專利名稱：：紫外分光光度計測定嘌呤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動物科學(xué)，具體說就是一種紫外分光光度計測定嘌呤的方法。(二)
背景技術(shù)：
：奶牛日糧十二指腸代謝蛋白質(zhì)(Metablizableprotein,MP)包括日糧的過瘤胃蛋白(Rumenundegradableprotein,RUP)、瘤胃微生物蛋白(Microbialcrudeprotein,MCP)和內(nèi)源蛋白(Endogenouscrud印rotein，ECP)三個部分。瘤胃微生物蛋白占代謝蛋白質(zhì)的6080%，因此定量瘤胃微生物蛋白合成量至關(guān)重要。Zi皿和Owen(1986)所提出的嘌呤氮法因其簡便、快捷、試驗成本低和易操作而被一些學(xué)者采用，同時也因嘌呤回收率比較低而受到了一些學(xué)者的置疑(Perezetal，1997;Makkeretal，1999;Gonzalazetal，2003,2004)。這個方法基于高氯酸對瘤胃微生物的水解釋放出嘌呤，再用硝酸銀沉淀嘌呤，最后用分光光度計260nm測定吸光度值。在該方法中用酵母RNA純品做為研究的對象，分別與其它物質(zhì)混合，最后測定嘌呤的回收率在90%以上。但是，用體內(nèi)法(Invivo)測定瘤胃微生物蛋白十二指腸供給量取得的樣品為瘤胃微生物凍干樣品(Lyophilizedrumenmicrobes,LRM)。瘤胃微生物凍干樣品中的微生物是以菌體的形式存在的，同時又包含了其它物質(zhì)，成分較為復(fù)雜。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種紫外分光光度計測定嘌呤的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的所述的紫外分光光度計測定嘌呤的方法，步驟如下步驟一準(zhǔn)確稱取0.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本，或分離所得的食糜微生物部分樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)，注意樣本必須是干燥的，否則會導(dǎo)致核酸水解不完全；步驟二加入2.5ml高氯酸(HC104，1M)，緊蓋瓶口，然后將其放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1小時，此時樣本即炭化，形成黑色硬結(jié)，將硬結(jié)破碎，以利反應(yīng)完全；步驟三再加入17.5ml乙酸緩沖液(NH4H2P04，0.0285M)，充分搖動，緊蓋瓶口，重新置于9095。C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1015分鐘，然后通過Whatman4號濾紙過濾，此時濾液的pH值為2左右；步驟四取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)，分別加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲種pH緩沖液(NH4H2P04，0.2M)，然后置于暗處至少30分鐘，最好是將其放置過夜(5°C)，可提高分析的準(zhǔn)確度；步驟五于4000rpm離心15分鐘，然后小心地棄去上清液，注意不要攪動瓶底的沉淀物；步驟六用pH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次，用與步驟五同樣的方法離心，棄去上清液；步驟七加入10ml0.5N的鹽酸溶液，充分搖動，使其與沉淀物混勻為止；步驟八用具塞密封離心管，放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘；步驟九用紫外分光光度計于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示；步驟十酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:準(zhǔn)確稱取O.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分別置于8個25ml的具塞帶刻度的試管內(nèi)，按上述分析樣本內(nèi)嘌呤含量的操作方法進行處理，最后于260nm處比色；步驟i^一數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS2003ANOVA進行多重比較。本發(fā)明具有方便易學(xué)，操作簡便，重復(fù)性高，數(shù)值準(zhǔn)確的特點，通過紫外分光光度計測定食糜中嘌呤含量，從而確定十二指腸食糜中微生物蛋白的含量，能夠為準(zhǔn)確確定奶牛代謝蛋白質(zhì)含量提供準(zhǔn)確的方法學(xué)基礎(chǔ)。具體實施例方式下面對本發(fā)明作進一步說明。實施例1:本發(fā)明一種紫外分光光度計測定嘌呤的方法，步驟如下步驟一準(zhǔn)確稱取O.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本，或分離所得的食糜微生物部分樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)，注意樣本必須是干燥的，否則會導(dǎo)致核酸水解不完全；步驟二加入2.5ml高氯酸(HC104，1M)，緊蓋瓶口，然后將其放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1小時，此時樣本即炭化，形成黑色硬結(jié)，將硬結(jié)破碎，以利反應(yīng)完全；步驟三再加入17.5ml乙酸緩沖液(NH4H2P04，0.0285M)，充分搖動，緊蓋瓶口，重新置于9095。C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1015分鐘，然后通過Whatman4號濾紙過濾，此時濾液的pH值為2左右；步驟四取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)，分別加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲種pH緩沖液(NH4H2P04，0.2M)，然后置于暗處至少30分鐘，最好是將其放置過夜(5°C)，可提高分析的準(zhǔn)確度；步驟五于4000rpm離心15分鐘，然后小心地棄去上清液，注意不要攪動瓶底的沉淀物；步驟六用pH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次，用與步驟五同樣的方法離心，棄去上清液；步驟七加入10ml0.5N的鹽酸溶液，充分搖動，使其與沉淀物混勻為止；步驟八用具塞密封離心管，放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘；步驟九用紫外分光光度計于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示；步驟十酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:準(zhǔn)確稱取O.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分別置于8個25ml的具塞帶刻度的試管內(nèi)，按上述分析樣本內(nèi)嘌呤含量的操作方法進行處理，最后于260nm處比色；步驟^^一數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS2003AN0VA進行多重比較。實施例2:本發(fā)明紫外分光光度計測定嘌呤的方法為嘌呤回收率紫外分光光度計法，嘌呤回收率紫外分光光度計法與液相色譜法對比研究如下l樣品的制備41.1瘤胃微生物凍干樣的制備晨飼后2小時取瘤胃內(nèi)容物1L。兩層棉布過濾保存在4t:充有C02的1L帶塞的廣口瓶中30分鐘。用吸量管吸取中間部分不含有下層比較重的顆粒和上層比較輕的顆粒勻質(zhì)液體。4°C，20000Xg離心20min。用蒸餾水洗菌球，再離心，最后凍干。1.2中性洗滌纖維的制備采用VanSoesteta1(1991)的方法制備中型洗滌纖維。用熱的蒸餾水徹底清洗中性洗滌劑。在烘箱中烘干羊草。1.3未消化羊草和微生物凍干樣的制備羊草500mg在體外(Invitro)自制發(fā)酵器條件下(Menkeetal.，1979)發(fā)酵24h。發(fā)酵之后將發(fā)酵液在20000Xg下離心30min，棄去上清后凍干。此凍干樣品(Undigestedresidue)中含有未消化的羊草和瘤胃微生物。1)Menke液配制方法如下培養(yǎng)液的配制按照Menke等(1979)的方法進行。在試驗牛晨飼前，分別從每頭牛瘤胃中抽取150ml瘤胃液，混合，用4層紗布過濾，將過濾后的瘤胃液注入持續(xù)通入0)2的1L玻瓶中，玻璃瓶保持在39t:水浴中。然后加入600ml混合培養(yǎng)液?；旌吓囵B(yǎng)液由400ml水、0.lml培養(yǎng)液A(13.2gCaCl22H20，10.OgMnCl24H20，1.0CoCl26H20，8.0gFeCl361120，溶于100ml水中)。200ml培養(yǎng)液B(39gNaHC03和2gNH4HC03溶于1L水中)。200ml培養(yǎng)液C(5.7gNa2HP04，6.2gKH2P04，0.6gMg2S04*7H20溶于1L水中)，lml樹脂天青(0.1%)和40ml還原液(95ml水，4mlNaOH和0.625gNa2S9H20)?；旌吓囵B(yǎng)液在使用前通入C02，置于39t:水浴中。每個注射器中吸入30ml瘤胃液與培養(yǎng)液混合液，將吸入的氣泡排出，然后將注射器頭部用自制堵頭密封。然后將注射器置于39t:水浴中，開動搖床，開始發(fā)酵。2分析方法2.1采用Zinn(1986)年的方法1)準(zhǔn)確稱取0.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本，或分離所得的食糜微生物部分樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)。注意樣本必須是干燥的，否則會導(dǎo)致核酸水解不完全。2)加入2.5ml高氯酸(HC104，12M，70%)，緊蓋瓶口，然后將其放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)l小時。此時樣本即炭化，形成黑色硬結(jié)。將硬結(jié)破碎，以利反應(yīng)完全。3)再加入17.5ml乙酸緩沖液(NH4H2P04，0.0285M)，充分搖動，緊蓋瓶口，重新置于9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1015分鐘，然后通過Whatman4號濾紙過濾，此時濾液的pH值為2左右。4)取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)。分別加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲種pH緩沖液(NH4H2P04，0.2M)。然后置于暗處至少30分鐘。最好是將其放置過夜(5tO，可提高分析的準(zhǔn)確度。5)于4000rpm離心15分鐘，然后小心地棄去上清液。注意不要攪動瓶底的沉淀物。6)用pH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次。用與第5步同樣的方法離心，棄去上清液。7)加入10ml0.5N的鹽酸溶液，充分搖動，使其與沉淀物混勻為止。8)用具塞密封離心管，放在9095°C的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘。9)用紫外分光光度計于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示。酵母RNA(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定準(zhǔn)確稱取0.05,0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分別置于8個25ml的具塞帶刻度的試管內(nèi)，按上述分析樣本內(nèi)嘌呤含量的操作方法進行處理，最后于260nm處比色。2.2HPLC條件下測定腺嘌呤和鳥嘌呤回收率將腺嘌呤和鳥嘌呤(購自Sigma公司)配制為含有腺嘌呤和鳥嘌呤均為1000yM的溶液，取2.5ml加入47.5ml蒸餾水，取15y1進樣分析。取瘤胃微生物凍干樣品100mg，或者與200mg其它物質(zhì)混合，樣品共分為5組，每組設(shè)3各重復(fù)。置于25ml帶有螺絲帽的試管中。處理分別為1)加入2.5ml12M藍04，90"水浴lh，冷卻到室溫;2)加入2.5ml1M藍04，90"水浴lh，冷卻到室溫;3)加入2.5ml2M藍04，90"水浴lh，冷卻到室溫;4)加入2.5ml12MHC104，12rC水浴2h，冷卻到室溫。用8MNaOH調(diào)整溶液pH值為6.5，加入HPLC溶液A到lOml。3000g離心10min，0.45濾膜過濾后取15iil進樣分析。液相色譜條件溶液(A)10mMNH2HP04，用2.86MNH4OH調(diào)整pH值為6。溶液(B)乙氰150ml加入到600ml12.5mMNH2HP04溶液中，用2.86MNH40H調(diào)整pH值為6。所有的溶液都經(jīng)0.45ym濾膜過濾，并在超聲波震蕩器中除氣15min。液譜柱溶液梯度條件為30min內(nèi)將溶液B從OX上升到100%，40min后溶液A在5min后上升到100%，流速為室溫條件下0.8ml/min，進樣量為15iU。3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS2003AN0VA進行多重比較。4嘌呤回收率紫外分光光度計法與液相色譜法對比研究4.1不同處理溫度和時間對瘤胃微生物凍干樣品嘌呤回收率的影響表4-l表明，采用Zi皿(1986)的方法測定瘤胃微生物凍干樣品與纖維素，中性洗滌纖維和淀粉混合后嘌呤回收率只有50%左右。瘤胃微生物凍干樣品與未消化飼料殘渣和微生物混合嘌呤的回收率也同樣只有50%左右。造成這個結(jié)構(gòu)的原因很有可能是由于所制備的樣品在12MHC104，9(TC，lh條件下沒有水解完全。因此，本試驗同時采用了12rC水解2h的方法。結(jié)果表明，在紫外分光光度計260nm處，12rC高溫處理后的吸光度值比9(TC，lh條件下水解后的吸光度值顯著提高，260nm處吸光度值與瘤胃微生物凍干樣品的量呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系(表4-l)。酵母RNA與中性洗滌纖維和淀粉分別混合后嘌呤的回收率比較高，分別達到了92.2%和98.3%。這各研究結(jié)果與Zi皿(1986)報道的結(jié)果很相近。6表4-l不同處理溫度和時間對瘤胃微生物凍干樣品嘌呤回收率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>25mg0.2090.00392.20.2100.00295.9yeastRNA+1001^淀粉25mg0.2170.00298.30.2110.001100.5yeastRNA+100mgNDF1LRMlyophilizedrumenmicrobes瘤胃微生物凍干樣品.2AUR經(jīng)人工瘤胃發(fā)酵器24小時發(fā)酵經(jīng)離心后的剩余物.3y=-0.01633+0.00926XmgLRM(R2=0.99，n=3).4y=-0.01433+0.01526XmgLRM(R2=0.99，n=3)4.2不同高氯酸濃度對瘤胃微生物凍干樣品嘌呤回收率的影響在相同水解溫度9(TC條件下，分別用1M，2M和12MHC104進行水解。結(jié)果表明在12MHC104條件下，260nm處的吸光度值偏高(表3-2)。在相同水解溫度9(TC條件下，分別用1M，2MHC104進行水解后的吸光度值非常接近。表4-2不同高氯酸濃度對瘤胃微生物凍干樣品嘌呤回收率的影響260nm吸光度Absorbanceat260nm1M-HC1042M-HC104MeanSDMeanSD25mgLRM0.170O扁0.1670.00450mgLRM0.333O扁0.3330.00175mgLRM0.4720.0010.466O細25mgLRM+50mg纖0.176O扁0.171O細(103.9)(102.3)50mgLRM+50mg纖0.3260.0040.3310.002(97.8)(99.3)9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1LRMlyophilizedrumenmicrobes,瘤胃微生物凍干樣品4.3液相色譜法測定瘤胃微生物凍干樣品不同處理條件下的回收率表4-3表明，12MHC104,分別采用90°C，lh和121°C，2h水解和90。C條件下分別采用1M，2M水解lh。用液相色譜(HPLC)測定瘤胃微生物凍干樣品與纖維素，中性洗滌纖維和淀粉混合后嘌呤回收率達到了100%左右。然而，12rc條件下，腺嘌呤的絕對回收量偏低。表明高溫條件下，腺嘌呤受到了破壞。液相色譜結(jié)果表明，在比較低的HC104濃度(1M，2M)和9(TC條件下，核酸的水解是完全的，嘌呤回收率可以達到95^以上。權(quán)利要求一種紫外分光光度計測定嘌呤的方法，其特征在于步驟如下步驟一準(zhǔn)確稱取0.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本，或分離所得的食糜微生物部分樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)，注意樣本必須是干燥的，否則會導(dǎo)致核酸水解不完全；步驟二加入2.5ml高氯酸(HClO4，1M)，緊蓋瓶口，然后將其放在90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1小時，此時樣本即炭化，形成黑色硬結(jié)，將硬結(jié)破碎，以利反應(yīng)完全；步驟三再加入17.5ml乙酸緩沖液(NH4H2PO4，0.0285M)，充分搖動，緊蓋瓶口，重新置于90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)10～15分鐘，然后通過Whatman4號濾紙過濾，此時濾液的pH值為2左右；步驟四取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)，分別加入0.5mlAgNO3(0.4M)和9ml甲種pH緩沖液(NH4H2PO4，0.2M)，然后置于暗處至少30分鐘，最好是將其放置過夜(5℃)，可提高分析的準(zhǔn)確度；步驟五于4000rpm離心15分鐘，然后小心地棄去上清液，注意不要攪動瓶底的沉淀物；步驟六用pH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次，用與步驟五同樣的方法離心，棄去上清液；步驟七加入10ml0.5N的鹽酸溶液，充分搖動，使其與沉淀物混勻為止；步驟八用具塞密封離心管，放在90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘；步驟九用紫外分光光度計于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示；步驟十酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定準(zhǔn)確稱取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分別置于8個25ml的具塞帶刻度的試管內(nèi)，按上述分析樣本內(nèi)嘌呤含量的操作方法進行處理，最后于260nm處比色；步驟十一數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS2003ANOVA進行多重比較。全文摘要本發(fā)明提供一種紫外分光光度計測定嘌呤的方法。步驟包括準(zhǔn)確稱取0.5克充分干燥(用凍干機干燥)的食糜樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)；加入2.5ml高氯酸，放在90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1小時；再加入17.5ml乙酸緩沖液，重新置于90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)10～15分鐘，然后過濾；取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)，于4000rpm離心15分鐘；放在90～95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘；用紫外分光光度計于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示；本發(fā)明操作簡便，重復(fù)性高，數(shù)值準(zhǔn)確，通過紫外分光光度計測定食糜中嘌呤含量，確定十二指腸食糜中微生物蛋白的含量，為確定奶牛代謝蛋白質(zhì)含量提供方法學(xué)基礎(chǔ)。文檔編號G01N21/33GK101776589SQ20101010251公開日2010年7月14日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者喬國華,單安山申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)