專利名稱：一種檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2,4-二氯苯氧乙酸的壓電免疫傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)方法，具體是一種檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸的壓電 免疫傳感方法。
背景技術(shù)：
2， 4-D是一種應(yīng)用廣泛的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其測(cè)定方法有萃取_光度法、液相色譜 法、液相色譜質(zhì)譜法、薄層色譜法、衍生氣相色譜法等。但這些傳統(tǒng)方法都有一定的局限性， 如樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣費(fèi)時(shí)、測(cè)定周期長(zhǎng)、設(shè)備昂貴、靈敏度低等。免疫傳感器是利 用電化學(xué)免疫傳感器的高靈敏度、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，結(jié)合生物識(shí)別系統(tǒng)(抗原抗體特異性 結(jié)合)而形成的一種自動(dòng)化分析檢測(cè)系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在2，4-D 的測(cè)定中引起高度重視，因此，研究一種高靈敏度、簡(jiǎn)便、快速的2，4-D免疫傳感測(cè)定新方 法有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量 的檢測(cè)方法。本發(fā)明能較好的滿足2， 4-D測(cè)定的需要，且方法簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，為檢測(cè) 2，4-D提供了一種新的途徑。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量的方法包括以下步 驟2，4-D與BSA的偶聯(lián)；在金電極表面制備無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器；制備納米金
標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；樣品檢測(cè)。 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案還可以進(jìn)一步完善。所述2，4-D與BSA 的偶聯(lián)可以由以下步驟制備稱取3. 315g 2，4-D(0.015mmo1)溶解在0. 5mL的無菌DMF中， 再稱取NHS 4. 028g(0. 035,1) 、EDC 6. 71g (0. 035,1)同時(shí)加入2， 4-D的無菌DMF中，室 溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4mL pH 11的硫酸緩沖液 中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完，在室溫 下慢速攪拌反應(yīng)4小時(shí)，4t:過夜。將反應(yīng)液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4t:透 析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4-D與BSA的偶聯(lián)物。將 2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。 所述無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器可以由以下步驟制備(l)石英晶振表面 的半胱胺鹽酸鹽溶液自組裝向洗凈的石英晶振內(nèi)加入10. OmM半胱胺鹽酸鹽溶液，并于 25°C自組裝2. 5小時(shí)，石英晶振表面用純水清洗三次，即在晶振表面獲得一層致密均勻的 半胱胺自組裝單層膜；(2)修飾后的石英晶振表面抗原固定化用2. 5% (V/V)戊二醛溶液 50 ii L活化組裝后金電極表面的羧基；經(jīng)PBS和去離子水清洗后，吹干。將自組裝了半胱胺 自組裝單層膜的金電極電極表面滴加30 ii L濃度為10. 0 ii g *mL—1的BSA_2，4_D溶液于晶振 表面，置于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時(shí)，用PBS和去離子水清洗，晾干；再在電極表面上滴加40 ii Ll% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒溫水浴箱中溫育1小時(shí)，以封閉電極表面多余的 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，防止免疫測(cè)定過程中的非特異性吸附產(chǎn)生誤差，經(jīng)PBS和去離子水清洗后， 吹干，即獲得無試劑型2，4-D電化學(xué)免疫傳感器。 所述的制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方法為取不同濃度的2，4_D標(biāo)準(zhǔn)溶液和2，4_D抗體 (單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環(huán)境下反 應(yīng)1小時(shí)；接著加入納米金標(biāo)記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)免疫傳感器表面 的頻率變化連續(xù)檢測(cè)直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。改變2， 4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，按上述步驟 測(cè)定一系列不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2，4-D濃度繪 制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。 所述的樣品測(cè)定方法為取處理好的樣品溶液和2， 4-D抗體(單抗)混合液，取常 規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應(yīng)l小時(shí)；接著加入納 米金標(biāo)記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)免疫傳感器表面的頻率變化連續(xù)檢測(cè)直 到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值。將頻率變化值與繪制好的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)照獲得農(nóng)產(chǎn)品樣品溶液 中2，4-D的數(shù)值。 2，4-D壓電免疫傳感器的檢測(cè)原理本發(fā)明是基于利用壓電免疫傳感器具有高靈 敏度、簡(jiǎn)便、快速、可靠等特點(diǎn)，結(jié)合生物識(shí)別系統(tǒng)(抗原抗體特異性結(jié)合)而形成的一種 自動(dòng)化分析檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D含量的檢測(cè)。本發(fā)明利用自組裝技術(shù)和靜電吸 附作用，將2，4-D-BSA全抗原固定在通過由自組裝半胱胺和靜電吸附納米金修飾的石英晶 振金電極表面，解決了抗原固定的難題，然后在電極上滴加anti-2， 4-D和2， 4-D的混合物， 由于2，4-D和2，4-D-BSA都能與anti-2， 4-D發(fā)生高特異性的免疫反應(yīng)，如果樣品中2，4_D 含量高，由于大部分2，4-D抗體已經(jīng)與樣品中2，4-D反應(yīng)了，結(jié)合到金電極表面的2，4-D抗 體就少，這樣納米金標(biāo)記的二抗結(jié)合上去的量也就少。2，4-D和2，4-D-BSA競(jìng)爭(zhēng)與anti-2， 4-D反應(yīng)后，用納米金標(biāo)記的羊抗鼠IgG將信號(hào)進(jìn)一步放大，然后用石英晶體分析儀及聯(lián)機(jī) 計(jì)算機(jī)測(cè)定。本發(fā)明實(shí)際上其放大倍數(shù)與樣品中2，4-D含量成反比，即樣品中2，4-D越少， 連接到金電極上的抗體反而越多，納米金標(biāo)記的二抗上去的也越多，質(zhì)量放大越明顯。
本發(fā)明效果是在2，4-D濃度為13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢測(cè) 下限為13. Ong/ml，能滿足農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D測(cè)定的需要。


圖1是本發(fā)明的農(nóng)產(chǎn)品實(shí)際樣品2，4-D含量的檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
—、試劑與儀器 半胱胺(Cys， ACROS公司)、BSA_2， 4_D偶聯(lián)抗原(BSA_2， 4_D)由植物激素與生長(zhǎng) 發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成、配制；戊二醛為Fluka公司產(chǎn)品；鼠抗2， 4-D抗體委托北京博 奧森生物技術(shù)有限公司制備；羊抗鼠IgG抗體(G-Anti-MsIgG)和牛血清白蛋白(BSA)從 北京鼎國生物技術(shù)有限公司購買；氯金酸和檸檬酸鈉購于上?；瘜W(xué)試劑公司；不同pH值的 PBS溶液用0. 01M Na2HP04和KH2P04配制;Piranha試劑為按體積比3 : 7配制的H202_H2S04混合液；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)中所用的水為二次蒸餾水。 9腿z， AT-切型雙面鍍金石英晶振(QCM)購于北京晨星無線電設(shè)備廠，使用前用 0型橡膠圈和塑料片將一側(cè)封閉而另一側(cè)粘有一個(gè)總體積為300 L的檢測(cè)池；聯(lián)機(jī)的壓 電分析儀(QCA922)購于美國的普林斯頓應(yīng)用研究所；CSS501型恒溫箱購于重慶實(shí)驗(yàn)裝備 廠；TCL-16A型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡 (SEM，JSM 6700F)為日本JEOLLtd.公司產(chǎn)品。
二、實(shí)施方法 這種檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4_D的方法，主要包括以下步驟來實(shí)現(xiàn)
1. 2，4-D與BSA的偶聯(lián):稱取3. 315g 2， 4_D (0. 015mmol)溶解在0. 5mL的無菌DMF 中，再稱取NHS 4. 028g(0. 035mmol) 、 EDC 6. 71g (0. 035mmol)同時(shí)加入2， 4_D的無菌DMF 中，室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4ml pHll的硫酸緩 沖液中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完，在 室溫下慢速攪拌反應(yīng)4小時(shí)，4t:過夜。將反應(yīng)液放入透析袋，在500M110X的DMF液中4°C 透析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D與BSA的偶聯(lián)物。 將2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。 2.無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器的制備向洗凈的石英晶振內(nèi)加入10. OmM半 胱胺鹽酸鹽溶液，并于25°C自組裝2. 5小時(shí)，石英晶振表面用純水清洗三次，即在晶振表 面獲得一層致密均勻的半胱胺自組裝單層膜；用2.5% (V/V)戊二醛溶液50iiL活化組裝 后金電極表面的羧基。經(jīng)PBS和去離子水清洗后，吹干。在電極表面滴加30iiL濃度為 10. 0 ii g mL—1的BSA-2， 4-D溶液于晶振表面，置于37。C恒溫水浴箱中溫育1小時(shí)，用PBS 和去離子水清洗，晾干。再在電極表面上滴加40 ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒溫水 浴箱中溫育1小時(shí)，以封閉電極表面多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，防止免疫測(cè)定過程中的非特異 性吸附產(chǎn)生誤差，經(jīng)PBS和去離子水清洗后，吹干，即獲得無試劑型2， 4-D壓電免疫傳感器。
3.制備納米金標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。 4.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作取不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液和2，4-D抗體(單抗) 混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2， 4-D壓電免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小 時(shí)；接著加入納米金標(biāo)記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)免疫傳感器表面的頻率 變化連續(xù)檢測(cè)直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。改變2， 4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，按上述步驟測(cè)定 一系列不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2，4-D濃度繪制 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在2，4-D濃度為13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，校正曲線是y =-279. 1+255. 5x，相關(guān)系數(shù)R為0. 9957，檢測(cè)下限為13. Ong/mL。 5.樣品檢測(cè)取處理好的樣品溶液和2，4_D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到 已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環(huán)境下反應(yīng)l小時(shí)；接著加入納米金標(biāo)記 抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)免疫傳感器表面的頻率變化連續(xù)檢測(cè)直到穩(wěn)態(tài)，獲 得穩(wěn)定數(shù)值。將頻率變化與繪制好的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)照獲得農(nóng)產(chǎn)品樣品溶液中2，4-D的數(shù) 值。 本方法檢測(cè)實(shí)例利用該傳感器對(duì)用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理過的棉花幼葉中2，4-D殘留 量進(jìn)行了檢測(cè)取棉花幼葉鮮樣1. 5000g，于1. 5mL離心管中冰浴研磨，加入600 y L 100% 的甲醇，混勻后浸提過夜，4800g離心10min，取上清液于一新離心管中，剩余殘?jiān)?00 y L100%的甲醇浸提2h， 4800g離心10min，取上清，合并兩次上清液，移入一新5mL離心管中。 用3000 ii L超純水稀釋提取液，過Waters S印-pak C18柱，用200iiL 20X甲醇和250iiL 30%甲醇分別洗脫后，用300iiL 100X甲醇洗脫并收集IAA，用于后續(xù)的檢測(cè)和分析。接 著，將收集好的2 ， 4-D用100 ii L 100 %甲醇溶解后，取20 ii L進(jìn)行HPLC檢測(cè)，同時(shí)，取20 y L 滴加入PBS溶液中，用2，4-D電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)，其檢測(cè)數(shù)據(jù)表明(圖l)，本方法與 HPLC測(cè)定的結(jié)果基本一致。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的壓電免疫傳感方法，其特征在于包括以下步驟(1)2，4-D與BSA的偶聯(lián)；(2)在石英晶振表面制備無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器；(3)制備納米金標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；(4)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(5)樣品檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D的方法，其特征包括 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)，其特征在于稱取3. 315g2，4-D溶解在0. 5mL的無菌二甲基甲酰胺(DMF)中，再稱取N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 4. 028g、二氯乙烷(EDC) 6. 71g同時(shí)加入2，4_D的無菌DMF中，室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí) (130rpm，28。C )。再稱取0. 024g BSA溶于2. 4mLpH 11的硫酸緩沖液中，然后將含有2，4_D 的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，在室溫下慢速攪拌反應(yīng)4小時(shí)，4t:過夜。將 反應(yīng)液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4。C透析二次(4h/次)；再在500mL的0. OIM 的PBS中透析4次。制得2， 4-D與BSA的偶聯(lián)物。將2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備 用。根據(jù)權(quán)利要求1所述的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器由以下步驟制備向洗凈的石 英晶振內(nèi)加入10. OmM半胱胺鹽酸鹽溶液，并于25°C自組裝2. 5小時(shí)，石英晶振表面用純水 清洗三次，即在晶振表面獲得一層致密均勻的半胱胺自組裝單層膜；用2. 5% (V/V)戊二醛 溶液50iiL活化組裝后金電極表面的羧基。經(jīng)PBS和去離子水清洗后，吹干。在電極表面滴 力口 30 ii L濃度為10. 0 ii g. mL—1的BSA_2， 4_D溶液于晶振表面，置于37"恒溫水浴箱中溫育 1小時(shí)，用PBS和去離子水清洗，晾干。再在電極表面上滴加40ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置 于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時(shí)，經(jīng)PBS和去離子水清洗后，吹干，即獲得無試劑型2， 4-D 壓電免疫傳感器。根據(jù)權(quán)利要求1所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作，其特征在于取不同濃度的2， 4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液 和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器， 37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)；接著加入納米金標(biāo)記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，實(shí)驗(yàn) 過程中傳感器的頻率變化由石英晶體分析儀及聯(lián)機(jī)計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)記錄。對(duì)免疫傳感器表面的 頻率變化連續(xù)檢測(cè)直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。改變2， 4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，按上述步驟測(cè) 定一系列不同濃度的2， 4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2， 4-D濃度繪制 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-D的方法，其特征在于取處理好的樣品溶液 和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規(guī)量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器， 37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)；接著加入納米金標(biāo)記抗體(二抗)，37t:環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)免 疫傳感器表面的頻率變化連續(xù)檢測(cè)直到穩(wěn)態(tài)，獲得穩(wěn)定數(shù)值。將頻率變化與繪制好的標(biāo)準(zhǔn) 工作曲線對(duì)照獲得農(nóng)產(chǎn)品樣品溶液中2，4-D的數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)含量的壓電免疫傳感方法，主要包括以下步驟來實(shí)現(xiàn)1)2，4-D與BSA的偶聯(lián)；2)電極修飾與免疫傳感器的制備；3)制備納米金標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；5)樣品檢測(cè)。本發(fā)明有益的效果是在檢測(cè)中，利用納米金標(biāo)記的羊抗鼠IgG將信號(hào)放大，提高檢測(cè)靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)2，4-D的高靈敏定量測(cè)定，該方法在2，4-D濃度為13.3ng·mL-1～666ng·mL-1范圍內(nèi)時(shí)成線性關(guān)系，檢測(cè)下限為13ng·mL-1。同時(shí)，該方法具有方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，成本較低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/414GK101782574SQ20101010103
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者劉清, 王若仲, 肖浪濤, 藺萬煌 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)