專利名稱：變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)裝 置，特別是一種變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒及應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS) 是20世紀(jì)80年代中后期出現(xiàn)的一種新傳染性疾病，由豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)弓|起，主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、早 產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等嚴(yán)重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，該病于1987 首先在美國產(chǎn)生，隨后在加拿大，歐州各國和亞州各地迅速流行。我國自1995年年底暴發(fā) 此病，現(xiàn)已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。2006年下半年以來，以江西開始暴發(fā)的 一種被稱為無名"高熱病"的豬病在全國各地廣泛傳播。由于該病來勢(shì)兇猛，不同品種，不 同日齡豬群均可感染發(fā)病死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，據(jù)報(bào)道該疫情主要是由變異型 PRRSV引起的，農(nóng)業(yè)部把該病命名為高致病性豬藍(lán)耳病。目前，繁殖與呼吸綜合征病毒的檢 測(cè)方法有多種，如病毒分離、原位雜交和RT-PCR技術(shù)等，病毒分離和原位雜交雖然有很高 的靈敏度，但操作煩瑣，成本較高，周期較長，并且對(duì)病料的要求較高，不適應(yīng)于臨床PRRSV 的快速診斷；常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方示雖然具有方便、快速和敏感等特點(diǎn)，但RT-PCR需要電泳， 容易EB或分子污染，并且不能進(jìn)行定時(shí)，定量監(jiān)測(cè)等，而熒光定量RT-PCR方法能克服以上 缺點(diǎn)，熒光定量PCR方法是1996年由美國A卯liedBiosystems公司推出的新方法，它通過 在PCR反應(yīng)中加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，它不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR 相比，它更具有定時(shí)、定量、特異性強(qiáng)、有效解決PCR污染問題等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于建立一種變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒 TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)的試劑盒。 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種上述變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man 熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。 本發(fā)明的變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于，該試劑盒包括如下組分構(gòu)成DEPC水，5XAMV buffer, 2. 5mmol/LdNTP， 2. 5翻1/L Mgcl2， 10xPCR Buffer, Nuclease Inhibitor, AMV反轉(zhuǎn)錄酶，LATaqDNA聚合酶， Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探針，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，陰性 對(duì)照品， (1)上下游引物混合物為按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV_VR2332、
4PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)變異株的NSP2序列，用PrimerExpress5. 0 軟件和01igo6. 0軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建質(zhì)粒的 一 對(duì)引物和探針，UP Primer : 5， -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5， -AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3，，目的片段大小 為125bp， (2) TaqMan探針 熒光探針序列5' FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3' (3)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品所述的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按如下方法獲得； (3. 1)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008. 1)變異株
序列基因序列的NSP2段，用01igo6. O軟件設(shè)計(jì)一對(duì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的引物Ul，Up Primer :
5，-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3，，Low Primer :5 ，-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3 ，，目的片段
大小為868bp， (3. 2) RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent說明書進(jìn)行，其RT-PCR反應(yīng)體
系及條件如下RT反應(yīng)體系為lOii L :DEPC水1. 25ii L，5XAMV buffer 2iiL，2.5翻l/L
Mgcl2 1. 0 ii L， 2. 5,1/LdNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， NucleaselnhibitorO. 25 ii L，
AMV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5ii L， RNA模板3. 0 ii L，反應(yīng)程序?yàn)?0°C 10min，42。C lh，99。C 5min。合
成的CDNA置-20"冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為20iiL:無菌水13. 2 y L， 10XPCR
Buffer2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq酶0. 4 ii L， UP、L0W引物各0. 4 ii L，模板2. 0 ii L。反應(yīng)
程序?yàn)?5t:預(yù)變性5min，94t:變性lmin，58. 5"C復(fù)性lmin，72t:延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)，最后
72t:延伸10min， fC保存，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。 (3. 3)按常規(guī)方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、目的片段連接到PMD-18T Vector及轉(zhuǎn)化
到感受態(tài)細(xì)菌DH5a 。 (3.4)陽性克隆鑒定 挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng)，取1. 5ml過夜培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用HindIII與BamHI
進(jìn)行酶切鑒定，將初步鑒定正確的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)培，菌液測(cè)序， (3.5)質(zhì)粒定量 取5iU提取質(zhì)粒稀釋到lml，用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確測(cè)定OD，，然后算出質(zhì) 粒的質(zhì)量及摩爾濃度，再乘以阿拂加德羅常數(shù)，換算成copies/ml，并進(jìn)行IO倍系列稀釋，
作為標(biāo)準(zhǔn)品-7(rc保存， (4)陰性對(duì)照品為生理鹽水 本發(fā)明的變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的 應(yīng)用 (1)將試劑盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10xPCR Buffer, 2. 5mmol/LdNTP，
2. 5umol/LMgcl2， ， Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探針，放置
室溫溶解，T叫Man探針應(yīng)遮光； (2)將上下游引物混合物、探針合成， (3)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系建立， 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系25ul， lOxPCR Buffer 13. 5ul，2. 5mmol/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上下游引物混合物1. 6ul， 10nmol/L探針0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板1. Oul，剩余的為滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25iU，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45個(gè)循環(huán)，
(4)Mg2+、引物、探針濃度優(yōu)化 以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品，將Mg2+濃度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L， 2. 5咖ol/L， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物濃度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探針濃度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分別加入反 應(yīng)體系，采用距陣法優(yōu)選出最佳Mg2+、引物、探針濃度，
(5)熒光定量RT-PCR特異性測(cè)定 在相同條件下，分別提取豬瘟(CSFV)、普通豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)、胃腸炎
(TEG)病毒的RNA和圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢
測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性， (6)熒光定量RT-PCR敏感性測(cè)定 分別以10倍系列稀釋(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷貝/UL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和按 TCID5。進(jìn)行倍比稀釋變異型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA為 模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的敏感性，
(7)重復(fù)性測(cè)定 對(duì)3份不同病毒含量的樣品以及3份分別保存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品， 做5個(gè)重復(fù)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，
(8)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程式建立 將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。 為了更進(jìn)一步的說明本發(fā)明，下面以實(shí)驗(yàn)為例，說明了變異型豬繁殖與呼吸綜合 征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的制備及應(yīng)用。
1材料與方法
1. 1病毒與細(xì)胞 PRRSV-06A株、PRRSV-FJ04a株、CSFV、 PRV、 PCV2、 TEGV及Marc-145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn) 室保存。 1. 2試劑和儀器 LATaqDNA聚合酶、HindIII、 BamHI內(nèi)切酶、dNTP、 pMD18-TVector， DNA凝膠回收試 劑盒，質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自TaKaRa(大連)公司，定量PCR八聯(lián)管購自BIO-RAD公司。 大腸埃希氏工程菌DH5a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。普通PCR儀為ABI公司2720，核酸測(cè)定儀為 E卯endorf BIO phorometer，熒光定量PCR擴(kuò)增儀為Eppendorf AG 22331、引物和探針均由 TaKaRa(大連)公司合成。 1. 3熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒品的構(gòu)建
1.3. 1引物設(shè)計(jì)與合成 按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)變異株 序列基因序列的nsp2段，用01igo6. 0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的引物Ul，UpPrimer : 5，-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3，，Low Primer :5，-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG_3，，目的片段 大小為868bp。
1. 3. 2RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按照Invitrogen TRIzol Reagent說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 體系為lOii L :無RNase水1. 25ii L，5XAMV buffer 2 ii L， MgC12 (25mmol L—0 1. 0 ii L， dNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， Nuclease InhibitorO. 25 ii L， AMV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 ii L，模板 RNA3. 0 ii L。反應(yīng)程序?yàn)?0°C lOmin， 42°C lh， 99°C 5min，合成的cDNA，置-4(TC冰箱保存?zhèn)?用。PCR反應(yīng)體系為20ii L :無菌水13. 2ii L， 10XPCR Buf f er2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq 酶0. 4 ii L，上、下游引物各0. 4 ii L，模板2. 0 ii L。反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性5min， 94。C變性 lmin，58. 5。C復(fù)性lmin，72。C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10min，4。C保存，對(duì)PCR產(chǎn) 物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
1.3. 3擴(kuò)增產(chǎn)物回收 產(chǎn)物回收按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。具體過程如下根據(jù)目的基因的大小， 切下目的條帶；裝入滅過菌的1.5mlEP管，稱重，計(jì)算膠的總體積；加入等體積的Binding Buffer,于55 65t:的水中溫育，直至膠完全熔化；全部溶液轉(zhuǎn)入結(jié)合柱，10000rpm，室溫 離心lmin ;棄流出液，加入300ii 1 BindingBuffer， 10000rpm，室溫離心lmin ;棄流出液，加 700iUSPW Buffer,室溫下靜置2 3min， 10000rpm，室溫離心lmin ;棄流出液，空柱子再 10000rpm，室溫離心lmin ;將柱子裝入滅過菌的1. 5mlEP管中，加30 50 yl無菌去離子 水，10000rpm，室溫離心lmin ;純化的目的片斷，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.3.4目的片段連接轉(zhuǎn)化 使用PMD-18T Vector連接試劑盒進(jìn)行連接，體系為PCR膠回收產(chǎn)物4. 5 iU， Solutionl 5iU，pMD-18T 0. 5 yl， 16。C過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 a ，取10 yl菌 液，涂布于含氨芐青霉素(Amp)抗性的LB瓊脂平皿上，37t:倒置培養(yǎng)18h。
1. 3. 5陽性克隆鑒定 挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng)，取1. 5ml過夜培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用HindIII與BamHI 進(jìn)行酶切鑒定，將初步鑒定正確的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)培，菌液送TaKaRa(大連)公司測(cè)序。
1.3. 6質(zhì)粒定量 取5 iU提取質(zhì)粒稀釋到lml，用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確測(cè)定0D26。(連續(xù)測(cè)定3 次，每次重復(fù)4管，取平均值)，然后算出質(zhì)粒的質(zhì)量及摩爾濃度，再乘以阿拂加德羅常數(shù)， 換算成copies/ml，并進(jìn)行10倍系列稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品-7(TC保存。
1. 4熒光定量PCR檢測(cè)方法建立
1.4. l引物、探針合成 按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332、 PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06(EF641008. 1)變異株NSP2序列，用Primer Express5. 0軟件禾口 01igo6. 0 軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建質(zhì)粒的 一 對(duì)引物和探針，UP Pr imer : 5' -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5'-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3'，目的片段大小為125bp，熒光探針序列5'FAM-CCGC GTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA3'
1. 4. 2熒光定量PCR反應(yīng)體系建立 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系25ul， 10xPCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上游和下游引物混合物1. 6ul， 10nmol/L探針0. 8ul， LATaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的為滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25iU，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，然后94°C 10s，55°C 20s，70。C 20s，共45個(gè)循環(huán)。
1.4. 3Mg"、引物、探針濃度優(yōu)化 以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品，將Mg2+濃度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L， 2. 5咖ol/L， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物濃度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探針濃度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分別加入反 應(yīng)體系，采用距陣法優(yōu)選出最佳Mg2+、引物、探針濃度。
1. 4. 3熒光定量RT-PCR特異性測(cè)定 在相同條件下，分別提取豬瘟(CSFV)、普通豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)、胃腸炎
(TEG)病毒的RNA和圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢
測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。 1. 4. 4熒光定量RT-PCR敏感性測(cè)定 分別以10倍系列稀釋(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷貝/UL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和按 TCID5。進(jìn)行倍比稀釋變異型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA為 模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的敏感性。
1. 4. 5重復(fù)性測(cè)定 對(duì)3份不同病毒含量的樣品以及3份分別保存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品，
做5個(gè)重復(fù)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)。 1.4. 6標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程式建立 將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
1. 4. 7臨床樣品檢驗(yàn) 對(duì)福建省于2008-2009年度送檢疑是"高熱病"病料進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，被測(cè)的22份 樣品分別進(jìn)行熒光定量RT-PCR、常規(guī)RT-PCR和病毒分離，并比較三者的檢查結(jié)果。
2結(jié)果 2. 1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒品的構(gòu)建 用RT-PCR擴(kuò)增PRRSV的NSP2片段，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的
目的片段大小與預(yù)期值S68bp相符合。經(jīng)膠回收的PCR電泳產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)
化DH5 a ，獲得重組質(zhì)粒，HindIII和BamHI雙酶切初步鑒定，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)為變異型PRRSV。
取5iU質(zhì)粒稀釋到lml，連續(xù)測(cè)定3次，得到重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度，取平均值換算成拷貝數(shù)
濃度為2. 64*1012copies/ml。 2. 2熒光定量RT-PCR方法建立 2. 2. 1Mg"、引物、探針濃度優(yōu)化 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mg"的最佳反應(yīng)濃度為2.5umol/L(圖1);引物的最佳反應(yīng)濃度為 32. 0翻1/L，(圖2);探針最佳反應(yīng)濃度為3. 2翻1/L(圖3)。
2. 2. 2特異性測(cè)定 分別對(duì)豬瘟(CSFV)、普通PRRSV、胃腸炎(TEG)病毒的RNA和圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂 犬病毒(PRV)的DNA，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果只有變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)檢測(cè)呈陽性(圖4)。
2. 2. 3敏感性測(cè)定
2. 2. 3. 1將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 6扭l(Tcopies/ uL-2. 6扭10^opies/uL)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從圖5可見該方法可以檢測(cè)到 264個(gè)拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。 2. 2. 3. 2將培養(yǎng)的PRRSV按總TCID5。進(jìn)行倍比稀釋后提取RNA，稀釋濃度分別從 5623TCID5。到0. 0523TCID5。，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果該方法可以檢測(cè)到0. 5623 TCID5。 病毒量，比常規(guī)RT-PCR敏感10倍(圖6)。
2. 3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，自動(dòng)生成起始 模板數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(圖8)。
2. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和回歸方程設(shè)定 用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得出了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率為_3.319，截距為48.8，從 而可以得出拷貝數(shù)(Copy皿mber)與循環(huán)閾值(Ct)之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式Ct =-3. 319Copynumber+48. 8，而待測(cè)樣品的Ct值可以從儀器中讀??；把待測(cè)樣品的Ct值代 入表達(dá)式就可以算出它的初始拷貝數(shù)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)看出，起始模板濃度與Ct值之 間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2 = 0. 988。表明該試驗(yàn)誤差較小，該標(biāo)準(zhǔn)樣品為熒光定量 的標(biāo)準(zhǔn)品是合格的。
2. 5重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)3份不同病毒含量的樣品以及3份分別保存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品， 做5個(gè)重復(fù)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明差異不顯著，該方法重復(fù)性好。
2. 6臨床送檢樣品檢測(cè) 對(duì)福建省于2008-2009年度送檢22份疑似為高致病性豬藍(lán)耳病的樣品分別進(jìn)行 熒光定量RT-PCR、常規(guī)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)及病毒分離比較檢測(cè)，結(jié)果表明熒光定量RT-PCR 檢測(cè)出了 8份陽性，陽性率為36. 4%;常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出7份陽性，陽性率為31. 8%;分離 到了6株病毒，分離率為27.3%。 綜上所述，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn) PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的病毒，具有廣泛的抗原變異和毒力變化 的能力。其核酸序列中最保守的區(qū)域是在ORFlb和0RF7序列，而在基因組ORFla的Nsp2、 0RF3、0RF4、0RF5是比較容易發(fā)生變異的區(qū)域，目前流行的變異性PRRSV其基因變異最明顯 的地方就是在ORFla的Nsp2區(qū)域內(nèi)發(fā)生了 2段基因缺失， 一共缺失了 90個(gè)堿基即30AA，其 中僅在一段基因序列中就連續(xù)缺失了 87個(gè)堿基即29AA，另外在一段連續(xù)缺失了 3個(gè)堿基 即1AA。本研究是通過對(duì)多株變異性PRRSV、PRRSV-VR233及PRRSV-FJ04a的基因分析和序 列對(duì)比，在發(fā)生基因缺失的ORFla的Nsp2區(qū)域兩端設(shè)計(jì)了 1對(duì)引物，并在基因缺失處設(shè)計(jì) 探針，該探針長度為26個(gè)bp，其中前16個(gè)堿基對(duì)于普通PRRSV來說位于缺失位置前，而后 ll個(gè)堿基位于缺失位置后，因此該探針不能與普通PRRSV結(jié)合，致使普通PRRSV不能被檢測(cè) 到，保證其檢測(cè)變異型PRRSV的特異性。研究表明，通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，特異性和敏感 性檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒品的構(gòu)建，我們建立了特異性強(qiáng)、敏感性高的T叫Man熒光定量RT-PCR方 法。本方法與韋天超、徐輝等針對(duì)PRRSV的0RF7基因、范忠軍針對(duì)PRRSV的0RF6基因、魯 韋韋針對(duì)未變異PRRSV的0RF1和0RF6設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和探針檢測(cè)PRRSV的方法不同，他們建立的方法是區(qū)分不出PRRSV是否出現(xiàn)變異，而本方法可以檢測(cè)出變異型PPRSV，檢測(cè)不出 普通的PRRSV，從而區(qū)分出了 PRRSV是否出現(xiàn)變異。由于該方法具有快速、準(zhǔn)確及敏感性高 的特點(diǎn)，同時(shí)能夠檢測(cè)出豬體內(nèi)微量的病毒，因此也適合于豬群早期感染變異型PRRSV的 檢測(cè)，對(duì)豬群潛伏期是否感染變異型PRRSV的診斷及防治具有重大意義。
根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR定量方法大致可分兩類絕對(duì)定量和相對(duì)定量，絕對(duì)定量要求 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，一般用拷貝數(shù)報(bào)告結(jié)果，常用于病毒載量的檢測(cè)；標(biāo)準(zhǔn)品也可用于相對(duì)定量， 常用于基因表達(dá)差異的比較。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性首先取決于合格標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu) 建。質(zhì)粒DNA、體外逆轉(zhuǎn)錄的RNA及純化的dsDNA都可以作為標(biāo)準(zhǔn)品用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但 是無論是體外轉(zhuǎn)錄的RNA還是dsDNA用作標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)其穩(wěn)定性與重復(fù)性都不及 質(zhì)粒DNA[15]。如果用cDNA、 PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，雖然制備簡(jiǎn)單易于保存，但是將會(huì)因?yàn)?標(biāo)準(zhǔn)品無法準(zhǔn)確指示樣品反轉(zhuǎn)錄效率，而給最終定量起始拷貝數(shù)帶來影響。因此，構(gòu)建好的 質(zhì)粒DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。本研究通過RT-PCR擴(kuò)增 出目的基因片段，T-A克隆獲得預(yù)期的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線有較大的線性范圍 (6. 24*109copies/uL-6. 24*103copies/uL)。經(jīng)應(yīng)用研究表明，該方法制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 品可以長期穩(wěn)定保存，有效克服了直接提取PRRSV的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品容易降解的問題，保證 了較為可靠的定量結(jié)果，適用于對(duì)變異性PRRSV的定時(shí)、定量檢測(cè)。 對(duì)臨床樣品比較檢驗(yàn)結(jié)果可知熒光定量RT-PCR方法檢出的陽性率最高為 36. 4% ，其次為常規(guī)RT-PCR方法檢出陽性率為31.8%，而病毒分離檢測(cè)率最低為27. 3% ， 但RT-PCR與病毒分離方法檢測(cè)出來的陽性樣品與熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)出來的符合率 為100%。出現(xiàn)T叫Man熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)出來陽性率最高這種現(xiàn)象，申請(qǐng)人認(rèn)為 是因?yàn)門叫Man熒光定量RT-PCR方法具有比其他檢測(cè)方法敏感性高的緣故，雖然病毒分離 敏感性也高，但可能由于某些樣品保存或凍融過程中，病毒喪失了感染細(xì)胞的能力，使病毒 分離結(jié)果呈陰性。綜合上述病料來源發(fā)病豬的臨床癥狀、病理變化及防治效果判斷，熒光定 量RT-PCR方法最為準(zhǔn)確可靠，能夠檢測(cè)出亞臨床或潛伏感染豬群，適合于豬群感染變異型 PRRSV的早、中、晚期的診斷，對(duì)及時(shí)有效地防治高致病性PRRSV發(fā)生有重要意義。


圖1是Mg2+的最佳反應(yīng)濃度選擇示意圖 圖2是引物反應(yīng)濃度優(yōu)化示意圖， 圖3是探針濃度優(yōu)化示意圖
圖4是熒光定量RT-PCR方法的特異性測(cè)定示意圖 RT-PCR方法的敏感性測(cè)定示意圖 RT-PCR方法的敏感性示意圖 RT-PCR方法的動(dòng)力學(xué)曲線示意圖 RT-PCR檢測(cè)PRRSV的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖





圖5是熒光定3 圖6是熒光定3 圖7是熒光定3 圖8是熒光定具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1
本發(fā)明的變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒。包括如下組分構(gòu)成DEPC水，5XAMV buffer, 2. 5mM/L dNTP， 2. 5umol/LMgcl2， 10xPCR Buffer, Nuclease Inhibitor, AMV反轉(zhuǎn)錄酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT) 18， lOOnmol/L 引物混合物，10nmol/LT叫Man探針，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品(生理鹽水)，
(1)上下游引物混合物為按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV_VR2332、 PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)變異株的nsp2序歹lj，用PrimerExpress5. 0 軟件和01igo6. 0軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建質(zhì)粒的 一 對(duì)引物和探針，UP Primer : 5， -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5， -AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3，，目的片段大小 為125bp， (2)TaqMan探針 熒光探針序列5' FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3' (3)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品所述的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按如下方法獲得； (3. 1)GenBankBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332及PRRSV_JXwn06 (EF641008. 1)
變異株序列基因序列的的NSP2段，用01igo6. 0軟件設(shè)計(jì) 一 對(duì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品
質(zhì)粒的引物Ul， UpPrimer :5' -GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3'， Low Primer:
5， -ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3，，目的片段大小為868bp， 1. 3. 2RNA提取及RT-PCR (3. 2) RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent說明書進(jìn)行，其RT-PCR反應(yīng)體 系及條件如下RT反應(yīng)體系為lOii L :DEPC水1. 25ii L，5XAMV buffer 2iiL，2.5翻l/L Mgcl2 1. 0 ii L， 2. 5,1/LdNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， NucleaselnhibitorO. 25 ii L， AMV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 ii L， RNA模板3. 0 ii L，反應(yīng)程序?yàn)?0 °C lOmin， 42 °C lh， 99 °C 5min。 合成的CDNA置-20 °C冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為20 ii L :無菌水13. 2 y L， 10XPCRBuffer2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq酶0. 4 ii L， UP、 LOW引物各0. 4 ii L，模板 2. Oil L。反應(yīng)程序?yàn)?5t:預(yù)變性5min，94t:變性lmin，58. 5。C復(fù)性lmin，72。C延伸lmin，35 個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸10min， fC保存，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
(3. 3)按常規(guī)方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、目的片段連接到PMD-18T Vector及轉(zhuǎn)化 到感受態(tài)細(xì)菌DH5a 。
(3.4)陽性克隆鑒定 挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng)，取1. 5ml過夜培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用HindIII與BamHI
進(jìn)行酶切鑒定，將初步鑒定正確的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)培，菌液測(cè)序， (3.5)質(zhì)粒定量 取5iU提取質(zhì)粒稀釋到lml，用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確測(cè)定OD，，然后算出質(zhì) 粒的質(zhì)量及摩爾濃度，再乘以阿拂加德羅常數(shù)，換算成copies/ml，并進(jìn)行IO倍系列稀釋，
作為標(biāo)準(zhǔn)品-7(rc保存， (4)陰性對(duì)照品為生理鹽水。 本實(shí)施例未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同 實(shí)施例2 本發(fā)明的變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用(l).將試劑盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10xPCR Buffer, 2. 5mmol/L dNTP，
2. 5翻1/L Mgcl2， ，Oligo(dT) 18， 100nmol/L引物混合物，10nmol/LTaqMan探針，放置室溫 溶解； (2)將引物混合物、探針合成，
(3)熒光定量PCR反應(yīng)體系建立， 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系25ul， lOxPCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上游和下游引物各0. 8ul， 10nmol/L探針0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的為滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25iU，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45個(gè)循環(huán)，
(4)Mg"、引物、探針濃度優(yōu)化 以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品，將Mg"濃度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L，2. 5咖ol/L，
3. 5umol/L ;上下流引物混合引物濃度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. 0nmo1/ L ;探針濃度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分別加入 反應(yīng)體系，采用距陣法優(yōu)選出最佳Mg2+、引物、探針濃度， (5)熒光定量RT-PCR特異性測(cè)定 在相同條件下，分別提取豬瘟(CSFV)、普通豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)、胃腸炎
(TEG)病毒的RNA和圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢
測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性， (6)熒光定量RT-PCR敏感性測(cè)定 分別以10倍系列稀釋(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷貝/UL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和按 TCID5。進(jìn)行倍比稀釋變異型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA為 模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的敏感性，
(7)重復(fù)性測(cè)定 對(duì)3份不同病毒含量的樣品以及3份分別保存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品， 做5個(gè)重復(fù)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，
(8)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程式建立 將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，
本實(shí)施例未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同。
1權(quán)利要求
變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下組分構(gòu)成DEPC水，5×AMV buffer，2.5mM/L dNTP，2.5umol/L Mgcl2，10x PCR Buffer，Nuclease Inhibitor，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT)18，100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探針，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，(1)上下游引物混合物為按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332、PRRSV-FJ04a、PRRSV-JXwn06(EF641008.1)變異株的NSP2序列，用PrimerExpress5.0軟件和Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建質(zhì)粒的一對(duì)引物和探針，UPPrimer5’-AGCTGATGACACCTTTGAGT-3’LOW Primer5’-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3’，目的片段大小為125bp，(2)TaqMan探針熒光探針序列5’FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3’(3)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品所述的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按如下方法獲得；(3.1)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008.1)變異株序列基因序列的NSP2段，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的引物U1，UpPrimer5’-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3’，Low Primer5’-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3’，目的片段大小為868bp，(3.2)RNA提取及RT-PCR病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent說明書進(jìn)行，其RT-PCR反應(yīng)體系及條件如下RT反應(yīng)體系為10μLDEPC水1.25μL，5×AMV buffer 2μL，2.5umol/L Mgcl2 1.0μL，2.5mmol/LdNTP1.0μL，Oligo(dT)18 1μL，NucleaseInhibitor0.25μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，RNA模板3.0μL，反應(yīng)程序?yàn)?0℃10min，42℃1h，99℃5min。合成的CDNA置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為20μL無菌水13.2μL，10×PCR Buffer2.0μL，dNTP 1.6μL，LA-Taq酶0.4μL，UP、LOW引物各0.4μL，模板2.0μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，58.5℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。(3.3)按常規(guī)方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、目的片段連接到PMD-18T Vector及轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌DH5α。(3.4)陽性克隆鑒定挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng)，取1.5ml過夜培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用HindIII與BamHI進(jìn)行酶切鑒定，將初步鑒定正確的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)培，菌液測(cè)序，(3.5)質(zhì)粒定量取5μl提取質(zhì)粒稀釋到1ml，用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確測(cè)定OD260，然后算出質(zhì)粒的質(zhì)量及摩爾濃度，再乘以阿拂加德羅常數(shù)，換算成copies/ml，并進(jìn)行10倍系列稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品-70℃保存。
2. —種變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒T叫Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng) 用，其特征在于Q).將試劑盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10x PCRBuffer， 2. 5mmol/L dNTP，2. 5umol/L Mgcl2， Nuclease Inhibitor, Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物， 10nmol/LTaqMan探針，放置室溫溶解，TaqMan探針應(yīng)遮光；(2) 將上、下游引物混合物、探針合成，(3) 熒光定量PCR反應(yīng)體系建立，熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系25ul， 10x PCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 10Onmol/L上下游引物混合物1. 6ul， 1Onmol/L探針0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的為滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25iU，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45個(gè)循環(huán)，(4) Mg2+、引物、探針濃度優(yōu)化以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品，將Mg2+濃度配制成1 0咖o 1 /L ， 1 5咖o 1 /L ， 2 5咖o 1 /L ， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物濃度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探針濃度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分別加入反 應(yīng)體系，采用距陣法優(yōu)選出最佳Mg2+、引物、探針濃度，(5) 熒光定量RT-PCR特異性測(cè)定在相同條件下，分別提取豬瘟CSFV、普通豬繁殖與呼吸綜合征PRRSV、胃腸炎TEG病毒 的RNA和圓環(huán)病毒PCV、偽狂犬病毒PRV病毒的DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法 的特異性，(6) 熒光定量RT-PCR敏感性測(cè)定分別以10倍系列稀釋(6. 24X 109 6. 24X 102拷貝/UL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和按TCID5。進(jìn) 行倍比稀釋變異型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA為模板，進(jìn) 行熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的敏感性，(7) 重復(fù)性測(cè)定對(duì)3份不同病毒含量的樣品以及3份分別保存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)品，做5 個(gè)重復(fù)的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，(8) 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程式建立將重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍系列稀釋品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)，各取 1 ii 1作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，本發(fā)明參照GenBank的變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV與普通PRRSV的NSP2段基因序列，設(shè)計(jì)并合成了引物和TaqMan探針。通過對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒品構(gòu)建，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR診斷變異型PRRSV方法。結(jié)果表明，該方法具有特異性強(qiáng)，敏感性高等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)出264個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒品，0.5623TICD50的病毒量，比RT-PCR敏感10倍。對(duì)22份病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有8份為陽性，陽性率為36.4％。由于該方法具有定量、快速、準(zhǔn)確、敏感等優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)豬群感染變異型PRRSV早、中、晚期的診斷，對(duì)有效診斷及防治高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)生起到重要作用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101736094SQ20101012080
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者周倫江, 莊向生, 王隆柏, 車勇良, 陳如敬, 魏宏 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所;周倫江;王隆柏;莊向生;魏宏;陳如敬;車勇良