制造形成第二表面的多個(gè)層，第二表面是第一表面的頂部?！绊敳俊卑ㄗ鳛楦采w、蓋子，或任何其它附于第一表面的附件的任意表 面。第二表面可使用與第一表面相同的材料，采用下述成型方法制成，如，三維原型機(jī)。三維原型機(jī)可用一種或多種工藝來(lái)形成包括第二表面的層，包括激光燒結(jié)、紫外線照射、鉆、 機(jī)械加工，注塑或者原型。該制造方法可進(jìn)一步用于制造第二表面，包括一個(gè)或多個(gè)以下的部分(1)入口或者出口，或者管道的接入端口，(2)—個(gè)或多個(gè)可放置重物的空間，(3) 一個(gè)或多個(gè)所述第一表面可附著的空間或裝置，(4) 一個(gè)或多個(gè)螺紋，可用來(lái)附著相對(duì)的表面，(5) 一個(gè)或多個(gè)環(huán)或者鉤子，用以固定管道，(6) 一個(gè)或多個(gè)壓緊螺釘組合，其被彈簧鎖附著，以及(7) —個(gè)或多個(gè)固定器支架，及其組合。組合是指具有7種類型部件中多于一個(gè)部件，或者具有帶有單個(gè)類型部件至少兩種功能的結(jié)構(gòu)。此外，該方法可用來(lái)制造附著在第一表面上的第二表面，通過(guò)以下一個(gè)或多個(gè)部件制造(1) 一個(gè)或多個(gè)鎖(latches), (2) 一個(gè)或多個(gè)螺栓，(3) —個(gè)或多個(gè)卡扣(snaps)，(4) 一個(gè)或多個(gè)夾子，(5) —個(gè)或多個(gè)槽口 (notches), (6) 一個(gè)或多個(gè)中心空間，軸可穿過(guò)該空間放置，(7) 一個(gè)或多個(gè)可用于附著相對(duì)表面的螺紋，或者(8)任意已知的鎖定機(jī)構(gòu)。例如，螺紋使得螺釘能夠用來(lái)將第二表面固定在第一表面上。第二表面也可包括將第二表面定位或固定到第一表面上，或者定位或固定在第一表面上的裝置。一個(gè)實(shí)施例是在所述第一或者第二表面之一上成型的凸起，在另一表面具有與所述成型凸起相配合的孔。通常，行星式齒輪裝置直接或者間接地附著在外表面上，比如在第二表面，使得所關(guān)心的轉(zhuǎn)子整合到CCC設(shè)備中，作為一個(gè)設(shè)計(jì)選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種利用逆流色譜來(lái)分離物質(zhì)的方法，該方法采用了由一個(gè)或多個(gè)上述改進(jìn)制造或包含上述一個(gè)或多個(gè)改進(jìn)的儀器。這里所用的“物質(zhì)”包括化學(xué)物質(zhì)、小的有機(jī)分子和生物物質(zhì)比如DNA、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、多糖、 寡糖、脂質(zhì)、其組合等等。執(zhí)行逆流色譜的方法包括(1)提供試樣和溶劑體系，(2)排布管道使其穿過(guò)入口、螺旋和徑向通道及出口，(3)將所屬試樣載入所述溶劑體系，(4)將所述組合的試樣和溶劑體系置入儀器中，以及(5)將儀器在離心機(jī)中以特定速度旋轉(zhuǎn)一段時(shí)間。 可使用的任意種類的彈性管道包括但不限于=(I)TeflorA (2)氟化乙烯丙烯(fluorinated ethylene propylene), (3)有機(jī)硅，(4)不銹鋼，(5) TygorA (6)鋸齒的，(7)回旋的，(8)任意常用的彈性管道，或者(9)包括任意上述材料的組合的任意管道。管道也可具有不規(guī)則或者非均一的內(nèi)表面。通過(guò)使用以如下那種方式制造的市售管道或手工操作管道，比如通過(guò)卷曲該管道，彎曲該管道，折疊該管道等等，可獲得不規(guī)則，以在管道中形成引入的缺陷，特別是通過(guò)破壞管道平滑的內(nèi)表面來(lái)在管道中形成非均一或者不規(guī)則的內(nèi)表面。執(zhí)行逆流色譜的方法可通過(guò)將第二表面覆蓋或者附著在第一表面上來(lái)實(shí)現(xiàn)。第二表面可具有孔，用于出口在中心軸處的管道。在管道可能遇到任何類型的摩擦或者磨損的地方，該方法可進(jìn)一步包括在第一或第二表面應(yīng)用或者涂覆TeflorA聚乙二醇液體，或者類似的材料。制造的儀器可用于任何類型的離心機(jī)。優(yōu)選的離心機(jī)類型為行星旋轉(zhuǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可利用包含以下一種或多種改進(jìn)的儀器來(lái)執(zhí)行逆流色譜(1) 一個(gè)或多個(gè)彎曲的徑向通道， (2) —個(gè)或多個(gè)所述儀器螺旋通道中的凸起，幫助引導(dǎo)和放置管道，(3)—個(gè)或多個(gè)固定器支架，以及(4)在螺旋管支架表面或者頂部的一個(gè)或多個(gè)環(huán)，用于引導(dǎo)和放置管道。螺旋管支架可能也需要一個(gè)或多個(gè)重物來(lái)平衡；重物可放置在一個(gè)或多個(gè)第一表面或者第二表面的空間里，或者同時(shí)放置在一個(gè)或多個(gè)第一表面和第二表面的空間里。該方法也可包括通過(guò)第一或第二表面或兩者的一個(gè)或多個(gè)環(huán)來(lái)排布管道。用本文要求權(quán)利的方法制造的螺旋管支架可用于分離一種或多種化學(xué)物質(zhì)，包括生物材料。生物材料或者化學(xué)物質(zhì)可為小分子或者大分子如DNA、蛋白質(zhì)，或者多肽?，F(xiàn)有技術(shù)描述了利用極性溶劑來(lái)純化大分子化合物。可使用的溶劑體系包括，但不限于(1)兩相的聚乙烯水溶液和鹽溶液；(2)兩相的重醇水溶液；(3)PEG (MW 1000) 12. 5 %_Κ2ΗΡ04 12.5 % ；或者1 1 (ν/ν)的仲丁醇-1 %的三氟乙酸溶液。


以下對(duì)圖的描述及各自的圖為非限制的實(shí)施例，描述了舉例說(shuō)明本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。圖1為改進(jìn)的螺旋管支架的截面；
圖2Α是在螺旋管支架頂部和底部有齒輪和軸承座的組裝轉(zhuǎn)子的側(cè)視圖； 圖2Β是螺旋管支架的底視圖； 圖3為沒(méi)有頂部的螺旋管支架的特寫圖4Α為利用逆流色譜進(jìn)行分離的包含溶菌酶和肌紅蛋白的蛋白質(zhì)混合物的洗脫曲線.
一入 ，
圖4Β為從圖如中選定餾分(fraction)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(PAGE analysis), 顯示了兩種蛋白質(zhì)的成功分離。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將參考附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明詳細(xì)的描述和多種實(shí)施方案，其中相同的數(shù)字描述相同的元件。本發(fā)明提供了相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)和幾種改進(jìn)，并且避免了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。雖然本發(fā)明主要涉及逆流色譜領(lǐng)域，但是本發(fā)明的范圍不局限于這些特定的(1)方法，(2)應(yīng)用，(3)使用，或者(4)儀器形狀。本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述意指本發(fā)明許多可能的實(shí)施方案中的一個(gè)，并不意圖理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制或限定。除非另有定義，這里所用的科學(xué)術(shù)語(yǔ)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的意思。也需要理解，復(fù)數(shù)的引用也包括在內(nèi)，除非上下文另有清楚的要求。例如，諸如“一”、“一個(gè)”和“該”的形式意味著既包括為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的單個(gè)也包括多個(gè)。本主題發(fā)明可在多種類型的離心機(jī)中使用，包括但不限于(1)行星，(2)固定角度，(3)吊桶式，(4)分析，(5)制備，(6)血細(xì)胞比容離心機(jī)。本主題發(fā)明也可在多種溫度下操作，并且可縮放，用于從小型到工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆流色譜儀由多個(gè)交織的螺旋通道組成。在一個(gè)實(shí)施方案中， 等距切口形成徑向凹槽或者通道。等距切口的數(shù)量可包括兩個(gè)切口、三個(gè)切口、四個(gè)切口、 五個(gè)切口等等。圖1描述了螺旋管支架儀1自上而下的視圖，顯示了頂部或內(nèi)部進(jìn)入點(diǎn)2， 用于順時(shí)針通過(guò)螺旋通道的管道，例如，從中心軸4出來(lái)。流管外部出口點(diǎn)在3處。這在圖 2B的17處也可見，在螺旋管支架1的底部。在此處的實(shí)施方案中，管道進(jìn)入中心軸4。顯示了四個(gè)彎曲的徑向通道5 ；但是本發(fā)明不限制徑向通道5的特定數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明，徑向通道5可在一端或者兩端彎曲?，F(xiàn)有技術(shù)發(fā)明包括直的徑向通道5，這會(huì)引起管道的卷曲， 從而阻礙溶劑流，參看W02009/073746。根據(jù)本發(fā)明，管道可按逆時(shí)針?lè)绞讲贾?。從中心向外的螺旋方向可以是逆時(shí)針而徑向通道可具有“S”形的構(gòu)造。圖1中描述的實(shí)施方案包括改進(jìn)螺旋管支架儀1的橫截面。管道可以穿過(guò)彎曲的徑向通道5布置。曲率調(diào)整管道以進(jìn)入合適的螺旋通道，形成交織的螺旋管道。螺旋管支架1每層包括四個(gè)交織的螺旋。管道可以從框架底部放置，并且可在通道中以逆時(shí)針?lè)较蚍胖?。然后管道?點(diǎn)鐘位置跨過(guò)徑向通道，其中管道被引導(dǎo)裝入從外面進(jìn)來(lái)的一個(gè)通道中。在6點(diǎn)鐘位置，管道跨過(guò)徑向通道進(jìn)入通道中，即從外圓周進(jìn)來(lái)的兩個(gè)通道中。在3點(diǎn)鐘位置，管道進(jìn)入通道，所述通道即從邊緣進(jìn)來(lái)的三個(gè)通道等等。當(dāng)管道跨過(guò)點(diǎn)3旁的徑向通道時(shí)，管道從外邊緣進(jìn)入四排通道。圍繞轉(zhuǎn)子重復(fù)該操作，直至管道來(lái)到中心，并接著排布出9點(diǎn)鐘位置處的徑向通道5，然后在邊緣順著通道并在6點(diǎn)鐘處跨過(guò)下一徑向通道進(jìn)入一個(gè)從邊緣進(jìn)來(lái)的通道，像以前一樣，直至到達(dá)中心并再次從下一徑向通道5出來(lái)。當(dāng)管道到達(dá)中心的頂部，管道被排布出頂部的接入端口，并連接到進(jìn)入中心軸的管道。感興趣轉(zhuǎn)子中管道的卷繞可以利用徑向通道，如果存在的話。因?yàn)檗D(zhuǎn)子可能不包括徑向通道，即使存在徑向通道，管道卷繞也不必包括徑向通道的使用。同樣，如這里所教導(dǎo)，卷繞可以是順時(shí)針?lè)较?CW)或者逆時(shí)針?lè)较?CCW)，與合適配置的轉(zhuǎn)子結(jié)合，因?yàn)榭梢愿淖児艿赖姆较蚝娃D(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的方向來(lái)使感興趣的分子或?qū)嶓w(entity)的分離變?yōu)榭赡芤约白畲蠡Ｒ驗(yàn)楣艿谰砝@的方向作為設(shè)計(jì)選擇是可選的，那些參數(shù)可以用于感興趣的分離。 感興趣的轉(zhuǎn)子將具有合適彎曲的可選徑向通道，和合適定向的螺旋通道或者凹槽。通道和凹槽為在第一表面中構(gòu)造并成型的孔，用以接受和安放管道。因此，在中心處，管道可被引導(dǎo)入徑向通道中并延伸通過(guò)徑向通道到第一表面的外圍。管道在螺旋管支架邊緣被排布到通道中并進(jìn)入從邊緣進(jìn)來(lái)的通道中。管道被排布進(jìn)入通道中，即兩個(gè)從邊緣進(jìn)來(lái)的通道等等。當(dāng)管道到達(dá)中心軸區(qū)域，管道被排布通過(guò)另一徑向通道到達(dá)外緣，并沿螺旋通道跨過(guò)徑向通道，向內(nèi)彎向中心內(nèi)部進(jìn)入?yún)^(qū)域(center inner entry area)，并從另一徑向通道出去，直至到達(dá)邊緣上沿外部進(jìn)入點(diǎn)區(qū)域的最后通道，管道從所述邊緣被排布通過(guò)螺旋通道直至到達(dá)中心軸區(qū)域。管道穿過(guò)蓋子中的出口或者接入端口，在這里管道與流管連接，例如，在壓緊螺釘組合處(見，例如，圖2A和2B，其中壓緊螺釘組合被描繪為放置在彈簧鎖裝置里面)。進(jìn)入螺旋管支架軸的管道(例如，如圖1、2A和2B所示)，連同來(lái)自螺旋管支架另一入口的管道可出去(exit)并進(jìn)入中心軸線上的軸。一般，管道在螺旋路徑中定向，螺旋路徑越過(guò)每三個(gè)通道，并且回到外部區(qū)域。徑向通道中的管道可被按入設(shè)有壁(walled)的第一表面空間以接受螺旋定向管道的多個(gè)層， 亦即，在框架中安裝更多的層。溶劑通過(guò)管道流動(dòng)，并且從內(nèi)部進(jìn)入點(diǎn)引入兩相溶劑系統(tǒng)中的輕相和重相。替代地，結(jié)合轉(zhuǎn)子上螺旋的合適取向(從而結(jié)合管道的取向)以及離心機(jī)合適的旋轉(zhuǎn)方向，兩相溶劑系統(tǒng)中的上相或者輕相可通過(guò)外部進(jìn)入點(diǎn)泵入。因此，單一管道可被配置形成系列交織的螺旋。對(duì)于本發(fā)明的目的，交織被認(rèn)為與交錯(cuò)同義，并且也與具有一系列互相對(duì)準(zhǔn)的螺旋或者其中嵌套(nest)有一系列的螺旋同義。轉(zhuǎn)子包括兩個(gè)接入點(diǎn)，用于感興趣轉(zhuǎn)子的管道的進(jìn)入和出去。此外，為了加強(qiáng)流徑，本發(fā)明轉(zhuǎn)子使交織的螺旋層成層狀堆積。因此，轉(zhuǎn)子可包括兩層、三層、四層、五層、六層、七層、 八層、九層、十層、十一層、十二層、十三層、十四層、十五層等等，它們是交織、嵌套的管道螺旋。管道可從底部以逆時(shí)針?lè)较蚓砝@。利用專用按壓工具以及一個(gè)或多個(gè)剛性部分或者凸出，單層交織的螺旋可設(shè)在或者包裝在轉(zhuǎn)子體里面，所述剛性部分或凸出被塑造成與徑向通道、螺旋通道或兩者相配合。在圖1所示儀器的外圍，顯示了一系列的孔6。一個(gè)或多個(gè)孔6可為重物提供位置，幫助平衡螺旋管支架1。這里所用的詞語(yǔ)“重物”指的是具有質(zhì)量的任意物體。替代地， 一個(gè)或多個(gè)孔6可用來(lái)將頂部8 (參看圖2A)附著到螺旋管支架1上，例如，用螺紋孔7和螺釘。孔6不必是圓形或者圓柱形的形狀，也不必位于或者靠近裝置的周邊。圖2A顯示了組裝螺旋管支架或者帶有支架1的轉(zhuǎn)子9以及對(duì)應(yīng)的頂部8的側(cè)視圖。頂部8在齒輪10和軸承座11的下面，用于整合到CCC儀中并且產(chǎn)生行星旋轉(zhuǎn)。一個(gè)或多個(gè)齒輪10以及一個(gè)或多個(gè)軸承座11的形狀或者位置可與圖2A所示的不同。頂部8包括中心附近的孔，管道穿過(guò)所述的孔到達(dá)頂部8表面上的環(huán)15，并且附著到進(jìn)入圖1中心軸4 的流管上。與管道支架1相似，頂部8包含一個(gè)或多個(gè)孔13，這些孔的形狀可以是圓形的。 一個(gè)或多個(gè)孔13可為重物提供位置，幫助平衡組裝的螺旋管支架9。替代地，可使用一個(gè)或多個(gè)孔13將頂部8附著到螺旋管支架1上，例如，用螺釘14?？?3不必為圓形或者圓柱形，也不必位于或者靠近裝置外圍。同樣地，孔6和13可相互對(duì)齊，用于重物的放置和用于附著裝置。頂部8可通過(guò)多種方式附著到螺旋管支架1上，所述多種方式包括但不限于以下的一種或多種(1) 一個(gè)或多個(gè)鎖，(2) 一個(gè)或多個(gè)螺栓，(3) 一個(gè)或多個(gè)卡扣，(4) 一個(gè)或多個(gè)夾子，(5) —個(gè)或多個(gè)槽口或者其它的互鎖裝置20，(6)—個(gè)或多個(gè)軸可穿過(guò)放置的中心空間，(7)可用來(lái)附著相對(duì)表面的一個(gè)或多個(gè)螺紋，或者(8)任何已知的鎖定機(jī)構(gòu)，及其組合，其中組合包括具有八種類型中超過(guò)一種類型或者結(jié)合兩種或者更多功能的形式。例如，螺釘可用作附著工具。頂部8也可包含旋入螺旋管支架1的螺紋，作為另一附著工具。 同樣地，同樣多種的附著工具可用來(lái)將螺旋管支架1附著到頂部8上。如圖2B所示，管道支架也包括管道接入端口，17。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的另一改進(jìn)為包含一個(gè)或多個(gè)環(huán)15，以及在該螺旋管支架1和頂部8上如圖2A和2B所示的一個(gè)或多個(gè)固定器支架16。環(huán)15可固定流管。環(huán)15和固定器支架16可間隔分布在螺旋管支架1的下表面、頂部8的上表面或者同時(shí)在上述兩表面上。 不必使環(huán)15直接附著到固定器支架16上。也可以使用除環(huán)15以外的形狀以符合本發(fā)明的方式來(lái)固定流管。本發(fā)明實(shí)施方案中的固定器支架16以楔狀出現(xiàn)，其中楔子最窄的部分面向螺旋管支架1的外圍、頂部8，或者兩者，而楔子最寬的部分面向螺旋管支架1的中心、 頂部8，或者兩者。固定器支架16的形狀以及間隔都可從根據(jù)本發(fā)明的形式改變。環(huán)15的復(fù)位能力是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，使其可以(1)避免管道的卷曲，(2)避免可磨損管道的銳邊，(3)避免移動(dòng)部件，以及(4)當(dāng)組裝的螺旋管支架9在離心機(jī)中時(shí)，其具有更容易的進(jìn)入。固定器支架16的優(yōu)點(diǎn)在于在螺旋管支架1和頂部8上增加力量，而不用在任一表面上增加太多的重量
圖2A和圖2B顯示了螺旋管支架1以及頂部8的另一改進(jìn)，其中存在一個(gè)或多個(gè)壓緊螺釘組合。通過(guò)彈簧鎖18可將壓緊螺釘組合附著到螺旋管支架1和頂部8上。這個(gè)改進(jìn)的目的在于將內(nèi)部管道連接到流管上，所述內(nèi)部管道存在于螺旋管支架1中，所述流管內(nèi)徑與內(nèi)部管道不同。流管從螺旋管支架1出來(lái)并穿過(guò)軸，伸出組裝的螺旋管支架儀9的底部夕卜，至Ij達(dá)中心太陽(yáng)能中心軸(the central solar axis shaft)。在另一個(gè)實(shí)施例中，如圖3所示，在逆流色譜中使用的通道或者凹槽里面，小的凸起19已經(jīng)被加到螺旋管支架1的表面。在先前的發(fā)明中，缺乏這種凸起19阻礙了管路在螺旋管支架1中的排布或者卷繞。本發(fā)明約束了管道進(jìn)出螺旋槽的大體移動(dòng)，使得通過(guò)螺旋管支架1排布管路的過(guò)程與現(xiàn)有技術(shù)相比更加容易并且更加快速。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)電腦輔助設(shè)計(jì)(CAD)算法來(lái)設(shè)計(jì)組裝的螺旋管支架 9。對(duì)于實(shí)現(xiàn)本實(shí)施方案的目的，使用CAD來(lái)設(shè)計(jì)組裝的螺旋管支架9不是必須的；但是代表了根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生設(shè)計(jì)的方便的方法?；贑AD的設(shè)計(jì)比現(xiàn)有技術(shù)更有利，其可適應(yīng) (accommodate)設(shè)計(jì)的改變。例如，可以改變螺旋管道的寬度以適應(yīng)特定直徑的管道。每個(gè)螺旋通道的寬度可在0.5 mm至10 mm之間、在1 mm至9 mm之間、在2 mm至8 mm間、在3 mm至7mm之間、在4 mm至6 mm之間、5 mm、2. 5mm、3. 5mm等等。徑向通道可以具有相同的尺寸。本發(fā)明如圖2A和圖2B所示的例子是形狀為圓柱形、直徑大約為17.5 cm、高度約為 7.3 cm?？筛淖冃螤詈统叽缫赃m應(yīng)任何離心機(jī)類型。螺旋管支架1包括通道或者凹槽的螺旋壁，以及來(lái)到中心的徑向通道5，所述徑向通道5在一端或者兩端可彎曲或者不彎曲，如同圖1所示。圖1描述了四個(gè)彎曲的徑向通道5。但是，管道支架1可以利用一個(gè)或多個(gè)直的或者彎曲的徑向通道5來(lái)制造。每個(gè)徑向通道5的寬度可在0.5 mm至10 mm之間、在1 mm 至7mm之間、在2 mm至5 mm之間、在3 mm至4 mm之間，例如，或者適當(dāng)縮放以用于包括較大體積的分離。螺旋通道或者凹槽可具有同樣大小的尺寸，如所提到的，根據(jù)分離的規(guī)模作為設(shè)計(jì)選擇可以改變。因此，螺旋通道和可選的徑向通道可超過(guò)上述尺寸來(lái)使較大體積的分離成為可能。因此，通道的尺寸可為厘米級(jí)、分米級(jí)、英寸級(jí)等等?？梢韵氲剑蓸?gòu)造沒(méi)有頂部8的螺旋管支架1。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括螺旋管支架1表面上螺旋管通道內(nèi)的小凸起19，用于輔助管道的排布。螺旋管支架1和頂部8可通過(guò)多種材料制作成型，包括但不限于，一種或多種以下物質(zhì)(1)尼龍聚合物，(2)塑料，(3)聚四氟乙烯(TeflorO，(4)聚氯乙烯，(5)聚苯乙烯， (6)聚酰胺 PA-220，(7)光敏聚合物，(8)FullCure 材料，(9) Polyjet 3D Printer 材料， (10)單體粉末，以及(11)包括金屬或者金屬組合物的顆粒。上述材料可用于制造硬的表面?？墒褂萌缬蒔olyjet 3D I^rinte/提供的Tango Black的材料來(lái)制造彈性結(jié)構(gòu)。使用容易成型材料的優(yōu)點(diǎn)是可快捷并且低成本地制作螺旋管支架1或者頂部8，并且容易適應(yīng)設(shè)計(jì)的改變。現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)通過(guò)在金屬中鉆出螺旋來(lái)制造螺旋管支架，這種制造方式本質(zhì)上比本發(fā)明更費(fèi)力。本發(fā)明制造組裝逆流色譜儀9的方法包括金屬變得易于在快速原型機(jī)中使用的可能性，這會(huì)在下面介紹。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于設(shè)計(jì)的材料通過(guò)三維原型機(jī)成型。三維原型機(jī)可以使用各種工藝來(lái)制成管道支架1或者頂部8，比如激光燒結(jié)或者紫外線照射。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本發(fā)明，使用除激光燒結(jié)或者紫外線照射以外的工藝，可制成螺旋管支架1或者頂部8?？捎糜诼菪Ъ茉O(shè)計(jì)使材料成型的機(jī)器的例子包括但不限于=Sinterstation 2300 plus、Objet Geometries、Inc. Eden 500V,或者 EOS Precision。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的另外一個(gè)改進(jìn)是制造的螺旋管支架1與任意已知的彈性管道兼容， 所述彈性管道包括但不限于=(I)TeflorA (2)氟化乙烯丙烯，(3)有機(jī)硅，(4)不銹鋼，(5) Tygone, (6)鋸齒的，(7)回旋的，(8)任意常用的彈性管道，或者(9)包括任意上述材料的組合的任意管道。該管道也可通過(guò)手工或者機(jī)械方式以交叉按壓(cross-presses)或者扭曲方式按壓。因?yàn)樵撗b置可適應(yīng)多種大小的通道，管道可具有任何幾乎任意直徑。在過(guò)去， 將管道纏繞入逆流色譜儀的螺旋通道是困難的。與制造螺旋管道支架1和頂部8相同的方法可用來(lái)制造一種工具，該工具可以反過(guò)來(lái)用于將管道引導(dǎo)或者壓下到徑向通道5中。管道外的展平可使其具有更多的管道層，所述管道層可給試樣提供較大的分離。此外，這種構(gòu)造破壞了溶劑的層流流動(dòng)。制造的儀器或者具有本文描述的改進(jìn)的現(xiàn)有技術(shù)逆流色譜儀可用于分離一種或多種生物材料和化學(xué)物質(zhì)。生物材料包括大分子比如DNA、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、寡多肽、多糖、寡糖、脂質(zhì)，及其組合等等。鑒于現(xiàn)有技術(shù)主要限于小分子，本發(fā)明組裝的螺旋管支架9能夠分離或者純化小分子和大分子。本發(fā)明能夠保持專有的可純化大的生物材料的溶劑體系，比如兩相的聚乙烯水溶液和鹽溶液，以及兩相的重醇水溶液。用于本發(fā)明的制造的CCC設(shè)備和本發(fā)明轉(zhuǎn)子(instant rotor)容易縮放以適應(yīng)對(duì)大體積液體介質(zhì)的分離，比如細(xì)胞裂解物或者用于其中含有分子的培養(yǎng)基，比如多肽、寡肽、多核苷酸、寡核苷酸、聚糖、寡糖、脂質(zhì)，及其組合等等。如同感興趣轉(zhuǎn)子的使用在色譜技術(shù)領(lǐng)域中是已知的一樣，感興趣轉(zhuǎn)子可被配置用于任意色譜裝置中。因此，感興趣的轉(zhuǎn)子用管道裝載，所述管道連接到適當(dāng)?shù)乃鼗蛘呔彌_液、溶劑等，用來(lái)提供固定相和流動(dòng)相，并且將其置于色譜儀器中，比如，離心機(jī)，比如行星離心機(jī)。試樣通過(guò)管道加入，而離心機(jī)為轉(zhuǎn)子提供適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)。收集餾分用于進(jìn)一步的處理和/或分析。固定相可通過(guò)已知的沖洗方式從管道中被替換，所述沖洗方式比如，使用緩沖液、溶劑或者氣體。以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例先前的工作利用螺旋管支架儀來(lái)分離小分子和多肽，說(shuō)明了每種流動(dòng)相的使用或者洗脫模式的方法。管道以順時(shí)針?lè)较驈闹行幕蛘唔敳烤砝@，可導(dǎo)致固定相保留在表1歸納的條件中。由于不同的流體力學(xué)性質(zhì)，基本上用于小分子的非極性溶劑體系對(duì)洗脫模式具有不同的固定相保留。因此，對(duì)于此前難以用于逆流色譜的極性溶劑體系，本發(fā)明主題螺旋管支架儀的使用方法是不同的。螺旋管支架的頂部可為引入下相的內(nèi)部終端而螺旋管支架的底部可為當(dāng)用作流動(dòng)相時(shí)上相泵入其中的外部終端。當(dāng)旋轉(zhuǎn)為順時(shí)針?lè)较蚧蛘吲c螺旋卷繞方向一致時(shí)，內(nèi)部終端為頭部。在這些情況下，外部終端為尾部。當(dāng)旋轉(zhuǎn)為逆時(shí)針?lè)较驎r(shí)，頭部和尾部端反轉(zhuǎn)。當(dāng)旋轉(zhuǎn)為逆時(shí)針?lè)较驎r(shí)，內(nèi)部終端變成尾部。在這些條件下，可出現(xiàn)固定相的高保留。同樣的洗脫方式可在兩相水溶劑體系(“TPAS”)中使用，比如聚乙二醇/磷酸鹽溶液。表2列出了使用那些具有高固定相保留的溶劑體系從蛋白質(zhì)分離中獲得的結(jié)果。溶劑體系用在示例性實(shí)驗(yàn)中用以純化蛋白質(zhì)和分級(jí)裂解物的操作參數(shù)如下所示。 TPAS的組成可被修改以包括不同麗的聚乙二醇(“PEG”)，而鹽的pH可不同。其它的添加， 比如高M(jìn)W右旋糖酐也可被加入?？墒褂萌宜?TFA)。表2列出的最后一個(gè)溶劑體系在洗脫方式中使用重醇-正丁醇和中等濃度的磷酸鹽緩沖水溶液，水相是流動(dòng)的，用以從裂解物中分離蛋白質(zhì)。這些條件不會(huì)使蛋白質(zhì)變性。其它重醇比如仲丁醇以及其它鹽，比如 NaCl、乙酸銨等等均可被采用。實(shí)施例1
螺旋管支架框架通過(guò)激光燒結(jié)技術(shù)制作，使用的Sinterstation 2300plus快速原型機(jī)進(jìn)行三維(空間)打印過(guò)程?？焖僭蜋C(jī)形成CAD設(shè)計(jì)的螺旋管支架和頂部的3-D形狀。那是通過(guò)單體粉末、EOS Precision聚酰胺PA220的激光淬火完成的。一個(gè)以及三個(gè)螺旋管支架儀在打印機(jī)中同時(shí)形成。粉末在腔室中分層，激光以程序化的模式在表面移動(dòng)，激光觸及表面時(shí)使形狀硬化。然后用散布器加入另一個(gè)粉末層。因此，如本發(fā)明提供制造的多層包括支架1和頂部8。形狀從底部開始建立。當(dāng)完全成形后，其被脫離出來(lái)并用水洗滌以除去散粉。所得的硬的白色尼龍組合物轉(zhuǎn)子被染色或者用耐化學(xué)腐蝕的油漆著色。利用與螺旋管支架相同的制造方法制備頂部，此外，在頂部下側(cè)涂上Teflon 涂層，防止組裝的儀器中管道的磨損。用相同的激光燒結(jié)工藝制造按壓工具。這由中間具有2 cm中心孔的15 cm 直徑的圓盤構(gòu)成，與具有四個(gè)彎曲的5 cm延伸(extensions)的軸適配，所述延伸裝入螺旋管支架儀的徑向凹槽中。管道，F(xiàn)EP Sff #14 (Zeus Co.) 1. 6 mm ID、2. 4 mm 0D，從底部纏繞在螺旋管支架中，然后，每三層，用按壓工具以中等壓力并用夾具固定15分鐘來(lái)按壓管道。 在此工藝后，大約10層管道適于給出135 ml的總體積。組裝的螺旋管支架儀中的管道用水填滿。通過(guò)管道由插入中心軸的螺釘中止儀器，加上重物平衡轉(zhuǎn)子。重物為短的金屬條 (大約2 cm長(zhǎng))，插入圍繞轉(zhuǎn)子周長(zhǎng)的孔中，并且通過(guò)環(huán)氧膠固定位置。來(lái)自轉(zhuǎn)子內(nèi)部的管道用螺母(nuts)、金屬環(huán)和組合(union)在底部外面連接到兩條流管，而在蓋子上連接到0. 8 mm ID、1.6 mm OD的PTFE流管，所述PTFE流管穿過(guò)中心軸到達(dá)行星離心機(jī)的頂部并被夾緊。入流管道連接到與溶劑泵連接的樣環(huán)上，而外流管連接到餾分收集器。制造7. 3 cm高和17. 5 cm OD的螺旋管支架以及蓋子(無(wú)齒輪的尺寸)，置于并用于Centrichrom行星離心機(jī)中，另一同樣大小的轉(zhuǎn)子用在P. C. Inc.的行星離心機(jī)中。在這里描述的實(shí)驗(yàn)的例子通過(guò)在Centrichrom設(shè)備中用該轉(zhuǎn)子執(zhí)實(shí)現(xiàn)。離心機(jī)中的轉(zhuǎn)子用與重物相對(duì)的軸來(lái)平衡。此外，在Pharma-Tech Research Corporation的行星離心機(jī)中用互聯(lián)的流管將一組三個(gè)轉(zhuǎn)子(10. 4 cm高，10.8 cm 0D)串聯(lián)(in series)安裝到三個(gè)分開的行星軸上，并用于實(shí)驗(yàn)中。最后，構(gòu)建兩個(gè)轉(zhuǎn)子并且安裝在單一軸上，管道由組合連接。這些轉(zhuǎn)子的尺寸為9 cm深和17 cm 0D，它們被構(gòu)建并安裝在Siimadzu Corporation制造的設(shè)備上。實(shí)施例2
這個(gè)例子描述了使用螺旋管支架來(lái)分離表3所示的三個(gè)肽。20-mer具有與18-mer相同的序列，除了額外的W殘基，并且在20-mer中，H殘基被A取代。多肽在溶劑體系中被分離，該溶劑體系由水中1 :1 (v/v)的仲丁醇-1 %的三氟乙酸(“TFA”)溶液組成，較低的水相作為流動(dòng)相。在1 ml/min流動(dòng)速率下，大約IOmg的每個(gè)多肽被分離。餾分以2分鐘的間隔被收集并且每個(gè)多肽的洗脫曲線由HPLC和吸收分光光度法來(lái)確定。必須做螺旋管支架儀的初步研究，用來(lái)測(cè)量在操作條件下用于多肽和蛋白質(zhì)分離的溶劑體系的固定相保留。溶劑體系的重相和輕相根據(jù)離心的方向和管道在螺旋管支架中纏繞的方向被不同地保留。通常，該固定相的最大的保留可達(dá)到，當(dāng)重相被引入到內(nèi)部進(jìn)口(頭到尾)而輕相被泵入到外部末端(尾到頭)。在這些設(shè)置下，輕相被用作流動(dòng)相而螺旋管支架以逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)。對(duì)用作流動(dòng)相的每個(gè)相測(cè)定固定相保留。這是通過(guò)以下方式完成的(1)用固定相裝滿盤管，(2)開始螺旋管支架儀的旋轉(zhuǎn)，以及(3)將流動(dòng)相泵入通過(guò)。在旋轉(zhuǎn)開始和溶劑前沿通過(guò)的時(shí)間之間離開儀器的體積代表在平衡建立后的排除體積 (excluded volume), Vffl0總體積V。減去Vm，得到固定相體積，Vs。相保留為固定相體積和總體積的比值，Vs/Vc。當(dāng)流動(dòng)相被洗脫時(shí)，背壓增加。背壓取決于溶劑體系的界面張力。
分配系數(shù)K是通過(guò)將小型試樣溶解到溶劑體系中，搖振該混合物，并在相分離后測(cè)量樣品在兩個(gè)相中的濃度確定的。這提供了上相和下相的濃度比(Cyc1)15分配系數(shù)介于 1至2的相被選作流動(dòng)相。分離的效率利用常規(guī)氣相色譜方程來(lái)確定N<4R/W)2。該理論塔板數(shù)或者N通過(guò)峰的形狀計(jì)算。R是最大峰的保留時(shí)間或者保留體積而W是以與R相同單位表示的峰寬。對(duì)于制備分離，N值可能達(dá)到1000，但是更重要的關(guān)系是分辨率。相鄰峰之間的分辨率由以下式子給出As=Z(Viu-Viu)/(W1+ W2)。利用這個(gè)方程，并且用以下方程替換每一個(gè)溶質(zhì)的保留體積VK=Vm+KVs。消去Vm，得到=Rd(K2-K1)V(WAW2)。分辨率與Vs以及各K之間的差成正比。典型的逆流色譜具有高的Vs，N<1000的高分辨率是可能的。逆流色譜情況下，分辨率在等度洗脫(沒(méi)有梯度)中被測(cè)量，并且可以通過(guò)溶劑體系的組合物調(diào)整。通常，試樣以小體積溶解在小體積的兩相中(不超過(guò)盤管總體積的1/10)，并裝入到已用固定相填充的盤管上。開始離心，并且流動(dòng)相被泵入，例如，以2 ml/min泵入。流出物可經(jīng)過(guò)UV檢測(cè)器，方向向上通過(guò)流動(dòng)池用于流動(dòng)下相以及向下用于流動(dòng)上相來(lái)清除相液滴。在收集餾分的時(shí)間段里，色譜法可進(jìn)行兩個(gè)到三個(gè)柱體積。當(dāng)旋轉(zhuǎn)停止的時(shí)候，內(nèi)容物被泵出或者用氮或氦壓力推出，繼續(xù)收集餾分。如果想要，對(duì)于非常緩慢洗脫的化合物， 流動(dòng)相可通過(guò)改變另一個(gè)流動(dòng)相的入口并且使化合物洗脫通過(guò)經(jīng)過(guò)另一個(gè)相作為固定相來(lái)改變。在多個(gè)運(yùn)行之間，盤管可通過(guò)以下方式清洗(1)用水沖洗，(2)用丙酮沖洗，以及 (3)用氮流干燥盤管?？赏ㄟ^(guò)對(duì)分裝的餾分進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)來(lái)分析餾分，確定感興趣的蛋白質(zhì)或者多肽的洗脫曲線。蛋白質(zhì)或者多肽也可通過(guò)對(duì)收集的餾分進(jìn)行質(zhì)譜分析來(lái)鑒定。餾分包括純化合物，如由HPLC或者PAGE分析的化合物，可被匯總并且干燥。如前所述，K定義為Cu/Clt)對(duì)于表3所示的每個(gè)多肽，通過(guò)用固定相的濃度(Cs) 除以流動(dòng)相的濃度(Cm)來(lái)計(jì)算實(shí)驗(yàn)的K (Kexp)0三個(gè)肽以期望的順序洗脫出，并且預(yù)期的K 與Krap值有較好的相關(guān)性。三個(gè)肽如從其各自的K值預(yù)計(jì)的那樣洗脫出(表3)。數(shù)據(jù)顯示螺旋管支架轉(zhuǎn)子與理論預(yù)測(cè)十分接近，并且可用新轉(zhuǎn)子有效分離尺寸較大的分子。實(shí)施例3
這個(gè)實(shí)施例描述了用三維打印和激光燒結(jié)構(gòu)建的塑料螺旋管支架分離小分子(定義為 MW<500的分子)混合物的能力。小分子化合物阿司匹林、水楊酸、水楊苷和柚皮素被載入溶劑體系中，溶劑體系由1:1 (v/V)的仲丁醇-1 %TFA溶于水的水溶液組成。然后，載入的混合物以800 rpm的速度在螺旋管支架中進(jìn)行離心，流動(dòng)速率為1 ml/min。餾分以2分鐘的間隔收集，直到50個(gè)餾分被收集。在第50個(gè)餾分被收集后，內(nèi)容物被擠出。所有四個(gè)小分子被分離，并且只有阿司匹林和柚皮素在其洗脫過(guò)程中部分重疊。 洗脫順序符合基于分子的K值預(yù)期的順序。固定相保留為69 %，這個(gè)值很高。數(shù)據(jù)顯示了改進(jìn)螺旋管支架在分離小分子方面的效用。該設(shè)計(jì)可容易放大用于工業(yè)過(guò)程或者縮小用于質(zhì)譜的分析應(yīng)用。實(shí)施例4
感興趣的儀器可用來(lái)分離蛋白質(zhì)或者其它的大分子。在這個(gè)實(shí)施例中，螺旋管支架用前述的方法制造，并用于純化小鼠子宮球蛋白。小鼠子宮球蛋白的麗為70kDa，并通常以二聚體的形式存在，但是，在溶液中，該蛋白的單體形式也可累積。在螺旋管支架中進(jìn)行分離，以從子宮球蛋白二聚體中分離子宮球蛋白單體。這是通過(guò)用HPLC測(cè)量K值然后用具有螺旋管支架儀的逆流色譜分離蛋白質(zhì)來(lái)完成的。PAGE分析顯示蛋白單體和二聚體的成功分離，并且采用定量HPLC法測(cè)量各自的K值。HPLC的保留時(shí)間為31. 5 min的峰高代表單體，而32. 8 min的峰高代表二聚體，測(cè)定兩個(gè)峰高，而比率給出了在上相對(duì)下相濃度的不同值。在PEG (1000) 12.5 %-Κ2ΗΡ04 12.5 %中，兩個(gè)蛋白峰計(jì)算的K值為4. 0和6. 9。不同 K值意味著兩個(gè)種類可以用一個(gè)或者另外一個(gè)流動(dòng)相分離。因?yàn)閿?shù)值超過(guò)2，分析物將停留在盤管中一段很長(zhǎng)的時(shí)間，最終以大約4個(gè)到7個(gè)柱體積洗脫。因此，兩個(gè)柱體積執(zhí)行一次運(yùn)行，然后柱的內(nèi)容物被擠出并分析。下相(流動(dòng)相)顯示蛋白質(zhì)出現(xiàn)在預(yù)期體積中，并且從實(shí)驗(yàn)收集的選定餾分用PAGE 進(jìn)行研究。PAGE顯示了子宮球蛋白單體和二聚體的分離，因此證明了儀器以及該儀器的使用法成功用于分離大的生物材料如蛋白質(zhì)。初始物質(zhì)的PAGE顯示小鼠子宮球蛋白單體和二聚體的存在，分別約為5 kDa和14. 5 kDa。實(shí)施例5
這個(gè)實(shí)施例進(jìn)一步展示了改進(jìn)的儀器和所述儀器使用方法分離大分子的能力。在這個(gè)實(shí)施例中，31 mg溶菌酶(14. 4 1^)￡1)與對(duì)mg肌紅蛋白(17. 7 kDa)混合在一起，并且用逆流色譜儀以及如所要求權(quán)利的方法進(jìn)行分離。非變性的兩相水溶劑體系由12.5 %PEG(MW 1000):12.5 %Κ2ΗΡ04組成，提供富含聚乙烯的上相和富含磷酸鹽緩沖液的下相。下相被用作流動(dòng)相，流動(dòng)速率為1 ml/min。UV檢測(cè)器顯示溶劑前沿的洗脫大約為40 ml，表明固定相保留為70 %，其次是兩個(gè)蛋白峰基線分離。圖4A為這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)的UV吸收?qǐng)D(在圖中以電壓作標(biāo)識(shí))。圖4B為對(duì)100 min的峰(參看泳道3_5)和200 min的峰(參看泳道7-9)的 PAGE分析。泳道10和11為對(duì)照品，分別僅為溶菌酶或者肌紅蛋白。數(shù)據(jù)顯示逆流色譜儀和使用方法在純化大的生物材料混合物中的通用性。肌紅蛋白和溶菌酶的K值分別為0. 38 和1.35，并且與洗脫順序相應(yīng)。實(shí)施例6
此處描述的逆流色譜儀和方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其使用多種溶劑體系分離多種化學(xué)物質(zhì)和生物材料的能力。在這個(gè)實(shí)施例中，該方法和儀器被用于從天然裂解物中分離蛋白質(zhì)。 現(xiàn)有技術(shù)發(fā)明在細(xì)胞裂解后需要其它的準(zhǔn)備步驟以實(shí)施逆流色譜(例如，離心)。使用要求權(quán)利的螺旋管支架儀及使用方法，大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞溶解后被分離，并無(wú)其它色譜或者準(zhǔn)備步驟。使用在前面實(shí)施例中所描述的PEG溶劑體系。目標(biāo)融合蛋白從大量宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞碎片中分離出來(lái)，并被充分純化，使其可被特定的蛋白酶消化，從融合蛋白中釋放目標(biāo)蛋白。經(jīng)消化的融合蛋白或者多肽再次在合適的溶劑體系中用該儀器純化，從蛋白質(zhì)產(chǎn)物、起始融合蛋白和蛋白酶中分離融合標(biāo)記(fusion tag)。實(shí)施例7
這個(gè)實(shí)施例進(jìn)一步描述融合蛋白Tosyn 2-Insulin A從粗裂解物中的分離。將具有 Tosyn 2-Insulin A融合蛋白的細(xì)菌在4 LSuperBroth中培養(yǎng)。球狀細(xì)菌細(xì)胞重87 g，懸于 435 ml 的 20 mM Na2HPO4^O. 5 M NaCl、pH7. 2 的溶液中。在 10-15 Kpsi 下，懸液兩次運(yùn)行通過(guò)Avestin Emulsiflex_C5勻漿器。溶液在19，000 g、4°C下離心30 min。部分上清液在-20°C下儲(chǔ)存用于后面的分析。目標(biāo)融合蛋白質(zhì)的麗大約為10 kDa。螺旋逆流色譜的溶劑體系通過(guò)結(jié)合以下來(lái)制備在1 L Erlenmeyer燒瓶中加入75 g PEG1000、75 g K2KPO4,以及 450 g 水(12.5 %PEG:12. 5 % 鹽溶劑體系)。攪拌溶液直到化學(xué)物質(zhì)完全溶解。然后將溶液轉(zhuǎn)移至500 ml玻璃分液漏斗中，其中，溶液被分離成大約MO ml的上相和300 ml的下相。包含"Tosyn 2-Insulin A的粗裂解物通過(guò)混合9 g解凍的裂解物(來(lái)自于上述的勻漿)、1. 5 g的PEG1000以及1. 5 g的K2KPO4制成。在化學(xué)物質(zhì)溶解后，試樣以1000 g離心5 min。上相的清液部分和下相的清液部分結(jié)合到試樣環(huán)中，用于注射到螺旋管支架儀中。留下深色的沉淀物。12.5 %PEG:12.5 %鹽溶劑體系用以除去大量的細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞蛋白以及DNA。將螺旋管支架儀置于行星離心機(jī)中，并用上相填充管道。開始，試樣以830 rpm的速度離心，在1 ml/min開始流動(dòng)，將試樣注入流線中。下相以逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)洗脫到內(nèi)部終端。 每2分鐘收集餾分。來(lái)自螺旋管支架儀的溶劑前沿或者排除的上相在44. 5 ml處或者餾分 20處出來(lái)。運(yùn)行中固定相保留為67 %。在餾分161處，停止離心。留在螺旋管支架儀中的內(nèi)容物用氦壓力壓出，收集餾分。基于吸收分光光度法測(cè)量的峰，某些餾分用HPLC和PAGE來(lái)分析。根據(jù)PAGE，餾分30具有很多較低麗的條帶，而餾分181和182有很多較高麗的蛋白質(zhì)條帶，包括10 kDa的目標(biāo)蛋白，其為最小的蛋白質(zhì)。較早的餾分177到174具有較少量的蛋白質(zhì)。Tosyn 2-Insulin A融合蛋白質(zhì)在第一個(gè)大峰從許多蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。通過(guò)PAGE，遲洗脫蛋白質(zhì)的量比第一洗脫餾分中蛋白質(zhì)的量要高，盡管第一洗脫餾分的UV峰較高。在上述分離中，目標(biāo)蛋白高度保留在螺旋管支架儀中，因此決定以相反的模式洗脫，觀察是否可以更好地分辨蛋白質(zhì)。制備相同的溶劑體系和相同的試樣，但是用下相填充螺旋管支架。開始離心，上相的流動(dòng)也開始。將上相泵入外部末端，并且旋轉(zhuǎn)方向?yàn)槟鏁r(shí)針。 溶劑前沿出現(xiàn)在餾分31，固定相保留為59 %。在溶劑前沿之后，留在另一個(gè)運(yùn)行中的蛋白質(zhì)被洗脫，并且在兩個(gè)主峰里擴(kuò)展開。非常高UV吸收的餾分處在末端。PAGE顯示目標(biāo)蛋白存在于餾分35中，其它蛋白質(zhì)餾分40、50以及55中也顯示該蛋白質(zhì)以低濃度存在其中。為觀察溶劑體系中較高M(jìn)W的PEG對(duì)分離的效果，遵循上述相同的程序，除了溶劑體系用較高麗的PEG (麗3350)來(lái)制備。溶劑前沿在餾分39處出來(lái)，排除體積為67 ml, 固定相保留為50 %。PAGE顯示，目標(biāo)蛋白以大大高于較高麗蛋白質(zhì)(并且與餾分52、56和 112相比)的濃度存在于餾分44中。餾分52到56含有目標(biāo)蛋白和僅僅一個(gè)另外的重要的蛋白。餾分112具有很多不同的蛋白質(zhì)并且從目標(biāo)蛋白質(zhì)中除去。這個(gè)結(jié)果似乎從融合蛋白質(zhì)中出去了更多的雜質(zhì)。總之，多聚體的溶劑體系工具可以通過(guò)以下方式改變(1)與聚合物MW相關(guān)的組合物，(2)鹽的水溶液的pH，以及(3)可加入用以優(yōu)化想要純化的物質(zhì)分配系數(shù)的其它內(nèi)含物。溶劑體系可用在流動(dòng)的上相或者下相中，用以最大分離雜質(zhì)。因此本發(fā)明是分離和純化實(shí)體(比如，大分子，比如，生物分子)的通用方法。表 權(quán)利要求
1.一種逆流色譜儀，包括1)一個(gè)或者多個(gè)第一表面，其中所述第一表面包括多個(gè)交織的螺旋通道；2)—個(gè)或多個(gè)管道接入端口；以及3)可選地，一個(gè)或多個(gè)徑向通道。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述徑向通道是彎曲的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)凸起，用于將管道固定在所述螺旋通道的適當(dāng)位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述的逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)放置重物的空間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定壓緊螺釘組合的彈簧鎖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)壓緊螺釘組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定管道的環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定器支架。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜儀，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括第二表面，其中所述第二表面為所述第一表面頂部。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第二表面進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)管道接入端口。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第二表面進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)可放置重物的空間。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第一表面通過(guò)一種或多種鎖定機(jī)構(gòu)附著于所述第二表面上。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第二表面進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定管道的環(huán)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第二表面進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定壓緊螺釘組合的彈簧鎖。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種逆流色譜儀，其中所述第二表面進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)固定器支架。
16.一種制造逆流色譜儀的方法，包括制作成型第一表面，所述第一表面包括多個(gè)交織的螺旋通道；一個(gè)或多個(gè)管道接入端口，以及可選地，徑向通道。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種方法，其中所述第一表面由一種或多種選自以下的材料制成尼龍聚合物、塑料、聚四氟乙烯(Teflon )、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酰胺PA-220、光敏聚合物、FullCure 材料、Polyjet 3D Printer 材料、單體粉末，以及包含金屬或者金屬組合物的顆粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種方法，其中所述成型為選自以下的工藝激光燒結(jié)、紫外線照射、鑄模、原型、鉆和機(jī)械加工。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種方法，其中所述徑向通道是彎曲的。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種方法，其中所述第一表面進(jìn)一步包括可放置重物的空間、固定管道的環(huán)、固定器支架、彈簧鎖或者其組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種方法，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括制作成型第二表面，其中所述第二表面為所述第一表面的頂部。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種方法，其中所述第二表面用一種或多種選自以下的材料制作成型尼龍聚合物、塑料、聚四氟乙烯(Teflon )、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酰胺 PA-220、光敏聚合物、FullCure 材料、Polyjet 3D Printer 材料、單體粉末以及包含金屬或者金屬組合物的顆粒。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種方法，其中所述成型工藝選自激光燒結(jié)、紫外線照射、鑄模、原型、鉆和機(jī)械加工。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種方法，其中所述第二表面進(jìn)一步包括管道接入端口、 可放置重物的空間、將所述第二表面附著到所述第一表面的鎖定機(jī)構(gòu)，或者其組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的一種方法，其中所述鎖定機(jī)構(gòu)選自鎖、螺栓、卡扣、夾子、 螺釘、槽口、可放置軸的中心空間以及用于附著相對(duì)表面的螺紋。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種方法，其中所述第二表面進(jìn)一步包括環(huán)、彈簧鎖、固定器支架或者其組合。
27.一種利用逆流色譜儀分離一種或多種物質(zhì)的方法，包括將管道排布通過(guò)入口進(jìn)入到所述逆流色譜儀使用的轉(zhuǎn)子中，包括交織的螺旋通道以及可選的徑向通道；將所述管道排布通過(guò)所述交織的螺旋通道，然后穿過(guò)所述轉(zhuǎn)子的出口 ；提供包含一種或多種物質(zhì)的試樣；提供溶劑體系；將所述試樣載入所述溶劑體系中；通過(guò)所述管道將所述結(jié)合的試樣和溶劑體系置于所述逆流色譜儀中；以及提供在所述逆流色譜儀轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)以分離所述一種或多種物質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述管道具有非均勻的內(nèi)表面。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述徑向通道是彎曲的。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括在所述螺旋通道中的一個(gè)或多個(gè)凸起，以固定管道的位置。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括可放置重物的空間、彈簧鎖、壓緊螺釘組合、環(huán)、固定器支架或者其組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述逆流色譜儀進(jìn)一步包括第二表面，其中所述第二表面為所述第一表面的頂部。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的一種方法，其中所述第二表面進(jìn)一步包括管道接入端口、 可放置重物的空間、鎖定機(jī)構(gòu)、環(huán)、彈簧鎖、固定器支架或者其組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述旋轉(zhuǎn)為行星式。
35.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種方法，其中所述溶劑體系選自兩相的聚乙烯水溶液和鹽溶液；兩相的重醇水溶液；聚乙二醇K2HPO4溶液；以及仲丁醇-三氟乙酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建逆流色譜中使用的螺旋管支架儀的方法、對(duì)逆流色譜管道支架設(shè)計(jì)的改進(jìn)，以及利用改進(jìn)的逆流色譜儀的方法。螺旋管支架儀可通過(guò)成型工藝構(gòu)建，成型過(guò)程比如反過(guò)來(lái)使用激光燒結(jié)技術(shù)的三維立體打印工藝，并可用任何容易成型的材料制造。在管道支架以及頂部?jī)烧叩男螤罡淖兏倪M(jìn)了管道支架的性能以及制造的難度。改進(jìn)的管道支架以及制造的新方法使其既可在小規(guī)?；蛘叽笠?guī)模制備中使用，也可在小分子或者大分子制備中使用。特別地，描述了可純化蛋白質(zhì)的特定溶劑體系。
文檔編號(hào)G01N30/42GK102282464SQ200980154785
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者托馬斯·芬恩, 瑪莎·奈特 申請(qǐng)人:Cc生物技術(shù)有限責(zé)任公司