專利名稱：乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒，具體涉及一種應(yīng) 用乳膠粒子增強(qiáng)技術(shù)提高轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度檢測的靈敏度，可用于尿液中低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白的檢 測。
背景技術(shù)：
腎小球濾過膜對蛋白質(zhì)濾過有兩種屏障，即體積屏障和電荷屏障。濾過膜濾過孔 徑的大小決定了體積屏障；電荷屏障的產(chǎn)生是由于腎小球濾過膜富含帶負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)成 分，使帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)難以濾過，轉(zhuǎn)鐵蛋白屬此類蛋白質(zhì)。已有證明一旦腎小球疾病，腎 小球濾過膜中帶負(fù)電荷成分涎酸和硫酸肝素含量減少，此時電荷屏障受損使帶負(fù)電荷的蛋 白質(zhì)易于濾出，從而進(jìn)入腎小囊并從尿能夠排泄。目前臨床常用檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法為免疫比濁法，此方法以其快速，簡便可靠，可 在各型自動生化分析儀上使用的特點而在臨床廣泛應(yīng)用。但是其檢測范圍通常在2-15g/L， 只能用于檢測血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度(參考范圍2-3. 6g/L)，而難以檢出尿中的轉(zhuǎn)鐵蛋白 濃度水平(尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白參考范圍0-0. 2mg/L)。如能開發(fā)出可在自動生化分析儀上使用 的免疫比濁試劑盒用于檢測尿液中低濃度范圍的轉(zhuǎn)鐵蛋白，將為臨床早期檢測腎病發(fā)生提 供有力的實驗依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述問題，通過研究乳膠粒子增強(qiáng)的方法，提高檢測的靈敏 度，從而解決臨床沒有可常規(guī)檢測尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白手段的問題，提供一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁 法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒。該發(fā)明適用于臨床進(jìn)行常規(guī)檢測尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測。本發(fā)明研究選擇合適的乳膠粒子，及轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子共價結(jié)合的合適途 徑，建立低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白水平下和已結(jié)合乳膠粒子的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體反應(yīng)形成340nm-700nm 可檢測的濁度反應(yīng)體系，包括反應(yīng)必需的合適的緩沖液，PH和離子強(qiáng)度等。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)—種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的 包括乳膠粒子、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和緩沖液；轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子共價結(jié)合的合適途徑，建 立低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白水平下和已結(jié)合乳膠粒子的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體反應(yīng)形成在340nm-700nm檢 測的濁度反應(yīng)體系。一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟(1)、乳膠粒子的活化①取1000 μ 1兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體加入2000 μ 1 20mM磷酸緩沖液，pH7. 50，混勻
②取600 μ 1 10% 20-40nm 乳膠粒子，離心 4°C 2IOOOrpm 90min，棄去濾液；③加入1000 μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00用超聲清洗劑溶解粒子，離心清洗兩 次；④用3000 μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00溶解乳膠粒子，使乳膠粒子活化濃度為 2% ；加入0.036g N-羥基琥珀酰亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到12mg/ml ；0. 060gl_(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，使反應(yīng)濃度達(dá)到20mg/ml ；⑤室溫振蕩15min ；⑥4°C高速離心60min，棄去濾液；⑦用3000μ1 2mM鹽酸冰浴溶解乳膠粒子，4°C高速離心清洗90min，立刻用于結(jié) 合；(2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子的結(jié)合①加入兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體緩沖液，使乳膠粒子結(jié)合濃度為2% ；②室溫振蕩2hr;③4°C高速離心60min，分離濾液，保存濾液；④用3000 μ 1 20mM磷酸緩沖液，pH7. 50，溶解乳膠粒子，高速離心清洗，制成保存 溶液，立刻用于保存；(3)、保存①加入3000 μ 1保存溶液，ρΗ7. 50溶解乳膠粒子，使乳膠粒子保存濃度為2% ；②混勻，4°C保存，用于穩(wěn)定。所述高速離心是21000rpm離心。其中，所述室溫振蕩的頻率為2000次/分鐘。其中，所述室溫是指溫度不高于30°C。本發(fā)明的有益效果此試劑盒可用于檢測尿液中濃度范圍為0_12mg/L的尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白水平，準(zhǔn)確度 可溯源到CRM470CRM是英語Certified Reference Material (認(rèn)可的參考材料)的縮寫， CRM 470是14個(血清)蛋白分析物的參考制品，精密度< 10%，從而滿足臨床的需要。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具 體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實施例1(一 )抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體包被乳膠粒子一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的 包括乳膠粒子、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和緩沖液；轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子共價結(jié)合的合適途徑，建 立低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白水平下和已結(jié)合乳膠粒子的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體反應(yīng)形成340nm-700nm可檢 測的濁度反應(yīng)體系，包括以下步驟1、乳膠粒子的活化(1)取1000 μ 1Q0327(兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體，丹麥Dako公司生產(chǎn))加入2000 μ 1 20mM磷酸緩沖液，pH7. 50 (編號20PS5)，混勻備用；
(2)取600 μ 1 10 % Κ1-0005乳膠粒子(Merck公司生產(chǎn))，離心 40C 21000rpm90min，棄去濾液；(3)加入1000 μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00(編號10PS)用超聲清洗劑溶解粒子， 離心清洗兩次；(4)用3000 μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00 (編號10PS)溶解乳膠粒子，使乳膠粒 子活化濃度為2% ；加入0.036g N-羥基琥珀酰亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到12mg/ml ；0. 060g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，使反應(yīng)濃度達(dá)到20mg/ml ；(5)室溫2000次/分鐘頻率振蕩15min，室溫不高于30°C ；(6)離心 4°C 2IOOOrpm 60min，棄去濾液；(7)用3000 μ 1 2mM鹽酸冰浴溶解乳膠粒子，4°C 2IOOOrpm 90min離心清洗，立刻
用于結(jié)合；2、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子的結(jié)合(1)加入兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體緩沖液，使乳膠粒子結(jié)合濃度為2% ；(2)室溫2000次/分鐘頻率振蕩2hr ；(3)離心4°C 2IOOOrpm 60min,分離濾液，保存濾液；(4)用3000 μ 1 20mM磷酸緩沖液，ρΗ7. 50 (編號20PSQ，溶解乳膠粒子，離心清洗， 制成保存溶液，立刻用于保存；3、保存(1)加入3000 μ 1保存溶液，ρΗ7. 50 (編號SB)溶解乳膠粒子，使乳膠粒子保存濃 度為2% ；(2)混勻，4°C保存，用于穩(wěn)定。( 二)試劑盒制備1.試劑1—反應(yīng)緩沖液:200mM Tris緩沖液50ml, ρΗ7· 15，見表1。表1試劑1的配方
權(quán)利要求
1.一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的包 括乳膠粒子、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和緩沖液；轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子共價結(jié)合的合適途徑，建立 低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白水平下和已結(jié)合乳膠粒子的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體反應(yīng)形成在340nm-700nm檢測 的濁度反應(yīng)體系。
2.一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟(1)、乳膠粒子的活化①取1000μ 1兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體加入2000 μ 1 20mM磷酸緩沖液，pH7. 50，混勻備用；②取600μ 1 10% 20-40nm乳膠粒子，離心4°C 2IOOOrpm 90min,棄去濾液；③加入1000μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00用超聲清洗劑溶解粒子，離心清洗兩次；④用3000μ 1 IOmM磷酸緩沖液，pH6. 00溶解乳膠粒子，使乳膠粒子活化濃度為2% ； 加入0.036g N-羥基琥珀酰亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到12mg/ml ；0. 060gl-(3_ 二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，使反應(yīng)濃度達(dá)到20mg/ml ；⑤室溫振蕩15min；⑥4°C高速離心60min，棄去濾液；⑦用3000μ 1 2mM鹽酸冰浴溶解乳膠粒子，4°C高速離心清洗90min，立刻用于結(jié)合；(2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子的結(jié)合①加入兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體緩沖液，使乳膠粒子結(jié)合濃度為2%；②室溫振蕩2hr；③4°C高速離心60min，分離濾液，保存濾液；④用3000μ 1 20mM磷酸緩沖液，pH7. 50,溶解乳膠粒子，高速離心清洗，制成保存溶 液，立刻用于保存；03)、保存①加入3000μ 1保存溶液，ρΗ7. 50溶解乳膠粒子，使乳膠粒子保存濃度為2% ；②混勻，4°C保存，用于穩(wěn)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述高速離心是21000rpm離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，其中，所述室溫振蕩的頻率為2000次/分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，其中，所述室溫是指溫度不高于 30°C。
全文摘要
一種乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的包括乳膠粒子、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和緩沖液；轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子共價結(jié)合的合適途徑，建立低濃度轉(zhuǎn)鐵蛋白水平下和已結(jié)合乳膠粒子的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體反應(yīng)形成在340nm-700nm檢測的濁度反應(yīng)體系。其制備方法，包括乳膠粒子的活化、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和乳膠粒子的結(jié)合和保存。該試劑盒可用于檢測尿液中濃度范圍為0-12mg/L的尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白水平，準(zhǔn)確度可溯源到CRM470，精密度＜10％，從而滿足臨床的需要。
文檔編號G01N33/545GK102128924SQ201010022668
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者孫永杰 申請人:上海景源醫(yī)療器械有限公司