專利名稱：三聚細(xì)胞因子的三聚結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的三聚結(jié)合蛋白。更具體地提供了能以某種方 式結(jié)合的三聚結(jié)合物(trimeric binder)，從而在結(jié)合以后，能基本上封閉所述三聚細(xì)胞因 子的全部受體結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制三聚細(xì)胞因子的潛在生物活性。一方面，本發(fā)明涉及能結(jié) 合腫瘤壞死因子配體超家族的細(xì)胞因子、包括腫瘤壞死因子(TNF)的三聚結(jié)合物。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子是高等真核生物分泌的小多肽，其負(fù)責(zé)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且影響其它 細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和功能。它們是有效的、多效的多肽，其例如通過(guò)相應(yīng)的受體，發(fā)揮局部的 或系統(tǒng)的細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子的作用，因此在許多生物過(guò)程中起關(guān)鍵作用，例如免疫、炎癥和造 血作用(骨髓中的血細(xì)胞的形成和發(fā)育)。細(xì)胞因子由多種細(xì)胞類型生產(chǎn)，包括成纖維細(xì) 胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞。迄今為止，已經(jīng)鑒別出了大量的細(xì)胞因 子，包括干擾素、腫瘤壞死因子、白介素和淋巴因子。它們與經(jīng)典的激素不同，因?yàn)樗鼈冇稍S 多組織或細(xì)胞類型生產(chǎn)，而不是由專門的腺體生產(chǎn)。細(xì)胞因子_受體相互作用的調(diào)控是治療性地干涉多種疾病和病理的有用機(jī)理?？?以與細(xì)胞因子相互作用的可溶性的結(jié)合蛋白能潛在地把細(xì)胞因子與受體隔開(kāi)，由此降低或 阻止特定受體途徑的激活。某些細(xì)胞因子以多亞基復(fù)合物形式出現(xiàn)，其含有多拷貝的相同亞基。腫瘤壞死 因子配體超家族(TNFLSF)中的巨噬細(xì)胞移行抑制因子(MIF)和蛋白，例如腫瘤壞死因子 (TNF ；TNFLSF成員2)和淋巴毒素α (LT-α ；TNFLSF成員1)，以3個(gè)相同亞基形成的同型三 聚體的形式出現(xiàn)。已知許多這樣的三聚細(xì)胞因子會(huì)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并起調(diào)節(jié)因子的作用，還 參與許多不同類型的疾病和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。已知TNF配體超家族的三聚細(xì)胞因子能在不同水平控制和調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。 還已知TNF配體超家族成員與幾種疾病有關(guān)，例如急性的或慢性的炎性疾病。現(xiàn)在，TNF 配體超家族具有至少17種公認(rèn)的配體，包括LTA(淋巴毒素α ；TNFLSF成員1)，TNF(腫 瘤壞死因子；TNFLSF成員2)，LTB (淋巴毒素β ；TNFLSF成員3)，0X-40L TNFLS成員4)； CD40L (TNFLS 成員 5) ；FasL (TNFLS 成員 6) ；CD27L (TNFLS 成員 7) ；CD30L (TNFLS 成員 8)； 4-lBB-L(TNFLS 成員 9) ；TRAIL (TNFLS 成員 10) ；RANKL (TNFLS 成員 11) ；TTOAK (TNFLS 成員 12) ；APRIL (TNFLS 成員 13) ；BAFF (TNFLS 成員 13B) ；LIGHT (TNFLS 成員 14) ；VEGI (TNFLS 成 員 15)；和 GITRL (TNFLS 成員 18)。有證據(jù)表明，TNF配體超家族的三聚細(xì)胞因子的信號(hào)單元和它們的對(duì)應(yīng)受體是3 個(gè)受體和3個(gè)配體裝配成六聚體復(fù)合物的形式，其中一個(gè)細(xì)胞因子三聚體結(jié)合3個(gè)受體分 子(Bodmer 等 2002，TRENDS inBiochemical Sciences 27(1)，pp. 19-26)。在成為該六聚體復(fù)合物的一部分之前，受體以單體形式存在。圖1解釋了該一般機(jī)理。TNF(TNFLSF成員2)是免疫和炎癥反應(yīng)的主要介導(dǎo)物之一，例如已知它在類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，該病是常見(jiàn)的自身免疫炎癥疾病，它影響著約0. 5-1% 的人口。另外，還已知TNF參與廣泛的疾病狀態(tài)的發(fā)病機(jī)理，包括內(nèi)毒素休克、腦型瘧和移 植物抗宿主反應(yīng)。TNF由許多細(xì)胞類型生產(chǎn)，主要由活化的巨噬細(xì)胞生產(chǎn)?？扇苄问降腡NF 由3個(gè)相同的17kD蛋白亞基組成，而膜結(jié)合形式則由3個(gè)相同的26kD亞基組成。TNF以前 還稱作〃 TNF-α “和〃惡液質(zhì)素"。最近發(fā)現(xiàn)TWEAK(TNFLSF成員12)是血管生成(血管的形成和生長(zhǎng))的直接的 和強(qiáng)烈的誘導(dǎo)物，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)皮摩爾濃度的TWEAK就能促進(jìn)正常內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，且TWEAK 能在體內(nèi)大鼠角膜模型中誘導(dǎo)血管生成(Lynch等，1999，The Journal of Biological Chemistry, 274 (13) pp. 8455-8459)。更具體地，血管生成對(duì)于實(shí)體瘤的生長(zhǎng)、維持和它們的 轉(zhuǎn)移是必須的，還已知它參與其它的病理學(xué)疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病、接觸性 皮炎和再狹窄。US20020037852A1中指出三聚細(xì)胞因子BAFF(TNFLS成員13B)由T細(xì)胞和樹(shù)突細(xì) 胞表達(dá)，以進(jìn)行B細(xì)胞的共刺激，因此它可能在B細(xì)胞功能的控制中起重要作用。其中暗示 BAFF和它的受體可能具有抗癌和免疫調(diào)節(jié)用途、以及治療免疫抑制病例如HIV的應(yīng)用。APRIL(TNFLS成員13)是能結(jié)合受體TNFRSF13B和TNFRSF17的三聚細(xì)胞因子。近 來(lái)已經(jīng)證實(shí)，向各種腫瘤細(xì)胞添加重組的APRIL會(huì)刺激它們的增殖，因而APRIL可能參與調(diào) 節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(Hahne M.，等，1998 ;J. Exp. Med. 188 1185-1190)。還已經(jīng)提出，APRIL 可 能參與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過(guò)程。而且，據(jù)稱TNF超家族內(nèi)的細(xì)胞因子會(huì)參與遺傳性疾病，例如超IgM綜合癥、I型 自身免疫淋巴增殖綜合癥、TNF-Rl-相關(guān)的周期熱綜合癥、少汗性外胚層發(fā)育不良和家族擴(kuò) 張性骨質(zhì)溶解癥。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來(lái)發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)合適的三聚細(xì)胞因子的拮抗劑和結(jié)合物，其能 結(jié)合特定的三聚細(xì)胞因子，并由此阻止該三聚細(xì)胞因子結(jié)合到例如細(xì)胞膜結(jié)合型受體上， 從而抑制該特定受體途徑的激活。一個(gè)實(shí)例是針對(duì)三聚細(xì)胞因子TNF(TNFLSF成員2)的拮抗劑?，F(xiàn)在，市場(chǎng)上可以 得到2種類型的TNF拮抗劑，即英夫利昔單抗(Remicade)和Eternarc^pt(Enbrel)，美國(guó) 和歐洲的市場(chǎng)主管部門都批準(zhǔn)了其用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。還已經(jīng)證實(shí)，這2種產(chǎn)品對(duì) 于治療銀屑病和克羅恩氏病也是有效的。英夫利昔單抗是一種嵌合抗體，其含有鼠可變區(qū) 和人IgGl和κ恒定區(qū)，通過(guò)結(jié)合可溶的和跨膜形式的TNF來(lái)中和TNF的生物活性，并抑制 TNF與其受體的結(jié)合。英夫利昔單抗的結(jié)構(gòu)類似于自然產(chǎn)生的抗體。Eternac印t是一種融 合蛋白，由P75 TNF受體的胞外域和人IgGl的鉸鏈和Fc域組成。WO 00/42073中給出了三聚細(xì)胞因子的拮抗劑的另一個(gè)實(shí)例，其中公開(kāi)了針對(duì)三 聚細(xì)胞因子TWEAK(TNFLS成員12)的單克隆抗體。其中提到，該抗體可以阻止移植物抗宿 主病的發(fā)展。但是，使用現(xiàn)在已知的三聚細(xì)胞因子的結(jié)合物和抑制劑產(chǎn)物會(huì)遇到的一個(gè)常見(jiàn)的 技術(shù)問(wèn)題是，在形成三聚細(xì)胞因子和結(jié)合物或抑制劑產(chǎn)物的1 1復(fù)合物后，不能有效地封 閉三聚細(xì)胞因子的所有3個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)?個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)中的至少1個(gè)或2個(gè)還是開(kāi)放的。開(kāi)放的細(xì)胞因子受體結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體結(jié)合，由 于該受體在細(xì)胞表面的高局部濃度，由此開(kāi)始進(jìn)一步募集細(xì)胞因子受體，并介導(dǎo)受體信號(hào) 傳遞。通過(guò)TNF結(jié)合物Eternac印t可以清楚地解釋該問(wèn)題。Eternacept是二價(jià)分子，能 與TNF三聚體形成1 1復(fù)合物。當(dāng)Eternac^pt結(jié)合TNF時(shí)，Eternac^pt分子僅能占據(jù)3 個(gè)可能的受體結(jié)合位點(diǎn)中的2個(gè)，剩下的第3個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)仍是開(kāi)放的。這暗示著開(kāi)放 的TNF受體結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)與細(xì)胞表面TNF受體結(jié)合，由于該受體在細(xì)胞表面上的高局部 濃度，從而開(kāi)始進(jìn)一步募集TNF受體，并介導(dǎo)信號(hào)傳遞。圖2解釋了該問(wèn)題。TNF結(jié)合物英夫利昔單抗也存在相同的問(wèn)題。每個(gè)英夫利昔單抗分子僅能結(jié)合給 定的TNF分子的1個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)(亞基)，因而剩下2個(gè)開(kāi)放的受體結(jié)合位點(diǎn)。這些開(kāi)放 的受體結(jié)合位點(diǎn)可能隨后與對(duì)應(yīng)的游離受體結(jié)合，導(dǎo)致TNF受體的進(jìn)一步募集和受體信號(hào) 傳遞?，F(xiàn)在，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提供一種融合蛋白(原聚體)可以克服上面 的技術(shù)問(wèn)題，該融合蛋白被構(gòu)建成三聚細(xì)胞因子的結(jié)合單元(結(jié)合物)與三聚化結(jié)構(gòu)域的 融合體。本發(fā)明的融合蛋白作為三聚蛋白，能與三聚細(xì)胞因子形成1 1復(fù)合物，優(yōu)選地同 時(shí)有效地結(jié)合三聚細(xì)胞因子的所有3個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)，由此沒(méi)有受體結(jié)合位點(diǎn)是開(kāi)放的， 因此能抑制細(xì)胞因子向細(xì)胞表面的積聚。本發(fā)明由此提供了一種融合蛋白，其具有下述優(yōu) 點(diǎn)與目前已知的三聚細(xì)胞因子拮抗劑相比，能更有效地抑制和中和三聚細(xì)胞因子的生物 活性。根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)用作藥物時(shí)，與目前已知的三聚細(xì)胞因子 的結(jié)合物相比，使用更少量的融合蛋白即可達(dá)到治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明一方面涉及含有3個(gè)單體的三聚多肽，每個(gè)所述的單體含有能結(jié)合 三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合構(gòu)件，且每個(gè)所述的單體含有三聚化結(jié)構(gòu)域。另一方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)給具有三聚細(xì)胞因子(例如腫瘤壞死因子)介導(dǎo)的病 理學(xué)的對(duì)象施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽來(lái)治療該對(duì)象的方法。最后，提供了制備根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽的方法、和檢測(cè)樣品中的三聚多肽細(xì)胞 因子的實(shí)驗(yàn)方法。發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明提供了能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的三聚結(jié)合物，優(yōu)選地其結(jié)合方式能 夠使得在結(jié)合后，能基本上封閉和/或中和三聚細(xì)胞因子的所有受體結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制 或中和三聚細(xì)胞因子的潛在生物活性。因此，提供了包含3個(gè)單體的三聚多肽，其中每個(gè)單 體含有能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合構(gòu)件，且其中每個(gè)單體都含有三聚化結(jié)構(gòu)域。在本文中，術(shù)語(yǔ)"三聚細(xì)胞因子"是指小蛋白和其片段，其由細(xì)胞生產(chǎn)和分泌，能 在具有針對(duì)該細(xì)胞因子的受體的細(xì)胞中引起特異性反應(yīng)，例如影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和/ 或功能。術(shù)語(yǔ)"三聚的"在本文中指本發(fā)明的細(xì)胞因子以含有3個(gè)亞基、優(yōu)選3個(gè)相同亞 基(同型三聚體)的多亞基復(fù)合物形式存在。這種三聚細(xì)胞因子的典型實(shí)例包括巨噬細(xì)胞移行抑制因子(MIF)和腫瘤壞死因
6子配體超家族(TNFLSF)中的細(xì)胞因子。現(xiàn)在，如上所述，TNF配體超家族具有至少17種 公認(rèn)的配體，它們共享有稱作〃 TNF同源域〃(TNF homology domain，THD)的保守的三 聚C-末端域，其負(fù)責(zé)受體結(jié)合。該三聚化結(jié)構(gòu)域的序列相同性在TNF家族成員之間約為 20-30%。THD是長(zhǎng)為150個(gè)氨基酸的序列，其含有芳族和疏水殘基的保守框架，如Bodmer 等 2002，TRENDS in Biochemical Sciences 27 (1)，第 19-26 頁(yè)的圖 2 所示。因此，在本文 中，“腫瘤壞死因子配體超家族的成員"是指含有該TNF同源域THD的三聚蛋白。目前已 知的TNF配體超家族中的三聚細(xì)胞因子如下面的表1所示，還列出了別名和相應(yīng)的Genbank ID (GenBank, National Center for Biotecnology Information ；http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank)。本文所使用的TNF配體超家族的命名法遵循官方TNF超家族(TNFSF) 命名法，可以參見(jiàn) http://www. gene. ucl. ac. uk/nomenclature/genefamily/tnftop. html。表1 :TNF配體超家族 因此，在本發(fā)明的一個(gè)有用的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽能結(jié)合選自 下列的腫瘤壞死因子配體超家族成員的三聚細(xì)胞因子LTA ；TNF ；LTB ；TNFSF4 ；TNFSF5 ； TNFSF6 ；TNFSF7 ；TNFSF8 ；TNFSF9 ；TNFSF10 ；TNFSF11 ；TNFSF12 ；TNFSF13 ；TNFSF13B ； TNFSF14 ； TNFRSF Fn 14 ； TNFSF15 ；禾口 TNFSF18。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合構(gòu)件"是指彼此具有結(jié)合特異性的一對(duì)分子 中的成員。特異性結(jié)合對(duì)中的成員可以是自然產(chǎn)生的，或全部地或部分地合成生產(chǎn)的。分子 對(duì)中的一個(gè)成員在其表面上有區(qū)域或者有腔，能特異性地結(jié)合分子對(duì)中的另一成員的特定 空間和極性結(jié)構(gòu)，因此與其呈互補(bǔ)性。因而，該對(duì)中的成員具有彼此特異性地結(jié)合的性質(zhì)。 特異性結(jié)合對(duì)類型的實(shí)例是抗原-抗體、生物素-鏈霉抗生物素蛋白、激素-激素受體、配 體-配體受體、酶-底物。特異性結(jié)合對(duì)的其它實(shí)例包括碳水化合物和凝集素，互補(bǔ)的核 苷酸序列(包括在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的探針和捕獲核酸序列)，互補(bǔ)的 肽序列，包括通過(guò)重組方法形成的那些，效應(yīng)物和受體分子，酶輔因子和酶，酶抑制劑和酶 等。而且，特異性結(jié)合對(duì)可以包括作為原始特異性結(jié)合構(gòu)件的類似物或片段的成員。在有用的實(shí)施方案中，能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合構(gòu)件為本發(fā)明的三聚多 肽提供了對(duì)三聚細(xì)胞因子的結(jié)合親合力(Kd)，由表面等離子體共振測(cè)得該結(jié)合親合力優(yōu) 選地為1x10、或更低。在其它有用的實(shí)施方案中，Kd值低于1x10_9M，IXIO-iqM, IxlO-11M, 1χ1(Γ12Μ，1Χ1(Γ13Μ，1Χ1(Γ14Μ，或甚至低于lxl(T15M。在其它有用的實(shí)施方案中，由表面等離子 體共振測(cè)得根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽的K-off速度小于IxlO-3S-1,例如小于lxlO、—1、包括小 于IxlO-5S-1和甚至小于IxlO-6S-1。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)〃 K-off"是指特異性結(jié)合構(gòu)件 從特異性結(jié)合構(gòu)件/三聚細(xì)胞因子復(fù)合物中解離出來(lái)的解離速度常數(shù)。如本文所使用的， 術(shù)語(yǔ)"表面等離子體共振"是指一種光學(xué)現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè)生物生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白濃 度的變化，例如使用 BIAcore 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden)檢測(cè)，可以 分析實(shí)時(shí)的生物特異性的相互作用。關(guān)于進(jìn)一步的描述，見(jiàn)實(shí)施例10。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的三聚細(xì)胞因子結(jié)合物優(yōu)選地能至少部分地或完全地封 閉、抑制或中和三聚細(xì)胞因子的生物活性。如本文所使用的，表述“中和”是指抑制或降低 體內(nèi)或體外測(cè)得的三聚細(xì)胞因子的生物活性。在有用的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合構(gòu)件是源自腫瘤壞死因子受體超家族成員的多 肽?，F(xiàn)在，已經(jīng)知曉腫瘤壞死因子超家族中的至少29種受體，列在下面的表2中，同時(shí)列 出了它們的別名以及相應(yīng)的 Genbank ID(GenBank, National Center for Biotecnology 因而，在有用的實(shí)施方案中，源自腫瘤壞死因子超家族中的受體的特異性結(jié)合構(gòu) 件選自受體 TNFRSF1A，TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF1 OA, TNFRSF1 OB, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 和 TNFRSF23。但是，預(yù)期可以鑒別出該蛋白家 族的其它有用受體，并由此可以鑒別出其它的功能特異性結(jié)合構(gòu)件。在有用的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合元件源自TNF受體TNFRSF1A (TNFrI，p55受體) 和/或TNFRSF1B (TNFrII，p75 TNF受體)。更具體地，已經(jīng)證實(shí)了 TNFRSF1B受體和其亞基 能有效地特異性地結(jié)合和中和TNF。作為實(shí)例，TNF結(jié)合蛋白Eternac^pt是由TNFRSF1B受 體的胞外域(即TNFRSF1B受體的亞基)組成的融合蛋白。因此，在具體的實(shí)施方案中，根 據(jù)本發(fā)明的三聚多肽包括特異性結(jié)合元件，其是TNFRSF1B受體(TNFrII)的亞基或片段，例 如US 5，712，155公開(kāi)的1順1 18受體片段。因此，在有用的實(shí)施方案中，所述特異性結(jié) 合元件是含有選自下述的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B 1-235 (SEQ ID NO 76), TNFRSF1B 1-185 (SEQID NO 77),TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO 78)和TNFRSFIB 1-142(SEQ IDNO 79).
在其它有用的實(shí)施方案中，如下面的實(shí)施例所公開(kāi)的，所述特異性結(jié)合元件可以 是TNFRSF1B受體(TNFrII)的一個(gè)或多個(gè)片段、和這種片段的組合，例如含有選自下述 的DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ ID NO 13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEQ ID NO 15), TNFRSF1B D1D21/4(SEQ ID NO 17), TNFrII D1D2,1/3 (SEQ ID NO: 19), TNFRSF1B D1D2,1/2(SEQ ID NO 21), TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO 23)，TNFRSFIB D2 (SEQ ID NO 25),TNFRSF1B D2,1/6 (SEQ ID NO :26)，TNFRSF1B D2,1/4(SEQ ID NO :27)， TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28),TNFRSF1B D2，1/2(SEQ ID NO :29)和TNFRSF1B D2D4(SEQ ID NO 30)。根據(jù)本發(fā)明，能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合元件還可以是抗體或抗體片段。 在本文中，術(shù)語(yǔ)“抗體，，用于描述天然的、或者部分地或全部地合成的免疫球蛋白。由于可 以以多種方式修飾抗體，術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)當(dāng)理解為包括了具有所需三聚細(xì)胞因子特異性的結(jié) 合域的任何特異性結(jié)合元件或物質(zhì)。因此，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了抗體片段、抗體的衍生物、功能等 同物和同系物，包括含有免疫球蛋白結(jié)合域的任何多肽，無(wú)論是天然的，還是全部地或部分 地合成的。因此，也包括含有免疫球蛋白結(jié)合域與另一多肽相融合的嵌合分子、或等同物。 該術(shù)語(yǔ)還包括具有結(jié)合域的任何多肽或蛋白，所述結(jié)合域是抗體結(jié)合域或與其同源，例如 抗體模擬物。它們可以源自天然來(lái)源，或者它們是部分地或全部地合成的。抗體的實(shí)例是 免疫球蛋白同種型和它們的同種型亞類；含有抗原結(jié)合域的片段，例如Fab，scFv, Fv, dAb， Fd ；和二體(diabodies)。US 6，451，983 B2描述了人腫瘤壞死因子的抗體，其能i. a.中和TNF的生物學(xué)活 性。更具體地，US 6,451,983 B2提供了能結(jié)合某些特定拓?fù)鋵W(xué)區(qū)域內(nèi)的成熟人TNF(SEQ ID NO 80)的抗體或其片段。因此，在本發(fā)明的有用的實(shí)施方案中，該特異性結(jié)合元件是能 在選自由下列氨基酸殘基組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)區(qū)域結(jié)合成熟的人TNF(SEQ ID NO 80) 的抗體或其片段氨基酸殘基 1-18，1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45,49-97, 49-98,56-79,58-65,69-97,70-87,76-90,96-105,105-128，108-128，110-127，115-125， 117-128，132-157，135-155，136-153，138-149，141-153 或 146-157。US 6，451，983 B2還提供了可以用于本發(fā)明的特異性單克隆抗體。因此，能結(jié)合人 TNF的特異性結(jié)合元件可以是選自下述的抗體或抗體片段MAb 1 (ECACC 89080301)，MAb 21(ECACC 90012432)， MAb 25(ECACC89121401)， MAb 32(ECACC 89080302)， MAb 37(ECACC 89080303)，MAb42 (ECACC 89080304)，MAb 47 (ECACC 89121402)，MAb 53 (ECACC90012433) 和MAb 54 (ECACC 89083103)，其中ECACC是指歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中心(European Collection of Animal Cell Cultures)。有用的抗體的其它實(shí)例包括US 6，090，382中公開(kāi)的人化抗體D2E7和 W0/00194585中公開(kāi)的人化抗體片段CDP 870。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特異性結(jié)合元件可以含有抗體類似物或人工抗 體，例如W0/0248189中公開(kāi)的具有C-型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(C-type lectin-like domains, CTLD)的支架結(jié)構(gòu)的蛋白。正如將從下面的實(shí)施例中明白的，基于能結(jié)合TNF的CTLD抗體類 似物的有用人 tetranectin 可以選自 TN3-2-B (SEQ ID NO :103)、TN3_2_C(SEQ IDNO 104) 和 TN3-2-D(SEQ ID NO: 105)。本發(fā)明的一個(gè)重要的方面是，除了特異性結(jié)合元件外，三聚多肽的單體還含有三聚化結(jié)構(gòu)域。在本文中，術(shù)語(yǔ)"三聚化結(jié)構(gòu)域"是能與其它類似的或相同的三聚化結(jié)構(gòu)域 相互作用的肽、蛋白或蛋白的部分。這種相互作用是能生成三聚蛋白或多肽的類型。這樣 的相互作用可以是由三聚化結(jié)構(gòu)域的組分之間的共價(jià)鍵造成，以及由氫鍵力、疏水力、范德 華力和鹽橋造成。三聚化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)實(shí)例公開(kāi)在WO 95/31540中，其中公開(kāi)了含有膠凝素 (collectin)頸區(qū)的多肽。構(gòu)成膠凝素頸區(qū)的氨基酸序列可以附著到選擇的任何多肽上。 然后可以在合適的條件下，用含有膠凝素頸區(qū)氨基酸序列的3個(gè)多肽制備三聚體。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，三聚化結(jié)構(gòu)域源自tetranectin，更具體地包含 tetranectin三聚化結(jié)構(gòu)單元(此后稱作TTSE)，其在W098/56906中詳細(xì)公開(kāi)。TTSE的氨 基酸序列如SEQ ID NO :81所示。TTSE的三聚化作用由卷曲螺旋結(jié)構(gòu)造成，該結(jié)構(gòu)與2個(gè)其 它的TTSE的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，形成3個(gè)α螺旋卷曲螺旋三聚體，其即使在相對(duì)較高 的溫度下也是特別穩(wěn)定的。術(shù)語(yǔ)TTSE也意在包括天然產(chǎn)生的tetranectin蛋白家族成員的 TTSE的變體、已經(jīng)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了修飾而未在任何實(shí)質(zhì)程度上負(fù)面影響TTSE形成 α螺旋卷曲螺旋三聚體的能力的變體。因此，根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽可以包含作為三聚化 結(jié)構(gòu)域的TTSE，其含有與SEQ ID NO SEQ ID NO :81的序列具有至少68%、例如至少75%、 包括至少87%、例如至少92%的氨基酸序列相同性的序列。與此相一致，TTSE (SEQ ID NO 81)的半胱氨酸殘基No. 50可以有利地誘變成絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或任何其它的氨基 酸殘基，以防止形成不希望的鏈間二硫鍵，后者會(huì)導(dǎo)致不希望的多聚化作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以如下修飾TTSE三聚化結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO 81) (i)插入 多組氨酸序列和/或血液凝固因子X(jué)a的切割位點(diǎn)，( )用Ser替換Cys 50，和(iii)包含 C-末端KGS序列。下面的實(shí)施例中提供了根據(jù)本發(fā)明的不同三聚多肽的幾個(gè)實(shí)例，其中已經(jīng)應(yīng)用 了上面的TTSE三聚化結(jié)構(gòu)域。它們包括基于CTLD的TNF結(jié)合單元TN-2-B (SEQ ID NO: 106)、TN-2-C(SEQ ID NO 108)和 TN-2-D(SEQID NO 107)、和三聚體化的人 TNFRII 片段 AD1D4-GSS-I10(SEQ ID NO: 109)。根據(jù)本發(fā)明，所述特異性結(jié)合元件可以連接到三聚化結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端氨基 酸殘基。但是也預(yù)見(jiàn)到，在某些實(shí)施方案中，可以將特異性結(jié)合元件有利地連接到單體的三 聚化結(jié)構(gòu)域N-末端和C-末端，由此提供含有6個(gè)能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合元件 的三聚多肽?？梢悦靼?，有彈性的分子連接物可以任選地置于特異性結(jié)合元件和三聚化結(jié)構(gòu)域 之間，并共價(jià)地連接它們。在某些實(shí)施方案中，連接物是約1-20個(gè)氨基酸殘基的多肽序列。 連接物可以小于10個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地，為5，4，3，2，或1個(gè)。在某些情況下，9、8、7或6個(gè) 氨基酸是合適的。在有用的實(shí)施方案中，連接物基本上是無(wú)免疫原性的，不易于蛋白水解切 割，且不含有已知能與其它殘基相互作用的氨基酸殘基(例如半胱氨酸殘基)。通過(guò)在能表達(dá)三聚多肽的條件下、培養(yǎng)用編碼三聚多肽的載體轉(zhuǎn)化的宿主，可以 在任何合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的三聚多肽。優(yōu)選地，表達(dá)系統(tǒng)是這樣的系 統(tǒng)，其中所需蛋白可以容易地分離和進(jìn)行體外再折疊。作為一般規(guī)律，原核表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選 的，因?yàn)榭梢缘玫礁弋a(chǎn)量的蛋白，并且有有效的純化和再折疊方法可供利用。因而，本領(lǐng)域 的技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)、憑借自身的能力和判斷即可選擇合適的或中意的表達(dá)系統(tǒng)。類
12似地，一旦選定了本發(fā)明的三聚多肽的一級(jí)氨基酸序列，結(jié)合所選宿主中的密碼子偏好、宿 主中的分泌信號(hào)序列的必要性、信號(hào)序列中的蛋白酶切割位點(diǎn)的導(dǎo)入等因素，本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員即可容易地設(shè)計(jì)合適的能編碼目標(biāo)蛋白的重組DNA構(gòu)建體。這些重組DNA構(gòu)建 體可以框架內(nèi)地插入適用于選定宿主的許多表達(dá)載體中的任意一個(gè)中。合適的或中意的表 達(dá)載體的選擇也是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力和判斷力之內(nèi)。優(yōu)選地，表達(dá)載體包含能驅(qū)動(dòng) 重組構(gòu)建體的表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。最后，使用本領(lǐng)域熟知的合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以分離出三聚 多肽，并任選地進(jìn)行其它的操作，例如凍干。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何合適的方法，可以用根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽制備藥物組合 物。該組合物可以含有與三聚多肽在一起的一種或多種可接受的載體、和任選的其它治療 成分。該載體必須是在與其它成分相容且對(duì)其受體無(wú)毒害的意義上為可接受的。通常，制 備藥物組合物的方法包括將活性成分和載體相結(jié)合的步驟。本發(fā)明的治療應(yīng)用包括通過(guò)給需要治療的動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的 三聚多肽來(lái)治療該動(dòng)物的疾病或障礙。如上所述，已知三聚細(xì)胞因子、特別是TNF配體超家 族的三聚細(xì)胞因子，是能充當(dāng)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的多效多肽，其能控制和調(diào)節(jié)免疫和炎癥 反應(yīng)。因而應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的三聚多肽可以用于治療三聚細(xì)胞因子介導(dǎo)的廣范圍的障礙 和疾病，包括炎癥疾病、自身免疫病、免疫障礙、感染、惡性瘤和神經(jīng)變性病。在一個(gè)有用的 實(shí)施方案中，疾病是腫瘤壞死因子介導(dǎo)的病理學(xué)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和克羅恩氏 病。通過(guò)任何合適的技術(shù)，包括腸胃外地，可以將本發(fā)明的三聚多肽直接施用給動(dòng)物， 也可以局部地或全身地施用。具體的給藥途徑依賴于，例如，動(dòng)物的病史。腸胃外給藥的實(shí) 例包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥。本文中可由三聚融合蛋白潛在地治療的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，例如人。最后，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中的三聚多肽細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法，其包括(i)使 樣品與根據(jù)本發(fā)明的三聚多肽接觸，和(ii)檢測(cè)三聚多肽向三聚細(xì)胞因子的結(jié)合?，F(xiàn)在，通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例和附圖來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明。


圖1顯示了腫瘤壞死因子超家族內(nèi)的三聚細(xì)胞因子與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合型單體受 體的結(jié)合，其啟動(dòng)2個(gè)細(xì)胞因子受體的進(jìn)一步募集，導(dǎo)致六聚細(xì)胞因子_受體信號(hào)單元的形 成。圖2顯示了二價(jià)結(jié)合物與腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)內(nèi)的三聚細(xì)胞因子的結(jié) 合，該二價(jià)結(jié)合物與三聚細(xì)胞因子形成1 1復(fù)合物。當(dāng)所述二價(jià)結(jié)合物結(jié)合三聚TNFSF 細(xì)胞因子時(shí)，二價(jià)結(jié)合物分子僅僅占據(jù)3個(gè)可能的受體結(jié)合位點(diǎn)中的2個(gè)，第3個(gè)受體結(jié)合 位點(diǎn)仍是開(kāi)放的。這暗示著，開(kāi)放的細(xì)胞因子受體結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合細(xì)胞表面三聚細(xì)胞因 子受體，并且，由于該受體在細(xì)胞表面的高局部濃度，從而開(kāi)始進(jìn)一步募集三聚受體，并介 導(dǎo)信號(hào)傳遞。圖3顯示了三聚細(xì)胞因子的結(jié)合物，其能與三聚細(xì)胞因子形成1 1復(fù)合物，并 同時(shí)有效地結(jié)合三聚細(xì)胞因子的所有3個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)，由此沒(méi)有受體結(jié)合位點(diǎn)仍是開(kāi)放 的。細(xì)胞因子向細(xì)胞表面的積聚受到阻斷，地就不會(huì)發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖4顯示了 10倍稀釋的三聚體化受體片段DlD4GSSI10Trip在鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞 系L929實(shí)驗(yàn)中在固定的兩種不同TNFa濃度(1. Ong/ml和0. lng/ml)下對(duì)TNFa介導(dǎo)的 細(xì)胞毒性的抑制。實(shí)施例實(shí)施例1用于生產(chǎn)三聚細(xì)胞因子結(jié)合物的trip大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒和噬菌粒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建噬菌粒使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將用寡核苷酸引物C-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 1)和 N-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 2)由表達(dá)質(zhì)粒pTtripb擴(kuò)增的經(jīng)Sfi I和Not I限制性消化的 DNA 片段 sktripB 連接到 Amersham PharmaciaBiotech (編號(hào) 27-9401-01)提供的經(jīng) Sfi I 和Not I預(yù)切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒psktripB。sktripB插入片段的核苷 酸序列如SEQ ID NO :3所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將用寡核苷酸引物C-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 1)和 N-sfikpn-IlOTRI (SEQ ID NO :4)從表達(dá)質(zhì)粒pTtripb擴(kuò)增的、經(jīng)SfΠ和Not I限制性消 化的 DNA 片段 skiIOtripB 連接到 Amersham PharmaciaBiotech (編號(hào) 27-9401-01)提供的 經(jīng)Sfi I和Not I預(yù)切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pskllOtripB。skllOtripB 插入片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。表汰質(zhì)粒 使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 6)和 N-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 7)從表達(dá)質(zhì)粒pTtripb擴(kuò)增的、經(jīng)BamH I和Hind I性消化限 制的DNA片段bktripB連接到經(jīng)BamH I和Hind I限制性消化的表達(dá)質(zhì)粒pT7H6中，構(gòu)建 了表達(dá)質(zhì)粒pT7H6-bktripB。bktripB的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 6)和 N-bamkpn-110TRI (SEQ ID NO 9)從表達(dá)質(zhì)粒 pTtripb 擴(kuò)增的、經(jīng) BamH I 和 Hind I 限制性 消化的DNA片段bkl IOtripB連接到經(jīng)BamH I和Hind I限制性消化的表達(dá)質(zhì)粒pT7H6中， 構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pT7H6-bkI10tripB。bkltripB的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。實(shí)施例2使用TNFRII片段的三聚TNF結(jié)合物的設(shè)計(jì)和構(gòu)建TNF受體TNFRSF1B (TNFRII)的片段和亞基用于構(gòu)建基于源自tetranectin的三聚 化結(jié)構(gòu)域TripB的三聚TNF結(jié)合物。如下進(jìn)行設(shè)計(jì)和克隆將TNFRSF1B片段克隆進(jìn)噬菌粒載體使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl-rev (SEQ ID NO 11) 和 D2kpn-fo (SEQ ID NO 12))、Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D2 連接到 Sfi I 和Kpn I切割載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2tripB。得到的D1D2的核苷酸序 列如SEQ ID NO 13所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: ll)Dl/6kpn-fo(SEQ IDNO 14))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 切割的 DNA 片段 D1D1/6 連接到經(jīng) Sfi
14I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/6tripB。得到的D1D2，1/6 的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/4kpn-fo(SEQ IDNO 16))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性切割的 DNA 片段 D1D1/4 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/4tripB。得到的 D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 17所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/3kpn-fo(SEQ IDNO 18))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/3 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/3tripB。得到的 D1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 19所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/2kpn-fo(SEQ IDNO 20))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性切割的 DNA 片段 D1D1/2 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/2tripB。得到的 D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 21所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性切割的DNA片段D1D4連接到 經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD4tripB。得到的D1D4 的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D2kpn-fo (SEQ ID NO 12))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D2連接到 經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2I10tripB。得到的 D1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/6kpn-fo(SEQ IDNO 14))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/6 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/6I10tripB。 得到的D1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/4kpn-fo(SEQ IDNO 16))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/4 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/4I10tripB。 得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 17所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl-rev (SEQ ID N0:11)和 Dl/3kpn-fo(SEQ IDNO 18))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/3 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/3I10tripB。 得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 19所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/2kpn-fo(SEQ IDNO 20))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/2 連接 到經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD2，l/2I10tripB。 得到的D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 21所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D4連接到 經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pDlD4I10tripB。得到的 D1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2連接到經(jīng) Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2tripB。得到的D2的核苷 酸序列如SEQ ID NO 25所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/6kpn-fo (SEQ IDNO 14))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/6tripB。得到的D2， 1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 26所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/4kpn-fo (SEQ IDNO 16))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/4tripB。得到的D2， 1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 27所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/3kpn-fo (SEQ IDNO 18))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/3tripB。得到的D2， 1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 28所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和 Dl/2kpn-fo (SEQ IDNO 20))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1/2 連接 到經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD21/2tripB。得到的D2， 1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 29所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4連接到 經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體psktripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2D4tripB。得到的D2D4 的核苷酸序列如SEQ ID NO 30所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2連接到經(jīng) Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2I10tripB。得到的D2 的核苷酸序列如SEQ ID NO 25所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/6kpn-fo (SEQ IDNO 14))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/6I10tripB。得到 的D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 26所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/4kpn-fo (SEQ IDNO 16))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/4I10tripB。得到 的D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 27所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/3kpn-fo (SEQ IDNO 18))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/3I10tripB。得到 的D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 28所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/2kpn-fo (SEQ IDNO 20))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/2連接到 經(jīng)SfiI和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2，l/2I10tripB。得到 的D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 29所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、經(jīng)Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4連接到 經(jīng)Sfi I和Kpn I切割的載體pskllOtripB中，構(gòu)建了噬菌粒載體pD2D4IIOtripB。得到的 D2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 30所示。將TNFRSF1B(TNFRII)受體片段克隆至表達(dá)載體中使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D2 連 接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2tripB。得到的FXD1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO 32所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/6kpn-fo(SEQID NO :14))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/6 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/6tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ IDNO 33所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/4tripB。得到的FXD1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO 34所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev (SEQ ID NO :31)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/3tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO 35所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev (SEQ ID NO :31)和Dl/2kpn-fo(SEQID NO :20)) ^BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/2 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/2tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ IDNO 36所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO :22))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D4連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI10tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7H6FXDlD4tripB。得到的FXD1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO :37所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD2 連接 到經(jīng)BamHI和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2tripB。得 到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO 39所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)bamD2-rev(SEQ IDNO :38)和 Dl/6kpn_fo (SEQ ID NO 14)) J^BamH I 和 Kpn I 限制 性消化的DNA片段FXD1/6連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建 了表達(dá)載體PT7H6FXD2，l/6tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 40所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO :38)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4
18連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/4tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 41所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/3tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 42所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 Dl/2kpn-fo (SEQID NO 20))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/2 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/2tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 43所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO 22))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA片段FXD2D4連接 到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2D4tripB。 得到的FXD2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 44所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D2連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bkI10tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7H6FXD1D2IIOtripB0 得到的 FXD1D2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :32 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/6kpn-fo(SEQID NO :14))，經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/6 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/6I10tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQID NO 33所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 Dl/4kpn-fo(SEQID NO 16))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D1/4連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bkIIOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7H6FXD1D2. l/4I10tripB。得到的 FXD1D2，1/4 的核苷酸序列如 SEQID NO 34 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/3I10tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQID NO 35所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ IDNO :31)和Dl/2kpn-fo(SEQID NO :20)) ^BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/2 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXDlD2， l/2I10tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQID NO :36所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO 22))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D4連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI10tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7H6FXD1D4IIOtripB0 得到的 FXD1D4 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 37 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和D2kpn-fo(SEQ IDNO :12))、經(jīng)BamH I和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD2連接到 經(jīng)BamHI 和 Kpn I 切割的載體PT7H6_bkI10tripB 中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2I10tripB。 得到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO 39所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 Dl/6kpn-fo (SEQID NO 14))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/6 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/6I10tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 40所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/4I10tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO 41所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、經(jīng)BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/3I10tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO :42所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO 38)和 Dl/2kpn-fo (SEQID NO 20))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/2 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI IOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXD2， l/2I10tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 43所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV(SEQ ID NO 38)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO :22))、經(jīng) Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD2D4連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bkI10tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7H6FXD2D4I10tripB。得到的 FXD2D4 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :44 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-1162 (SEQID NO 83))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-I162連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7ADlD4-I162-tripB。得到的 ADlD4_I162_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 84 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)禾口 pKpnI-GSS(SEQ IDNO :85))、經(jīng) BamH I 禾口 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-GSS連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7ADlD4-GSS-tripB。得到的 ADlD4_GSS_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 86 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-D235 (SEQID NO 87))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-D235連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7_bktripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7ADlD4-D235-tripB。得到的 ADlD4_D235_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 88 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-I162(SEQID NO :83))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-I162連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7_bkIIOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7AD1D4-1162-110-tripB。得到的 ADlD4_I162-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID N0: 89所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 83)和 pKpnI-GSS(SEQ IDNO 85))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-GSS連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7_bkI10tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7AD1D4-GSS-110-tripB。得到的 ADlD4-GSS-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 90 所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄 號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 83)和 pKpnI-D235 (SEQID NO :87))、經(jīng) BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-D235連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7_bkIIOtripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 PT7AD1D4-D235-110-tripB。得到的 ADlD4-D235-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID N0: 91所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO :92)和 pBAD6H(SEQ ID NO 93))擴(kuò)增的、經(jīng) Kpn I 和 Hind III 限制性消化的 DNA 片段 V17_TripB 連接到經(jīng)Kpn I和Hind III切割的載體pT7ADlD4-GSS_tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7ADlD4-GSS-V17-tripB。得到的 ADlD4-GSS_V17_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 94所示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO :92)和 pBAD6H(SEQ ID NO 93))擴(kuò)增的經(jīng) Kpn I 和 Hind III 限制性消化的 DNA 片段 V17_TripB
21連接到經(jīng)Kpn I和Hind III切割的載體pT7ADlD4-D235_tripB中，構(gòu)建了表達(dá)載體 pT7ADlD4-D235-V17-tripB。得到的 ADlD4-D235_V17_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 95所示。實(shí)施例3三聚體化的TNFRII片段AD1D4_GSS_IIO-TripB的生產(chǎn)、再折疊和純化T7RNA聚合酶依賴性的表達(dá)質(zhì)粒pT7DlD4GSSI 10 (能表達(dá)TNFRII衍生物 AD1D4-GSS-IIO-TripB)的構(gòu)建如上面的實(shí)施例2所述。如Studier 和 Moffat，J. Mol. Biol.，189 :113_130，1986 所述，以中等規(guī)模(6x1 升)培養(yǎng)和表達(dá)大腸桿菌BL21細(xì)胞中的質(zhì)粒PT7AD1D4-GSS-I10，生產(chǎn)了三聚體化的人 TNFRII 片段 AD1D4-GSS-110 (SEQ ID NO 109) 簡(jiǎn)言之，在 37°C 的指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)物(0D600 值為0.8)以感染復(fù)數(shù)約為5用噬菌體λ-CE6感染。在離心收集細(xì)胞之前，培養(yǎng)物在37°C 再生長(zhǎng)3小時(shí)。通過(guò)滲透壓休克和超聲處理裂解細(xì)胞，將總細(xì)胞蛋白萃取到苯酚(用 Trisma堿調(diào)節(jié)到pH8)中。通過(guò)加入2. 5倍體積的乙醇和離心，從苯酚相中沉淀出蛋白。 將蛋白沉淀溶解到含有6M氯化胍、50mM Tris-HCl pH8和50mM dithioerythriol的緩沖 液中。在 S印hadex G-25 (Amersham Biosciences)上用 8M 脲、0· 5M NaCl、50mM Tris-HCl PH8和5mM 2-巰基乙醇進(jìn)行凝膠過(guò)濾后，將粗蛋白制品應(yīng)用到M2+活化的NTA-瓊脂糖 (Qiagen,Germany)柱上進(jìn)行融合蛋白的純化(Hochuli等，1988)，在固定化到柱上時(shí)，如WO 94/18227所述進(jìn)行循環(huán)折疊過(guò)程。在加入還原劑和/或使用之前，將為液相色譜制備的所有緩沖液在真空下脫氣。在將粗蛋白提取物上樣到Ni2+NTA-瓊脂糖柱上后，通過(guò)用1柱體積的上樣緩沖液、 隨后用6M氯化胍(Guanidinium chloride)、50mMTris_HCl和5mM 2-巰基乙醇洗滌，直到 柱洗出液在280nm的光密度(OD)是穩(wěn)定的，從大腸桿菌和λ噬菌體蛋白主要部分中純化 出了融合蛋白AD1D4-GSS-I10。使用如表1所述的梯度方式，用0. 5Μ NaCl、50mM Tris-HCl pH8和2mM/0. 2mM還 原型/氧化型谷胱甘肽作為緩沖液A，用8M脲、0. 5MNaCl、50mM Tris-HCl pH8和3mM還原 型谷胱甘肽作為緩沖液B，在M2+NTA-瓊脂糖柱上重折疊融合蛋白。循環(huán)折疊過(guò)程完成后，使用含有8M脲、0. 5M NaCl、50mM Tris-HCl和IOmM EDTA PH8的緩沖液，從Ni2+NTA-瓊脂糖柱上洗脫下AD1D4-GSS-I10融合蛋白。通過(guò)在S-禾口 Q-S印harose (Amersham Biosciences)上的離子交換色譜,從二聚體 和更高級(jí)的多聚體純化出單體的AD1D4-GSS-I10融合蛋白將洗脫緩沖液洗脫的融合蛋白 (約80%的融合蛋白物)在S印hadex G-25上凝膠過(guò)濾到含有8M脲、IOmM Tris-HCl pH8. 0 和25mM NaCl的緩沖液中，并應(yīng)用到S-S印harose離子交換柱上。將“穿過(guò)的”級(jí)分中的不 結(jié)合蛋白直接上樣到Q-S印harose柱上。用從8M脲、25mM NaClUOmM Tris-Hcl pH8至8M 脲、300mM NaClUOmM Tris-Hcl pH8的線性梯度，經(jīng)10個(gè)柱體積，從Q-S印harose柱洗脫出 單體的AD1D4-GSS-110融合蛋白。單體的AD1D4-GSS-110融合蛋白在梯度的最開(kāi)始處洗脫， 而二聚體和更高級(jí)的多聚體較后洗脫。通過(guò)凝膠過(guò)濾到含有IOmM HEPES pH7. 4和125mM NaCl的緩沖液中，將含有單體融合蛋白的級(jí)分復(fù)性和三聚體化。表3 緩沖液梯度控制方案
22 實(shí)施例4三聚體化的TNFRII片段AD1D4-GSS-I10的生物活性在L929細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)TNF α介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制，檢測(cè)三聚體化的TNFRII 片段AD1D4-GSS-I10 (如實(shí)施例3所述生產(chǎn)的)的生物活性。使用鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系L929(ECACC no. :85011425)來(lái)檢測(cè)TNF α介導(dǎo)的細(xì)胞 毒性。將細(xì)胞維持在添加了 10% FBS和抗生素(100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素)的 RPMI 1640液體培養(yǎng)基(Biowhittaker，UK)中。將細(xì)胞以3xl05細(xì)胞/ml涂布到含有75 μ 1/ 孔的RPMI 1640完全培養(yǎng)基的96-孔平底微滴定平板(NUNC，Roskilde，Denmark)中，并在 37°C、在5% CO2中培養(yǎng)過(guò)夜。在補(bǔ)充了 2 μ g/ml放線菌素D (Sigma)的完全RPMI 1640培養(yǎng) 基中，將重組人 TNFa (rhTNF a ,RD Systems, UK) (lng/ml 和 0. lng/ml)與各種濃度(10-倍 稀釋液)的三聚體化受體片段(AD1D4-GSS-I10)在37°C、在5% CO2中孵育1小時(shí)。此后， 將75 μ 1/孔的TNF- a /三聚體化受體片段混合物添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，在37°C、在5% CO2 中孵育過(guò)夜。一式三份地測(cè)試了每種濃度的TNF-a/受體片段混合物。使用MTT(3_[4， 5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二-苯基-四唑鐺溴化物)作為CellTiter 96非放射性 細(xì)胞增殖測(cè)試試劑盒(Promega)的一部分，檢測(cè)了細(xì)胞增殖。為了制備足以用于一個(gè)96孔 平板(含有在150 μ 1體積中培養(yǎng)的細(xì)胞)的試劑，將3. Oml MTS溶液加入到150 μ 1 PMS 中。加入30 μ 1/孔的組合的MTS/PMS溶液，在使用ELISA平板讀數(shù)器在492nm記錄吸光度 之前，將平板在37°C、在5% CO2中孵育1-4小時(shí)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還包括TNF α和細(xì)胞的 對(duì)照組、單獨(dú)的細(xì)胞和緩沖液對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在圖4中。在存在最高濃度的々0104-655-110的情況下1順(1的細(xì) 胞毒性作用受到顯著抑制，因而證實(shí)了該化合物的生物學(xué)活性。實(shí)施例5使用D2E7抗體片段設(shè)計(jì)、構(gòu)建和生產(chǎn)三聚TNF結(jié)合物選擇了人化抗體D2E7的單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)作為結(jié)合物用于構(gòu)建能結(jié)合 TNF的三聚多肽基于US 6，090，382公開(kāi)的序列，通過(guò)擴(kuò)增D2E7的VH和VL域，可以構(gòu)建三
聚結(jié)合物。
含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化結(jié)構(gòu)域之間的Gly, Thr接頭的三聚D2E7 scFv的設(shè)計(jì)和構(gòu)津以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXD2E7tripB。第一步是構(gòu)建pT7H6FX(D2E7VH) tripB。通過(guò)將從含有D2E7序列的DNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO 45) 和 VHBamKpn (SEQ ID NO 46))、經(jīng) Bgl II 和 KpnI 限制性消化的 DNA 片段 FX(D7E2VH)連 接到經(jīng)BamH I Kpn I切割的pT7H6bktripB載體中，構(gòu)建出該載體。第二步是，通過(guò)將從 含有D2E7序列的DNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物G4SVL(SEQ ID NO 47)和VLkpn(SEQID NO :48))、經(jīng)BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL連接到經(jīng)BamH I Kpn I切割的 PT7H6FX (D2E7VH) tripB載體中，構(gòu)建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 49 所示。含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化結(jié)構(gòu)域之間的Gly, Gly, Gly, Gly, Ser, GlV，Thrftl^H^D2E7 scFv 的設(shè)計(jì)和構(gòu)律以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXD2E7G4StripB。第一步是，通過(guò)將從含有D2E7 序列的DNA擴(kuò)增的((用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO 45)和VHBamKpn(SEQ ID N0:46))、 經(jīng)Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FX(D7E2VH)連接到經(jīng)BamH I Kpn I切割的 pT7H6bktripB載體中，構(gòu)建出pT7H6FX (D2E7VH) tripB。第二步是，通過(guò)將從含有D2E7序列 的 DNA 擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物 G4SVL(SEQ ID NO :47)和 VLG4Skpn(SEQ IDNO :50))、經(jīng) BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL連接到經(jīng)BamHI Kpn I切割的pT7H6FX(D2E7VH) tripB載體中，構(gòu)建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7G4S的核苷酸序列如SEQ ID NO: 51所示。含有位于N-末端三聚化結(jié)構(gòu)域和C-末端scFv之間的Gly，Ser接頭的三聚D2E7 scFv的設(shè)計(jì)和構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從pT7H6FXD2E7G4StripB擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物 bclVH(SEQ ID NO 52)和VLhind(SEQ ID:53))、經(jīng)Bcl I和HindIII 限制性消化的DNA片段 連接到經(jīng) BamH I 和 Hind III 切割的載體 pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J.； 347 =83-87,2000)中，構(gòu)建出表達(dá)載體pT76HFXTripAGSD2E7。得到的GSD2E7的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 54 所示。含有位于N-末端三聚化結(jié)構(gòu)域和C-末端scFv之間的Gly，Ser, Gly, Gly, Gly, Gly, Ser接頭的三聚D2E7 scFv的設(shè)計(jì)和構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從pT7H6FXD2E7G4StripB擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物 bclG4SVH(SEQ ID NO 55)和 VLhind(SEQ ID:53))、經(jīng)Bcl I 禾口Hind III 限制性消化的DNA 片段連接到經(jīng) BamH I 禾口 Hind III 切割的載體 pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J. ；347 =83-87,2000)中，構(gòu)建出表達(dá)載體 pT76HFXTripAG4SD2E7。得到的 G4SD2E7 的核苷 酸序列如SEQ ID NO 56所示。為了制備上面的融合蛋白 H6FXD2E7tripB， H6FXD2E7G4StripB, H6FXTripAD2D7TripA 禾口 H6FxTripAG4SD2E7，如 Studier 等(1990)所述，使 質(zhì)粒 pT7H6FXD2E7tripB, pT7H6FXD2E7G4StripB, pT7H6FXTripAD2D7TripA 禾P pT7H6FxTripAG4SD2E7在大腸桿菌BL21細(xì)胞中小規(guī)模地生長(zhǎng)(1升；2xTY培養(yǎng)基，5mM MgSO4 和100 4g氨芐青霉素)。在37°C指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物(0D600值為0.8)以感染復(fù)數(shù)約為5用噬菌體XCE6進(jìn)行感染。使培養(yǎng)物在37°C再生長(zhǎng)3小時(shí)，通過(guò)離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞 重新懸浮在50ml 0. 5M NaCl、50mM Tris-HCl pH8和ImM EDTApH8中。向每份中加入苯酚 (50ml，調(diào)節(jié)至pH8)，超聲處理混合物，以提取總蛋白。進(jìn)行離心澄清(25分鐘，10. OOOg)后， 通過(guò)加入2. 5體積的乙醇和離心，使粗蛋白級(jí)分從苯酚相中沉淀出來(lái)。將蛋白沉淀溶解到 含有 6M 氯化胍、50mM Tris-HCl pH8 和 0. IM dithioerythriol 的緩沖液(15_25ml)中。在 Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden)上凝膠過(guò)濾到 8M 脲、IM NaCl、50mM Tris-HCl pH8 禾口 IOmM 2-巰基乙醇中后，將粗蛋白制品應(yīng)用到Ni活化的NTA-瓊脂糖柱(75ml柱體積)上 進(jìn)行純化(Hochuli等，1988)。然后使洗滌緩沖液(6M胍-HCl，50mMTris-HCl pH8和IOmM 2-巰基乙醇)流經(jīng)柱，直到得到穩(wěn)定的基線值。然后對(duì)每個(gè)柱應(yīng)用pH梯度(1000ml，8M脲和IOmM 2-巰基乙醇中的梯度，通過(guò)線 性(每體積)混合含有50mM磷酸二氫鈉(pH5緩沖液)和50mM磷酸氫二鈉(pH8緩沖液) 的溶液得到)，洗脫基本純的融合蛋白。為了通過(guò)Thegersen等(WO 94/18227)的方法進(jìn)行體外重折疊，將20mg每種
純化的融合蛋白在重折疊"緩沖液B"(如下所述)中與足以產(chǎn)生約75ml填充床體積柱 的M2+活化NTA-瓊脂糖基質(zhì)懸浮液的等份試樣混合成懸浮液。然后對(duì)每種融合蛋白如 WO 94/18227中關(guān)于纖溶酶原kringle 4所述進(jìn)行反復(fù)的重折疊過(guò)程，但是使用含有0. 5M NaCl、50mMTris-HCl pH8，2mM谷胱甘肽和0. 2mM氧化型谷胱甘肽的緩沖液作為“緩沖液 A"，使用含有8M脲、IM NaCl,50mM Tris-HCl pH8和2mM谷胱甘肽的緩沖液作為〃緩沖液 B"，在10°C進(jìn)行含有融合蛋白的scFv的重折疊。完成重折疊過(guò)程后，用300ml含有0. 5M NaCl和50mM Tris-HClpH 8的緩沖液洗 滌每個(gè)柱，以洗去谷胱甘肽。然后用20mM EDTA，0. 5MNaCl和50mM Tris-HCL pH8將每種蛋 白的重折疊部分從NTA-瓊脂糖中洗脫到洗脫緩沖液中。向每種蛋白樣品中加入固態(tài)脲達(dá) 到約8M的終濃度、并通過(guò)稀釋或透析將NaCl濃度降低到5mM以下以后，再通過(guò)離子交換色 譜(S-S 印 harose，Pharmacia，1，6 (i. d.)，經(jīng) 90 厘米柱，在含有 8M 脲、5mM Tris-HCl (來(lái)自 IM貯液、pH8)和25mM醋酸鈉(來(lái)自IM貯液、pH5)的緩沖液中，以2ml/min洗脫，對(duì)每種正 確折疊的融合蛋白產(chǎn)物進(jìn)行最終的純化。在水性緩沖液(例如磷酸鹽緩沖的鹽水)中透析 后，回收每種純的和正確地重折疊的融合蛋白，其產(chǎn)率為2-6mg/升生長(zhǎng)培養(yǎng)物。實(shí)施例6使用TNFRSF13B受體片段設(shè)計(jì)和構(gòu)建三聚的APRIL結(jié)合物使用APRIL受體TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化結(jié)構(gòu)域TripB，構(gòu) 建針對(duì)三聚細(xì)胞因子APRIL的三聚結(jié)合物。具有不同接頭的這樣的結(jié)合物的設(shè)計(jì)和克隆如 下所述TNFRSF13B6 的克隆以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXTNFRS13B6tripB。第一步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法， 通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1) 的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bgl i iFX Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 57)禾Π Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ IDNO :58))、經(jīng) Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13B連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體pT7H6_bktripB中，構(gòu)建 PT7H6FXATNFSF13B。第二步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech
29Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸 引物 kpnATNFSF13B(SEQ ID NO 59)禾口 Δ TNFSF13B6kpn(SEQ ID N0:60))、經(jīng) Kpn I 限制 性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β6連接到經(jīng)Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFSF13Β載體中，構(gòu)建 出最終的表達(dá)載體pT7H6FXTNFRSF13B6tripB。得到的FXTNFRSF13B6的核苷酸序列如SEQ ID NO 61 所示。TNFRSF13B10 的克降以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXTNFRS13B10tripB。第一步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法， 通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1) 的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bgl i iFX Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 57)和 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58))、經(jīng) Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷 酸引物 kpn Δ TNFSFl3B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFSF13ΒIOkpn(SEQ ID NO :62)) J^Kpn I 限 制性消化的DNA片段Δ TNFSF13Β10連接到經(jīng)Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β載體中， 構(gòu)建出最終的表達(dá)載體pT7H6FXTNFRSF13B10tripB。得到的FXTNFRSF13B10的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 63 所示。TNFRSF13B20 的克降以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXTNFRS13B20tripB。第一步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法， 通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的 混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO 57)和 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58)) J^Bgl II 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FX Δ TNFSF13B 連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建出pT7H6FX Δ TNFRSF13B。第 二步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào) 7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物kpn Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 59)禾口 Δ TNFRSF 13B20kpn (SEQ ID NO 64))、經(jīng) Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 ATNFSF13B20連接到經(jīng)Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13B載體中，構(gòu)建出最終的表達(dá)載體 pT7H6FXTNFRSF13B20tripB。得到的 FXTNFRSF13B20 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :65 所示。TNFRSF13B30 的克隆以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXTNFRS13B30tripB。第一步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法， 通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1) 的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO: 57)和 ΔTNFRSF 13Bkpn(SEQ ID NO :58))、經(jīng) Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷 酸引物 kpnATNFRSF13B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFRSF13B30kpn(SEQ ID N0:66))、經(jīng) Kpn I 限制性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β30連接到經(jīng)Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β載體 中，構(gòu)建出最終的表達(dá)載體pT7H6FXTNFRSF13B30tripB。得到的FXTNFRSF13B30的核苷酸序
30列如SEQ ID NO 67所示。TNFRSF13B61 的克降以2個(gè)步驟構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6FXTNFRS13B61tripB。第一步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法， 通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1) 的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO: 57)禾口 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58))、經(jīng) Bgl II 禾口 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的載體PT7H6_bktripB中，構(gòu)建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人骨髓和人白細(xì)胞(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7181-1和7182-1)的混合物分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷 酸引物 kpnATNFRSF13B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFRSF13B6Ikpn(SEQ ID Ν0:68))、經(jīng) Kpn I 限制性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β61連接到經(jīng)Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β載體 中，構(gòu)建出最終的表達(dá)載體pT7H6FXTNFRSF13B61tripB。得到的FXTNFRSF13B61的核苷酸序 列如SEQ ID NO 69所示。實(shí)施例7使用TNFRSF Fnl4受體片段設(shè)計(jì)和構(gòu)建三聚TWEAK結(jié)合物使用TWEAK受體TNFRSF Fnl4，并基于源自tetranectin的三聚化結(jié)構(gòu)域TripB構(gòu) 建針對(duì)三聚細(xì)胞因子TWEAK的三聚結(jié)合物。該結(jié)合物的設(shè)計(jì)和克隆如下所述使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人心臟(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7121-1)分 離出的 cDNA 擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物 bamFn-rev(SEQ IDNO 70)和 FNkpn-fo (SEQ ID NO: 71)、經(jīng)BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXFnl4連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切割的 載體PT7H6-bktripB中，構(gòu)建出表達(dá)載體pT7H6FXFnl4tripB。得到的FXFnl4的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 72 所示。實(shí)施例8使用TNFRSF13C受體片段設(shè)計(jì)和構(gòu)建三聚BAFF結(jié)合物使用BAFF受體TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化結(jié)構(gòu)域TripB構(gòu)建 針對(duì)相應(yīng)三聚細(xì)胞因子BAFF的三聚結(jié)合物。該結(jié)合物的設(shè)計(jì)和克隆如下所述三聚TNFRSF13C片段的克隆使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人淋巴結(jié)(Clontech Laboratories, Inc目錄號(hào)7164-1) 分離出的cDNA擴(kuò)增的(用寡核苷酸引物baml3C-rev(SEQID NO 73)和13Ckpn_fo (SEQ ID NO :74) J^BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXTNFRSF13C連接到經(jīng)BamH I和Kpn I切 割的載體PT7H6-bktripB 中，構(gòu)建了表達(dá)載體pT7H6FXTNFSF13CtripB。得到的FXTNFRSF13C 的核苷酸序列如SEQ ID NO 75所示。實(shí)施例9TNF的三聚體化CTLD結(jié)合物的分離和構(gòu)建使用如以前在W0/0248189中公開(kāi)的Tetranectin(SEQ ID NO :96)C_型凝集素-樣 結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)來(lái)分離和構(gòu)建三聚細(xì)胞因子TNF (TNF α)的三聚結(jié)合單元。結(jié)合 單元的設(shè)計(jì)和克隆如下所述文庫(kù)構(gòu)建和初步篩選使用噬菌體展示來(lái)分離TNF CTLD結(jié)合物。使用的噬菌體展示文庫(kù)是基于
31tetranectin 的單價(jià) CTLD 形式(SEQ ID NO 97)。組合文庫(kù)PhtCTLD-lb003(W0/0248189，實(shí)施例 5)和與 PhtCTLD_lb003 的基本相 同地制成的文庫(kù)變體，該文庫(kù)變體在裝配反應(yīng)中包括針對(duì)環(huán)1的兩個(gè)額外隨機(jī)化的寡核苷 酸在tetranectin (SEQ IDNO 98)的氨基酸殘基位點(diǎn)116-122隨機(jī)化的TN-lib3_tprev和 TN-Iib2-tprey (SEQ ID NO 99)和針對(duì)環(huán)4的兩個(gè)額外寡核苷酸在位點(diǎn)146-149隨機(jī)化 的 TN-lib3-tpfo(SEQ ID NO 100)和 TN-lib2_tpfo (SEQ ID N0:101)。使用約 IxlO12 個(gè)噬 菌體作為輸入，進(jìn)行了 2輪篩選，在第一輪淘選中使用10 μ g/ml生物素化的-TNF，在第二輪 淘選使用lyg/ml。如下進(jìn)行篩選在Iml PBS(PBS，0.2g KCl,0. 2g KH2PO4,8gNaClU. 44g Na2HPO4, 2H20,用水補(bǔ)加至1L，并用NaOH調(diào)節(jié)至pH7. 4)中洗滌20 μ 1鏈霉抗生物素蛋白包被的順 磁珠(Dynal)2次，在室溫下、在3%脫脂奶粉中封閉1小時(shí)。將在3%脫脂奶粉/PBS中的 250 μ 1預(yù)封閉噬菌體與250 μ 1可溶的生物素化TNF混合，使之在37°C孵育30分鐘。在 PBS, 0. 1% Tween 20中洗滌1次、在PBS中洗滌2次鏈霉抗生物素蛋白珠后，將它們加入反 應(yīng)物中，以捕獲結(jié)合了抗原的噬菌體。用PBS、0. I^Tween 20和PBS進(jìn)一步洗滌珠子，用 200 μ 1 50mM dithiothreitol，將結(jié)合了抗原的噬菌體從珠子上洗脫30分鐘。用洗脫的噬 菌體重新感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌TGl細(xì)胞，然后涂布平板，并在含有2%葡萄糖和0. Img/ ml氨芐青霉素的2xTY瓊脂平板上滴定?；旧习凑誛0/0248189所述，通過(guò)在ELISA中分析與TNFα的結(jié)合而從選擇的群 體中篩選出單個(gè)克隆，只是在ELISA中用于覆蓋的抗原是5 μ g/ml TNF。在第2輪篩選中分離出了稱作TN3-2的特異性TNF α結(jié)合物(表4)。次級(jí)文庫(kù)構(gòu)津和親合力驅(qū)動(dòng)的篩選研究了向ΤΝ3-2引入新的序列變化是否能提高ΤΝ3-2的TNF親合力。為了構(gòu)建 ΤΝ3-2突變體文庫(kù)，使用ΤΝ3-2克隆作為模板，使用寡核苷酸TN-Iib2_tpfo (SEQ ID NO 101)和 TN-Iib3-tpfo (SEQ ID NO 100)在環(huán) 4 中進(jìn)行新的隨機(jī)化(Lib. TN3-2 1οορ4 r)。 基本上按照W0/0248189所述進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。在含有遞減濃度的生物素化TNF(100ng/ml至0. lng/ml)的3輪親合力驅(qū)動(dòng)篩選 中使用了 TN3-2100p4r文庫(kù)。如上所述進(jìn)行選擇。如上所述篩選陽(yáng)性克隆。結(jié)論親本克隆TN3-2 的序列與 tetranectin 在環(huán) 1 (Tetranectin 氨基酸號(hào) 116-122) 和環(huán)4(Tetranectin氨基酸號(hào)146-149)中有所不同。對(duì)TN3_21oop4r文庫(kù)進(jìn)行3輪親合 力驅(qū)動(dòng)篩選后，通過(guò)ELISA分析鑒別出陽(yáng)性克隆，顯示出48個(gè)克隆中的45個(gè)能結(jié)合TNFa。 選出的一種鑒定的TNF α結(jié)合克隆的環(huán)1和環(huán)4序列以及它們對(duì)應(yīng)的SEQ ID NO如表4所 示(ΤΝ3-2-Β, TN3-2-C, TN3-2-D)。表4 親本克隆ΤΝ3-2的環(huán)1和環(huán)4中的氨基酸序列和從文庫(kù)TN3_21oop4r分離 出的3個(gè)親合力成熟化克隆 "tetranectin的環(huán)4序列之外的突變實(shí)施例10TNF的三聚體化CTLD結(jié)合物的親合力檢測(cè)將按照實(shí)施例7所述分離出的編碼單體CTLD TNFa結(jié)合物的DNA插入片段亞克 隆進(jìn)大腸桿菌PBAD表達(dá)載體(Invitrogen Corp.，USA)中。使重組單體TNF α結(jié)合物在大 腸桿菌中表達(dá)，并根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)從周質(zhì)中純化。在BiaCore上進(jìn)行分析之前，將純化 的單體在 IOmM TrispH8. 0U50mM NaCl、2mM CaCl2 中透析。為了表達(dá)TNFa結(jié)合物的三聚形式，使用限制性內(nèi)切核酸酶Bgl II和Mim I切割 編碼TNF α結(jié)合物的合適DNA插入片段(來(lái)自實(shí)施例7)，并將含有環(huán)1和4的DNA片段亞 克隆進(jìn)經(jīng)Bgl II Mun I限制性消化的大腸桿菌pT7H6FX-htlec DNA(如WO 02/48189中的 實(shí)施例1和圖5所述)中。在大腸桿菌中表達(dá)了重組的三聚TNF α結(jié)合物，基本上按照WO 94/18227的實(shí)施 例9所述純化未折疊的融合蛋白衍生物。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將融合蛋白上樣到處于8Μ脲、50mM Tris-HCl pH8. 0、500mM NaCl、 5mM 2-巰基乙醇中的帶Ni2+的次氮基三醋酸(NTA)柱上，進(jìn)行TNFa結(jié)合物的重折疊。上 樣以后，對(duì)柱進(jìn)行循環(huán)重折疊過(guò)程。使用的重折疊緩沖液是復(fù)性緩沖液A(50mM Tris-HCl pH8. 0, 500mM NaCl，2mM CaCl2, 2mM還原型谷胱甘肽和0. 2mM氧化型谷胱甘肽)和變性緩 沖液 B(8M 脲，50mM Tris-HCl pH8. 0,500mM NaCl，2mMCaCl2，3mM 還原型谷胱甘肽)。使用 50mM Tris-HCl pH8. 0、500mM NaClUOmM EDTA，將重折疊的融合蛋白從柱上洗脫下來(lái)，使 用牛凝血因子 Xa (Protein Engineering Technology, Aarhus, Denmark),以 1 100 (w/ w)、在4°C切割融合蛋白過(guò)夜。通過(guò)在S^hadex G25上進(jìn)行凝膠過(guò)濾，將切割后的蛋白 換入8M脲、25mM醋酸鈉緩沖液(pH5)、50mM NaClUmMTris-HCl緩沖液中，并上樣到IOml SP-Sepharose 柱(AmershamBiosciences)上，用 50mM 至 500M NaCl 經(jīng) 20 個(gè)柱體積進(jìn)行梯 度洗脫。通過(guò)非還原性SDS/PAGE分析進(jìn)行判斷，收集含有切割的單體蛋白的級(jí)分并合并， 通過(guò)在PDlO柱(Amersham Biosciences)上的凝膠過(guò)濾將緩沖液換成IOmM Tris ρΗ8· 0、 150mM NaCl、2mM CaCl2。在BIAcore 3000裝置(BiaCore，Sweden)上進(jìn)行了表面等離子體共振(SPR)結(jié) 合分析。將要固定化的TNFa捕獲抗體(AHC3712，BiosourceInternational)溶解到IOmM 醋酸鈉PH5. 0中，并使用胺耦連試劑盒(BiaCore，Sweden)固定到CM5 BiaCore傳感器芯片 上。
33
以5μ Ι/min的流速進(jìn)行結(jié)合分析。在將蛋白樣品上樣之前，將芯片在IOmM Tris pH8. 0,150mM NaCl,2mM CaCl2, 50 μ M EDTA 和 0. 005%表面活性劑 Ρ20 中平衡。將 TNF α 以 10 μ g/mL 的濃度溶解到 IOmM TrispH8. 0，150mM NaCl，2mM CaCl2 中，并注射 10 μ L。使 用KINJECT選項(xiàng)，注射單體或三聚形式的TNF α結(jié)合物的等份試樣(20 μ 1)進(jìn)行5分鐘的 解離，然后用IOmM甘氨酸ρΗ2. 5再生芯片。在從1至200ηΜ的6個(gè)不同蛋白濃度下測(cè)試 TNFa結(jié)合物的結(jié)合。使用BIA評(píng)價(jià)程序3. 2版(BiaCore)評(píng)價(jià)結(jié)合數(shù)據(jù)。表5顯示了來(lái)自BiaCore數(shù)據(jù)的動(dòng)力學(xué)值。從單體結(jié)合物至相應(yīng)的三聚結(jié)合 物(ΤΝ-2-Β, TN-2-C和TN-2-D)有親合力的增加倍數(shù)，顯示了將TNF α結(jié)合物TN3-2-B， TN3-2-C，TN3-2-D三聚體化的親合力作用。表 5 通過(guò)將TNF α結(jié)合物三聚體化，親合力(Kd)有了顯著增長(zhǎng)。例如，單體的TN3_2_B 具有非常差的k。ff值。與此相反，同一 CTLD結(jié)合物的三聚形式(TN-2-B)的k。ff值提高了超 過(guò)1000倍?？傮w上可以看出，三聚體化能將解離速度提高數(shù)倍。而且，實(shí)施例7的低親合 力親本克隆TN3-2僅能以其三聚形式在BiaCore上檢測(cè)到，因?yàn)槠鋯误w的親合力低于檢測(cè) 限度。參考文獻(xiàn)Studier 和 Moffat(1986)，Journal of Molecular Biology 189:113—130.Hochuli, Ε. ，Bannwarth, W. ,Dobel ,Η. ，Gentz，R.禾口 StUber，D. (1988)，Bio/ Technology 6 :1321_1325·Lorentsen, RH.等(2000)Biochemical Journal 347 83-87.
權(quán)利要求
含有3個(gè)單體的三聚多肽，其中每個(gè)所述的單體含有能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的特異性結(jié)合元件，且每個(gè)所述的單體含有三聚化結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子配體超家族 的成員。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的三聚多肽，其中所述的腫瘤壞死因子配體超家族的成員選自由下 述組成的組LTA ； TNF ； LTB ； TNFSF4 ； TNFSF5 ； TNFSF6 ； TNFSF7 ； TNFSF8 ； TNFSF9 ； TNFSF10 ； TNFSFl 1 ； TNFSF12 ； TNFSF13 ； TNFSF13B ； TNFSF14 ； TNFSF15 ；和 TNFSF18。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件是源自腫瘤壞死因子受體 超家族成員的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的三聚多肽，其中所述的腫瘤壞死因子受體超家族成員選自由下 述組成的組:TNFRSF1A, TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF1 OA, TNFRSF1 OB, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF Fnl4, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 和 TNFRSF23。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件源自TNFRSFlA(p55TNF受 體)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件源自TNFRSFlB(p75TNF受 體)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件是含有選自下述的氨基酸 序列的多肽TNFRSF1B 1-235 (SEQ ID NO 76), TNFRSFIB 1-185 (SEQ ID NO 77), TNFRSF1B 1-163 (SEQ ID NO 78)和 TNFRSFIB 1-142(SEQ ID NO :79)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件是含有由選自下述的DNA 序列編碼的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO 13)，TNFRSF1B D1D2，1/6(SEQ ID NO 15)，TNFRSFIB D1D2 1/4(SEQID NO 17)，TNFRSF1B D1D2,1/3 (SEQ ID NO 19), TNFRSF1B D1D2,1/2 (SEQ ID NO 21), TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO 23), TNFRSF1B D2 (SEQ IDNO 25)，TNFRSF1B D2,1/6(SEQ ID NO 26)，TNFRSF1B D2,1/4(SEQ IDNO27)，TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28), TNFRSF1B D2,1/2(SEQ IDNO 29)和 TNFRSFIB D2D4(SEQ ID NO: 30)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件是抗體或抗體片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的三聚多肽，其中所述的抗體或抗體片段能在至少一個(gè)區(qū)域內(nèi)結(jié) 合人TNF(SEQ ID NO :80)，該區(qū)域選自由下述的氨基酸殘基組成的區(qū)域氨基酸殘基1-18， 1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45，49-97，49-98，56-79，58-65，69-97，70-87， 76-90,96-105,105-128，108-128，110-127，115-125，117-128，132-157，135-155，136-153， 138-149，141-153 和 146-157。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的三聚多肽，其中所述的抗體或抗體片段選自MAb1(ECACC89080301)，MAb21 (ECACC 90012432)，MAb 25 (ECACC89121401)，MAb 32 (ECACC89080302)，MAb37 (ECACC 89080303)，MAb42 (ECACC 89080304)，MAb 47 (ECACC 89121402), MAb 53 (ECACC90012433)和 MAb 54 (ECACC 89083103)或其片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的三聚多肽，其中所述的抗體是D2E7或其片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的三聚多肽，其中所述的抗體是CDP870或其片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的特異性結(jié)合元件是具有C型凝集素樣結(jié)構(gòu) 域(CTLD)支架結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的三聚多肽，其中所述的具有C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合 元件是選自TN3-2-B(SEQ ID NO: 103)，TN3-2-C (SEQID NO 104)和 TN3_2_D(SEQ ID NO: 105)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚化結(jié)構(gòu)域是源自tetranectin。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化結(jié)構(gòu)域含有 與SEQ ID NO 81的序列具有至少68%氨基酸序列相同性的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的三聚多肽，其中所述的氨基酸序列相同性至少為75%，例如至 少87%，包括至少92%。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化結(jié)構(gòu)域含有 氨基酸序列SEQ ID NO :81ο
21.根據(jù)權(quán)利要求17的三聚多肽，其選自TN-2-B(SEQID NO 106)，TN-2-C (SEQ ID NO 108), TN-2-D(SEQ ID NO 107)和 AD1D4-GSS-I10(SEQID NO: 109)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的三聚多肽，其中還含有位于所述特異性結(jié)合元件和三聚化結(jié)構(gòu) 域之間的接頭。
23.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的三聚多肽。
24.治療患有由三聚細(xì)胞因子、例如腫瘤壞死因子介導(dǎo)的病理的對(duì)象的方法，包括給所述 的對(duì)象施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的三聚多肽或根據(jù)權(quán)利要求23的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的腫瘤壞死因子介導(dǎo)的病理選自類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、銀屑病和克羅恩氏病。
26.制備含有3個(gè)單體的三聚多肽的方法，每個(gè)所述單體含有能結(jié)合三聚多肽細(xì)胞因 子的特異性結(jié)合元件，且每個(gè)所述單體含有三聚化結(jié)構(gòu)域，所述的方法包括下述步驟(i) 在能表達(dá)所述三聚多肽的條件下，培養(yǎng)用編碼所述三聚多肽的載體轉(zhuǎn)化的宿主；和(ii)分 離所述的三聚多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的特異性結(jié)合元件含有選自下述的氨基酸 序列TNFRSFIB 1-235 (SEQ ID NO 76)，TNFRSFIB 1-185 (SEQ ID NO 77), TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO 78)和 TNFRSFIB 1-142(SEQID NO :79)。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的特異性結(jié)合元件是多肽，其含有由選自下述 的DNA序列編碼的氨基酸序列:TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO 13) ,TNFRSF1B D1D2,1/6 (SEQ ID NO 15),TNFRSF1B D1D21/4(SEQID NO :17)，TNFRSF1B D1D2,1/3(SEQ ID NO 19),TNFRSF1B D1D2,1/2 (SEQ ID NO :21)，TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO :23)，TNFRSF1B D2 (SEQ IDNO :25)， TNFRSF1B D2,1/6(SEQ ID NO 26),TNFRSF1B D2,1/4(SEQ IDNO :27)，TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28), TNFRSF1B D2,1/2 (SEQ IDNO :29)和 TNFRSFIB D2D4 (SEQ ID NO :30)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的三聚多肽的應(yīng)用。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的三聚多肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
31.檢測(cè)樣品中的三聚細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法，其包括(i)使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求 1的三聚多肽接觸，和(ii)檢測(cè)所述三聚多肽與所述三聚細(xì)胞因子的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的三聚結(jié)合單元。更具體地，提供了含有三聚化結(jié)構(gòu)域和3個(gè)單體的三聚多肽，所述單體含有能結(jié)合三聚細(xì)胞因子的結(jié)合元件。優(yōu)選地，該三聚結(jié)合單元以這樣的方式結(jié)合，使得在結(jié)合以后，能基本上封閉三聚細(xì)胞因子的全部受體結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制三聚細(xì)胞因子的潛在生物活性。一方面，本發(fā)明涉及能結(jié)合腫瘤壞死因子配體超家族的三聚細(xì)胞因子例如TNF、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL和BAFF的三聚結(jié)合物。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101899106SQ20101013525
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者H·K·奧托, M·H·安德森, T·L·霍爾帝特 申請(qǐng)人:阿納福公司