專利名稱：：一種快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥生產質量監(jiān)控方法，更具體地說是一種快速測定丹參提取液中鞣質含量的紫外光譜檢測方法。
背景技術：
：鞣質是中藥材中廣泛存在的一類水溶性多元酚類化合物，具有沉淀蛋白的作用。該化合物是由沒食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其它多元醇)S旨、黃烷醇及其衍生物的聚合物以及兩者混合共同組成的植物多元酚。鞣質在中藥注射劑中不僅會影響制劑的穩(wěn)定性和澄明度，還可能會引起一系列嚴重的生理反應，例如，某些鞣質注入體內會引起黃疸和肝壞死等一系列臨床癥狀。因此，鞣質在中藥注射劑生產過程中常作為雜質除去。近年來中藥注射劑的安全性問題已引起人們的廣泛關注。鞣質檢查已成為中藥注射劑的特殊檢查項目之一。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學中應用最早且最廣泛的藥物之一，丹參注射液是國家基本醫(yī)療保險藥品乙類品種，對治療冠心病等心血管疾病具有較好的療效。丹參注射液的生產流程包括提取、濃縮、醇沉、活性炭脫色等工序，各工序中的鞣質含量監(jiān)測是丹參注射液生產過程質量控制的重要監(jiān)控點。傳統(tǒng)的以干酪素為吸附劑，以磷鉬鎢酸為顯色劑的鞣質含量測定法操作繁瑣、耗時。遠不能滿足對丹參注射液生產過程進行鞣質含量分析與監(jiān)控的要求。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法，可有效地滿足丹參注射液生產過程中提取液鞣質含量快速測定的需求，從而保證最終產品質量。本發(fā)明通過如下步驟實現1.校正集樣本收集收集不同批次丹參第13次提取過程中獲取的丹參提取液樣本作為校正集樣本；2.采用磷鉬鎢酸/干酪素法測定校正集樣本鞣質含量(1)試劑、溶液配置(按2005版中國藥典附錄XB中的方法配制供試品溶液和對照品溶液，)磷鉬鎢酸試劑的配制取Na2W04100g，Na2Mo0425g，加水700ml使其溶解，加100mlHCl，50mlH3P04，加熱回流10h，放冷，再加150gLi2S04，50ml水和0.2ml溴水，煮沸約15min除去殘留的Br，冷卻，加水稀釋至1000ml，過濾，即得，對照品溶液的配制精密稱取沒食子酸50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解，定容，混勻后，精密吸取5.Oml置于50ml棕色量瓶中，加水定容，備用(每ml含沒食子酸0.05mg)，3供試品溶液的配制精密量取丹參提取液適量于棕色量瓶中，加水稀釋1535倍，搖勻，濾過，棄去初濾液，備用，(2)標準曲線測定分別精密量取對照品溶液O.5ml，1.0m1，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.Oml置于25ml棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液lml，再分別精密量取蒸餾水適量，補足體積至13ml，加29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應試劑為空白，照中國藥典2005年版一部附錄VA紫外一可見分光光度法，在760nm波長處測定吸光度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。(3)總酚含量測定精密量取供試品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液lml，加水10ml，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應試劑為空白，在760nm波長處測定吸光度A，按標準曲線法計算總酚含量，(4)不被吸附多酚含量測定精密量取供試品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml錐形瓶中，密塞，置3(TC水浴中保溫lh，時時振搖，取出放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液lml，加水10ml，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應試劑為空白，在760nm波長處測定吸光度A'，按標準曲線法計算不被吸附多酚含量，(5)鞣質含量計算丹參提取液中鞣質含量=提取液中總酚含量_提取液中不被吸附多酚含量；3.校正集樣本紫外光譜數據采集校正集樣本供試品溶液制備精密量取丹參提取液0.5ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，備用，紫外光譜數據采集使用紫外分光光度計，采集校正集樣本供試液200480nm波長范圍的紫外光譜掃描數據；4.校正集樣本的選擇使用計算機定制軟件(如TQ，Unscrambler等)殘差分布圖的方法對樣本進行選擇，將殘差值較大的數據暫定為異常樣本，以相關系數和交叉驗證誤差均方根RMSECV作為校正模型性能優(yōu)劣判定依據，使用逐一回收的方法確定上述異常樣本對模型性能優(yōu)劣的影響，剔除影響模型性能的異常樣本，最后確定校正集樣本數，校正模型及驗證模型的評價參數(1)相關系數R2:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中，Yi為標準法測定的參照值，《為由校正模型預測值，f為&均值。R2值越接近l，表示校正模型的預測值與真實值越接近，(2)交叉驗證誤差均方根(RMSECVRootmeansquareerrorofcrossvalidation):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中，f^為校正模型交叉驗證的分析結果，n為校正集樣本數。此參數是評價內部交叉驗證好壞的質量指標，RMSECV越小，模型的預測精度越高，(3)預測誤差均方根(RMSEPRootmeansquareofprediction):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中，m為用于檢驗模型的驗證集樣本數。此參數是外部驗證評價模型好壞的質量指標，RMSEP越小，模型的預測性能越好；5.定量校正模型的建立本發(fā)明利用化學計量學多元校正法，包括多元線性回歸(MLR)、主成分回歸(PCR)和偏最小二乘回歸(PLS)，建立鞣質含量回歸模型，采用留一法全交叉進行內部驗證，在建立定量校正模型前，首先需要使用計算機定制軟件(Unscrambler9.6)對光譜進行波段選擇，得到丹參提取液特征光譜信息。接著建立特征光譜數據和鞣質含量之間的數學模型，采用留一法全交叉進行驗證來確立模型的最佳因子數和最小RMSECV，本發(fā)明的校正集由X變量(光譜數據)和Y變量(鞣質含量)組成；6.定量校正模型的驗證收集丹參提取液樣本，采用磷鉬鎢酸/干酪素法測定樣本鞣質含量，選取鞣質含量落在校正集鞣質含量范圍之內的樣本作為驗證集進行模型的外部驗證，按校正集樣本紫外光譜數據采集方法采集驗證集紫外光譜數據，并將光譜特征值輸入已經建立的校正模型中，計算得到驗證集樣本鞣質含量并與磷鉬鎢酸/干酪素法測定的樣本鞣質含量參照值比較；上述校正模型可以根據實際需要，增加校正集和驗證集，對模型進行不斷的更新與完善，操作步驟同前；7.丹參提取液鞣質含量測定取未知鞣質含量的丹參提取液，按校正集樣本紫外光譜數據采集方法采集樣本紫外光譜數據，把特征光譜輸入定量校正模型，便可快速計算得到提取液中鞣質含量值。本發(fā)明的另一個目的是提供該方法在丹參注射液提取過程中提取液的鞣質含量測定中的應用。本發(fā)明提供的快速測定丹參提取液中鞣質含量的紫外光譜法操作簡便、測量速度快、所用的儀器設備方便易得，適用于生產過程的鞣質含量快速監(jiān)測。圖1為本發(fā)明建立定量校正模型的流程示意圖。圖2為鞣質對照品沒食子酸和丹參提取液紫外光譜對照圖。圖3為丹參提取液的紫外光譜圖。圖4為丹參提取液樣品集樣本的殘差分布圖。圖5為丹參提取液鞣質含量PCR回歸模型的參比值與預測值之間相關關系。圖6為丹參提取液鞣質含量PLS回歸模型的參比值與預測值之間相關關系。具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1:方法流程參見圖l。1.校正集樣本收集收集22個批次丹參第1次提取的提取液22份、第二次提取的提取液17份、第三次提取的提取液14份共計丹參提取液樣本53份，作為校正集樣本。2.校正集樣本參照值的測定采用2005版中國藥典附錄XB中磷鉬鎢酸/干酪素法測定校正集樣本鞣質含量，并將顯色反應時間統(tǒng)一控制為30min。校正集樣本鞣質含量分布范圍為11.2303.5yg/ml。3.校正集樣本紫外光譜數據采集取校正集樣本，用水定量稀釋100倍，混勻，過濾，取續(xù)濾液，置于0.5cm石英比色皿中，使用紫外可見分光光度計，采集校正集樣本紫外光譜數據。光譜采集相關參數為光譜掃描范圍200480nm，每隔lnm采集一個光譜點，每個樣品平行掃描3次，取平均光譜圖作為樣本的紫外光譜。采集到的鞣質對照品沒食子酸和丹參提取液紫外光譜對照圖及丹參提取液紫外光譜圖分別見附圖2和附圖3。圖2中1為丹參提取液，2為沒食子酸。4.校正集樣本的選擇采用Unscrambler9.6軟件的殘差分布圖對樣本數據進行選擇，53個樣本殘差分布圖見附圖4，其中編號為1-7、1-8、1-10、2-20和3-20樣本的殘差值較大，將其暫列為異常樣本。使用逐一回收的方法確定上述異常樣本對模型的影響(以I^、RMSECV和RMSEP作為校正模型性能優(yōu)劣的判定依據)，分析結果見表1。從表1可知，樣本1-7和1-8的較大地影響模型性能，應該予以剔除，最后確定校正集樣本數為51，樣本集鞣質含量分布范圍為11.2197.1iig/ml。表1逐一回收異常樣本后的鞣質模型性能對比分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>剔除5個回收3-200.95413.416.65.校正模型的建立利用主成分回歸PCR法建立鞣質含量回歸模型，采用留一法全交叉進行內部驗證。定量分析使用Unscrambler9.6軟件。首先使用Unscrambler9.6軟件對光譜進行波段選擇，以得到丹參提取液特征光譜信息。由表2可知，波段的選擇對PCR法建立的模型性能的影響不顯著。PCR回歸選擇250480nm波段建立鞣質定量回歸模型，其性能相對最優(yōu)，即相關系數R2最大為0.940，RMSECV最小為18.2iig/ml。選擇250480nm波段進行定量建模，所建鞣質定量模型預測值與參照值的相關圖見附圖5。由圖可知該模型預測值與參照值之間相關性良好，模型有較好的性能。表2基于PCR回歸結合不同波段范圍所建鞣質定量模型的分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.校正模型的驗證取10份丹參提取液，按校正集測定參數測定其紫外特征光譜，將該光譜數據輸入已建立的鞣質定量模型中計算樣品的鞣質含量，與磷鉬鎢酸/干酪素法測定的鞣質含量數據比較，結果見表3。得到的預測值與參照值的預測誤差均方根RMSEP為9.4iig/ml，為可接受的預測誤差。表3PCR鞣質含量模型參照值與預測值比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7.未知含量的丹參提取液樣本中鞣質含量的預測取待測的丹參提取液樣本，按校正集樣本紫外光譜數據采集方法采集紫外光譜數據，把特征光譜輸入定量校正模型，快速獲得提取液中鞣質含量預測值。實施例2:按照實施例1的方法，區(qū)別之處在于使用偏最小二乘回歸(PLS)法建立鞣質定量校正模型，采用留一法全交叉進行內部驗證。定量分析使用Unscrambler9.6軟件。1.選用與實施例1相同的校正集樣本數據。2.使用Unscrambler9.6軟件對光譜進行波段選擇，由表3可知，波段的選擇對PLS法建立的模型性能的影響不顯著。PLS回歸選擇250nm480nm波段建立鞣質含量模型鞣質，其模型性能相對最優(yōu)，即相關系數R2最大為0.937，RMSECV最小為18.6yg/ml。選擇250480nm波段采用PLS法建立鞣質定量回歸模型。所建鞣質定量模型預測值與參照值的相關圖見附圖6。由圖可知該模型預測值與參照值之間相關性良好，模型有較好的性能。表3基于PLS回歸結合不同波段范圍所建鞣質含量模型的分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.校正模型的驗證取10份丹參提取液，按校正集樣本測定參數測定其紫外特征光譜，將該光譜數據輸入已建立的鞣質定量模型中計算樣品的鞣質含量，與磷鉬鎢酸/干酪素法測定的鞣質含量數據比較，結果見表4。得到的預測值與參照值的預測誤差均方根RMSEP為9.3g/ml，為可接受的預測誤差。表4PLS鞣質含量模型參照值與預測值比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.未知含量的丹參提取液樣本中鞣質含量的預測取待測的丹參提取液樣本，按校正集樣本紫外光譜數據采集方法采集紫外光譜數據，把特征光譜輸入定量校正模型，快速獲得提取液中鞣質含量預測值。權利要求一種快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(1)校正集樣本收集收集丹參提取過程不同煎煮時間、不同提取工序的丹參提取液樣本；(2)校正集樣本鞣質含量的測定按2005版中國藥典附錄XB中的方法配制供試品溶液和對照品溶液，磷鉬鎢酸/干酪素法測定丹參提取液中鞣質含量，將顯色反應時間統(tǒng)一控制為30分鐘，并將測得的含量值作為參照值；(3)校正集樣本紫外光譜的采集將澄清的丹參提取液稀釋液放置于石英比色皿中，置紫外分光光度計中，獲取校正集樣本紫外特征光譜數據；(4)校正集樣本的選擇使用計算機定制軟件殘差分布圖的方法對采集到的丹參提取液樣本進行選擇，將殘差值較大的數據定為異常樣本，以相關系數(R2)、交叉驗證誤差均方根和預測誤差均方根作為校正模型性能優(yōu)劣判定依據，使用逐一回收的方法確定上述異常樣本對模型性能優(yōu)劣的影響，剔除影響模型性能的異常樣本，最后確定校正集樣本數；(5)校正模型的建立使用多元校正方法，建立校正集樣本鞣質含量與紫外特征光譜之間的數學模型；(6)校正模型的驗證取丹參提取液，測定其紫外特征光譜，將該光譜數據輸入已建立的多元校正數學模型中計算樣品的鞣質含量，與磷鉬鎢酸/干酪素法測定的鞣質含量數據比較，要求測量誤差小于15％；(7)校正模型的應用采集待測樣本的紫外特征光譜，將該光譜數據輸入經驗證的校正模型中，計算丹參提取液中鞣質的含量。2.根據權利要求1所述的快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法，其特征在于，樣本集紫外光譜測定條件為采用0.5cm石英比色皿，波長掃描范圍為200480nm，每隔lnm采集一個光譜點，每個樣品平行掃描3次，取平均光譜圖作為樣本的紫外光譜。3.根據權利要求1所述的快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法，其特征在于，使用多元校正法建立丹參提取液中鞣質含量與其紫外特征譜圖之間關系的定量校正模型，采用的多元校正方法包括主成分回歸法和偏最小二乘法。4.根據權利要求1所述的快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法在丹參注射液提取過程中提取液的鞣質含量測定中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種快速測定丹參提取液中鞣質含量的方法，首先收集不同煎煮時間、不同提取工序的丹參提取液作為校正集樣本，采用磷鉬鎢酸/干酪素法進行鞣質含量的測定，并將測量結果作為參照值，同時采用紫外分光光度計測得這些校正集樣本稀釋液在200～480nm范圍的光譜數據，應用化學計量學技術，建立丹參提取液紫外光譜與其鞣質含量的定量校正模型，將未知鞣質含量的丹參提取液樣本，按同樣的方法測定其紫外光譜數據，利用已建立的定量校正模型便可快速計算出鞣質的含量值。本發(fā)明方法儀器簡單、操作簡便、測量速度快、節(jié)省了大量的人力和物力，可用于丹參注射液生產過程中鞣質含量的快速檢測，并可在中藥注射劑生產中推廣應用。文檔編號G01N21/33GK101791331SQ20101012553公開日2010年8月4日申請日期2010年3月16日優(yōu)先權日2010年3月16日發(fā)明者瞿海斌,程翼宇,黃紅霞申請人:浙江大學