專利名稱：：一種克倫特羅檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種檢測(cè)尿液、動(dòng)物組織(肌肉、心臟、肝臟)、血清、飼料等中的克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒和其使用方法。
背景技術(shù)：
：克倫特羅(Clenbuterol，CLE)，俗稱"瘦肉精"，化學(xué)名為"2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽"，藥品名為"克喘素"是一種P-興奮劑。因其能改善脂肪型動(dòng)物的肉與脂肪的比例，并能加速動(dòng)物生長(zhǎng)，而被廣泛添加于動(dòng)物飼料中，并且可以殘留在動(dòng)物的體內(nèi)。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，克倫特羅的毒性并不很強(qiáng)，但因其半衰期長(zhǎng)，在體內(nèi)代謝慢等原因，人體對(duì)其的耐受量非常小，治療用藥時(shí)也都十分慎重，用量過大或無病用藥則會(huì)導(dǎo)致肌肉震顫、心悸、戰(zhàn)栗、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀。由于這種藥物對(duì)人有嚴(yán)重的副作用，輕則導(dǎo)致心跳及心率不正常，重則可引發(fā)心臟病。目前，我國(guó)已禁止其使用。而在生產(chǎn)上，一些不法生產(chǎn)者在育肥豬(6070Kg以上)飼料中添加，連用至宰前。由于克倫特羅飼用濃度是治療用量的IO倍以上，停藥期短(如果停藥造成受體調(diào)節(jié)減弱，脂肪在皮下和內(nèi)臟補(bǔ)償性蓄積，瘦肉率下降)，更重要的是它的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此在肝、肺等動(dòng)物內(nèi)臟器官殘留量很大。另外，克倫特羅能耐受IO(TC高溫，經(jīng)126t:油煎5min才會(huì)破壞減半，常規(guī)烹調(diào)對(duì)肉食品中克倫特羅殘留起不到破壞作用，因而人類食用后會(huì)發(fā)生中毒。早在上世紀(jì)80年代就有學(xué)者開始對(duì)于克倫特羅的定量檢測(cè)和分析研究，上述分析技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)20余年。通常，檢測(cè)克倫特羅的主要方法有分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等。這些方法由于儀器設(shè)備復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、過程繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用昂貴等原因，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。1993年Boyd等人(D.Boyd，P.Shearan.J.P.HopkinsandM.0'Keeffe.Applicationofmatrixsolidphasedispersionforthedeterminationofclenbuterolinliversamples[J]，AnalyticaChimicaActa,1993，27(5):221-226.)應(yīng)用基質(zhì)固相分散法與放免法結(jié)合對(duì)肝臟中克倫特羅殘留作了檢測(cè)。檢測(cè)中用^標(biāo)記克倫特羅，檢測(cè)限達(dá)0.5ng/g，回收率大于70%，上述方法的應(yīng)用開創(chuàng)了免疫檢測(cè)分析克倫特羅殘留的先河。放免法檢測(cè)克倫特羅殘留具有很好的特異性和高度靈敏度。但由于對(duì)條件要求比較苛刻且放射性同位素對(duì)工作人員有一定傷害，因而限制了該法的廣泛應(yīng)用。隨后發(fā)展起來的熒光免疫分析法(FIA)同放免法相比，克服了放免法中的核輻身寸缺點(diǎn)。Bacigalupo等(M.A.Bacigalupo，A丄us，G.MeroniDovisandEPetruzzlli.Comparisonoftime—resolvedfluroimm皿oassayandimmm皿oenzymometricassayforclenbuterol[J].Analyst,1995，120(8):2269-2271.)利用單抗技術(shù)與熒免分析技術(shù)檢測(cè)了克倫特羅在牛尿中的殘留，檢測(cè)線性范圍10105pg，檢測(cè)限10pg。與色譜法相比，熒光免疫法檢測(cè)克倫特羅殘留具有特異性高，穩(wěn)定性好，對(duì)樣品處理要求比較簡(jiǎn)單及一次可檢測(cè)多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是對(duì)溫度的強(qiáng)烈依賴性和熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)波長(zhǎng)。3標(biāo)記免疫分析技術(shù)是"邁向21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)"之一，其發(fā)展趨勢(shì)是新標(biāo)記物的發(fā)展與聯(lián)合應(yīng)用、單克隆以及基因工程抗體的應(yīng)用及免疫放大技術(shù)，可明顯提高檢測(cè)特異性，敏感度可達(dá)z印to(10—2°)、yocto(10—24)水平，即可實(shí)現(xiàn)分子水平的檢測(cè)。目前，檢測(cè)克倫特羅較高效的免疫分析技術(shù)是ELISA技術(shù)。McCo皿ell等人(McCo皿ellRI，McCormickA，LamontJV，etal.Developmentofanimm皿oaffinitycolumnandanenzymeimmunoassayforthescreeningofclenbuterolinmeatsamplesandthepracticalapplicationofthistestinthescreeningof1005samples[J]FoodAgriImmunol,1994，6:147-153.)在1994年米用ELISA方法對(duì)1005份包括肝臟、腎臟、肌肉在內(nèi)的組織樣品進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)。由于組織試樣的前處理采用了IAC分離技術(shù)，因此假陽性率極低。經(jīng)過復(fù)核測(cè)定，僅有4份假陽性，假陽性率為0.4%。其中檢出的陰性樣品有982份，陽性樣品23份。1998年陳繼明等(陳繼明，龔曉明，陸承平.兔異源蛋白與自身蛋白作為載體制備克倫特羅抗血清南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，21(3):81-88.)用ELISA方法檢測(cè)了飼料、尿樣與臟器中克倫特羅含量，檢測(cè)范圍為15.6iig/mL1.90ng/mL;回收率多在85X。上述檢測(cè)結(jié)果有較好的穩(wěn)定性和較高的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，與用HPLC檢測(cè)結(jié)果大體一致。目前，作為商品化的檢測(cè)試劑盒來講，英國(guó)的Randox公司和德國(guó)的r-biopharm公司均率先開發(fā)出了檢測(cè)肉品、飼料中克倫特羅殘留的ELISA試劑盒。中國(guó)在應(yīng)用ELISA檢測(cè)克倫特羅方面的研究起步相對(duì)國(guó)外稍晚些，但近幾年取得了明顯的進(jìn)展。目前國(guó)內(nèi)企業(yè)和研究單位已經(jīng)開發(fā)成功自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的克倫特羅ELISA檢測(cè)試劑盒，并在近期通過了農(nóng)業(yè)部獸藥殘留試劑盒的備案審核。早在2002年葉妮等(葉妮，閆小峰.國(guó)內(nèi)外克倫特羅ELISA檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)中國(guó)獸藥雜志，2002，36(10):25-28.)對(duì)中國(guó)獸藥監(jiān)察所研制的試劑盒及國(guó)外快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明該試劑盒與德國(guó)r-biopharm公司生產(chǎn)的CLEELISA檢測(cè)試劑盒有相當(dāng)?shù)目杀刃?，且檢測(cè)水平相當(dāng)。上述多種檢測(cè)克倫特羅的方法中，色譜、質(zhì)譜等方法的檢測(cè)過程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需貴重儀器、常常作為高端實(shí)驗(yàn)室確證手段。但是，實(shí)驗(yàn)室確診不能完全取代快速、便捷、高效的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大樣本量、高通量的篩選。根據(jù)我國(guó)目前已經(jīng)形成了一套獸藥殘留的監(jiān)控檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于克倫特羅的監(jiān)控過程包括了ELISA篩選，HPLC或GC-MS、HPLC-MS定量，GC-MS或HPLC-MS/MS確證。由此可見，ELISA作為一種準(zhǔn)確、靈敏性、高性價(jià)比的檢測(cè)方法，是食品安全監(jiān)測(cè)、獸藥殘留監(jiān)測(cè)領(lǐng)域?qū)?瘦肉精"進(jìn)行高通量篩選的理想方法。本發(fā)明通過特有的免疫方案免疫動(dòng)物制備具有高親和力、高特異性的抗體克倫特羅抗體，并采用酶標(biāo)記抗原，建立一種可以檢測(cè)克倫特羅的高特異性、高親和力、靈敏快速的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。相比其他產(chǎn)品，本方法具有操作更簡(jiǎn)便、時(shí)間更短、特異性更高等特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛深入的研究，并因此完成本發(fā)明。本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來進(jìn)行的。首先在微孔板上包被克倫特羅特異性抗體，然后加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣品，再加入酶標(biāo)抗原，溫4育后，用洗滌液洗板后分別加入底物液A和底物液B，顯色后，加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長(zhǎng)讀取吸光值，然后通過提供的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。在整個(gè)反應(yīng)完成后，樣品中克倫特羅含量越多，反應(yīng)呈色就越淺；反之，樣品中克倫特羅含量越少，則呈色越深。—方面，本發(fā)明提供了一種快速、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、靈敏度高及便于攜帶的用于檢測(cè)克倫特羅的試劑盒。本發(fā)明的克倫特羅檢測(cè)試劑盒包括以下物質(zhì)(1)包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)清洗緩沖液；(4)濃縮酶標(biāo)記物；(5)底物溶液A;(6)底物溶液B;(7)反應(yīng)終止液；(8)酶標(biāo)稀釋液，其中，將克倫特羅進(jìn)行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進(jìn)行偶氮連結(jié)，形成克倫特羅-BSA，作為制備多克隆抗體的免疫抗原，并且用該免疫抗原制備的多克隆抗體包被微量測(cè)試孔，以及在酶標(biāo)記物的制備中，將小分子克倫特羅先進(jìn)行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進(jìn)行偶氮連接形成酶標(biāo)抗原克倫特羅-HRP。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，在包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔的制備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1iig/mL，包被體積為100iiL，37t:放置2小時(shí)后置于4t:靜置過夜。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，清洗緩沖液可為含有吐溫20的PBS，優(yōu)選為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，濃縮酶標(biāo)記物(酶標(biāo)抗原)的濃度可為0.3lig/mL_l.0lig/mL。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，底物液A液可為用一定濃度的檸檬酸緩沖液，調(diào)pH值至4.5-5.O，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，底物溶液B可為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞砜和水。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，反應(yīng)終止液可為10%_15%的硫酸溶液。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒中，酶標(biāo)稀釋液可為0.05mol/L的PBS溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種檢測(cè)克倫特羅的試劑盒，該試劑盒包括以下各項(xiàng)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>另一方面，本發(fā)明提供了使用所述試劑盒檢測(cè)克倫特羅的方法，該方法包括1、檢測(cè)樣品的制備；2、使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)克倫特羅；禾口3、分析檢測(cè)結(jié)果。其中，使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)克倫特羅的方法包括向包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔中加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25。C下溫育10min顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。計(jì)算方法(1)計(jì)算B/B。值，用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B。)再乘以100%。(2)以B/B。值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。(3)根據(jù)每個(gè)樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度。(4)有些樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定再要乘以其稀釋倍數(shù)。本發(fā)明的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，除可用于尿液檢測(cè)以外，同時(shí)著重于對(duì)血清樣本的檢測(cè)，使檢驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定；也可以對(duì)飼料、肌肉、組織等樣品進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒簡(jiǎn)化了樣品處理方式，使用簡(jiǎn)便，省時(shí)省力省錢，整個(gè)操作過程不到40分鐘，回收率為80%120%，靈敏度可達(dá)到0.05ppb，是各類飼料企業(yè)、屠宰企業(yè)及各級(jí)政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)的理想產(chǎn)品。圖1為克倫特羅檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式下文中，將通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明的范圍不僅僅限于實(shí)施例。實(shí)施例材料與儀器藥品和耗材藥物名稱生產(chǎn)廠家規(guī)格批號(hào)NaOH國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF20080125HCL國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR080101NaN02國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR080103牛血清白蛋白(BSA)SEEBIO公司OG2012A鹽酸克倫特羅Sigma公司HPLC067K0668完全福氏佐劑Sigma公司不完全福氏佐劑Sigma公司H2S04國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF20080128NaCL國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF20080104KCL國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF20080110KH2P04國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF20080106Na2HP0412H20國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司ARF200711037<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例1主要材料的制備1、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備克倫特羅(以下簡(jiǎn)稱CLE)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，lmL/瓶。制備過程如下參精確稱取CLE標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用蒸餾水溶解，定容至lOOmL，得到lOOppmCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液；參取1.OmL100卯m標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容至lOOmL，得到1.O卯mCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液；參用1.O卯mCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稀釋成0.lppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7卯b、8.lppb(Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.Ing/mL)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、克倫特羅免疫抗原與酶標(biāo)抗原的制備參將CLE進(jìn)行重氮化(段行信.實(shí)用精細(xì)有機(jī)合成手冊(cè)[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000)，再與BSA(Bovineserumalbumin,牛血清白蛋白BSA)蛋白進(jìn)行偶氮連結(jié)，形成CLE-BSA，作為制備多抗的免疫抗原；參酶標(biāo)抗原CLE-HRP:將小分子CLE先進(jìn)行重氮化，再與辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)進(jìn)行偶氮連接。3、克倫特羅多抗的制備參CLE-BSA過柱(葡聚糖凝膠G25)純化，其中BSA含量有9mg/mL;參初次免疫用100-500iigCLE-BSA加入lmL福氏完全佐劑(Freund'sCompleteAdjuvant,FCA)，在家兔背部皮下注射10點(diǎn)每點(diǎn)0.lmL;參每隔4-6個(gè)星期用100-500iigCLE-BSA于福氏不完全佐劑(Freund'slncompleteAdjuvant,FIA)中，在肌肉皮下靜脈注射和腳趾皮下注射加強(qiáng)免疫5次，每次lmL;參佐劑和CLE-BSA按照1:1的比例混合乳化。每只兔子每次免疫用lmL乳化完的抗原，CLE-BSA含量100-500iig;分10個(gè)點(diǎn)打入，每個(gè)點(diǎn)0.lmL。參最后一次免疫直接用lmL生理鹽水稀釋100-500ygCLE-BSA，靜脈注射，10天后頸部靜脈取血，獲得抗血清。4、克倫特羅抗體的檢測(cè)9免疫時(shí)間免疫次數(shù)效價(jià)抑制(0.l卯b)抑制(lppb)2007年9月9日1i:io萬5%21%2007年10月1日21:40萬17%58%2007年10月22日3i:ioo萬24%79%2007年11月13日4i:400萬28%87%2007年12月4日5i:800萬32%94%2007年12月25日第五次免疫后測(cè)定為合格(用間接法測(cè)定效價(jià)達(dá)到檢測(cè)要求且通過直接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定靈敏度達(dá)到0.05ng/mL)可以取血。5、多克隆抗體的純化1)將上述經(jīng)測(cè)定達(dá)到要求的兔血經(jīng)4t:或室溫離心13000r/min(20000Xg)，30min，收集上清；2)取上清約20mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加40mL飽和硫酸氨溶液，于4。C沉淀30min以上或過夜，使蛋白充分沉淀；3)13000r/min，4。C離心10min，棄上清；4)用12mL生理鹽水溶解沉淀，同步驟(2)滴加8mL飽和硫酸銨溶液，4"C靜置lh;5)重復(fù)步驟3)離心，用13.3mL生理鹽水溶解沉淀；6)滴加6.6mL飽和硫酸氨溶液，4"靜置lh;7)重復(fù)步驟4)離心后所得沉淀物用少許鹽水溶解沉淀，并裝入透析袋；8)用大于20倍體積的PBS緩沖液于4。C透析，更換透析液數(shù)次，然后加入等體積甘油置-2(TC保存。9)多抗效價(jià)的測(cè)定采用間接ELISA法(EnzymeImmunoassays:FromConc印ttoProductDevelopment.S.S.DESP應(yīng)DE.ChapmanandHall，NewYork，1996.)測(cè)定多抗血清的效價(jià)。實(shí)施例2檢測(cè)方法的建立1、包板多抗及克倫特羅-HRP最佳濃度的選擇將上述制備的多抗做不同稀釋后，進(jìn)行方陣滴定(EnzymeImmunoassays:FromConcepttoProductDevelopment.S.S.DESPHANDE.ChapmanandHal1，NewYork,1996.)，在用ELISA法測(cè)定一定濃度的克倫特羅中，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光值在2.3-2.8時(shí)，即為兩個(gè)參數(shù)的最佳工作濃度。2、競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品含量的測(cè)定在確定了最優(yōu)化的多抗包被濃度和CLE-HRP濃度的基礎(chǔ)上，用CLE標(biāo)準(zhǔn)品與CLE-HRP進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA。103、樣品提取方法的研究情況3.l待測(cè)物為尿液直接將尿液取50L進(jìn)行測(cè)試，如有混濁請(qǐng)先離心取上清液進(jìn)行分析。3.2待測(cè)物為血清抽取待驗(yàn)動(dòng)物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取0.ImL血清，加入0.4mL樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)，渦旋1分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50yL進(jìn)行分析。3.3待測(cè)物為肉類取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進(jìn)行1:3(4倍)稀釋后，取50iiL進(jìn)行分析。3.4.待測(cè)物為心、肝等器官取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進(jìn)行l(wèi):3(4倍)稀釋后，取50iiL進(jìn)行分析。3.5.待測(cè)物為飼料取lg已磨碎的待測(cè)飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，取上清液100iiL，用樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)做10倍稀釋。取50yL進(jìn)行分析。4、理化方法的比較與氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)比對(duì)報(bào)告。實(shí)施例3克倫特羅檢測(cè)試劑盒的制備1.微量測(cè)試孔的包被將上述經(jīng)硫酸銨法純化后的抗體用0.05moL/L、pH為9.6的碳酸緩沖液稀釋到濃度為0.1iig/mL-1.0iig/mL，每孔0.lmL加入96孔微孔板，37攝氏度孵育2小時(shí)后4攝氏度過夜。2.制備CLE-HRP采用重氮法將克倫特羅與辣根過氧化物酶按10:l摩爾比連接，4攝氏度過夜后對(duì)PBS充分透析。根據(jù)偶聯(lián)物的活性決定酶的工作濃度。實(shí)施例4克倫特羅檢測(cè)試劑盒的組建組建克倫特羅檢測(cè)試劑盒，使其包括以下組分(1)包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔，每條8孔，每板12條；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL，每個(gè)濃度各1瓶；(3)20倍清洗緩沖液，含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS;(4)20倍濃縮酶標(biāo)記物，濃縮酶標(biāo)記物(酶標(biāo)抗原)的濃度為0.3iig/ml-l.0yg/ml;(5)底物溶液A，稱取NaAcH202.825g，檸檬酸1.725g，檸檬酸鈉？H202.95g，加蒸餾水溶解，用濃HAc調(diào)pH至4.50后加入0.1-1.OmL30%的H202，最后用250mL的容量11瓶定容即可；(6)底物溶液B，稱取TMB20-200mg，溶解于125mL的二甲亞砜中，再加入蒸餾水定容至250mL;(7)反應(yīng)終止液，用量筒量取濃硫酸150mL，在玻璃棒攪拌下緩慢加入850mL蒸餾水中；(8)酶標(biāo)稀釋液，為0.05mol/L的PBS溶液。實(shí)施例5檢測(cè)樣品的制備(樣品前處理)1.若待測(cè)物為尿液，直接將尿液取50L進(jìn)行測(cè)試，如有混濁請(qǐng)先離心取上清液進(jìn)行分析。2.若待測(cè)物為血清，則用以下方法進(jìn)行處理(5倍稀釋)抽取待驗(yàn)動(dòng)物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取O.lmL血清，加入O.4mL稀釋液，渦旋l分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50iiL進(jìn)行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，則可直接取lmL血清進(jìn)行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。3.若待測(cè)物為肉類，則用以下方法進(jìn)行處理(10倍稀釋)取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與稀釋液進(jìn)行1:3(4倍)稀釋后，取50yL進(jìn)行分析。*若需要0.05卯b的靈敏度，則可繼續(xù)取稀釋液3mL進(jìn)行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。4.若待測(cè)物為心、肝等器官，則用以下方法進(jìn)行處理(10倍稀釋、煮沸)取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與稀釋液進(jìn)行1:3(4倍)稀釋后，取50yL進(jìn)行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，可繼續(xù)取稀釋液3mL進(jìn)行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。5.若待測(cè)物為飼料，則用以下方法進(jìn)行稀釋(50倍稀釋)取lg已磨碎的待測(cè)飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，取上清液100iiL，用稀釋液做10倍稀釋。取50iiL進(jìn)行分析。管柱純化(C18，500mg3mL)若利用C-18管柱進(jìn)行樣品純化，可提升敏感度至0.05卯b，方法如下1.以10mL甲醇洗滌管柱，流速3mL/分。2.再以10mL蒸餾水洗滌管柱，流速3mL/分。3.分析樣品進(jìn)入管柱(血清加入lmL，肉類或內(nèi)臟均質(zhì)稀釋后的上清液加入3mL)。(注)4.以10mL蒸餾水洗管柱，流速3mL/分。5.利用減壓真空裝置干燥管柱10分鐘。6.以2mLCH3CN洗滌管柱，流速3mL/分。7.再利用減壓真空裝置干燥管柱10分鐘。8.以2mL甲醇流出樣品，流速3mL/分。9.以5(TC氮?dú)饬鞔蹈蓸悠泛螅尤胂♂屢喝芙鈽悠贰?樣品若是血清，則加入lmL稀釋液，樣品若是肉類或是內(nèi)臟類，則加入300iiL稀釋液)。10.取100iiL進(jìn)行分析。注:分析樣品進(jìn)管柱之前必須先用1NNaOH調(diào)整到pH9.0~9.5間！實(shí)施例6使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)克倫特羅的操作步驟檢測(cè)前使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)克倫特羅的方法包括1、將標(biāo)準(zhǔn)品6瓶、待測(cè)樣品、20倍濃縮清洗緩沖液、酶標(biāo)記物、微孔測(cè)試板，置于室溫下，回溫5分鐘。2、清洗緩沖液的配制用蒸餾水將20倍清洗緩沖液以1:19的比例稀釋(即lmL濃縮液+19mL蒸餾水)，作為微孔板清洗液。3、酶標(biāo)記物配制利用酶標(biāo)稀釋液將20倍濃縮酶標(biāo)記物以1:19的比例稀釋(即0.lmL20倍濃縮酶標(biāo)記物+1.9mL酶標(biāo)稀釋液)，即完成原倍酶標(biāo)記物的配制。稀釋后的酶標(biāo)記物請(qǐng)盡快使用，若保存于-20°C，保存期可達(dá)1個(gè)月，若保存于4°C，請(qǐng)勿超過一個(gè)星期。5、將剩余的微孔條放回鋁箔袋中，以膠帶封好儲(chǔ)存于4°C。6、如要提高靈敏度可用酶標(biāo)稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋一倍后使用。檢領(lǐng)[J時(shí)1、于適當(dāng)微孔中分別加入50iiL標(biāo)準(zhǔn)溶液(O，O.l，O.3，0.9，2.7和8.l卯b)。2、在另外的微孔中加入50iiL已完成前處理的樣品溶液。3、再于每一微孔中另再加入100iiL已完全回溶的酶標(biāo)記物。4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育30分鐘。5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。7、將底物A和B液等比例稀釋，于每一微孔中加入混合好的底物溶液100iiL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。8、于室溫下避光靜置溫育15分鐘。9、于每一微孔中加入50iiL反應(yīng)終止液。10、用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm下判讀。實(shí)施例7判定1.計(jì)算B/B。值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B。)再乘以100%。2.以B/B。值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。3.根據(jù)每個(gè)樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度。4.有些樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例本試劑盒1至6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液為無色透明液體；酶標(biāo)記物為藍(lán)色帶有絮狀沉淀物液體；底物(A液)為粉紅色澄清透明液體，無沉淀和絮狀物；顯色劑(B)液為無色澄清透明液體，無沉淀和絮狀物，無藍(lán)色趨向性變化；反應(yīng)終止液為澄清透明液體，無沉淀和絮狀物。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例l靈敏度向包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔中加入0ng/mL克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。上述制備的試劑盒的克倫特羅含量為Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液20次測(cè)定OD值為<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>平均值B。=EXi鰭(i=1n)標(biāo)準(zhǔn)差SD={[n□EX2-(EX)2]轔n□(n_l)]}1/2靈敏度LOD=B。-3SDB。=2.170SD=0.0106LOD=2.136代入曲線計(jì)算得靈敏度=0.Olng/mL本試劑盒靈敏度在0.05ng/mL以內(nèi)IC50=0.57ng/mL平行20孔測(cè)定零值標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收度值，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值(B)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。靈敏度LOD=(B0-3SD)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。本試劑盒靈敏度為0.lppb以內(nèi)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2特異性上述制備的克倫特羅試劑盒的特異性通過對(duì)相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)性分析而得到?？寡宓囊种莆锓謩e用萊克多巴胺、沙丁胺醇等類似物，以類似物在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的實(shí)測(cè)濃度的回收率計(jì)算交叉反應(yīng)率。向包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔中加入不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或者其他相關(guān)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)及交叉物五次平均OD值實(shí)測(cè)濃度ng/mL交叉反應(yīng)率02.23000.lng/mL1.7650.10.3ng/mL1.3840.314<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果顯示本試劑盒與克倫特羅類似物的交叉反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3精密度使用試劑盒批號(hào)為20080201，20080202，20080203分別用三個(gè)批次的試劑盒，進(jìn)行相同的質(zhì)控樣品的檢測(cè)。其中質(zhì)控樣品1為lng/mL，質(zhì)控樣品2為2ng/mL，質(zhì)控樣品3為5ng/mL每份樣品做5次重復(fù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果顯示本試劑盒批內(nèi)CV<10%，批間CV<20%。體現(xiàn)了良好的精密度。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒與氣相色譜_質(zhì)譜法(GC核S)比對(duì)GC-MS法優(yōu)點(diǎn)是把色譜高效快速的分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機(jī)合起來，能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，而且具更高的檢測(cè)極限。應(yīng)用氣相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS-MS)對(duì)牛、羊、豬組織中的CLE含量進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為O.5ng/g;用GC-MS法(El離子源)檢測(cè)豬尿中的CLE,檢測(cè)限為0.5ng/mL;本次使用GC-MS法檢測(cè)豬尿中的CLE含量與試劑盒經(jīng)行比對(duì)。進(jìn)行30個(gè)豬尿盲樣進(jìn)行領(lǐng)lj試。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從以上數(shù)據(jù)，可以看出克倫特羅含量在0.5ppb以上本試劑盒所測(cè)定的結(jié)果與GC-MS所測(cè)定的結(jié)果基本一致，0.5ppb以下時(shí)已經(jīng)超出了GC-MS的檢測(cè)下限，而本試劑盒仍然可以給出準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，本試劑盒完全可以取代GC-MS用于常規(guī)克倫特羅的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5回收率在不同樣品中添加不同濃度的CLE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后采用本試劑盒提供的前處理方法和試劑進(jìn)行檢測(cè)，回收率=實(shí)測(cè)濃度/添加濃度X100%<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)1、使用有效期實(shí)驗(yàn)使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，28t:放置，分別于0、l、2、3月，及以后每3個(gè)月，測(cè)定6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD值及計(jì)算陰性豬尿中添加lng、5ng克倫特羅的回收率，并計(jì)算IC5Q。(IO次重復(fù)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>B回收率尿樣品中大約90110%BIC50二0.54上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，該試劑盒在一年內(nèi)不同月份檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)OD數(shù)值、標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)、樣品濃度、添加回收率均無顯著性變化。體現(xiàn)了該試劑盒在正確保存條件下，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)良好的再現(xiàn)性。2、室溫放置實(shí)驗(yàn)室溫放置本發(fā)明的試劑盒，室溫(25_28°C)放置，分別于15天、1個(gè)月、2個(gè)月后測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次重復(fù)的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒在室溫(25-28°C)放置2個(gè)月內(nèi)實(shí)驗(yàn)OD值及IC5。無顯著性變化。3、凍融實(shí)驗(yàn)使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行凍融實(shí)驗(yàn)，將試劑盒組份置-181:三天，解凍后測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒組分經(jīng)凍融后0D值及IC50無顯著性變化。4、37攝氏度加速試驗(yàn)使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行加速試驗(yàn)，37t:放置，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天后測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次重復(fù)的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒組分經(jīng)37攝氏度后0D值及IC50無顯著性變化。本發(fā)明的克倫特羅檢測(cè)試劑盒靈敏度已達(dá)到國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品的水平，且交叉反應(yīng)低，反應(yīng)時(shí)間短，穩(wěn)定性好。權(quán)利要求一種克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其包括(1)包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)清洗緩沖液；(4)濃縮酶標(biāo)記物；(5)底物溶液A；(6)底物溶液B；(7)反應(yīng)終止液；和(8)酶標(biāo)稀釋液，其中，將克倫特羅進(jìn)行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進(jìn)行偶氮連結(jié)，形成克倫特羅-BSA，作為制備多克隆抗體的免疫抗原，并且用該免疫抗原制備的多克隆抗體包被微量測(cè)試孔，以及在酶標(biāo)記物的制備中，將小分子克倫特羅先進(jìn)行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進(jìn)行偶氮連接形成酶標(biāo)抗原克倫特羅-HRP。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分另U為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述濃縮酶標(biāo)記物的濃度為0.3lig/mL_l.0lig/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔的制備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1g/mL，包被體積為100L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述清洗緩沖液為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述底物溶液A用一定濃度的檸檬酸緩沖液，調(diào)PH值至4.5-5.0，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得，而所述底物溶液B為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞砜和水。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其中，所述反應(yīng)終止液為10%-15%的硫酸溶液。8.—種檢測(cè)樣品中殘留的克倫特羅的方法，該方法包括以下步驟(1)檢測(cè)樣品的制備；(2)使用權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)克倫特羅；禾口(3)分析檢測(cè)結(jié)果。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，向包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔中加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后，用清洗緩沖液洗板后加入等體積混合的底物溶液A和B，顯色，然后加入反應(yīng)終止液終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，其中，所述酶標(biāo)克倫特羅溶液為用所述酶標(biāo)稀釋液稀釋濃縮酶標(biāo)記物得到的溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述樣品為尿液、血清、動(dòng)物組織、器官或飼料。全文摘要本發(fā)明提供了一種克倫特羅檢測(cè)試劑盒，其包括包被了克倫特羅抗體的微量測(cè)試孔、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液、清洗緩沖液、濃縮酶標(biāo)記物、底物溶液A、底物溶液B、反應(yīng)終止液和酶標(biāo)稀釋液。本發(fā)明還公開了使用上述試劑盒檢測(cè)克倫特羅的方法，其包括以下步驟檢測(cè)樣品的制備；使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)克倫特羅；和分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的克倫特羅檢測(cè)試劑盒，除可用于尿液檢測(cè)以外，同時(shí)著重于對(duì)血清樣本的檢測(cè)，使檢驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定；也可以對(duì)飼料、肌肉、組織等樣品進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒簡(jiǎn)化了樣品處理方式，使用簡(jiǎn)便，省時(shí)省力省錢，整個(gè)操作過程不到40分鐘，回收率為80％～120％，靈敏度可達(dá)到0.05ppb。文檔編號(hào)G01N33/543GK101776684SQ20101011056公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年2月12日優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日發(fā)明者李康,肖理文,胡佳駿,董國(guó)秀,蔡曉帆,郭曉梅申請(qǐng)人:上海優(yōu)你生物科技股份有限公司