專利名稱：一種檢測農(nóng)產(chǎn)品中2,4-二氯苯氧乙酸的電化學免疫傳感方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測方法，具體是一種檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸的電化 學免疫傳感方法。
背景技術：
2， 4-D是一種應用廣泛的植物生長調(diào)節(jié)劑，其測定方法有萃取_光度法、液相色譜 法、液相色譜質(zhì)譜法、薄層色譜法、衍生氣相色譜法等。但這些傳統(tǒng)方法都有一定的局限性， 如樣品前處理復雜、操作繁瑣費時、測定周期長、設備昂貴、靈敏度低等。免疫傳感器是利 用電化學免疫傳感器的高靈敏度、簡便、快速等特點，結合生物識別系統(tǒng)(抗原抗體特異性 結合)而形成的一種自動化分析檢測系統(tǒng)，具有操作簡單、快速、廉價、精簡、靈敏度高等優(yōu) 點，在2， 4-D的測定中引起高度重視。因此，研究一種高靈敏度、簡便、快速的2， 4-D免疫傳 感測定新方法有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量 的檢測方法。本發(fā)明能較好的滿足2， 4-D測定的需要，且方法簡單，快速，靈敏度高，為檢測 2，4-D提供了一種新的途徑。 為了達到上述目的，本發(fā)明提供的檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量的方法包括以下步 驟2，4-D與BSA的偶聯(lián)；在金電極表面制備無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器；制備HRP
標記的羊抗鼠Ig6抗體；制作標準工作曲線；樣品檢測。 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案還可以進一步完善。所述2，4-D與BSA 的偶聯(lián)可以由以下步驟制備稱取3. 315g 2，4-D(0.015mmo1)溶解在0. 5mL的無菌DMF中， 再稱取NHS 4. 028g(0. 035,1) 、EDC 6. 71g (0. 035,1)同時加入2， 4-D的無菌DMF中，室 溫下攪拌反應5小時(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4mL pHll的硫酸緩沖液 中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完，在室溫 下慢速攪拌反應4小時，4t:過夜。將反應液放入透析袋，在500M1 10%的DMF液中4t:透 析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4-D與BSA的偶聯(lián)物。將 2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。 所述無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器可以由以下步驟制備(l)金電極表面 的1，6-己二硫醇自組裝將洗凈過的金電極放入2. 5mM 1，6-己二硫醇溶液中，自組裝2 小時，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，即在金電極表面獲得一層致密均勻的1， 6-己二硫醇自組裝單層膜；(2)修飾后的金電極表面抗原固定化將自組裝了 1，6-己二硫 醇自組裝單層膜的金電極浸入納米金膠溶液中室溫靜置1. 5-2小時，取出后用PBS攪拌洗 滌5min，用水淋洗后，吹干；在電極表面滴加15ii L的2，4-D-BSA溶液并置于37t:恒溫水浴 箱中溫育4小時，用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干；再在電極表面上滴加40y Ll%
3BSA(pH 7. 4)并置于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時，以封閉電極表面多余的蛋白結合位點， 防止免疫測定過程中的非特異性吸附產(chǎn)生誤差，用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干， 即獲得無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器。 所述的制作標準工作曲線方法為取不同濃度的2，4_D標準溶液和2，4_D抗體 (單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器，37t:環(huán)境下 反應50min ;接著加入HRP標記抗體(二抗)，37。C環(huán)境下反應50min，對免疫傳感器表面的 計時電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。改變2， 4-D標準溶液的濃度，按上述步驟測 定一系列不同濃度的2，4-D標準溶液，用免疫傳感器表面的計時電流變化值與2，4-D濃度 繪制標準工作曲線。 所述的樣品測定方法為取處理好的樣品溶液和2， 4-D抗體(單抗)混合液，取常 規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應50min ;接著加入 HRP標記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應50min，對免疫傳感器表面的計時電流連續(xù)檢測直到 穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值。將計時響應電流值與繪制好的標準工作曲線對照獲得農(nóng)產(chǎn)品樣品溶 液中2，4-D的數(shù)值。 2，4-D電化學免疫傳感器的檢測原理本發(fā)明是基于利用電化學免疫傳感器具有 高靈敏度、簡便、快速、可靠等特點，結合生物識別系統(tǒng)(抗原抗體特異性結合)而形成的一 種自動化分析檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量的檢測。本發(fā)明利用自組裝技術和靜電 吸附作用，將2，4-D-BSA全抗原固定在通過由自組裝1，6-己二硫醇和靜電吸附納米金修飾 的金電極表面，解決了抗原固定的難題，然后在電極上滴加anti-2，4-D和2，4_D的混合物， 由于2， 4-D和2， 4-D-BSA都能與anti-2， 4-D發(fā)生高特異性的免疫反應，如果樣品中2， 4-D 含量高，由于大部分2，4-D抗體已經(jīng)與樣品中2，4-D反應了，結合到金電極表面的2，4-D抗 體就少，這樣HRP標記的二抗結合上去的量也就少。2， 4-D和2， 4-D-BSA競爭與anti-2， 4-D 反應后，用HRP標記的羊抗鼠IgG將信號進一步放大，然后用循環(huán)伏安法測定。本發(fā)明實際 上其放大倍數(shù)與樣品中2，4-D含量成反比，即樣品中2，4-D越少，那么連接到金電極上的抗 體反而越多，HRP標記的二抗上去的也越多，質(zhì)量放大越明顯。 本發(fā)明效果是在2，4-D濃度為0. 5ng/mL-2500ng/mL范圍內(nèi)成線性關系，校正曲 線是y = -18. 45x+71. 59，相關系數(shù)R為0. 9960，檢測下限為0. 05ng/mL。經(jīng)應用證實此方 法能較好的滿足農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D測定的需要。


圖1是本發(fā)明的農(nóng)產(chǎn)品實際樣品2，4-D含量的檢測圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
—.試劑與儀器 2，4_D，1，6-己二硫醇，氯金酸，BSA，擰檬酸三鈉均從Sigma公司購買，鐵氰化鉀， 亞鐵氰化鉀，氯化鉀磷，EDC， NHS，l，4-二氧雜環(huán)乙烷均購自上?；瘜W試劑公司。其它試劑 均為分析純試劑，實驗用水均為二次蒸餾水。 CHI660C電化學工作站，金電極，Ag/Agcl飽和電極，鉬絲電極均從上海辰華儀器公司購買，BRANS0NIC200超聲清洗儀(德國BRANSON ULTRASCHALL公司)，CS501-SP型超 級數(shù)顯恒溫器(重慶四達實驗儀器廠制造)，MP230酸度計(瑞士 Metter Toledo公司)， AB204-S電子天平(瑞士 Metter Toledo公司)，2， 4_D單克隆抗體。
二、實施方法 這種檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4_D的方法，主要包括以下步驟來實現(xiàn)
1. 2，4-D與BSA的偶聯(lián):稱取3. 315g 2， 4_D (0. 015mmol)溶解在0. 5mL的無菌DMF 中，再稱取NHS 4. 028g(0. 035mmol) 、 EDC 6. 71g (0. 035mmol)同時加入2， 4_D的無菌DMF 中，室溫下攪拌反應5小時(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4mL pH 11的硫酸 緩沖液中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完， 在室溫下慢速攪拌反應4小時，fC過夜。將反應液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中 4t:透析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D與BSA的偶聯(lián) 物。將2 ， 4-D-BSA保存在4 °C的PBS中，備用。 2.無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器的制備將洗凈過的金電極放入2. 5mMl， 6-己二硫醇溶液中，自組裝2小時，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，即在金電極 表面獲得一層致密均勻的1，6-己二硫醇自組裝單層膜；將自組裝了 1，6-己二硫醇自組裝 單層膜的金電極浸入納米金膠溶液中室溫靜置1. 5-2小時，取出后用PBS攪拌洗滌5min， 用水淋洗后，吹干；在電極表面滴加15 ii L的2，4-D-BSA溶液并置于37。C恒溫水浴箱中溫 育4小時，用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干；再在電極表面上滴加40 y LI % BSA (pH 7. 4)并置于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時，以封閉電極表面多余的蛋白結合位點，防止免 疫測定過程中的非特異性吸附產(chǎn)生誤差，用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干，即獲得 無試劑型2， 4- 二氯苯氧乙酸電化學免疫傳感器。
3.制備HRP標記的羊抗鼠IgG抗體。 4.標準工作曲線的制作取不同濃度的2，4-D標準溶液和2，4-D抗體(單抗) 混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應 50min ;接著加入HRP標記抗體(二抗)，37。C環(huán)境下反應50min，對免疫傳感器表面的計時 電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定值。改變標準濃度的2，4-D，按上述步驟測定一系列2， 4-D的標準溶液，用免疫傳感器表面的計時電流變化值與2，4-D濃度繪制標準工作曲線在 2，4-D濃度為0. 5ng/mL-2500ng/mL范圍內(nèi)成線性關系，校正曲線是y = -18. 45x+71. 59，相 關系數(shù)R為0. 9960，該免疫傳感器的的檢測下限為0. 05ng/mL ; 5.樣品檢測取處理好的樣品溶液和2， 4-D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到 已制備好的無試劑型2， 4-D電化學免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應50min ;接著加入HRP標記 抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應50min，對免疫傳感器表面的計時電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲 得穩(wěn)定值。將計時響應電流值與繪制的標準工作曲線對照獲得樣品溶液中2，4-D的數(shù)值。
本方法檢測實例利用該傳感器對棉花幼葉中2，4_D含量進行了檢測取棉花幼 葉鮮樣1. 5000g，于1. 5mL離心管中冰浴研磨，加入600ii L 100%的甲醇，混勻后浸提過夜， 4800g離心10min，取上清液至一新離心管中，剩余殘渣用200 y L 100X的甲醇浸提2h， 4800g離心10min，取上清液，合并兩次上清液，移入一新5mL離心管中。用3000 y L超純水 稀釋提取液，過Waters S印-pak C18柱，用200iiL 20X甲醇和250iiL 30%甲醇分別洗脫 后，用300 ii L 100%甲醇洗脫并收集IAA，用于后續(xù)的檢測和分析。接著，將收集好的2，4-D
5用100 ii L 100%甲醇溶解后，取20 ii L進行HPLC檢測，同時，取20 y L加入PBS溶液中，用2，4_D電化學免疫傳感器檢測，其檢測數(shù)據(jù)表明(圖l)，與HPLC測定的結果基本一致。
權利要求
一種檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的電化學免疫傳感方法，其特征在于包括以下步驟(1)2，4-D與BSA的偶聯(lián)；(2)在金電極表面制備無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器；(3)制備HRP標記的羊抗鼠IgG抗體；(4)制作標準工作曲線；(5)樣品中2，4-D含量的檢測。
2. 根據(jù)權利要求1所述的2，4-D與BSA的偶聯(lián)方法，其特征在于中所述的2，4-D與 牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)按以下方法進行稱取3. 315g 2，4-D溶解在0. 5ml的無菌二甲 基甲酰胺(DMF)中，再稱取N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)4.028g、二氯乙烷(EDC)6. 71g同時加 入2，4-D的無菌DMF中，室溫下攪拌反應5小時(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024g BSA溶于 2. 4mLpH 11的硫酸緩沖液中，然后將含有2，4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液 中，在室溫下慢速攪拌反應4小時，4t:過夜。將反應液放入透析袋，在500ml 10X的DMF液 中4"透析二次(4h/次)；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D與BSA的 偶聯(lián)物。將2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。
3. 根據(jù)權利要求1所述的無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器由以下步驟制備將洗凈 過的金電極放入2. 5mM 1，6-己二硫醇溶液中，自組裝2小時，取出金電極，金電極表面用純 水清洗三次，即在金電極表面獲得一層致密均勻的1，6-己二硫醇自組裝單層膜；將自組裝 了 1，6-己二硫醇自組裝單層膜的金電極浸入納米金膠溶液中室溫靜置1. 5-2小時，取出后 用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干；在電極表面滴加15 y L的2， 4-D-BSA溶液并置于 37t:恒溫水浴箱中溫育4小時，用PBS攪拌洗滌5min，用水淋洗后，吹干；再在電極表面上 滴加40 ii Ll% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒溫水浴箱中溫育1小時，以封閉電極表面多余的 蛋白結合位點，防止免疫測定過程中的非特異性吸附產(chǎn)生誤差，用PBS攪拌洗滌5min，用水 淋洗后，吹干，即獲得無試劑型2 ， 4-D電化學免疫傳感器。
4. 根據(jù)權利要求1所述標準工作曲線的制作，其特征在于取不同濃度的2，4-D標準 溶液和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D電化學免疫 傳感器，37t:環(huán)境下反應50min ;接著加入HRP標記抗體(二抗)，37。C環(huán)境下反應50min， 對免疫傳感器表面的計時電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。改變2，4-D標準溶液 的濃度，按上述步驟測定一系列不同濃度的2，4-D標準溶液，用免疫傳感器表面的計時電 流變化值與2，4-D濃度繪制標準工作曲線。
5. 根據(jù)權利要求1所述的檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D的方法，其特征在于取處理好的樣品 溶液和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D電化學免疫 傳感器，37t:環(huán)境下反應50min ;接著加入HRP標記抗體(二抗)，37。C環(huán)境下反應50min， 對免疫傳感器表面的計時電流連續(xù)檢測直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值。將計時響應電流值與繪 制好的標準工作曲線對照獲得農(nóng)產(chǎn)品樣品溶液中2，4-D的數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種檢測農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸的電化學免疫傳感方法，主要包括以下步驟來實現(xiàn)1)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)與BSA的偶聯(lián)；2)電極修飾與免疫傳感器的制備；3)制備HRP標記的羊抗鼠IgG抗體；4)標準曲線的制備；5)樣品檢測。本發(fā)明有益的效果是在檢測中，利用HRP標記的羊抗鼠IgG將信號放大，提高檢測靈敏度，從而實現(xiàn)2，4-D的高靈敏定量測定。該方法在2，4-D濃度為0.5ng/mL～2500ng/mL范圍內(nèi)成線性關系，檢測下限為0.05ng/ml，能較好的滿足農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D測定的需要，且具有方法簡便，結果可靠，成本較低等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/531GK101769892SQ201010100810
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權日2010年1月26日
發(fā)明者劉清, 夏石頭, 李合松, 肖浪濤 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學