專利名稱：一種快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型流感病毒領(lǐng)域，具體涉及一種評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法。
背景技術(shù)：
甲型流感病毒為常見流感病毒，并容易發(fā)生變異。禽流感病毒為甲型流感病毒的一種亞型，禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，也能感染人類。禽流感病毒不僅嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的生產(chǎn)，特別是高致病性的H5m禽流感病毒已經(jīng)跨越種屬屏障直接引起人類感染并造成感染者死亡。禽流感病毒抗原類型眾多，變異頻繁，導(dǎo)致高致病性禽流感防控非常困難。因此有必要發(fā)展可用于監(jiān)測(cè)和評(píng)估禽流感病毒病原的變異和宿主特異性的新技術(shù)。在病毒和宿主細(xì)胞表面糖鏈間的相互作用存在種類特異性，如禽流感病毒主要識(shí)別和結(jié)合存在于禽腸胃道上皮細(xì)胞表面的唾液酸(SA) α 2_3Gal (半乳糖)的糖鏈?zhǔn)荏w，而人流感病毒主要識(shí)別和結(jié)合存在于肺及呼吸道上皮細(xì)胞表面的SA α 2_6Gal的糖鏈?zhǔn)荏w。最初認(rèn)為，這種受體特異性的差異，造成了禽流感病毒無法在人間傳播。但是，近來的研究表明，禽流感的H5W型的一些毒株能直接感染人類，H9N2亞型同樣能由禽類直接傳染給人，其原因是它們能同時(shí)結(jié)合這兩種糖鏈?zhǔn)荏w。與甲型流感病毒結(jié)合的細(xì)胞受體是位于細(xì)胞膜上糖蛋白或糖脂鏈末端的唾液酸 (SA)。研究表明流感病毒血凝素(HA)蛋白的受體特異性決定了病毒的宿主范圍。人流感病毒HA主要識(shí)別和結(jié)合末端為SA α 2-6半乳糖(Gal)的唾液酸低聚糖受體，其存在于人呼吸道上皮細(xì)胞表面，禽流感病毒HA的主要識(shí)別和結(jié)合末端為SAa 2_3Gal的唾液酸低聚糖受體，其廣泛存在于禽腸胃道的上皮細(xì)胞表面。由甲型流感病毒引起的禽流感，其病理變化因感染病毒毒株致病性的強(qiáng)弱和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類、日齡和并發(fā)感染情況及所感染毒株的致病性和其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致。長(zhǎng)期以來，禽流感的診斷一直依賴于病原的分離和鑒定。近年來，國(guó)內(nèi)外已相繼建立了禽流感病毒瓊脂擴(kuò)散(AGP)、血凝抑制試驗(yàn)(HI) 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(Ni)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)診斷技術(shù)及分子診斷技術(shù)(如RT-PCR)，滿足了我國(guó)禽流感病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)地診斷與防制的迫切需要。病毒分離培養(yǎng)和血凝抑制試驗(yàn)經(jīng)常作為評(píng)價(jià)新的檢測(cè)禽流感病毒方法的對(duì)照，但病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，至少需7天，不利于快速診斷，病毒分離的實(shí)驗(yàn)條件要求較高，同時(shí)有致病性的危險(xiǎn)，對(duì)毒株的檢測(cè)及管理上要嚴(yán)格考慮生物安全措施。禽流感病毒在雞胚培養(yǎng)過程中還可能發(fā)生變異。血凝及血凝抑制試驗(yàn)特異性好，但其操作相對(duì)繁瑣。血清學(xué)檢查對(duì)最后確診有回顧性診斷價(jià)值，一般只能在發(fā)病2-3周甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能有抗體陽性出現(xiàn)。由于禽流感病毒血清型眾多，新的變異株不斷出現(xiàn)，制備血清型特異性單克隆抗體相對(duì)困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗(yàn)等血清學(xué)診斷方法也會(huì)失去作用。核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT) 檢測(cè)禽流感病毒，選擇好靶基因和引物及優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，均可獲得高靈敏度和特異性。對(duì)于血清型眾多的禽流感病毒，不同亞型致病性不同，其宿主分布也不同，故快速、特異地分型在禽流感病毒診斷中顯得尤為重要。RT-PCR方法能夠獲得所有禽流感病毒的已知HA亞型。 上述流感病毒的檢測(cè)方法中無論是哪一種檢測(cè)方法，都無法同時(shí)對(duì)眾多型和亞型的流感病毒進(jìn)行精確的分型。因而有必要尋找一種高效、高通量和快速的流感病毒檢測(cè)和分型方法。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)為同時(shí)對(duì)流感病毒進(jìn)行檢測(cè)和分型提供了可能的途徑。目前國(guó)內(nèi)外已有十多篇關(guān)于基因芯片技術(shù)在流感檢測(cè)及亞型鑒別上應(yīng)用的報(bào)道?；蛐酒椒▋H能夠獲得所有禽流感病毒的已知亞型，并不能完全檢測(cè)和評(píng)估甲型流感病毒病原的變異和宿主的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決常規(guī)檢測(cè)禽流感病毒手段和檢測(cè)病毒核酸的方法不能完全評(píng)估甲型流感病毒病原的變異和宿主的特異性的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，包括以下步驟步驟1 對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化；步驟2 制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物；步驟3 將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合；步驟4 將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫；步驟5 對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，以評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。上述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特殊之處在于所述步驟1中對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化包括以下步驟；1)取甲型流感病毒懸液；2)在甲型流感病毒懸液中加入等體積分析純乙醚；3)再置于4°C的環(huán)境中0. 5-2小時(shí)，并每隔IOmin充分振蕩一次；4)將步驟3)處理后的甲型流感病毒懸液以2000r/min的速度進(jìn)行10-20min的離心；5)對(duì)離心后的甲型流感病毒懸液進(jìn)行靜止分層，吸取下層甲型流感病毒懸液，并轉(zhuǎn)移至另一離心管中；6)將盛有轉(zhuǎn)移后的下層甲型流感病毒懸液的離心管置于通風(fēng)環(huán)境中，直至該甲型流感病毒懸液中的乙醚徹底揮發(fā)；7)將步驟6)處理后的甲型流感病毒懸液置于低于_18°C的環(huán)境中保存。上述步驟2中制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物包括以下步驟1)取2支離心管，分別放入等量羥基化磁性微粒若干l_15mg ；2)對(duì)羥基化磁性微粒進(jìn)行磁性分離；3)對(duì)分離后的羥基化磁性微粒棄上清，再用無水乙醇清洗；4)對(duì)無水乙醇清洗后的羥基化磁性微粒再次棄上清，再加入偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行清洗；
5)在裝有偶聯(lián)緩沖液清洗過的羥基化磁性微粒的2支離心管中，以羥基化磁性微粒的量為參照分別加入20-40 μ L/mg的偶聯(lián)緩沖液；以羥基化磁性微粒的量為參照，再在其中一個(gè)離心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2-3Gal糖鏈；另一個(gè)離心管以0. 3-0. 75 μ mo l/mg加入的SA α 2_6Gal糖鏈；6)對(duì)2支離心管內(nèi)的羥基化磁性微粒、偶聯(lián)緩沖液以及糖鏈進(jìn)行混勻；并進(jìn)行 2-10小時(shí)的振蕩反應(yīng)；得到糖鏈磁性微粒復(fù)合物；7)對(duì)得到的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清；8)并用結(jié)合緩沖液清洗磁性分離后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物；9)清洗完成后，將糖鏈磁性微粒復(fù)合物置于保存緩沖液中保存。上述步驟3中將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合包括以下步驟1)取制備好的上述兩種糖鏈磁性微粒復(fù)合物分別放入另外兩個(gè)離心管中；2)以2mL離心管為例，在每個(gè)離心管中分別加入200-1000 μ L結(jié)合緩沖液， 20-500 μ L初步純化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)對(duì)混勻后的溶液進(jìn)行0. 5-2小時(shí)的振蕩反應(yīng)，得到結(jié)合有甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物。上述步驟4中將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫包括以下步驟1)對(duì)得出的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清，并用清洗液清洗；2)將清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物加入洗脫液100-1000 μ L ；3)對(duì)加入洗脫液的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行0. l-2h的振蕩反應(yīng)；4)對(duì)反應(yīng)后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，獲得上清液，即純化出的甲型流感病毒液血凝素；5)對(duì)純化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的環(huán)境中保存。上述步驟5中對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定具體是分別將兩種不同糖鏈磁性微粒復(fù)合物純化得到的甲型流感病毒液血凝素進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯色，從而評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。上述評(píng)估具體是在電泳圖中如果顯示洗脫液洗脫下來與SAa 2_6Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，分子量為75KD左右，故可判斷甲型流感病毒可以感染人類；電泳圖中如果顯示洗脫液洗脫下來與SAa2-3Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，分子量為75KD左右，故可判斷甲型流感病毒可以感染禽類。上述步驟5中對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定包括以下步驟1)用熒光染料標(biāo)記甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清；幻將標(biāo)記好的甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清與磷酸緩沖液以1 9的比例混合配成抗體溶液；3)將糖鏈磁性微粒復(fù)合物與初步純化的甲型流感病毒血凝素結(jié)合；4)對(duì)結(jié)合甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物中加入100-1500 μ L的抗體溶液，再經(jīng)振搖反應(yīng)后得到標(biāo)記后的糖磁粒蛋白復(fù)合物；
6)對(duì)標(biāo)記后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200 μ L清洗過的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物置于玻片上，并進(jìn)行干燥處理；8)將干燥后的玻片放入熒光掃描儀中掃描，從而評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。上述評(píng)估具體是如果SAa 2_6Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染人類；如果SAa 2_3Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染禽類。上述步驟1中在2支離心管分別放入3mg的羥基化磁性微粒；所述步驟3與步驟 4中的清洗次數(shù)至少為3次。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、磁性微粒可以均勻的懸浮在液體中，這些微粒在外加磁場(chǎng)的作用下會(huì)朝一定的方向聚集，磁極的方向保持一致，當(dāng)撤除外加磁場(chǎng)后，微粒的磁極又會(huì)很快的恢復(fù)成原來的狀態(tài)，依然可以保持原來性質(zhì)，可以均勻的懸浮在液體中，因此利用磁性微粒的這種特性， 可把磁性微粒用作分離純化生物分子的載體。本發(fā)明在純化步驟中利用類似制備糖芯片共價(jià)偶聯(lián)糖鏈的方法，將磁性微粒與有機(jī)試劑進(jìn)行復(fù)合，在微粒表面引入一些功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)與引入物質(zhì)上的基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合就可以將這些物質(zhì)固定于微粒的表面。能高效率、 快速、簡(jiǎn)便的對(duì)糖結(jié)合蛋白(例如甲型流感病毒血凝素)進(jìn)行分離純化。2、目前世界衛(wèi)生組織是根據(jù)四個(gè)條件來判斷流感大爆發(fā)是否來臨第一，人類對(duì)這種病毒有沒有免疫力；第二，病毒能夠從禽傳播到人；第三，能夠造成被感染人死亡；第四，能夠在人與人之間傳播。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)甲型流感病毒宿主特異性的方法，適用于禽類及禽類產(chǎn)品的進(jìn)出口檢疫、衛(wèi)生防疫和流行病學(xué)調(diào)查。能滿足實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測(cè)病毒，適應(yīng)大規(guī)模檢疫、預(yù)報(bào)預(yù)測(cè)急性、烈性傳染病的需要。


圖1為本發(fā)明以H5N2禽流感病毒Mal lard/JX/16/05為例的電泳結(jié)果圖；


圖1中1-8泳道依次為1 蛋白Marker ；2 :未結(jié)合SA α 2_3Gal的蛋白；3 清洗完畢后的洗液組份；4 洗脫液洗脫下來與SAa 2_3Gal結(jié)合的蛋白；5 未結(jié)合SA α 2_6Gal的蛋白；6 清洗完畢后的洗液組份；7 洗脫液洗脫下來與SAa 2_6Gal結(jié)合的蛋白；8 病毒總蛋白。
具體實(shí)施例方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料具體如下1)、主要材料和試劑禽流感病毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；自制的羥基化磁性微粒；3，-N-Acetylneuraminy1-N-acetyllactosamine sodium salt(α-NeuNAc-(2 — 3 )-β -D-Gal-(l — 4)-D_GlcNAc)或3，-Sialyllactose ( α -NeuNAc-Q — 3)-β -D-Gal-(1 — 4)-D-Glc)，6，-Sialyllactose sodium salt ( α -NeuNAc-(2 ^ 6)-β -D-Gal-(1 — 4)-D-Gl c)，苯甲基磺酞氟(PMSF)，乙醇胺，ProteinMarker, sigma ；其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。2)、主要試劑的配方
偶聯(lián)緩沖液0. 2mol/L pH5. 4乙酸乙酸鈉緩沖液；結(jié)合緩沖液20mmol/LTris-HCl，0. 5mol/L NaCl, 10mmol/L CaCl2,6mmol/L MnCl2, pH7. 2 ；清洗液20mmol/LTris-HCl,0. 5mol/L NaCl，0. 05% Tween20, pH7. 2 ；洗脫緩沖液0.5% SDS ;保存緩沖液10%乙醇胺。3)、主要使用的儀器磁性分離架，陜西北美基因股份有限公司產(chǎn)品；ZHWY 2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器， 上海智城分析儀器制造有限公司；AB204-S電子天平，瑞士 Mettlertoledo ；移液槍，德國(guó) Epphendorf公司；5415D離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SK-I高速混勻器，常州國(guó)華電器有限公司；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；WD-9406型膠片觀察燈，北京市六一儀器廠。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，包括以下步驟步驟1 對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化；1)取甲型流感病毒懸液；2)在甲型流感病毒懸液中加入等體積乙醚；3)將加入等體積乙醚的甲型流感病毒懸液于4°C的環(huán)境中放置0. 5-2小時(shí)，并每隔IOmin振搖一次；4)將處理后的甲型流感病毒懸液以2000r/min的速度進(jìn)行10-20min的離心；5)對(duì)離心后的甲型流感病毒懸液進(jìn)行靜止分層，以吸取下層甲型流感病毒懸液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；6)轉(zhuǎn)移后的下層甲型流感病毒懸液置于通風(fēng)環(huán)境中進(jìn)行排醚；7)對(duì)排醚后的下層甲型流感病毒懸液放入低于_18°C的環(huán)境中保存。步驟2 制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物；1)取2支離心管，分別放入羥基化磁性微粒l_15mg ；以3mg為最佳；2)對(duì)羥基化磁性微粒進(jìn)行磁性分離；3)對(duì)分離后的羥基化磁性微粒棄上清，并加入無水乙醇進(jìn)行清洗3次。4)對(duì)無水乙醇清洗后的羥基化磁性微粒再次棄上清，再加入偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行清洗 3次；5)在裝有偶聯(lián)緩沖液清洗過的羥基化磁性微粒的2支離心管中每管加入90μ L偶聯(lián)緩沖液，并在其中一管加入 15mmol/L α-NeuNAc-Q — 3) - β -D-Gal-(1 — 4) -D-GlcNAc 或3，-Sialyllactose(α -NeuNAc-O — 3)- β -D-Gal-(1 — 4)-D-Glc)10-100 μ L，以 10 μ L 為佳，另一管加入 15mmol/L α-NeuNAc-Q — 6)-β-D-Gal-(1 — 4)-D-Glc 10-100 μ L ；以 10 μ L為佳。6)對(duì)2支離心管內(nèi)的羥基化磁性微粒、偶聯(lián)緩沖液、α -NeuNAc-(2 — 3)-β-D-Gal -(1 — 4)-D-GlcNAc、α -NeuNAc-O — 6) - β -D-Gal-(1 — 4)-D_Glc，進(jìn)行混勻；并進(jìn)行 2-10 小時(shí)的振蕩反應(yīng)；得到糖鏈磁性微粒復(fù)合物，以8小時(shí)為佳。7)對(duì)得出的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離；8)對(duì)磁性分離后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物棄上清；并用結(jié)合緩沖液清洗3次；
8
9)對(duì)結(jié)合緩沖液清洗后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物置于保存緩沖液中保存。步驟3 將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合；1)取制備好的兩種糖鏈磁性微粒復(fù)合物分別放入兩個(gè)離心管中；2)在每個(gè)離心管中分別加入200-1000 μ L結(jié)合緩沖液，20-500 μ L初步純化甲型流感病毒液的血凝素和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)對(duì)混合后的結(jié)合緩沖液，流感病毒液和苯甲基磺酞氟進(jìn)行0. 5-2小時(shí)的振蕩反應(yīng)，得到結(jié)合有甲型流感病毒血凝素的糖磁粒蛋白復(fù)合物。步驟4 將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫；1)對(duì)得出的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清，并用清洗液清洗 3 5次；2)將清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物加入洗脫液100-1000 μ L，200 μ L最佳；3)對(duì)加入洗脫液的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行0. l-2h的振蕩反應(yīng)，池最佳；4)對(duì)反應(yīng)后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，獲得上清液，即純化出的甲型流感病毒液血凝素；5)對(duì)純化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的環(huán)境中保存。步驟5 對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定，以獲得甲型流感病毒宿主特異性結(jié)果，即對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定是分別將兩種不同糖鏈磁性微粒復(fù)合物純化得到的甲型流感病毒液血凝素進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯色，從而評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。參見圖1，結(jié)合圖對(duì)該部分進(jìn)一步說明。圖中泳道7 洗脫液洗脫下來與SAa 2_6Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，位置位于 75KD，故可判斷其可以感染人類。圖中泳道4 洗脫液洗脫下來與SAa 2_3Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，位置位于 75KD，故可判斷其可以感染禽類。步驟6 對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行評(píng)估包括以下步驟1)用熒光染料標(biāo)記甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清；幻將標(biāo)記好的甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清與磷酸緩沖液以1 9的比例混合配成抗體溶液；3)將糖鏈磁性微粒復(fù)合物與初步純化的甲型流感病毒血凝素結(jié)合；4)對(duì)結(jié)合甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒復(fù)合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖磁粒蛋白復(fù)合物中加入100_1500μ L的抗體溶液，再經(jīng)振搖反應(yīng)后得到標(biāo)記后的糖磁粒蛋白復(fù)合物；6)對(duì)標(biāo)記后的糖磁粒蛋白復(fù)合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200 μ L清洗過的糖磁粒蛋白復(fù)合物懸液置于玻片上，并進(jìn)行干燥處理；9)如果SAa 2_6Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染人類。10)如果SAa 2_3Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染禽類。
權(quán)利要求
1.一種快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，包括以下步驟 步驟1 對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化；步驟2 制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物；步驟3 將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合； 步驟4 將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫； 步驟5 對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，以評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于 所述步驟1中對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化包括以下步驟；1)取甲型流感病毒懸液；2)在甲型流感病毒懸液中加入等體積分析純乙醚；3)再置于4°C的環(huán)境中0.5-2小時(shí)，并每隔IOmin充分振蕩一次；4)將步驟幻處理后的甲型流感病毒懸液以2000r/min的速度進(jìn)行10-20min的離心；5)對(duì)離心后的甲型流感病毒懸液進(jìn)行靜止分層，吸取下層甲型流感病毒懸液，并轉(zhuǎn)移至另一離心管中；6)將盛有轉(zhuǎn)移后的下層甲型流感病毒懸液的離心管置于通風(fēng)環(huán)境中，直至該甲型流感病毒懸液中的乙醚徹底揮發(fā)；7)將步驟6)處理后的甲型流感病毒懸液置于低于_18°C的環(huán)境中保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于 所述步驟2中制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物包括以下步驟1)取2支離心管，分別放入等量羥基化磁性微粒若干；2)對(duì)羥基化磁性微粒進(jìn)行磁性分離；3)對(duì)分離后的羥基化磁性微粒棄上清，再用無水乙醇清洗；4)對(duì)無水乙醇清洗后的羥基化磁性微粒再次棄上清，再加入偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行清洗；5)在裝有偶聯(lián)緩沖液清洗過的羥基化磁性微粒的2支離心管中，以羥基化磁性微粒的量為參照分別加入20-40 μ L/mg的偶聯(lián)緩沖液；以羥基化磁性微粒的量為參照，再在其中一個(gè)離心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的 SA α 2-3Gal糖鏈；另一個(gè)離心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2_6Gal糖鏈；6)對(duì)2支離心管內(nèi)的羥基化磁性微粒、偶聯(lián)緩沖液以及糖鏈進(jìn)行混勻；并進(jìn)行2-10小時(shí)的振蕩反應(yīng)；得到糖鏈磁性微粒復(fù)合物；7)對(duì)得到的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清；8)并用結(jié)合緩沖液清洗磁性分離后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物；9)清洗完成后，將糖鏈磁性微粒復(fù)合物置于保存緩沖液中保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于所述步驟3中將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合包括以下步驟1)取制備好的上述兩種糖鏈磁性微粒復(fù)合物分別放入另外兩個(gè)離心管中；2)以2mL離心管為例，在每個(gè)離心管中分別加入200-1000μ L結(jié)合緩沖液，20-500 μ L 初步純化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)對(duì)混勻后的溶液進(jìn)行0. 5-2小時(shí)的振蕩反應(yīng)，得到結(jié)合有甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于所述步驟4中將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫包括以下步驟1)對(duì)得出的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清，并用清洗液清洗；2)將清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物加入洗脫液100-1000μ L ；3)對(duì)加入洗脫液的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物進(jìn)行0.l-2h的振蕩反應(yīng)；4)對(duì)反應(yīng)后的糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，獲得上清液，即純化出的甲型流感病毒液血凝素；5)對(duì)純化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的環(huán)境中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于，所述步驟5中對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定具體是分別將兩種不同糖鏈磁性微粒復(fù)合物純化得到的甲型流感病毒液血凝素進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯色， 從而評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于，所述評(píng)估具體是在電泳圖中如果顯示洗脫液洗脫下來與SAa 2_6Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，分子量為75KD左右，故可判斷甲型流感病毒可以感染人類；電泳圖中如果顯示洗脫液洗脫下來與SAa 2_3Gal結(jié)合的蛋白有明顯的條帶，分子量為75KD左右，故可判斷甲型流感病毒可以感染禽類。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于所述步驟5中對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定包括以下步驟1)用熒光染料標(biāo)記甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清；2)將標(biāo)記好的甲型流感病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn)血清與磷酸緩沖液以1 9的比例混合配成抗體溶液；3)將糖鏈磁性微粒復(fù)合物與初步純化的甲型流感病毒血凝素結(jié)合；4)對(duì)結(jié)合甲型流感病毒血凝素的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物中加入100-1500μ L的抗體溶液，再經(jīng)振搖反應(yīng)后得到標(biāo)記后的糖磁粒蛋白復(fù)合物；6)對(duì)標(biāo)記后的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200μ L清洗過的糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物置于玻片上，并進(jìn)行干燥處理；8)將干燥后的玻片放入熒光掃描儀中掃描，從而評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于，所述評(píng)估具體是如果SAa 2_6Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染人類；如果SAa 2_3Gal糖鏈磁性微粒蛋白復(fù)合物顯示有熒光，表明甲型流感病毒可以感染禽類。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，其特征在于所述步驟1中在2支離心管分別放入:3mg的羥基化磁性微粒；所述步驟3與步驟4中的清洗次數(shù)至少為3次。
全文摘要
本發(fā)明涉及快速評(píng)估甲型流感病毒宿主特異性的方法，首先對(duì)甲型流感病毒血凝素進(jìn)行初步純化和制備糖鏈磁性微粒復(fù)合物；再將初步純化后的甲型流感病毒血凝素與糖鏈磁性微粒復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合；再將與糖鏈磁性微粒復(fù)合物結(jié)合的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行洗脫；最后對(duì)洗脫后的甲型流感病毒血凝素進(jìn)行鑒定，以獲得甲型流感病毒宿主特異性結(jié)果，判斷出流感病毒是否感染人。解決常規(guī)檢測(cè)流感病毒手段和檢測(cè)病毒核酸的方法不能完全評(píng)估甲型流感病毒病原的變異和宿主的特異性的技術(shù)問題。具有快速、簡(jiǎn)便、效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102192941SQ201010118950
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者孫宇, 李錚, 杜亞蓉, 楊剛龍, 王秀榮, 祁會(huì)彩, 鄧煒娜 申請(qǐng)人:西北大學(xué)