專利名稱：：一種微囊藻毒素-lr的免疫分析試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—種微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于水體中MC-LR含量的檢測，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICA)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：微囊藻毒素(Microcystin)是藍(lán)藻水華釋放出的一類具有強(qiáng)烈毒副作用的肝臟毒素，其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)是該毒素中毒性最強(qiáng)的一種。研究表明MC-LR可引起家禽、家畜及野生動物死亡。且飲用水中低劑量的MC-LR就能引起人的肝臟損傷甚至肝癌。目前淡水水體中的藻毒素已成為全球性的環(huán)境問題，世界各地經(jīng)常發(fā)生微囊藻毒素中毒事件。被藻毒素污染的飲用水和水產(chǎn)品，給人類健康帶來巨大的威脅，我國于2007年7月1日起實(shí)施的新版《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)》，已將微囊藻毒素列入水質(zhì)檢測指標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)為1Pg/mL。MC-LR是一種環(huán)狀七肽，分子量995.2，易溶于水，無揮發(fā)性，化學(xué)性質(zhì)及其穩(wěn)定，如高溫、光照、蛋白酶等均不能將其破壞。水處理工藝的混凝沉淀、過濾也不能將其有效去除，在紫外線的照射下和水中某些細(xì)菌的作用下可以降解。由于MC-LR造成的損傷快速且不可逆，因而建立快速敏感的檢測方法來監(jiān)測水體中的毒素含量將起到很好的預(yù)警作用。利用MC-LR的生理化學(xué)特性如分子量、生色團(tuán)和反應(yīng)性，目前已建立了MC-LR的測定方法有生物測定法、化學(xué)測定法和免疫測定法，而其中的生物毒性試驗(yàn)、蛋白磷酸酶抑制法(PPI)、HPLC檢測法和ELISA檢測法是目前國內(nèi)外較為常用的方法。在傳統(tǒng)檢測方法得到廣泛應(yīng)用的同時，人們也不斷將新技術(shù)引入MC-LR的檢測，以期建立更敏感、更穩(wěn)定、更簡便的MC-LR檢測技術(shù)。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICA)是以納米級高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)，該項技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。又稱為AlphaLISA分析法(PE公司)，被譽(yù)為免洗的ELISA。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)，它具有快速、均相(免洗)、高靈敏、量程寬和操作簡便的特點(diǎn)。LICA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同時，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價連接。納米級微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個微粒表面覆蓋著成百上千個生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。LICA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時間僅為4微秒。短暫的生存時間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會回落到基態(tài)氧而沒有信號產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICA均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體_配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測MC-LR的試劑盒及其檢測方法，用于對水體中MC-LR含量的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案一種微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品(2)，包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒(3)，生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液(4)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(5)組成。所述的試劑盒檢測MC-LR的方法，測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。依次向白色不透明微孔板中加入包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品、生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后檢測光信號，以加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品的檢測值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測樣品的檢測值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的MC-LR含量。具體操作為取包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒20yL、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品20L以及生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液20L依次加到白色不透明微孔板中，37t:孵育30分鐘；加入包被有鏈霉親和素的感光微粒175L，37t:孵育10分鐘；在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出樣品中的MC-LR含量。本發(fā)明的有益效果發(fā)光微粒上的MC-LR-BSA與游離MC-LR競爭連接到生物素化抗MC-LR單克隆抗體上，再與包被鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合物，在紅光激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測，光信號強(qiáng)度與樣品中MC-LR濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品中MC-LR含量。本發(fā)明用于水體中MC-LR含量的檢測，該檢測試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。圖1:檢測MC-LR的試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品，3、包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒，4、生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液，5、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:MC-LR-LICA反應(yīng)示意圖。圖3:MC-LR-LICA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:制備試劑盒和檢測水樣包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.L1%Tween-20，0.05mgMC-LR-BSA人工抗原，10iiL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200iiL，37t:避光振蕩反應(yīng)48小時。加入10yL0.3MpH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37。C避光孵育1小時后離心，分離得到已連接MC-LR-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。標(biāo)準(zhǔn)品MC-LR試劑的配制(Ong/mL，0.lng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，5ng/mL)，從MC-LR純品中稀釋得到，稀釋液為PBS(O.01mmol/L，pH7.4)。4試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條X8孔，可以拆分為單孔)。(2)、1X包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒2mL。(3)、6XMC-LR標(biāo)準(zhǔn)品，1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為:O，O.1，0.2，0.5，1，5ng/mL。(4)、1X生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液2mL。(5)、1X包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測定時注意事項1、使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C)。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8°C。3、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。檢測步驟樣品處理澄清水樣可直接用于檢測。若水樣渾濁，取混勻后的水樣2mL于3mL試管中，3000rpm離心20min，轉(zhuǎn)移澄清層至另一試管中，待檢測。取包被有MC-LR-BSA發(fā)光微粒、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品、生物素化抗MC-LR抗體溶液三種試劑各20iiL加到白色不透明微孔板中，37t:孵育30分鐘；加入175iiL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37t:孵育10分鐘；在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出樣品中的MC-LR含量。結(jié)果見表1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得水樣所含MC-LR濃度分別為0.342、1.21ng/mL。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求一種微囊藻毒素-LR，簡稱MC-LR，的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征是由(1)白色不透明微孔板，(2)MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品，(3)包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒，(4)生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液和(5)包被有鏈霉親和素的感光微粒組成。2.—種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測MC-LR的方法，其特征是依次向白色不透明微孔板中加入包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品、生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后檢測光信號，以加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品的檢測值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測樣品的檢測值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的MC-LR含量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測MC-LR的方法，其特征是操作為取包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒20iiL、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品20iiL以及生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液20iiL依次加到白色不透明微孔板中，37t:孵育30分鐘；加入包被有鏈霉親和素的感光微粒175i！L，37t:孵育10分鐘；在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出全文摘要一種微囊藻毒素-LR的免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICA)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的試劑盒由(1)白色不透明微孔板，(2)MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品，(3)連有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒，(4)生物素化抗MC-LR的單克隆抗體溶液和(5)包被有鏈霉親和素的感光微粒組成。檢測方法向不透明白色微孔板順序加入包被有MC-LR-BSA的發(fā)光微粒、MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、和生物素化抗MC-LR單克隆抗體溶液，避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測。用光激化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測，光信號強(qiáng)度與樣品中MC-LR濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品中MC-LR含量。本發(fā)明用于水體中MC-LR含量的檢測，試劑盒組分簡單，檢測時間短、靈敏度高、操作簡便。文檔編號G01N33/577GK101776690SQ20101010524公開日2010年7月14日申請日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者何恩奇,劉文衛(wèi),吳慶剛,周磊,張藝,鈕偉民,黃飚申請人:無錫市疾病預(yù)防控制中心