專利名稱：梅花鹿γ-干擾素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法及試劑盒與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域和動(dòng)物傳染病技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及梅花鹿γ-干擾素檢測(cè)方法及試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
鹿結(jié)核病(Cervus Tuberculosis，CTB)主要是由牛型分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種慢性人獸共患傳染病。該病其易傳染，一年四季均可發(fā)生，呈世界性流行，曾經(jīng)是引起人畜死亡數(shù)最多的疾病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為B類動(dòng)物傳染病，中國將其列為二類動(dòng)物疫病。主要引起人和動(dòng)物結(jié)核病的分枝桿菌有3種人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、禽型結(jié)核分枝桿菌。國內(nèi)外結(jié)核病原學(xué)調(diào)查均發(fā)現(xiàn)，牛結(jié)核、人結(jié)核和鹿結(jié)核是相互傳染的。因此，控制牛結(jié)核病和人結(jié)核，必須兼顧鹿等野生動(dòng)物結(jié)核病的防制。由于目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有效藥物與疫苗用于鹿結(jié)核病的防治，一些國家普遍采用的是“檢疫-捕殺”政策，即檢疫出的陽性鹿一律捕殺來實(shí)現(xiàn)控制鹿結(jié)核病。因此，準(zhǔn)確而及時(shí)的診斷方法對(duì)于該病的防治顯得尤為重要。
OIE唯一推薦的方法是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(Tuberculin skin test，TST)。但由于結(jié)核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的非特異性抗原組份，檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)假陽性；結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)對(duì)感染后期的開放性結(jié)核及全身性結(jié)核不敏感。此外，TST程序繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)，需專業(yè)人員操作，使“檢疫-撲殺”政策的實(shí)施效果大打折扣，且其只能進(jìn)行活體試驗(yàn)，而不能對(duì)保存的樣品進(jìn)行回顧性分析，更不適用于野生動(dòng)物和邊遠(yuǎn)山區(qū)的牛型結(jié)核病普查。因此，人們致力于開發(fā)一種更加簡(jiǎn)便、快速、高特異性、高敏感性的新型診斷方法。
γ-干擾素(簡(jiǎn)稱IFN-γ)是CD4+Th1細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞等在抗原(細(xì)菌、病毒等)及有絲分裂原(ConA和PHA等)刺激下產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子。IFN-γ具有抗感染、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細(xì)胞、提高M(jìn)HC I類和II類分子的表達(dá)、促進(jìn)抗原提呈等，在機(jī)體抗感染與免疫中發(fā)揮重要作用?；贗FN-γ與感染之間的密切聯(lián)系，醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)上均利用病原體特異性抗原體外刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ進(jìn)行傳染病診斷。該方法靈敏度與特異性均高，顯示出很大的應(yīng)用前景。IFN-γ體外釋放檢測(cè)法是用分枝桿菌特異性或非特異性抗原外刺激受檢動(dòng)物全血或外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，使少量T細(xì)胞充分接受刺激，從而分泌大量IFN-γ，然后用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IFN-γ濃度的細(xì)胞方法，IFN-γ體外釋放檢測(cè)法對(duì)結(jié)核病潛伏感染的早期診斷具有重要意義。
IFN-γ試驗(yàn)較高的特異性將有助于低流行國家對(duì)結(jié)核隱性感染(LTBI)進(jìn)行更加精確的診斷并對(duì)檢出個(gè)體及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性的抗結(jié)核治療，減少耐藥性結(jié)核分枝桿菌的傳播及控制抗生素的濫用?？乖禺愋訧FN-γ試驗(yàn)可以用于檢測(cè)抗結(jié)核治療的效果。根據(jù)抗原特異性IFN-γ試驗(yàn)的試驗(yàn)原理，在體內(nèi)環(huán)境下，最近接觸過TB特異性抗原的效應(yīng)淋巴細(xì)胞再次遇到相同的抗原時(shí)，只需數(shù)小時(shí)即可產(chǎn)生IFN-γ。與效應(yīng)淋巴細(xì)胞不同的是，記憶T淋巴細(xì)胞往往需要幾天時(shí)間才能生成IFN-γ。因此，如果在檢測(cè)中全血的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)或者更短的時(shí)間，檢測(cè)的主要是效應(yīng)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，而不是由記憶T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生。而如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，則檢測(cè)的將主要是記憶T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，這可能使得經(jīng)過治療或者感染已被清除的患者產(chǎn)生陽性結(jié)果。因此，抗原特異性IFN-γ試驗(yàn)可以用來作為TB機(jī)體病情發(fā)展及治療效果的進(jìn)行評(píng)價(jià)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種梅花鹿γ-干擾素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法、試劑盒及在梅花鹿結(jié)核病體外診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明的要點(diǎn)是獲得具有很好特異性、敏感性和穩(wěn)定性的單克隆抗體細(xì)胞株，通過對(duì)梅花鹿γ-干擾素(IFN-γ)單/多克隆抗體最佳工作濃度的確定、最佳封閉濃度和時(shí)間的確定、最佳抗體結(jié)合(孵育)時(shí)間的確定、最佳待檢血漿刺激濃度和時(shí)間的確定和最佳待檢細(xì)胞因子(IFN-γ)濃度的確定，最終建立梅花鹿IFN-γ結(jié)核病的檢測(cè)方法和專用試劑盒與應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明將構(gòu)建的重組融合載體質(zhì)粒pET-32a-IFN-γ轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)獲得一種具有抗病毒、抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)作用和強(qiáng)耐熱性的可溶性IFN-γ蛋白。利用純化的IFN-γ蛋白免疫小鼠，用真核細(xì)胞系穩(wěn)定分泌表達(dá)上清篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得一株高效價(jià)的單克隆抗體。用所獲得的單克隆抗體及兔抗IFN-γ多克隆抗體建立了梅花鹿IFN-γ的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法及其專用試劑盒，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到24.9pg/ml。
申請(qǐng)人:將獲得的一株能夠穩(wěn)定分泌梅花鹿干擾素-γ單克隆抗體的細(xì)胞株CerIFN-γ4C于2009年12月1日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOC200966。
申請(qǐng)人:建立了一種梅花鹿γ-干擾素的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，其步驟包括 (1)用包被液將保藏號(hào)為CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體稀釋到工作濃度(50ng/孔)加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μl，37℃作用1h后置4℃冰箱過夜； (2)棄去孔內(nèi)液體，用沖洗液洗酶標(biāo)板3次，每次3min，用吸水紙拍干； (3)在各酶標(biāo)板孔的孔中加入封閉液100μl，37℃作用1h，按步驟(2)的方法洗滌； (4)將誘導(dǎo)的待測(cè)的梅花鹿全血培養(yǎng)上清，加入包被有梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體的ELISA板孔中，每孔100μl；同時(shí)將收集的陰性和陽性對(duì)照培養(yǎng)上清分加加入孔中，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌； (5)用沖洗液將兔抗梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體按工作濃度(50ng/孔)稀釋，每孔加入100μl，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌； (6)用沖洗液將辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG按工作濃度稀釋(按照體積比1∶5000)，每孔加入100μl，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌； (7)在酶標(biāo)板孔的每孔中加入顯色液100μl，室溫避光顯色10min； (8)在酶標(biāo)板孔的每孔中加入50μl終止液使其終止反應(yīng)； (9)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于630nm波長(zhǎng)處測(cè)定步驟(8)光吸收值； 其中 步驟(1)所述的包被液配制如下碳酸鈉1.59g；碳酸氫鈉2.93g；用蒸餾水定容至1000ml； 步驟(2)所述的配制如下氯化鈉8.0g；氯化鉀0.2g；磷酸氫二鈉0.2g；磷酸二氫鉀2.9g；吐溫-200.5ml；用蒸餾水定容至1000ml，pH7.4； 步驟(3)所述的封閉液配制如下沖洗液100ml；脫脂牛奶10g； 步驟(7)所述的顯色液配制如下磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；用蒸餾水定容至100ml，得到A液；磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；用蒸餾水定容至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液100ml，再添加鄰苯二胺40mg；30％濃度的過氧化氫0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到顯色液。
步驟(8)所述的終止液配制如下2mol/L的硫酸22.2ml，蒸餾水177.8ml。
申請(qǐng)人:還組裝了與上述檢測(cè)方法相適應(yīng)的梅花鹿γ-干擾素的雙抗體夾心的ELISA檢測(cè)試劑盒，它包括保藏編號(hào)為CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體，梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體，保藏號(hào)為CCTCC NOM208244(專利申請(qǐng)?zhí)枮?009100609131，專利公開號(hào)為CN101538578A)牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白R(shí)CE，辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔IgG，顯色液和終止液。
其中所述的顯色液和終止液的組分及配制方法如下 顯色液磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；用蒸餾水定容至100ml，得到A液；磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；用蒸餾水定容至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液100ml，添加鄰苯二胺40mg；30％濃度的過氧化氫0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到顯色液。
終止液2mol/L硫酸22.2ml；蒸餾水177.8ml。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如《具體實(shí)施方式
》所述。



序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明的梅花鹿IFN-γ基因片段的DNA序列。
序列表SEQ ID NO3-4是本發(fā)明中擴(kuò)增梅花鹿IFN-γ基因片段的引物序列。
圖1是本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。
圖2是本發(fā)明所用原核表達(dá)載體pET32a(+)圖譜。
圖3是本發(fā)明PCR擴(kuò)增梅花鹿IFN-γ電泳圖譜。圖中M、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1、陰性對(duì)照；2、RT-PCR產(chǎn)物 圖4是本發(fā)明制備的SDS-PAGE檢測(cè)梅鹿IFN-γ蛋白表達(dá)形式鑒定圖譜。圖中M、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、CerIFN-γ上清蛋白；2、純化CerIFN-γ蛋白。
圖5是本發(fā)明制備的梅花鹿IFN-γ蛋白Western-Blot圖。圖中1、重組pET32α-CerIFN-γ；2、陰性質(zhì)對(duì)照；M、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
圖6是本發(fā)明通過間接ELISA檢測(cè)檢測(cè)梅花鹿IFN-γ單克隆抗體(McAb)效價(jià)滴度圖。
圖7是本發(fā)明通過間接ELISA檢測(cè)檢測(cè)梅花鹿IFN-γ多克隆抗體(PcAb)效價(jià)滴度圖。
圖8是本發(fā)明通過間接ELISA檢測(cè)檢測(cè)梅花鹿IFN-γ單克隆抗體(McAb)靈敏度滴度圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1目的基因梅花鹿IFN-γ的克隆 1、質(zhì)粒與宿主菌來源 本實(shí)施例所用的pET-32a(+)質(zhì)粒載體購自Novagen公司。大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自湖北省武漢生命技術(shù)有限公司。
2、引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)根據(jù)GenBank上發(fā)布的梅花鹿IFN-γcDNA序列(GenBank accession NoX63079)設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
原核表達(dá)引物序列如下上游引物5’ATATGGATCCGATCTTATGGCCAGGGCCCA3’(下畫線為BamHI位點(diǎn))；下游引物5’TAATAAGCTTTTACGTTGATGCTCTCCGGCCTCG3’(下畫線為HindIII位點(diǎn))。
3、目的基因的PCR擴(kuò)增 無菌采取梅花鹿頸靜脈血，肝素抗凝，取10mL梅花鹿的全血，加刀豆球蛋白A(英文縮寫Con A，購自Sigma公司)60μg/mL于37℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)24h。提取Con A刺激的外周血白細(xì)胞總RNA作為RT-PCR的模板，利用一步法擴(kuò)增得到梅花鹿IFN-γ成熟肽序列，見序列表SEQ ID NO1所示，序列全長(zhǎng)為438bp。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×Taq Buffer 5.0μL，25mmol/L MgCl21.0μl，2mmol/L dNTPs 1.5μL，20μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0μL，模板3μL，無菌雙蒸水加至50μL。擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性5min；然后95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，參照該試劑盒說明書)純化PCR產(chǎn)物。
4、PCR產(chǎn)物回收 采用上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照該UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說明書的提供步驟進(jìn)行，具體操作如下 用0.8％的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長(zhǎng)波紫外燈下，用在酒精燈火焰上燒過的手術(shù)刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1.5mL滅菌離心管中。
按每100mg瓊脂糖膠加入400μL Binding Buffer，置50-60℃水浴中10min，使瓊脂糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時(shí)，每2min混勻一次)。
將UNIQ-10柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱中，室溫靜置2min，室溫8000r/min離心1min。
取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500μL WashSolution，室溫8000r/min離心1min。
再加入500μL Wash Solution，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，室溫12000r/min離心15sec。
將UNIQ-10柱放入一個(gè)滅菌的1.5mL離心管中，根據(jù)PCR產(chǎn)物量的相對(duì)多少，在柱子底部的膜中央加10-20μL Elution Buffer或ddH2O，室溫或37℃放置2min室溫12000r/min離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2、重組質(zhì)粒pET-32a-IFN-γ的構(gòu)建 1、載體質(zhì)粒pET-32a和IFN-γPCR回收產(chǎn)物的連接 通過限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III(購自寶生物工程(大連)有限公司)分別同時(shí)雙酶切原核表達(dá)載體pET32a和回收得到的IFN-γPCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。將純化的酶切產(chǎn)物用T4DNA Ligase(購自Fermentas公司)進(jìn)行粘末端連接，16℃水浴連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
2、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取感受態(tài)細(xì)胞DH5α100μL加入到滅菌1.5mL EP管中，將連接后的中間質(zhì)粒pET-32a-IFN-γ各10μL加入并混勻。置冰上30min后，42℃熱激90sec，冰浴3-5min。加入400μL LB液體培養(yǎng)基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。在?00毫升LB液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉即為固體LB培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?，于37℃恒溫?fù)u床200r/min振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于4℃5000r/min離心10min，棄去400μL上清，用剩余的100μL重懸沉淀涂布于含有25μg/mL卡那霉素(購自Invitrogen公司)的LB瓊脂平板。37℃增殖1h，再將平板翻過來，倒置37℃培養(yǎng)14-16h至菌落出現(xiàn)。
3、質(zhì)粒的提取 使用堿裂解法(參照薩姆布魯克.J，弗里奇.E.F，曼尼阿蒂斯.T主編，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，黃培唐等譯，第三版，科學(xué)出版社，北京，2002版的方法)進(jìn)行，具體操作如下 用滅菌牙簽在LB平板上隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)單菌落，分別接種于3mL 25μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。
將菌液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管內(nèi)，于4℃8000r/min離心3min，棄上清，再將剩余的1.5mL菌液重復(fù)離心，倒立離心管于吸水紙上，使液體流盡。
加入100μL冰預(yù)冷的溶液I(0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA)，渦旋使菌體充分懸浮，再加入200μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，反復(fù)顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，最后加入150μL冰預(yù)冷的溶液III(5mol/L乙酸鈉60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL，pH5.0)，溫和顛倒離心管數(shù)次，冰浴10min。
于4℃以12000r/min離心10min，吸取上清至另一支1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混和均勻，室溫靜置5min。
室溫12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。
沉淀用200μL含20μL Rnase(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解，56℃水浴30min或37℃水浴1h以除去RNA。
加7.5mol/L NH4Ac 100μL，室溫靜置5min，再于室溫12000r/min離心5min。
吸取上清到另一1.5mL的EP管中，加入2倍體積的冷無水乙醇，冰浴置10min。
于4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μL ddH2O或TE(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-Cl，pH8.0)，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4、重組質(zhì)粒pET-32a-IFN-γ的酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別進(jìn)行單酶切和雙酶切中間質(zhì)粒pET-32a-IFN-γ，酶切后出現(xiàn)預(yù)期大小的外源片段和載體片斷，將包含該中間質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌液送上海生工生物技術(shù)工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genbank(序列登錄號(hào)X63079)中公布的梅花鹿IFN-γ的序列比對(duì)，結(jié)果符合率100％，說明該發(fā)明中構(gòu)建的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于大腸桿菌中表達(dá)。
實(shí)施例3、目的融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 1、目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將包含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株DH5α接種于含有25μg/mL卡那霉素的3mL LB液體培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。從培養(yǎng)好的菌液中取100μL接種于10mL含有25μg/mL卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)約3h，至OD600達(dá)到0.6-0.8，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，購自Invitrogen公司)至終濃度為0.8mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。
2、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析 2.1SDS-PAGE電泳樣品的制備 將誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌8000r/min離心15min。沉淀用1/10體積的50mM Tris-HCl(pH8.0)重懸，冰浴30min。冰浴條件下進(jìn)行超聲碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，離心30min。分別取少量裂解后的上清和沉淀，加入2×蛋白電泳上樣緩沖液(100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT，購自Amresco公司)，4％SDS(電泳級(jí))，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油)125μL，振蕩混勻，100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
2.2SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制及電泳 15％分離膠配制純化水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5mol/L Tris-Base溶液(pH8.8)1.3mL，10％SDS 0.05mL，10％過硫酸銨0.05mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加異丁醇。
5％濃縮膠配制純化水2.1mL，30％丙烯酰胺溶液0.5mL，1.0mol/L Tris-Base溶液(pH6.8)0.38mL，10％SDS 0.03mL，10％過硫酸銨0.03mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面，灌滿后插入加樣梳。待積層膠凝固后，取下梳子；將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品；電泳電壓80V，待溴酚藍(lán)至分離膠界面時(shí)，電壓改為120V，至溴酚藍(lán)泳出膠底面，終止電泳。
2.3聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色 卸下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R250染色液(45％甲醇，45％純化水，10％冰乙酸，0.25％的考馬斯亮藍(lán)R250)染色4h以上，再用脫色液(45％甲醇，45％純化水，10％冰乙酸)進(jìn)行脫色至背景色完全脫去，觀察結(jié)果。確定目的蛋白是可溶性表達(dá)還是以包涵體的形式表達(dá)。
2.4重組蛋白的純化 將收集的重組蛋白表達(dá)菌BL/pET-32a-IFN-γ用購自Novagen公司的試劑盒自帶的緩沖液重懸，超聲波破碎，4℃12000g離心15min取上清上樣。使用Ni-NTA His·Band層析柱(購自Novagen公司)純化目的蛋白。分別使用結(jié)合Binding buffer和洗滌緩沖液Washing buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，15mMImidazole，0.5M NaCl)洗柱直至OD值達(dá)到基線附近，換用洗脫緩沖液Elute buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，40mM Imidazole，0.5M NaCl)洗脫結(jié)合的重組蛋白，收集波峰部分蛋白作為純化的重組蛋白用于進(jìn)一步分析。
3、目的蛋白表達(dá)最佳條件的確定 根據(jù)上述步驟2(即表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析)的方法，檢測(cè)表明本發(fā)明制備的重組融合蛋白IFN-γ為可溶性表達(dá)。重新復(fù)蘇保存的轉(zhuǎn)化有pET-32a-IFN-γ的大腸桿菌BL21(DE3)菌液，37℃搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，按照IPTG濃度分別為0.4mM、0.8mM和1.0mM，和分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后3h、4h、5h取樣，SDS-PAGE分析。
確定IFN-γ蛋白的最佳表達(dá)條件為IPTG 0.8mmol/L，37℃誘導(dǎo)3h表達(dá)量最高。
4、重組蛋白純化最佳條件的確定 為摸索Wash Buffer中最佳的咪唑濃度，將Wash Buffer中咪唑濃度按終濃度30mM、40mM、50mM三個(gè)梯度稀釋，將細(xì)菌破碎后離心得到的上清上柱后、加Binding Buffer后、依次加三個(gè)濃度Wash Buffer后分別接收樣品，SDS-PAGE分析。
確定IFN-γ蛋白純化的最佳Wash Buffer咪唑濃度為30mM。
實(shí)施例4重組蛋白IFN-γ單/多克隆抗體的制備 1、用重組蛋白IFN-γ免疫小鼠和大白兔 本實(shí)施例所用的Balb/C小鼠和日本長(zhǎng)耳大白兔均購自湖北省預(yù)防疾病控制中心，4-6周齡的雌性Balb/C小鼠6只，按200μg/只皮下多點(diǎn)接種純化的重組IFN-γ，首免等量福氏完全佐劑重組抗原，2周后加強(qiáng)免疫等量福氏不完全佐劑抗原，2周后再次皮下注射無佐劑的等量抗原。至少間隔1個(gè)月后，在融合前的第3天，選擇抗體滴度高的Balb/C小鼠，按500μg/只抗原劑量每天進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)免疫3天后，對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，間接ELISA檢測(cè)血清抗CerIFN-γ抗體的效價(jià)。
同時(shí)，將純化的CerIFN-γ按以上程序免疫三只2.0kg以上體重的雌性日本長(zhǎng)耳大白兔，抗原免疫劑量為700μg/只，三免后通過間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，抗體滴度達(dá)到要求后放血，利用飽和硫酸銨法純化高免血清。
2、梅花鹿IFN-γ細(xì)胞融合 2.1SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的活化 本實(shí)施例所用的骨髓瘤(SP2/0)細(xì)胞購自中國獸藥監(jiān)察所，將復(fù)蘇的SP2/0細(xì)胞，收集起來用0.5mLRPMI-1640基礎(chǔ)液懸浮(0.5～1×106)注射Balb/C小鼠背部皮下。待9～10d實(shí)體瘤生長(zhǎng)后，視大小選擇取瘤細(xì)胞的時(shí)間。
2.2細(xì)胞融合 分別取免疫小鼠脾臟細(xì)胞和活化的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，在融合劑的作用下將二者融合，同時(shí)制備飼養(yǎng)細(xì)胞，以輔助雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，方法簡(jiǎn)述如下(史良如，1984) 2.2.1SP2/0瘤細(xì)胞的制備 若是細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，直接用RPMI-1640基礎(chǔ)液洗下，離心收集即可。從小鼠瘤子中制備的方法如下小鼠斷頸處死，75％酒精浸泡5mim，超凈臺(tái)無菌狀態(tài)取瘤，先將腫瘤塊剪下，放于一無菌；平皿中，先將共剪成幾小塊，再移至勻漿器中，加5mL RPMI-1640基礎(chǔ)液充分研磨后，補(bǔ)加10mL RPMI-1640液，靜置2min，待較大的組織團(tuán)塊沉于管底后，吸取上層的細(xì)胞懸液于另一離心管備用，再補(bǔ)加10mL RPMI-1640液，重復(fù)一次，將取出的細(xì)胞懸液體積控制在30mL。于另一50mL離心管中加入15mL淋巴細(xì)胞分離液，將細(xì)胞懸液輕輕地加在分離液之上(比例為1∶2到1∶1)，1800～2000r/m 20min，用吸管吸取位于界面致密的白色細(xì)胞層，用RPMI-1640液洗2遍，計(jì)數(shù)后備用。
2.2.2免疫脾細(xì)胞的制備 (1)取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。
(2)將消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用鑷子夾住下腹部皮膚，剪一小口，撕開皮露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，剪開腹膜，暴露出脾臟，再換一套器械，用鑷子夾住脾臟，用剪刀去掉粘連細(xì)胞的脂肪組織，剪破脾臟外膜，放入滅菌的勻漿器中。
(3)加3mL RPMI-RPMI-1640基礎(chǔ)液于勻漿器中，研磨(不要太劇烈，以免損傷脾細(xì)胞，可選用比較松的勻漿器)，擠壓出脾細(xì)胞，取出勻漿棒，補(bǔ)加7mL RPMI-1640基礎(chǔ)液，靜置2min，吸取上層細(xì)胞懸液于另一無菌的50mL離心管，再補(bǔ)加10mL RPMI-1640液于勻漿器中，同上重復(fù)2次。
(4)1000r/m離心10min去上清，細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)。
2.2.3飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 (1)取一只未免疫的Balb/C鼠，眼眶放血，收集血清為陰性血清。
(2)四肢固定后，先撕開皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管3mL RPMI-1640液注入小鼠腹腔，吸打幾次，再將液體吸出放于一50mL離心管，再重復(fù)一次，此為腹腔巨噬細(xì)胞。
(3)同上操作制備脾細(xì)胞懸液，并放入腹腔巨噬細(xì)胞管中。
(4)1000r/m離心10min去上清，細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)。
2.2.4細(xì)胞融合 (1)先將飼養(yǎng)細(xì)胞離心1000rpm，5min去掉上清，于37℃放置備用。
(2)將1-2×107個(gè)SP2/0與108個(gè)免疫細(xì)胞(1∶10-1∶15)于50mL離心管中混勻，1500r/m，離心10min。
(3)倒空上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
(4)將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37℃水浴中。然后在1min內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37℃的50％PEG 0.8mL，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌1min。
(5)然后慢慢加入37℃預(yù)溫的RPMI-1640基礎(chǔ)液10mL。具體方法為第一分鐘逐滴滴入1mL。第二分鐘加1mL，第3-4分鐘加3mL，第5分鐘加其余的5mL，每次加時(shí)需緩慢加入，并不斷輕輕地?cái)嚢?。最后加?0mL RPMI-1640液，也需慢慢加入。
(6)8000r/m離心5min，去上清于37℃放置5-8min。
(7)用HAT培養(yǎng)基懸浮，同時(shí)也用HAT培養(yǎng)基懸浮飼養(yǎng)脾細(xì)胞與融合后的細(xì)胞混合，根據(jù)需要補(bǔ)加適量HAT培養(yǎng)基，分種于96孔培養(yǎng)板，約250μL/孔。一次融合可接種4-8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細(xì)胞數(shù)計(jì)算，每孔接種量約含104左右個(gè)SP2/0細(xì)胞。
(8)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(9)融合后第二天開始觀察，有無污染，于第4天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8-10天吸去100μL培養(yǎng)基換HT培養(yǎng)基100μL。待融合細(xì)胞集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基略變黃時(shí)，進(jìn)行抗體檢測(cè)。
2.2.5間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞 于測(cè)定前一天4℃包被過夜(gG50ng/孔)，洗滌液洗三次拍干，37℃封閉1h，洗滌液洗三次拍干，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，于37℃溫育1h，洗滌液洗三次拍干，加入1∶10000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37℃溫育45mins，洗滌5次，加入TMB底物100μL，避光顯色10min，最后加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，同時(shí)設(shè)SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，OD630大于陰性對(duì)照2倍的樣品為陽性。
2.2.6雜交瘤細(xì)胞的克隆化(有限稀釋法) (1)克隆前或者前一天制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞層。
(2)將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹下，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
(3)將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基稀釋到5、10、50個(gè)細(xì)胞/毫升。
(4)將上述三個(gè)濃度的細(xì)胞懸液分別加入已制備好的飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，100μL/孔，使相應(yīng)的每孔分別含0.5、1和5個(gè)細(xì)胞。
(5)培養(yǎng)第4天換液一次，第5-6天仔細(xì)觀察各孔內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并記錄。
(6)特異性抗體的檢測(cè)在克隆后第7-9天，細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿1/3-1/2個(gè)視野時(shí)，即可檢測(cè)，如檢出細(xì)胞生長(zhǎng)孔有特異性抗體，可選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)，形態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)同法再克隆或擴(kuò)大培養(yǎng)。
(7)陽性孔的細(xì)胞可移至24孔培養(yǎng)板，并在原孔中補(bǔ)加另一批培養(yǎng)基，以防二者同時(shí)污染或細(xì)胞死亡。待24孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，可轉(zhuǎn)種至小方瓶中，并凍存2支以上的細(xì)胞。
實(shí)施例5梅花鹿IFN-γ單克隆抗體的鑒定 1、雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè) 在細(xì)胞傳代培養(yǎng)48h后加入秋水仙胺，使其最終濃度達(dá)到0.04μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2-2.5h。終止培養(yǎng)后，將貼壁的細(xì)胞全部用吸管吹下，移入10mL的離心管，以1000r/m離心10min，棄去上清液。加入37℃預(yù)溫的0.075mol/L的氯化鉀低滲溶液5mL，用吸管吹打均勻，置37℃水浴15-20min。每管加入新鮮配制的固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)1mL混勻，以1000r/m離心10min，去上清。再每管加固定液5mL，輕輕混勻，靜止30min后，以1000r/m離心10min，棄上清。再次固定，加固定液5mL，輕輕混勻靜止30min，以1000r/m離心10min，棄上清，用同樣方法加固定液5mL打勻，封上管口于4℃靜止過夜。輕輕吸去上清液，留下0.5mL左右的上清液，混勻使細(xì)胞懸浮，用滴管吸取細(xì)胞懸液2-3滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈的載玻片上，立即吹散，并在火焰上通過幾次，促使細(xì)胞平鋪于載玻片上，自然干燥。以10％Giemsa染液染色10min，洗去洗液自然干燥。最后于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)(章谷生，容秉培，1987)。
2、單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定 建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液，用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。也可在小鼠體內(nèi)誘生小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體，取8-10周齡的小鼠，腹腔注射滅菌的液體石蠟0.5mL/只，7-10天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105/只，7-10天后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存。
3、Western-blot分析單克隆抗體的特異性 將上述純化的重組融合蛋白IFN-γ進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
轉(zhuǎn)移切出6張Whatman 3M濾紙和1張硝酸纖維膜(NC膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標(biāo)記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相對(duì)方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min；在另一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris堿，0.037％ SDS(電泳級(jí))，20％甲醇)，將6張Whatman 3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下方法安裝轉(zhuǎn)移電泳槽平放石墨電極的底座(負(fù)極)，依次放3層3M濾紙、聚丙烯酰胺凝膠、硝酸纖維膜和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣泡；將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極-轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上；連接電源，根據(jù)凝膠板面積按照0.65-1.0mA/cm2的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5-2h。
將NC膜置于含1％BSA和5％的脫脂奶粉的1×TBST(10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)中，室溫封閉過夜或至少30min； 洗膜棄封閉液，用1×TBST洗滌NC膜3遍，每次5min； 一抗孵育將NC膜放入用1×TBST稀釋的梅花鹿IFN-γ單克隆抗體(體積比為1∶3000)，37℃孵育1h； 洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min； 二抗孵育將膜轉(zhuǎn)入1×TBST稀釋的HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗牛IgG(購自Sigma公司)抗體(體積比為1∶5000)，37℃孵育1h； 洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min； 顯色將NC膜置于新配置的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求后，用1×TBST沖洗以終止反應(yīng)。
結(jié)果表明，梅花鹿IFN-γ單克隆抗體表現(xiàn)出很高的特異性，而陰性對(duì)照組(pET32a(+)載體表達(dá)菌)沒有出現(xiàn)反應(yīng)。
實(shí)施例6梅花鹿IFN-γ雙抗體夾心ELISA方法的建成立 1.梅花鹿IFN-γ單克隆抗體敏感度的測(cè)定 利用雙抗體夾心ELISA測(cè)定梅花鹿IFN-γ單克隆抗體敏感度。用包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)保守值3000倍稀釋單克隆抗體，按每孔100μl加入ELISA板孔中，4℃包被過夜。次日用PBST(含0.05％Tween20的PBS，pH7.4)充分洗滌后加入5％脫脂奶粉37℃封閉45min。PBST充分洗滌后，用洗滌液遞增稀釋抗原(CerIFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品)，稀釋后為50ng、25.5ng、12.75ng、6.375ng、3.1875ng、1.593ng、0.79ng、0.398ng、0.199ng、0.099ng、0.498ng、0.025ng、0.012ng、0.006ng、0.003ng和0.002ng 12個(gè)梯度，37℃孵育1h，重復(fù)洗滌。用洗滌液保守值5000倍稀釋的兔抗CerIFN-γ多克隆抗體，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗滌。加1∶5000稀釋的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗滌后每孔100μlTMB/H2O2底物液，室溫避光反應(yīng)10min后，每孔加入50μl終止液(0.25％氫氟酸)終止反應(yīng)，讀取波長(zhǎng)630nm的光密度值(OD)。
2.梅花鹿IFN-γ單/多克隆抗體最佳工作濃度的確定 利用方陣間接滴定確定最佳最佳工作濃度確定。用梅花鹿IFN-γ作為抗原，分別以50ng、25.5ng、12.75ng、6.375ng、3.1875ng、1.593ng、0.79ng、0.398ng、0.199ng、0.099ng、0.498ng、0.025ng、0.012ng、0.006ng、0.003ng和0.002ng 12個(gè)梯度按每孔100μL包被96孔ELISA板，4℃包被過夜。次日用PBST充分洗滌后加入5％脫脂奶粉37℃封閉30min。用洗滌液200、400、800、1600、3200、6400、12800和25600倍8個(gè)梯度稀釋的CerIFN-γ單克隆抗體(或用洗滌液400、800、1600、3200、6400、12800、25600和51200倍8個(gè)梯度稀釋的CerIFN-γ多克隆抗體)，每孔100μL，37℃孵育30min后充分洗滌。加1∶5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG(或HRP-羊抗兔IgG)，每孔100μl，37℃30min，充分洗滌后每孔100μL TMB/H2O2底物液，室溫避光反應(yīng)10min后，每孔加入50μL終止液(0.25％氫氟酸)終止反應(yīng)，讀取波長(zhǎng)630nm的光密度值(OD) 3.梅花鹿IFN-γ體外特異性釋放 抽取梅花鹿頸靜脈血，肝素抗凝。將全血按1.5ml/孔分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的三個(gè)孔中，其中陽性對(duì)照含有60μg刀豆球蛋白A(Con A)，檢測(cè)孔80μg結(jié)核菌特異性蛋白R(shí)v3872-CFP10-ESAT6融合蛋白，空白對(duì)照孔含50μ基礎(chǔ)1640培養(yǎng)液。輕微振蕩培養(yǎng)板，使各孔試劑與血液充分混合，于含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16-24h。次日收集培養(yǎng)上清液，夾心ELISA檢測(cè)IFN-γ濃度。
4.梅花鹿IFN-γ檢測(cè)夾心ELISA的建立 用包被液適當(dāng)稀釋單克隆抗體，按每孔100μl加入ELISA板孔中，4℃包被過夜。次日用PBST充分洗滌后加入5％脫脂奶粉37℃封閉45min。PBST充分洗滌后，每孔100μl上述三種上清液，37℃孵育1h，重復(fù)洗滌。用洗滌液適當(dāng)稀釋的兔抗CerIFN-γ多克隆抗體，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗滌。加1∶5000稀釋的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗滌后每孔100μlTMB/H2O2底物液，室溫避光反應(yīng)10min后，每孔加入50μl終止液(0.25％氫氟酸)終止反應(yīng)，讀取波長(zhǎng)630nm的光密度值(OD)。
實(shí)施例7梅花鹿IFN-γ檢測(cè)結(jié)核病檢測(cè)法的應(yīng)用 1.樣品的處理 取120份抗凝梅花鹿鹿血樣品，按1.5ml/孔分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的三個(gè)孔中，其中陽性對(duì)照含有60μg刀豆球蛋白A(購自Sigma公司)，檢測(cè)孔80μg保藏號(hào)為CCTCC NOM208244(專利申請(qǐng)?zhí)枮?009100609131，專利公開號(hào)為CN101538578A)牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白R(shí)CE，空白對(duì)照孔含有50μ基礎(chǔ)1640培養(yǎng)液(配方見附錄1)。輕微振蕩培養(yǎng)板，使各孔試劑與血液充分混合，于含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16-24h，次日收集培養(yǎng)上清液。
2.用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上述樣品(對(duì)照試驗(yàn)1) 本實(shí)施例所用的商品化ELISA試劑盒購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司。方法如下使用保藏號(hào)為CCTCC NOM208244(專利申請(qǐng)?zhí)枮?009100609131，專利公開號(hào)為CN101538578A)牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白R(shí)CE，于4℃過夜包被酶標(biāo)板，洗滌液洗滌3次，用洗滌液稀釋的5％脫脂奶粉37℃封閉1h，洗滌液洗板3次后加入1∶100(體積比)倍稀釋血清，100μL/孔，每孔重復(fù)3次，37℃反應(yīng)30min。洗板3次后加入體積比為1∶10000(體積比)稀釋的羊抗牛IgG，37℃反應(yīng)30min。洗板5次后加入100μL底物液(含1mg/mL TMB和0.03％H2O2)，避光顯色10min后加入0.25％HF終止反應(yīng)，于OD630讀數(shù)。(結(jié)果表1) 3.用商品化試紙條檢測(cè)上述樣品(對(duì)照試驗(yàn)2) 本實(shí)施例所用的商品化試紙條購自韓國動(dòng)物遺傳公司(公司的英文名稱Animal Genetices，Inc，商品名稱為Anigen Rapid Bovine TB Ab Test Kit)。按照試紙條的說明書操作將上述待檢梅花鹿的血樣取100μL加入試紙條檢測(cè)孔中，10min后觀察結(jié)果(結(jié)果表2)。
4.用本發(fā)明的梅花鹿γ-干擾素雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè) 具體方法如下用包被液(見附錄2)按照50ng/孔稀釋單克隆抗體，按每孔100μl加入ELISA酶標(biāo)板孔中，4℃包被過夜。次日用沖洗液(見附錄2)充分洗滌后加入5％脫脂奶粉37℃封閉45min。用沖洗液充分洗滌后，每孔100μl上述三種上清液(待檢血樣)，37℃孵育1h，重復(fù)洗滌。用沖洗液(50ng/孔)稀釋的兔抗梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗滌。加1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗滌后每孔100μl顯色液，室溫避光反應(yīng)10min后，每孔加入50μl終止液(見附錄3)終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于630nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。
表1120份待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果
表2120份待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果
5.結(jié)果的判定 當(dāng)陽性與陰性對(duì)照孔的OD值差≥0.25，特異性抗原(RCE)與陰性對(duì)照孔的OD值差≥0.1時(shí)，判斷為結(jié)核病陽性； 當(dāng)陽性與陰性對(duì)照孔的OD值差≥0.25，特異性抗原(RCE)與陰性對(duì)照孔的OD值差＜0.1時(shí)，判斷為結(jié)核病陰性； 當(dāng)陽性與陰性對(duì)照孔的OD值差＜0.25，特異性抗原(RCE)與陰性對(duì)照孔的OD值差＜0.1時(shí)，結(jié)果無法確定。
附錄1 1、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制 (1)量取去離子水950ml，置于一定的容器中； (2)將RPMI1640粉劑(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)10g加于15℃-30℃的去離子水中，邊加邊攪拌，得到培養(yǎng)液； (3)向步驟(2)的培養(yǎng)液中按1000ml培養(yǎng)液加2g碳酸氫鈉； (4)加水至1000ml，用CO2將培養(yǎng)液pH值調(diào)至pH6.5-6.8，在過濾之前應(yīng)蓋緊容器瓶塞； (5)立即用孔徑為0.22μm的微孔濾膜正壓過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 附錄2 (1)沖洗液氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉0.2g，磷酸二氫鉀2.9g，吐溫-200.5ml，用蒸餾水定容至1000ml，pH7.4。
(2)包被液碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，用蒸餾水定容至1000ml。
(3)封閉液沖洗液100ml，脫脂牛奶10g。
附錄3 顯色液的配制 顯色A液的配制磷酸氫二鈉71.6g，檸檬酸19.2g，用蒸餾水定容至1000ml。
顯色B液的配制0.1mol/L pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液100ml(磷酸氫二鈉7.16g，檸檬酸1.92g，用蒸餾水定容至100ml)，鄰苯二胺40mg，30％濃度的過氧化氫0.15ml。
終止液2mol/L硫酸22.2ml，蒸餾水177.8ml。
說明本發(fā)明所述的“梅花鹿γ-干擾素”與生物材料樣品保藏證明中命名的“梅花鹿干擾素-γ”為同一種生物材料樣品，本說明書將生物材料樣品命名的“梅花鹿干擾素-γ”修改為“梅花鹿γ-干擾素”更適合中文的表述習(xí)慣。
序列表
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>梅花鹿γ-干擾素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法及試劑盒與應(yīng)用
<130>
<141>2010-01-28
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>438
<212>DNA
<213>梅花鹿(Cervus nippon)
<220>
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<223>
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>1
tct tat ggc cag ggc cca ttt ttt aaa gaa ata gaa aac tta aag gag 48
Ser Tyr Gly Gln Gly Pro Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu
1 5 10 15
tat ttt aat gca agt aac cca gat gta gct gag ggt ggg cct ctt ttc 96
Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Glu Gly Gly Pro Leu Phe
20 25 30
ata gaa att ttg aag aat tgg aaa gag gag agt gac aga aaa att att144
Ile Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Ile
35 40 45
cag agc caa att gtc tcc ttc tac ttc aaa ctc ttt gaa aac ttc aaa192
Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Phe Lys
50 55 60
gat aac cag gtc att cag agg agc gtg gat atc atc aag caa gac atg240
Asp Asn Gln Val Ile Gln Arg Ser Val Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met
65 70 75 80
ttt cag aag ttc ttg aat ggc agc tct gag aaa ctg gag gac ttc aaa288
Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys
85 90 95
aag ctg att caa att tcg gtg gat gat atg cag atc cag cgc aaa gcc336
Lys Leu Ile Gln Ile Ser Val Asp Asp Met Gln Ile Gln Arg Lys Ala
100 105 110
ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gac ctg tcg cca aaa tct aac384
Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn
115 120 125
ctc ata aag cgg aag aga agt cag aat ctc ttt cga ggc cgg aga gca432
Leu Ile Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
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Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Phe Lys
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Asp Asn Gln Val Ile Gln Arg Ser Val Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met
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Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys
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Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn
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taataagctt ttacgttgat gctctccggc ctcg 3權(quán)利要求
1.一株能夠穩(wěn)定分泌梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體的細(xì)胞株CerIFN-γ4C，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOC200966。
2.一種由權(quán)利要求1所述細(xì)胞株分泌的梅花鹿γ-干擾素的特異性單克隆抗體。
3.一種梅花鹿γ-干擾素的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，其步驟包括
(1)用包被液將保藏號(hào)為CCTCC NOC200966梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體按50ng/孔的量加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μl，37℃作用1h后置4℃冰箱過夜；
(2)棄去孔內(nèi)液體，用沖洗液洗酶標(biāo)板3次，每次3min，用吸水紙拍干；
(3)在各酶標(biāo)板孔的孔中加入封閉液100μl，37℃作用1h，按步驟(2)的方法洗滌；
(4)將誘導(dǎo)的待測(cè)的梅花鹿全血培養(yǎng)上清，加入包被有梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體的ELISA板孔中，每孔100μl；同時(shí)將收集的陰性和陽性對(duì)照培養(yǎng)上清分加加入孔中，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌；
(5)用沖洗液將兔抗梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體按照50ng/孔的量加入100μl，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌；
(6)用沖洗液將辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG按體積比為1∶5000稀釋，每孔加入100μl，37℃作用1h，重復(fù)步驟(2)的方法洗滌；
(7)在酶標(biāo)板孔的每孔中加入顯色液100μl，室溫避光顯色10min；
(8)在酶標(biāo)板孔的每孔中加入50μl終止液使其終止反應(yīng)；
(9)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于630nm波長(zhǎng)處測(cè)定步驟(8)酶標(biāo)板孔混合溶液的吸光度值；
其中
步驟(1)所述的包被液配制如下
碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，用蒸餾水定容至1000ml；
步驟(2)所述的沖洗液配制如下氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉0.2g，磷酸二氫鉀2.9g，吐溫-20 0.5ml，用蒸餾水定容至1000ml，pH7.4；
步驟(3)所述的封閉液配制如下沖洗液100ml，脫脂牛奶10g；
步驟(7)所述的顯色液配制如下磷酸氫二鈉7.16g，檸檬酸1.92g，用蒸餾水定容至100ml，得到顯色液A；磷酸氫二鈉7.16g，檸檬酸1.92g，用蒸餾水定容至100ml，調(diào)pH至5.0，得到0.1mol/L的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液100ml，再添加鄰苯二胺40mg，30％濃度的過氧化氫0.15ml，得到顯色液B，混合所述的顯色液A和顯色液B，得到顯色液；
步驟(8)所述的終止液配制如下2mol/L的硫酸22.2ml，蒸餾水177.8ml。
4.一種梅花鹿γ-干擾素的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括保藏編號(hào)為CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體，梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體，保藏號(hào)為CCTCC NOM208244的牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白R(shí)CE，辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔IgG，顯色液和終止液，
其中所述的顯色液和終止液配制方法如下
顯色液磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；補(bǔ)足蒸餾水至100ml，得到A液；磷酸氫二鈉7.16g；檸檬酸1.92g；補(bǔ)足蒸餾水至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液100ml，添加鄰苯二胺40mg；30％濃度的過氧化氫0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到顯色液。
終止液2mol/L硫酸(H2SO4)22.2ml；蒸餾水177.8ml。
5.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備梅花鹿γ-干擾素檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物基因工程和動(dòng)物傳染病領(lǐng)域。涉及一種梅花鹿γ-干擾素雙夾心ELISA檢測(cè)方法及試劑盒與應(yīng)用。獲得一株能穩(wěn)定分泌梅花鹿γ-干擾素單克隆抗體的細(xì)胞株CerIFN-γ4C，其保藏號(hào)為CCTCC NOC200966。本發(fā)明還建立了梅花鹿γ-干擾素雙夾心ELISA檢測(cè)方法，核心是，構(gòu)建梅花鹿γ-干擾素的單克隆抗體，制備梅花鹿γ-干擾素多克隆抗體等。本發(fā)明的試劑盒包含梅花鹿γ-干擾素的單克隆抗體，梅花鹿γ-干擾素的多克隆抗體，牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白R(shí)CE及其他試劑。本發(fā)明還公開了所述檢測(cè)方法和試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101788563SQ20101010457
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者郭愛珍, 劉穎, 張廣智, 廖娟紅, 劉冬光, 于清龍, 王冰, 鄒新峰, 熊家軍, 楊利國, 陳煥春 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)