專利名稱：全量程c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步地，本發(fā)明涉及一種全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒。

背景技術(shù)：
C反應(yīng)蛋白(CRP)是一種能和肺炎鏈球菌的莢膜C多糖結(jié)合，是機體受到微生物入侵或組織損傷等刺激時肝細胞合成的急性時相蛋白，痕量存在于健康人血清中(約580ng/ml)。當(dāng)發(fā)生炎癥疾病或組織發(fā)生潰爛或壞死時，會在血液中急速升高，但隨著組織結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)原其含量也恢復(fù)正常。因此，高濃度CRP的測定在診斷細菌感染、癌癥等疾病的嚴重性、進程、預(yù)后以及治療效果方面具有廣泛臨床意義。
另一方面，CRP作為心血管疾病最強的危險指標(biāo)，其水平可預(yù)測將來心肌梗塞及中風(fēng)的危險性。健康人CRP參考范圍基本為0.58～1.13mg/L。CRP含量＞2.1mg/L的人，比較CRP含量≤1mg/L者，將來發(fā)生心肌梗塞的危險性為后者的2.9倍；發(fā)生缺血性中風(fēng)的危險性為后者的1.9倍；發(fā)生外周動脈血管性疾病的危險性為后者的4.1倍。CRP與血脂(總膽固醇，總膽固醇高密度脂蛋白膽固醇的比值)的聯(lián)合測定，較其他的危險因子更能預(yù)示發(fā)生心、腦血管疾病的危險性，是目前進行冠心病危險評估的最佳模型。最近研究表明，低濃度CRP的測定還可作為新生兒感染，局部感染等疾病以及各種相關(guān)疾病如牙周病的診斷標(biāo)志物。
所謂全量程CRP是基于其測定方法更敏感，測定范圍更寬廣而命名。臨床常規(guī)測定CRP的方法為免疫比濁法，測定范圍一般為3～200mg/L，但存在靈敏度相對較低，無法準(zhǔn)確測定3mg/L以下水平的CRP含量，因此，無法作為心、腦血管疾病的危險指標(biāo)，預(yù)測將來心、腦血管疾病發(fā)生的危險性。臨床高敏CRP測定范圍為0.1～100mg/L，測定范圍又相對較窄，無法準(zhǔn)確測定高濃度水平下的CRP含量，因此，無法用于感染性疾病的診斷或療效觀察。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種既可以測定低CRP含量，又可以測定高CRP含量，且靈敏度高、穩(wěn)定性強、測定準(zhǔn)確的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，該試劑盒包含試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當(dāng)?shù)木彌_液； 所述的試劑R2為用抗人C反應(yīng)蛋白抗體致敏兩種或幾種不同平均粒徑的苯乙烯膠乳(包括平均粒徑較大的苯乙烯膠乳和平均粒徑較小的苯乙烯膠乳)，然后將致敏后的苯乙烯膠乳分別置于適當(dāng)?shù)木彌_液中形成試劑，然后將上述試劑按照不同比例混合起來即為試劑R2，試劑R2中結(jié)合有抗人C反應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳的含量為0.8～3.5mg/ml。
上述的抗人C反應(yīng)蛋白抗體為兔抗人C反應(yīng)蛋白抗體。
在本發(fā)明中，上述所述的緩沖液包括但不限于PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液、氯化銨緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的一種或幾種。
在本發(fā)明所述的全量程C反應(yīng)蛋白測定試劑盒中，還可包含CRP校準(zhǔn)品，所述的CRP校準(zhǔn)品中CRP含量間于0～400mg/L。
本發(fā)明還包含一種使用說明書(見實施例2)。
本發(fā)明上面所述的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，其平均粒徑在0.01～1.5μm之間，粒徑小于0.01μm時，膠乳顆粒聚集產(chǎn)生的光密度變化太小，結(jié)果很難達到試驗敏感度要求，在制備試劑的時候，需要花費過多的離心時間，延長了試劑生產(chǎn)的時間，增加了試劑成本且不利于重復(fù)性。而粒徑大于1.5μm的膠乳顆粒在測量高濃度檢測物時，其聚集產(chǎn)生的光密度變化超過了檢測限，結(jié)果很難獲得對應(yīng)于分析物濃度的光密度變化，而且顆粒太大會加速自聚集，導(dǎo)致分散性降低。膠乳顆粒粒徑隨著試驗方法和設(shè)備的改變而改變。所選擇的顆粒粒徑最好是介于0.05～0.5μm之間。
本發(fā)明不同平均粒徑的苯乙烯膠乳中，平均粒徑較小的苯乙烯膠乳顆粒的粒徑優(yōu)選為在0.04～0.1μm之間選擇，以保證所制備的檢測試劑盒使得抗原抗體反應(yīng)試驗?zāi)軌蛟谝粋€較寬的范圍內(nèi)進行，并且能夠長時間穩(wěn)定，適用于利用光密度測定裝置的血清學(xué)試驗。而粒徑小于0.04μm會延長試劑生產(chǎn)時間，而粒徑大于0.1μm卻會增加背景，降低低濃度測定時的準(zhǔn)確性。因此，用于制備本發(fā)明測定試劑盒的平均較小粒徑膠乳顆粒的最佳粒徑為0.05～0.095μm之間。
本發(fā)明不同平均粒徑的苯乙烯膠乳中，平均粒徑較大的苯乙烯膠乳顆粒的粒徑范圍優(yōu)選為0.15～0.5μm。
本發(fā)明采用膠乳凝集反應(yīng)法檢測C反應(yīng)蛋白，膠乳凝集反應(yīng)法是一種間接凝集試驗，其原理是包被了抗原或抗體的膠乳微粒，與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成所產(chǎn)生的濁度，即可測出標(biāo)本中被檢物的含量。在本發(fā)明中，血清中的C反應(yīng)蛋白與結(jié)合在膠乳顆粒表面的抗人C反應(yīng)蛋白抗體結(jié)合，產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，使膠乳顆粒形成聚集。在570nm波長處測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出C反應(yīng)蛋白的含量。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果 1.普通CRP檢測試劑盒僅限于檢測3mg/L以上水平的CRP含量，不能用于預(yù)測將來心、腦血管疾病發(fā)生的危險性以及局部感染或小病灶的檢測。然而，本發(fā)明的試劑盒不僅可以準(zhǔn)確測定3mg/L以下水平的CRP含量，靈敏度可達10μg/L，能夠用于心、腦血管疾病發(fā)生的危險性預(yù)測以及局部感染或小病灶的檢測，而且還可以準(zhǔn)確測定高濃度水平下的CRP含量(含量高達400mg/L，見表2)，因此能夠用于診斷各種感染性和炎癥等疾病。
2.本發(fā)明是一種抗原抗體反應(yīng)試驗方法，特別之處在于，本發(fā)明采用化學(xué)交聯(lián)法，用抗體致敏2種或幾種不同平均粒徑的膠乳顆粒，然后將致敏后的膠乳顆粒按照不同比例混合起來。小粒徑膠乳顆粒使試劑具有寬范圍，可以檢測高濃度范圍內(nèi)被檢測物的含量，而大粒徑膠乳顆粒使試劑具有比較高的靈敏度，可以檢測到低濃度范圍內(nèi)被檢測物的含量。
3.本發(fā)明的檢測試劑盒是通過使用2種或幾種膠乳顆粒所制備的診斷試劑，使得抗原抗體反應(yīng)試驗從低濃度到高濃度這樣一個比較寬的范圍內(nèi)具有高敏感度和高準(zhǔn)確性，且獲得的試劑具有較長時間的穩(wěn)定性，特別適用于光度檢測裝置如分光光度計，濁度儀，光散射光度儀等。
4.本發(fā)明測定試劑盒為液體雙試劑，具有靈敏、準(zhǔn)確、特異、抗干擾性強等優(yōu)點，本發(fā)明使得CRP的檢測更為經(jīng)濟、方便和快速，適用于自動分析儀測定人血清中CRP的含量。
5.本發(fā)明的試劑盒與現(xiàn)有的R1和R2中均含有膠乳顆粒的試劑盒比較，上述現(xiàn)有公開的試劑盒里面其R1、R2溶液中均含有膠乳顆粒，則R1、R2試劑直接與含有抗原物質(zhì)的血清接觸，則血清里面的某些物質(zhì)會導(dǎo)致膠乳顆粒非特異性聚集，從而導(dǎo)致非特性反應(yīng)的發(fā)生，而本發(fā)明的試劑盒里面，R1里面會加入一些物質(zhì)如去垢劑TritonX-100，進行生化反應(yīng)的時候，R1首先和血清進行孵育，去除掉血清中那些能夠引起膠乳顆粒非特異性聚集的物質(zhì)，然后再加入R2，這樣就可以避免非特異性反應(yīng)的發(fā)生。然而，R1、R2都含有膠乳顆粒的試劑盒，就算是相同的人用相同的操作所制備的試劑盒重復(fù)性都不好，因為膠乳試劑的制備中有很多不可控因素，而且由于2個試劑中都含有膠乳顆粒，調(diào)節(jié)有一定難度。但是，本發(fā)明的試劑盒，就算R2的重復(fù)性不好，但是，本發(fā)明的R1中不含膠乳溶液，可以通過調(diào)節(jié)R1，很容易地使得試劑盒最終的重復(fù)性達到一致。



圖1顯示了7種不同膠乳配比的CRP標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中X軸表示CRP的濃度(含量)；Y軸表示吸光度。

具體實施例方式 實施例1全量程CRP反應(yīng)試劑盒的制備 本發(fā)明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下 1.兔抗人CRP抗體(20.5mg/mL)采用間接ELISA法測定效價為1∶500000以上。
2.膠乳本發(fā)明采用的兩種苯乙烯膠乳為帶羧基基團的苯乙烯膠乳，苯乙烯膠乳顆粒平均粒徑分別為60nm和240nm。其中60nm的購自Bangs公司，240nm為自制的，制備方法為將4.2595g苯乙烯(St)、0.6000g甲基丙烯酸(MAA)、水加入到三口燒瓶后攪拌10～30min；在攪拌結(jié)束后，向混合體系中通入30min的N2，然后加入50ml含有過硫酸鉀和氯化鈉的水溶液(其中含有過硫酸鉀0.1065g，氯化鈉0.0032g)，再繼續(xù)通入20min的N2；然后升溫至60～80℃，反應(yīng)12h以上；反應(yīng)完成后將反應(yīng)體系冷卻到室溫后，再用去離子水多次清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似，經(jīng)上述純化后得到固含量為10％的苯乙烯膠乳溶液，苯乙烯膠乳顆粒平均粒徑為240nm。
本實施例的主要試劑的配制如下 試劑R1含3％PEG(聚乙二醇)，2％NaCl，0.05％TritonX-100的氯化銨緩沖液，該試劑為無色透明溶液。
試劑R2用兔抗人CRP抗體分別致敏平均粒徑為60nm和240nm兩種膠乳顆粒，致敏后置于適當(dāng)?shù)木彌_液中形成試劑，然后再按一定比例將上述試劑混合起來即為試劑R2，具體過程如下在1ml苯乙烯膠乳(以膠乳顆粒平均粒徑為60nm，膠乳固含量為10％的苯乙烯膠乳為例)中，加入碳化二亞胺(EDAC)至終濃度為11.5mg/ml，然后再加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺或稱N-羥基丁二酰亞胺)至終濃度為11.5mg/ml(上述兩個11.5mg/ml分別為EDAC和NHS最終在膠乳溶液中的濃度)；在25℃混勻20min；12000rpm，4℃離心25min；棄上清液，加入10ml 0.05M(M表示mol/L，以下同)pH5.5的2-嗎啉乙磺酸(MES)溶液，超聲重懸；然后再用0.05M pH5.5的2-嗎啉乙磺酸溶液(或稱緩沖液)稀釋兔抗人胱抑素C抗體，得到10ml 5mg/ml的抗體稀釋液；將10ml上述的抗體稀釋液快速加入到10ml超聲重懸后的膠乳中，混勻；4℃混勻過夜；然后再加入50μl乙醇胺，25℃混勻20min；12000rpm，4℃離心25min；棄上清液，再加入10ml0.15M、pH7.4的PBS緩沖液(又稱磷酸鹽緩沖溶液)(PBS緩沖液含有1％牛血清白蛋白BSA)，超聲重懸，25℃混勻30min；12000rpm，4℃離心25min，棄上清液，加入0.15M、pH7.4的PBS緩沖液(含有0.1％BSA，0.1％NaN3)，使得其中結(jié)合有兔抗人C反應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳的含量為1.8mg/ml，超聲重懸； 平均粒徑為240nm的苯乙烯膠乳以和上述平均粒徑為60nm的苯乙烯膠乳相同方法處理； 各取少量經(jīng)上述過程處理的膠乳，分別以小顆粒(平均粒徑為60nm)膠乳比大顆粒(平均粒徑為240nm)膠乳的體積比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1的比例分別混合起來，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后選擇上述體積比2∶1的混合試劑(從標(biāo)準(zhǔn)曲線即圖1可以看出，當(dāng)小粒徑與大粒徑體積比為2∶1時，低濃度和高濃度均可以測定)，該試劑為乳白色溶液即作為試劑R2。
C反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品為在含2％牛血清白蛋白的PBS緩沖液中加入不同含量的CRP蛋白，除菌過濾。這些校準(zhǔn)品均為無色透明液體。
實施例2C反應(yīng)蛋白的測定 檢測工具日立7060型自動分析儀。
分析方法2點終點法；主波長570nm，副波長700nm樣品量4.0μl(微升)；R1140μl；R2140μl；校準(zhǔn)方式樣條函數(shù)Spline；反應(yīng)方向上升；測定溫度37℃；樣品與R1混勻后，于第10秒讀取吸光度A1；于3-5分鐘時加入R2，于5分鐘時讀取吸光度A2。反應(yīng)吸光度的計算為A2與A1的校準(zhǔn)差值。
計算方法多點定標(biāo)，以樣條函數(shù)作為計算模式，根據(jù)吸光度與參考血清的值作劑量/響應(yīng)曲線，樣品含量可根據(jù)其吸光度值在劑量/響應(yīng)曲線上算出。
參考范圍血清C反應(yīng)蛋白＜8.2mg/L，健康人無感染時C反應(yīng)蛋白＞1mg/L，能預(yù)示將來發(fā)生心、腦血管疾病的危險性；血清＞8.2mg/L，用于感染性疾病的診斷或療效觀察。
實施例3全量程CRP檢測試劑盒各項性能指標(biāo)測試 1.靈敏度試驗 測定6種不同CRP含量的樣品，每個樣品測10次，通過計算均值和SD值，從表1可見，本發(fā)明檢測試劑盒的靈敏度為0.3mg/L。
表1 2.高值線性測定 測定10種不同CRP含量的樣品，每個樣品測2次，從表2可見，本發(fā)明檢測試劑盒的最高檢測范圍可達到400mg/L。
表2 3.精密度試驗 使用2種不同CRP含量的人血清樣品，測定本發(fā)明檢測試劑盒的批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測試劑盒的批內(nèi)精密度為4.55％和3.23％(見表3)，而批間精密度則為7.42％和5.79％(見表4)。
表3 表4 4.干擾試驗 在同一份人血清樣品中分別加入不同含量的干擾物質(zhì)后進行測定。加入干擾物質(zhì)后的測定值除以加入干擾物質(zhì)前的測定值即為影響率，試驗結(jié)果表明游離膽紅素，結(jié)合膽紅素，血紅蛋白以及乳糜微粒的濃度分別在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下時，它們對測定結(jié)果的干擾均在2％以下(見表5)。
表5

5.穩(wěn)定性試驗 在2～8℃貯存條件下，分別在0月、4月、8月、12月和14月對同一血清樣本進行測定，每個樣本測5次，取均值(結(jié)果見表6)。結(jié)果表明，4月、8月、12月和14月與0月相比，測得值差異很小，說明本發(fā)明的檢測試劑盒在2～8℃貯存條件下可穩(wěn)定一年。
表6 試劑開封后，在35天內(nèi)，35次測定同一份血清樣本的吸光度均值、最小值、最大值、標(biāo)準(zhǔn)差和吸光度日間變異(見表7)，可見本發(fā)明中使用的試劑即使在開封后，可穩(wěn)定一個月以上。
表7
權(quán)利要求
1.一種全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包含試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當(dāng)?shù)木彌_液；
所述的試劑R2為用抗人C反應(yīng)蛋白抗體致敏兩種或幾種不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，將致敏后的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳分別置于適當(dāng)?shù)木彌_液中形成試劑，然后將上述的試劑分別按照不同比例混合起來即為試劑R2，試劑R2中結(jié)合有抗人C反應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳的含量為0.8～3.5mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的適當(dāng)?shù)木彌_液為PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，該膠乳顆粒的平均粒徑范圍為0.01～1.5μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，該膠乳顆粒的平均粒徑范圍為0.05～0.5μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，包括粒徑范圍為0.15～0.5μm的平均粒徑較大的苯乙烯膠乳，還包括粒徑范圍為0.04～0.1μm的平均粒徑較小的苯乙烯膠乳。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的平均粒徑較小的苯乙烯膠乳其粒徑范圍為0.05～0.095μm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，其特征在于上述的全量程C反應(yīng)蛋白測定試劑盒中，還包含C反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品，所述的C反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中C反應(yīng)蛋白含量間于0～400mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開一種全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，該試劑盒包含試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當(dāng)?shù)木彌_液；所述的試劑R2為用抗人C反應(yīng)蛋白抗體致敏兩種或幾種不同平均粒徑的苯乙烯膠乳，將致敏后的不同平均粒徑的苯乙烯膠乳分別置于適當(dāng)?shù)木彌_液中形成試劑，然后將上述的試劑分別按照不同比例混合起來即為試劑R2，該試劑R2中結(jié)合有抗人C反應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳的含量為0.8～3.5mg/ml。本發(fā)明的全量程C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒既可以測定低CRP含量，又可以測定高CRP含量，且靈敏度高、穩(wěn)定性強、測定準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/559GK101769932SQ201010103429
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者鄒炳德, 夏佳音 申請人:寧波美康生物科技有限公司