專利名稱：電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌變的檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種電磁輻射致癌性的檢測方法，尤其是電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌 變的檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著科學技術(shù)的飛速發(fā)展，電磁技術(shù)已經(jīng)成為工業(yè)、醫(yī)療、通訊等領域中不可或缺 的重要工具之一。電磁技術(shù)在方便人們?nèi)粘Ｉ畹耐瑫r，對人體的影響也受到越來越多的 關注。電磁波可以透入生物體，并與生物組織發(fā)生相互作用，導致不同生物層次上的形態(tài)、 結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，甚至誘發(fā)癌癥。如何預防或減少電磁輻射對人體的傷害，已日益成為 生命科學、環(huán)境科學和醫(yī)療衛(wèi)生領域的研究熱點。通過對電磁輻射的生物效應進行深入研 究，目前已經(jīng)提出了多種作用機理的模型、假說和理論。1982年美國政府制訂了一套基于熱 效應的射頻輻射標準，用比吸收率(Specific Absorption Rate, SAR，單位為W/kg)值來衡 量電磁輻射的熱效應，該標準逐漸被全世界所接收并沿用至今。但是，越來越多的現(xiàn)象表明 僅僅用SAR值來衡量電磁輻射對人體的影響是不夠的，因為長期的電磁輻射給人體造成一 系列的健康問題無法用熱效應解釋和評價。于是，大量研究嘗試分析其它一些參數(shù)指標來 確定電磁輻射的危害。 Leszczynski等人(D丄eszczynski， et al. Differentiation. 2002， 70 :120 129)研究了電磁輻射對人內(nèi)皮細胞的影響，發(fā)現(xiàn)能引起熱休克蛋白27(HSP27)的短暫磷 酸化，并能激活多種細胞信號轉(zhuǎn)換路徑，并提出電磁輻射誘導的HSP27活化能阻止細胞 色素C的凋亡路徑，從而導致腦瘤的發(fā)生。Di carlo等人(A.DiCarlo， et al. J. Cell. Biochem. 2002,84 :447 454)用功率為3. 5mW的電磁輻射對雞胚胎進行每日30 60分鐘 的輻射，連續(xù)輻射4天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比熱休克蛋白70(HSP70)水平下降了 27%，從 而胚胎防御缺氧應激的能力降低，提示長期暴露于電磁輻射會由于HSP70水平降低而導致 細胞自我保護能力降低，從而增加發(fā)生腫瘤的可能性。Kramarenko等人(A. V. Kramarenko， et al. Int. J. Neurosci. 2003， 113 :1007 1019)研究了高頻電磁輻射對人腦電圖的影響， 發(fā)現(xiàn)用手機照射人腦后，在顳骨部位出現(xiàn)2. 5 6. 0Hz的慢波，每15 20秒出現(xiàn)一次，持續(xù) 約1秒；在兒童中有類似的發(fā)現(xiàn)，但慢波出現(xiàn)較早、振幅較大、持續(xù)時間長且間隔短，表明手 機輻射會影響人的大腦，而且可能更容易對兒童大腦造成損傷。然而，并非所有實驗都證明 電磁輻射會對人體的正常生理指標產(chǎn)生影響。比如在Tahvanainen等人(K. Tahvanainen， et al. Bioelectromagnetics. 2004,25 :73 83)的研究中，他們用900MHz和1800MHz的 手機輻射作用于志愿者35分鐘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈血壓和心率與對照組沒有顯著差異。
以上這些研究由于受到實驗條件的限制，不能確定長期的電磁輻射所造成的危害 及程度，特別是不能對電磁輻射的致癌作用進行評價。由于在實驗研究中利用不同的生物 學體系，如不同的細胞或動物亞型及生物體處于不同的生理狀態(tài)等個體差異，或使用不同 的輻射裝置、實驗程序等分析電磁輻射的生物學后果，有的甚至得出相反的結(jié)論，從而對確 定電磁輻射的致癌作用帶來了困難。因此，目前亟需一種可靠的方法來定量地檢測電磁輻射的致癌性。 Raji細胞是一種淋巴瘤細胞系，常用于致癌劑和促癌劑的檢測。Raji細胞攜帶 Epstein-Barr(EB)病毒基因，EB病毒與許多惡性淋巴瘤和上皮性惡性腫瘤有關，其中尤以 與Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌的關系最為密切。正常情況下，EB病毒在Raji細胞中處于潛 伏狀態(tài)，不能自發(fā)地產(chǎn)生EB病毒增殖后期的抗原和病毒粒子。但當Raji細胞被激活時，EB 病毒的早期抗原被激發(fā)，其表達會增加。到目前為止，利用Raji細胞的這一特性檢測電磁 輻射誘發(fā)細胞癌變的方法尚未見國內(nèi)外文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、重復性好的電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌變的 檢測方法。 本發(fā)明所提供的一種電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌變的檢測方法，包括以下步驟
(l)Raji細胞的培養(yǎng)與傳代 將Raji細胞在37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)并進行傳代， RPMI-1640培養(yǎng)液含有10%小牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素、1%谷胺酰胺； [OOW] (2)暴露實驗 將Raji細胞中加入促癌劑丁酸鈉、巴豆油、12-0-十四烷酰巴豆醇-13_乙酸酯 (12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate， TPA)或丁酸鈉+巴豆油，用RPMI-1640培養(yǎng) 液培養(yǎng)，將裝有Raji細胞的培養(yǎng)板置于橫電磁波傳輸小室(TransverseElectromagnetic Transmission Cell,簡稱TEM小室)中，再將TEM小室置于5% C02培養(yǎng)箱中，同時，將Raji 細胞暴露于功率密度為30 90W/m2的電磁輻射下，設定培養(yǎng)箱溫度為36. 5。C，每天輻射2 小時，培養(yǎng)3 15天；
(3)免疫酶檢測 將上述細胞離心、涂片、晾干、固定處理后，滴加鼻咽癌患者陽性血清，并在37t:培
養(yǎng)箱中培養(yǎng)40分鐘，取出后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗干凈，晾干，加辣根過氧化物酶標 記的羊抗人免疫球蛋白A進行酶標，并在37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40分鐘，然后放入酶底物溶液 中5 10分鐘，最后用PBS沖洗干凈后鏡檢。 上述步驟(1)中的促癌劑優(yōu)選12-0-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯。 上述步驟(3)中的磷酸鹽緩沖溶液含有NaCl 8. Og/L，KCl 0. 2g/L， Na2HP04l. 44g/
L， KH2P040 . 24g/L， pH 7. 4。 上述步驟(3)中的酶底物溶液含有3，3'-二氨基聯(lián)苯胺0.5g/L，三羥甲基氨基甲 烷鹽酸鹽(Tris-HCl)O. 05mol/L，0. 003% H202， pH 7. 6。 本發(fā)明方法以Raji細胞作為抗原靶細胞，經(jīng)過電磁波照射后，再用免疫酶法檢測 Raji細胞中EB病毒早期抗原(Epstein-Barr virus early antigen, EBV-EA)的表達。
本發(fā)明方法中的促癌劑丁酸鈉、巴豆油和TPA 可以激活類淋巴細胞內(nèi)潛伏狀態(tài) 的EB病毒，誘發(fā)Raji細胞中EBV-EA的表達。 本發(fā)明將Raji細胞作為體應用于檢測電磁輻射的致癌作用，使用免疫酶法對陽 性細胞進行檢測，了一種通過檢測Raji細胞中的EBV-EA來檢測電磁輻射致癌性的方法，無 需特，檢測過程簡單。
本發(fā)明方法可以應用于工業(yè)、科學、醫(yī)療以及日常生活中電磁輻射的致癌性預評 價，這將對預防電磁輻射對人體健康的期危害具有重要價值。
具體實方
實1 (l)Raji細胞的培養(yǎng)與傳代 將Raji細胞在37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，當細胞生長增殖 形成單層細胞后，小心吸出培養(yǎng)液，再加入的培養(yǎng)液，用吸將細胞成單細胞液，然后將細胞 液吸出分裝至3個培養(yǎng)中，放入C02培養(yǎng)箱中續(xù)培養(yǎng)；
(2)暴露實驗 在Raji細胞培養(yǎng)板上加入度為500ng/m 丁酸鈉，用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將裝 有Raji細胞的培養(yǎng)板放入TEM中，再將TEM置于5% C02培養(yǎng)箱中，同時，將Raji細胞暴 露于功率密度為30W/m2的電磁輻射下，設定培養(yǎng)箱溫度為36. 5t:，每天輻射2小時，培養(yǎng)3 天，電磁輻射由Agilent 8648C信號產(chǎn)生，經(jīng)20W功率放大放大，電磁輻射度由Narda制；
(3)免疫酶檢測 將對照組和實驗組細胞離心后，重細胞并細胞數(shù)，取lOOuL細胞涂片，晾干，然后 用預的在4t:箱中固定15分鐘，晾干，滴加鼻咽癌患者陽性血清，將涂片放入，在37t:培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)40分鐘，取出后用PBS沖洗干凈，晾干，加辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋 白A (，經(jīng)科化學試劑)進行酶標后放入，在37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40分鐘，取出，再用PBS沖洗 干凈，將涂片放入lOOmL酶底物溶液中5 10分鐘，最后用PBS沖洗干凈后鏡檢，并數(shù)500 個細胞中出現(xiàn)的陽性細胞數(shù)。 免疫酶檢測EBV-EA細胞陽性率為4. 2% 。
實2 步驟(2)中使用度為500ng/mL巴豆油，其它步驟同實1。免疫酶檢測EBV-EA細胞 陽性率為5.7%。
性率為8.1%。
實3
步驟(2)中使用度為500ng/mL TPA，其它步驟同實1。免疫酶檢測EBV-EA細胞陽
免疫酶檢》:
7. 6%。

9. 3%。

14. 2%
實4
步驟(2)中使用度為500ng/mL 丁酸鈉+度為500ng/mL巴豆油，其它步驟同實1。
EBV-EA細胞陽性率為6. 9%。 實5
步驟(2)中培養(yǎng)時間為15天，其它步驟同實1。免疫酶檢測EBV-EA細胞陽性率為 實6
步驟(2)中培養(yǎng)時間為15天，其它步驟同實2。免疫酶檢測EBV-EA細胞陽性率為
實7
步驟(2)中培養(yǎng)時間為15天，其它步 同實3。免疫酶檢測EBV-EA細胞陽性率為
實8 步驟(2)中培養(yǎng)時間為15天，其它步驟同實4。免疫酶檢測EBV-EA細胞陽性率為 12. 7%。
權(quán)利要求
一種電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌變的檢測方法，包括以下步驟(1)Raji細胞的培養(yǎng)與傳代將Raji細胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)并進行傳代，RPMI-1640培養(yǎng)液含有10％小牛血清、1％青霉素、1％鏈霉素、1％谷胺酰胺；(2)暴露實驗將Raji細胞中加入促癌劑丁酸鈉、巴豆油、12-O-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯或丁酸鈉+巴豆油，用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將裝有Raji細胞的培養(yǎng)板置于橫電磁波傳輸小室中，再將該小室置于5％CO2培養(yǎng)箱中，同時，將Raji細胞暴露于功率密度為30～90W/m2的電磁輻射下，設定培養(yǎng)箱溫度為36.5℃，每天輻射2小時，培養(yǎng)3～15天；(3)免疫酶檢測將經(jīng)過電磁輻射的Raji細胞離心、涂片、晾干、固定處理后，滴加鼻咽癌患者陽性血清，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40分鐘，取出后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈，晾干，加辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白A進行酶標，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40分鐘，然后放入酶底物溶液中5～10分鐘，最后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈后鏡檢。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于促癌劑為12-0-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電磁輻射誘發(fā)Raji細胞癌變的檢測方法。該方法首先培養(yǎng)Raji細胞并傳代，然后加入促癌劑丁酸鈉、巴豆油、12-O-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯或丁酸鈉+巴豆油，暴露于30～90W/m2的電磁輻射下，培養(yǎng)3～15天，最后用免疫酶法檢測EBV-EA細胞陽性率。本發(fā)明方法中的促癌劑可以提高檢測的靈敏性。該方法無需特殊儀器，檢測過程簡單。本發(fā)明方法可以應用于工業(yè)、科學、醫(yī)療以及日常生活中電磁輻射的致癌性風險預評價，對預防電磁輻射對人體健康的遠期危害具有重要價值。
文檔編號G01N33/53GK101782576SQ20101012336
公開日2010年7月21日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者崔亞松, 曾毅, 趙麗嬌, 鐘儒剛 申請人:北京工業(yè)大學