專利名稱：快速高效檢測致病菌的方法、生物敏傳感器及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食品安全檢測技術領域，特別是涉及一種快速高效檢測致病菌的方法、生物傳感器及其制備方法。
背景技術：
近年來世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件屢有發(fā)生，無論發(fā)達國家還是發(fā)展中國家， 食源性致病菌發(fā)生率居高不下，食源性致病菌的快速檢測一直是國內(nèi)外研究關注的焦點。 現(xiàn)有技術一般采用如下的檢測方法對食源性致病菌進行快速檢測方案一、傳統(tǒng)的微生物法，即GB13091-2002規(guī)定的檢測方法，一般需要以下五個連續(xù)的階段用非選擇性液體培養(yǎng)基預增菌16 20小時；在選擇性液體培養(yǎng)基上增菌24 小時；選擇性培養(yǎng)基上劃線識別24小時；分離，挑出菌落再次培養(yǎng)24小時；鑒定，用合適的生化和血清學實驗進行鑒定76h最終得出檢測結果。由上述步驟可以看出，傳統(tǒng)的微生物法檢測致病菌的步驟包括富集、選擇培養(yǎng)、分離、生化鑒定、有時還需要種型確定，需要5 7天才能出報告，耗時長，操作繁瑣。方案二、實時聚合酶鏈式反應(PCR，Polymerase Chain Reaction)法，如 SNT1869-—2007食品中多種致病菌快速檢測方法；公開號CN1536090A、名稱為“食源性致病菌快速檢測基因芯片及其應用”的方案；公開號為CN1814789A、名稱為“畜禽肉和水產(chǎn)品中常見致病菌多重PCR快速檢測試劑盒及其檢測方法”等，上述PCR技術均需要經(jīng)過特定引物設計、增菌，DNA或PNA的制備，PCR擴增、檢測等步驟。但PCR技術由于及其敏感，很容易受外界因素影響，一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結果。一方面，食品是復雜的反應基質，影響PCR反應的因素很多，如果不能有效排除各影響因素的干擾，可能會出現(xiàn)假陽性結果；另一方面，如果在PCR操作過程中各種試驗條件控制不當，很容易導致產(chǎn)物突變，還可能會導致假陰性結果。引物的設計及靶序列的選擇是決定PCR結果的關鍵因素，引物不同則擴增物不同，如果引物的設計不當.則直接影響對關鍵靶序列的選擇，從而降低PCR檢測的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。另外，PCR方法所需的試劑昂貴，有些還對人身體有害，并且檢測過程中操作繁瑣復雜，需要較長的檢測時間，總體檢測時間大于48 小時。方案三、ELISA方法，如GB/T22429-2008規(guī)定的檢測方法，包括對樣品做前增菌處理24小時，增菌液經(jīng)加熱處理后一如包被特異性抗體(一抗)的固相容器內(nèi)，使目標菌與一抗結合，洗去未結合的其他成分；加入特異性酶標二抗，再次洗去未結合的其他成分； 加入特定底物與之反應，生成熒光化合物或有色化合物，通過檢測熒光強度或吸光度，與參照值比較，經(jīng)過2. 5小時得出檢驗結果。但ELISA方法也有其無法克服的缺點首先，該技術的操作技巧性較強，而且對關鍵點的控制對結果影響很大，在ELISA方法中重要的第一步加樣，樣品加入及混勻過程的誤差會在以下的諸多操作中被逐級放大，造成檢測結果偏差較大甚至出現(xiàn)假陽性和假陰性；其次，操作過程中易出現(xiàn)孔間交叉污染，出現(xiàn)假陽性；另夕卜，該方法檢測限較高，達到IO6Cfu (ColonyForming Units，菌落形成單位)/升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速高效檢測致病菌的方法，可解決現(xiàn)有技術檢測限高、檢測時間較長、過程煩瑣、成本高等問題。本發(fā)明還提供了一種生物敏傳感器及其制備方法，以保證上述快速高效檢測致病菌的方法在實際中的應用。為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種快速高效檢測致病菌的方法，包括生物敏傳感器制備步驟在酶標板的每個酶標孔中將嗜熱菌超聲破碎后形成并標記有PH敏感熒光探針的色素體，與β亞基單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體按4 1的體積比例混合均勻，在40轉/分鐘、35 38°C條件下孵育1小時，得到具有捕獲檢測目標能力的生物敏傳感器；檢測物捕獲步驟在酶標板的每個酶標孔加入10微升制備好的生物敏傳感器，再加入20 100微升樣品檢測液，同時設置空白對照和標準品陽性濃度對照，在35 38°C條件下孵育25 35分鐘，捕獲檢測目標物；檢測步驟在酶標板的每個酶標孔再加入70微升腺苷三磷酸合成緩沖液啟動腺苷三磷酸合成反應，在38 45°C溫度下溫浴10 15分鐘后，用熒光掃描儀進行檢測；其中，所述熒光掃描儀的激發(fā)波長為485納米、發(fā)射波長為538納米；所述腺苷三磷酸合成緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，10%的丙三醇，濃度為5毫摩爾/升的磷酸二氫鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至8. 0，臨用前加入終濃度為2毫摩爾的腺苷二磷酸。優(yōu)選的，在所述檢測物捕獲步驟之前還包括樣品預處理步驟將按標準處理程序制備的檢測樣品進行滅活處理，取1 10毫升震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進行4000轉 /分鐘、30分鐘的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。優(yōu)選的，在所述檢測步驟之后還包括數(shù)據(jù)處理步驟參照空白組和陽性對照組對檢測樣品是否含有致病菌進行定性判斷。優(yōu)選的，所述生物敏傳感器包括具有信號轉化功能的色素體和具有分子識別功能的捕獲體系，所述生物敏傳感器的制備方法具體包括色素體制備步驟在60 80°C高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時，然后在4°C、 4000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時間為10分鐘的條件下進行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘去除細胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在 40C，40000轉/分鐘的條件下超速離心1小時，將沉淀用三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸， 濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100 毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)pH值至 8. 0.
pH敏感熒光探針標記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質量濃度為1毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時間為3分鐘的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補滿試管；然后在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30 分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的pH敏感熒光探針，得到標記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為pH值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復合體、檢測目標物單抗_生物素復合體按1 1的體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到具有捕獲能力的β亞基單抗-生物素_鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體組成的復合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標板的每個孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體，以及10微升標記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時，得到可以捕獲檢測目標物的生物敏傳感器。優(yōu)選的，在所述捕獲體系的構建步驟之前，還包括判斷所述FOFl-ATP酶的β亞基單抗溶液和檢測目標物的單抗溶液中是否含有疊氮化鈉，若是，則使用ΡΗ8.0的磷酸鹽緩沖液透析去除其中的疊氮化鈉。 優(yōu)選的，在所述捕獲體系構建步驟之前還包括β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈式反應方法擴增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進行克隆、外源表達、純化，再經(jīng)過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。優(yōu)選的，所述FOFl-ATP酶的β亞基的序列為ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTC
MGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。依據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例，還公開了一種生物敏傳感器，包括具有信號轉化功能的色素體和具有分子識別功能的捕獲體系，其中所述色素體為嗜熱菌超聲后細胞膜外翻形成的小囊泡，該小囊泡的膜上鑲嵌有FOFl-ATP酶，色素體細胞內(nèi)標記有pH敏感熒光探針；所述捕獲體系為FOFl-ATP酶的β亞基單抗與生物素連接形成的復合體，以及，檢測目標物單抗與生物素連接形成的復合體，通過鏈親和素連接得到的β亞基單抗-生物素_鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體。依據(jù)本發(fā)明的還一優(yōu)選實施例，公開了一種生物敏傳感器的制備方法，包括色素體制備步驟在60 80°C高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時，然后在4°C、 4000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時間為10分鐘的條件下進行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘去除細胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在 440000轉/分鐘的條件下超速離心1小時，將沉淀用羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)PH值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)PH值至8. 0 ；pH敏感熒光探針標記步驟取色素體懸液600微升，在12000 轉/分鐘的條件下離心30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入 1 2微升質量濃度為1毫克/毫升的pH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時間為3分鐘的條件下進行0 4°C水浴下超聲，之后用濃度為10毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖液補滿試管；然后在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的PH敏感熒光探針，得到標記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為 pH值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復合體、檢測目標物單抗_生物素復合體按1 1的體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到具有捕獲目標檢測物功能的β亞基單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體組成的復合體
生物敏傳感器生成步驟在酶標板的每個孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體，以及10微升標記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時，得到可以捕獲檢測目標物的生物敏傳感器。優(yōu)選的，在所述捕獲體系構建步驟之前還包括β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈式反應方法擴增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進行克隆、外源表達、純化，再經(jīng)過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點首先，本發(fā)明方案的檢測限低，檢測時間短。其檢測限可達到IOOcfu/孔，若按 lcfu/25g計算，整個檢測過程不超過12小時，至少比常規(guī)的微生物檢驗方法縮短60小時， 比PCR方法縮短36小時；當菌濃度高于lCfU//25g時，所需時間更短，因此，可對食品安全和治病菌控制產(chǎn)生深刻影響。其次，本發(fā)明方案所需試
第三，本發(fā)明方案還具有前增菌時間短、操作簡單(僅包括生物敏傳感器制備、力口樣和啟動反應、檢測等三個步驟，而且每批次可以檢測多個樣品)、可避免現(xiàn)有PCR檢測方法因外界因素影響而出現(xiàn)假隱性或假陽性檢測結果等優(yōu)點。另外，本發(fā)明方案不僅可參照空白組和陽性對照組對被檢測物進行致病菌類的檢測，還根據(jù)不同濃度標準品的相對熒光強度建立的曲線對被檢測物進行藥殘類檢測。


圖1是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實施例所制備的色素體結構示意圖；圖2是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實施例PH敏感熒光探針單方向標記色素體過程示意圖；圖3是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實施例捕獲體系構建過程示意圖；圖4是本發(fā)明生物敏傳感器一實施例基于FOFl-ATP酶的生物敏傳感器的模型示意圖；其中，41-酶標孔；42-膜上負載有FOFl-ATP酶的色素體；43-F0F1-ATP酶；44_pH 敏感熒光探針；45-F0F1-ATP酶的β亞基單抗；46-生物素；47-鏈親和素；48-目標檢測物單克隆抗體。
具體實施例方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。本發(fā)明的核心構思之一在于利用FOFl-ATP(Adenosine-Triphosphate，腺苷三磷酸)酶獨有的酶活機理研發(fā)了高靈敏生物傳感器FOFl-ATP酶的致病菌檢測技術。 FOFl-ATP酶是一旋轉分子馬達，它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能水解ATP而反向轉運 H+。在ATP合成過程中，質子能夠從色素體膜內(nèi)泵到膜外側，導致內(nèi)膜微環(huán)境溶液H+濃度變化。在FOFl-ATP酶上連接負載會不同程度影響其旋轉性能，在其β亞基上連接上不同負載引起質子轉運速率的改變不同。以PH敏感的熒光探針來感應負載，其熒光強度作為信號反應并定量負載情況，最終達到檢測目的。本發(fā)明方案中生物敏傳感器中生物識別元件為單克隆抗體，信號轉換元件為光學元件。其基本原理為待測物質和分子識別元件特異性結合，發(fā)生生物化學反應，產(chǎn)生的生物學信息通過信號轉換器轉化為可以定量處理的光信號，再經(jīng)儀表放大和輸出，從而達到分析檢測的目的。生物敏傳感器分析技術與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有選擇性好、靈敏度高、 分析速度快、成本低等優(yōu)點。對食品安全和致病菌疾病爆發(fā)的預防具有重大意義。在食品污染物的快速實時及特異性檢測方面有廣闊的應用前景。生物敏傳感器及其制備方法實施例一種檢測致病菌的生物敏傳感器，包括(1)具有信號轉化功能的色素體。從嗜熱菌制備得到的色素體，是嗜熱菌超聲后細胞膜外翻形成的小囊泡，該囊泡膜上鑲嵌的 FOFl-ATP酶也隨之外翻——疏水端暴露。(2)具有分子識別功能的捕獲體系。該生物敏傳感器可采用如下步驟制備步驟一、嗜熱菌ATPase的β亞基的外源表達與純化以嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502)基因組為模板，以PCR方法擴增 FOFl-ATP酶的β亞基，然后對擴增基因測序并進行序列比對，確定所擴增基因為FOFl-ATP 酶的β亞基，其序列為 ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTCMGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。對此序列分子克隆、外源表達，純化，進行單克隆抗體制備。制備得到的單克隆抗體進行分子篩純化，備用。因得到的β亞基需要為期半年左右的單克隆抗體制備過程，方可得到該亞基單抗，因此本步驟需要在生物敏傳感器制備之前預先執(zhí)行。步驟二、色素體的制備在60 80 °C 高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502) 20 24h (Hour,小時)。然后在 4 "C >4000rpm(Revolutions Per Minute,轉 / 分鐘)條件下離心30min(Minute，分鐘)，棄上清，收集沉淀菌體。菌體用洗滌緩沖液(50mmol/L tricine-NaOH, ρΗ8· 0，0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 緩沖液)重懸，在 4 °C、8000rpm 條件下離心lOmin，收集清洗后的菌體進行低溫超聲破碎(200w，on 5s, off 9s，有效時間 IOmin)。超聲破碎后的菌液在4°C、12000rpm條件下離心30min去除細胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm條件下進行超速離心lh，沉淀即為色素體。所得色素體用 Tris-HCl 緩沖液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10% 甘油， pH8. 0)懸浮備用。該色素體的結構如圖1所示，包括超聲過程中細胞膜外翻形成的囊泡和 F0F1-ATP酶；該囊泡不僅是F0F1-ATP酶的載體，同時為該酶提供質子庫，而膜內(nèi)外的質子梯差是該酶合成ATP的動力；F0F1-ATP酶包括Cn (10彡η彡14)環(huán)、以及α、β、δ、γ、 ε、a、b2亞基，在本發(fā)明方案中，選擇在F0F1-ATP酶的活性部位(即β亞基上)負載目標檢測物。步驟三、用ρΗ敏感熒光探針F1300單方向標記色素體及標記后水解活性測定取步驟二制備的色素體懸液600 μ L，在12000rpm條件下離心30min去甘油，所得的沉淀用超聲緩沖液(ρΗ5· 0 6. 0,0. Olmmol/L Tris-HCl)懸浮到原體積。然后加入1 2口1^質量濃度為111^/1^的？1300熒光探針，混勻，在0 41水浴下超聲(小功率下On 5s, Off 8s，有效時間3min)。超聲完成后用單倍磷酸鹽緩沖液(1XPBS，Phosphate Buffered Saline)補滿試管，然后在4°C、12000rpm條件下離心30min，用pH8. 0-8. 5緩沖液懸浮沉淀，重復4次，后三次離心時間為15min，其他條件不變，最終完全去除游離F1300探針，得到標記好的色素體(以下簡稱F1300-ch)。標記流程如圖2所示，包括加入熒光探針步驟21、 低PH值條件下超聲步驟22以及離心去除游離探針步驟23。需要說明的是，由于超聲放熱，為保證0 4°C的水浴條件，可選擇在水中放冰。F1300-ch的ATP水解活性測定可采用酶偶聯(lián)法，通過檢測NADH在340nm波長處的吸光度變化來測定ATPase水解活力。1個酶活單位定義為每毫克色素體每分鐘內(nèi)可水解 lymol ATP0步驟四、具有分子識別功能的捕獲體系的構建將F0F1-ATP酶的β亞基的單抗(步驟一制備)與生物素、檢測目標物的單抗與生物素的連接比例均按3 2混合，室溫半小時。其中抗體濃度為0. lmg/mL;生物素濃度為1 μ mol/L。如果抗體的儲存液中含有疊氮化鈉(NaN3)，使用前先采用pH8. 0的磷酸鹽緩沖液透析去除NaN3。F0F1-ATP酶的β亞基單抗-生物素、檢測目標物單抗-生物素兩復合體按1 1 體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 μ mol的鏈親和素，室溫15 30min。得到具有捕獲目標檢測物的β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體組成的復合體。上述捕獲體系的構建過程如圖3所示。步驟五、生物敏傳感器的完成
在酶標板每孔中加入40 μ Li3單抗-生物素_鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體，10 μ IL F1300-ch，輕輕敲打混勻。在40rpm、35 38°C (優(yōu)選采用 370C )條件下孵育lh，得到可以捕獲檢測目標的生物敏傳感器，該生物敏傳感器的結構示意圖如圖4所示。利用生物敏傳感器檢測樣品中致病菌的方法實施例步驟一、樣品預處理

將參照GB/T 4789. 30規(guī)定的程序制備的檢測樣品進行滅活處理，取1 IOmL震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進行4000rpm、30min的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。需要說明的是，不同的致病菌滅活的溫度和需要滅活的時間都是不同的，需要選擇最溫和的滅活條件，來保證對其破壞降低到最低限度，如0157 :H7菌55°C、5 20min即可滅活；單增李斯特70 80°C、20 30min即可滅活；而金黃色葡萄球菌一般需要80°C、 Ih滅活。步驟二、檢測物的捕獲在酶標板的每個酶標孔加入10 μ L前述生物敏傳感器制備步驟制備好的生物敏傳感器，再加入20μ L IOOyL樣品處理液。同時設置空白對照和標準品陽性對照，35°C 38°C孵育25 35min (優(yōu)選采用37°C孵育30min)，捕獲檢測目標物。步驟三、檢測在酶標板的每孔再加入70 μ L ATP合成緩沖液(50mmol/L Tricine_Na0HpH8. 0、 10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2,臨用前加入終濃度為2mmol腺苷二磷酸ADP) 啟動ATP合成反應，38 45°C溫浴10 15min (優(yōu)選采用45°C溫浴15min)后用熒光掃描儀進行檢測，選擇激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長538nm。步驟四、數(shù)據(jù)處理參照空白組和陽性對照組對檢測物中的致病菌進行定性判斷。需要說明的是，通過本發(fā)明方案，還可以根據(jù)不同濃度標準品的相對熒光強度建立的標準曲線對食品中抗生素、藥殘情況進行定量判斷。下面，以食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測方法為例，具體說明利用生物敏傳感器檢測食源性致病菌的方法，包括步驟一、樣品預處理參照GB/T 4789. 30規(guī)定的程序，制備檢測樣品，并進行增菌培養(yǎng)；其中，增菌的處理過程具體為增菌液60 70°C，進行5 20min滅活，然后取1 IOmL震蕩混勻的滅活后的增菌液，在4000rpm、30min條件下進行分離，所得菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，重復操作分離和懸浮過程兩次。第三次離心得到的菌體，用無菌生理鹽水懸浮到原體積，震蕩混勻，作為檢測液備用。步驟二、陽性對照培養(yǎng)標準菌株(ATCC15313) 18 24h，將菌液梯度稀釋后涂板計數(shù)，算出標準菌液濃度為5. 03X 108cfu/mL，標準菌株液體的增菌處理過程與前述增菌過程相同。沉淀的菌體恢復至原體積后梯度稀釋得到5X 103、5X 104、5X IO5CfVmL的陽性對照。需要說明的是，由于對致病菌檢測為定性檢測，理論上講只需要一組陽性對照即可，這里設計多個陽性對照組，是為了更好的說明本技術方案的可行性。步驟三、FOFl-ATP酶免疫生物傳感器的制備首先，進行制備色素體，并進行熒光標記，具體步驟為在60°C 高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502) 24h，然后在 4 °C、 4000rpm的條件下離心30min，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液(50mmol/L tricine-NaOH, pH8. 0,0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 緩沖液)重懸，然后在 4°C、8000rpm 的條件下離心lOmin，收集清洗后的菌體，在功率為200w、0N 5s,OFF 9s、有效時間為IOmin 的條件下進行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000rpm的條件下離心30min去除細胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm的條件下超速離心lh，將沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10%甘油，pH8. 0) 懸浮，得到色素體懸液，pH敏感熒光探針標記步驟取色素體懸液600μ ，在12000rpm的條件下離心 30min去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液(pH5. 0 6. 0,0. 01mmol/LTris-HCl)超聲懸浮到原體積；然后加入IpL質量濃度為lmg/mL的pH敏感熒光探針F1300，混勻，在小功率下 ON 5s、OFF 8s、有效時間為3min的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補滿試管；然后在4°C、 12000rpm的條件下離心30min，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時間為15min，其他條件不變，最終完全去除游離的pH敏感熒光探針， 得到標記好的色素體；其次，是捕獲體系的建立步驟將F0F1-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標物的單抗與生物素均按3 2 的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0. lmg/mL、生物素濃度為lymol/L，室溫條件下等待半小時；然后，將F0F1-ATP酶的β亞基單抗-生物素復合體、檢測目標物單抗-生物素復合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積1微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 分鐘后，得到具有捕獲目標檢測物的β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體組成的復合體；第三，F(xiàn)0F1-ATP酶免疫生物傳感器的完成生物敏傳感器生成步驟在酶標板的每個孔中加入40 μ L的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體，以及10 μ L標記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40rpm、35 38°C環(huán)境下孵育lh，得到可以捕獲檢測目標物的生物敏傳感器。步驟四、檢測首先，在酶標板的酶標孔中加樣，包括樣品檢測液、5X 103Cfu/mL陽性對照、5X 104cfu/mL陽性對照、5X 105cfu/mL的陽性對照、空白對照(無菌生理鹽水)共五組，選用英國Corning公司酶標板，每組設置10個平行孔，每孔加入20 μ L，五組分別對應“未知數(shù)量”cfu/孔，IO2Cfu/孔，IO3Cfu/孔，IO4Cfu/ 孔和 Ocfu/ 孔，37 °C 孵育 30min。然后，啟動合成反應并記錄檢測結果每孔再加入70 μ L終濃度為2mmol/L ADP的ATP合成緩沖液(50mmol/LTricine
14ρΗ8· 0、10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2)啟動 ATP 合成反應，45°C溫浴 15min， 選擇激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長538nm進行反應后相對熒光值的檢測。步驟五、檢測結果如下
權利要求
1.一種快速高效檢測致病菌的方法，其特征在于，包括生物敏傳感器制備步驟在酶標板的每個酶標孔中將嗜熱菌超聲破碎后形成并標記有 PH敏感熒光探針的色素體，與β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標檢測物單克隆抗體組成的捕捉復合體按4 1的體積比例混合均勻，在40轉/分鐘、35 38°C條件下孵育1小時，得到具有捕獲目標檢物能力的生物敏傳感器；檢測物捕獲步驟在酶標板的每個酶標孔加入10微升制備好的生物敏傳感器，再加入 20 100微升樣品檢測液，同時設置空白對照和標準品陽性對照，在35 38°C條件下孵育 25 35分鐘，捕獲目標檢測物；檢測步驟在酶標板的每個酶標孔再加入70微升腺苷三磷酸合成緩沖液啟動腺苷三磷酸合成反應，在38 45°C溫度下溫浴10 15分鐘后，用熒光掃描儀進行檢測；其中，檢測用到熒光掃描儀的激發(fā)波長為485納米、發(fā)射波長為538納米；所述腺苷三磷酸合成緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升、pH值為8. 0的離子緩沖劑，10%的丙三醇，濃度為5毫摩爾/ 升的磷酸二氫鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂，臨用前加入2毫摩爾的腺苷二磷酸。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在所述檢測物捕獲步驟之前還包括樣品預處理步驟將按標準處理程序制備的檢測樣品進行滅活處理，取1 10毫升震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進行4000轉/分鐘、30分鐘的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在所述檢測步驟之后還包括數(shù)據(jù)處理步驟參照空白組和陽性對照組對檢測樣品是否含有致病菌進行定性判斷。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述生物敏傳感器包括具有信號轉化功能的色素體和具有分子識別功能的捕獲體系，所述生物敏傳感器的制備方法具體包括色素體制備步驟在60 80°C高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時，然后在4°C、4000 轉/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在 48000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5 秒斷開9秒、有效時間為10分鐘的條件下進行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、 12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘去除細胞碎片和大部分雜蛋白，收集上清液再在4°C， 40000轉/分鐘的條件下超速離心1小時，將沉淀用三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮， 得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至 8.0;所述羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào) pH值至8. 0 ；PH敏感熒光探針標記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉/分鐘的條件下離心 30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質量濃度為1 毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時間為3分鐘的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補滿試管；然后在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，用 PH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的PH敏感熒光探針，得到標記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為pH值5. O 6. O、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液；捕獲體系的構建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復合體、檢測目標物單抗-生物素復合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積濃度為1 微摩爾/升的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到β亞基單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體組成的捕捉復合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標板的每個孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體，以及10微升標記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時，得到可以捕獲檢測目標物的生物敏傳感器。
5.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系構建步驟之前還包括 β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈式反應方法擴增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進行克隆、外源表達、純化，最后通過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。
6.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述FOFl-ATP酶的β亞基的序列為 ATGACAAGAGGACGCGTTATCCAAGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCAAGTTTGAGAACGGCCACTTGC CGGCGATCTACAACGCCCTGAAAATTCAACATAAAGCGCGCAACGAAAACGAAGTCGACATCGACTTGAC ATTGGAAGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTC ATCCGCGGCATGGAAGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGAAGTCACGCTTGGCC GCGTGTTCAACGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGAAGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCC GATTCACCGTCCGGCGCCAAAATTCGAGGAATTGGCGACGGAAGTCGAAATTTTGGAAACGGGGATTAAA GTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAAAGGCGGAAAAATCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGAA AAACGGTCTTGATTCAAGAGCTGATCCACAACATCGCCCAAGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGG CGTCGGCGAACGGACGCGCGAAGGAAACGACTTGTACCATGAGATGAAAGATTCCGGCGTCATCAGCAAA ACGGCCATGGTGTTCGGACAAATGAATGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGA CGATGGCCGAATACTTCCGTGATGAACAAGGCCAAGACGTGTTGCTCTTTATCGATAACATCTTCCGTTT CACGCAGGCCGGTTCGGAAGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCAACCGACA TTGGCGACGGAGATGGGTCAATTGCAAGAGCGGATCACGTCGACGGCGAAAGGATCGATCACCTCGATTC AAGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGC GACGACGAACCTGGAGCGGAAGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACA TCGCGTGCGTTGGCGCCGGAAATCGTCGGCGAGGAGCACTACCAAGTCGCCCGCAAAGTGCAGCAAACGC TGCAACGTTATAAAGAATTGCAAGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGAACTGTCGGATGAAGACAA ACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAAACTTCCACGTGGCGGAGCAGTTC ACGGGCCAACCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAAAGAAACAGTGCGCGGCTTTAAAGAAATTTTGGAAGGCA AATACGACCATCTTCCGGAAGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGAAGAAGTCGTTGAAAAAGCGAA AGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。
7.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系的構建步驟之前，還包括判斷所述FOFl-ATP酶的β亞基單抗溶液和檢測目標物的單抗溶液是否含有疊氮化鈉，若是，則使用ΡΗ8. 0的磷酸鹽緩沖液透析去除其中的疊氮化鈉。
8.一種用于致病菌檢測的生物敏傳感器，其特征在于，包括具有信號轉化功能的色素體和具有分子識別功能的捕獲體系，其中所述色素體為嗜熱菌超聲后細胞膜外翻形成的小囊泡，該小囊泡的膜上鑲嵌有 FOFl-ATP酶，色素體細胞內(nèi)標記有ρΗ敏感熒光探針；所述捕獲體系為FOFl-ATP酶的β亞基單抗與生物素連接形成的復合體，以及，檢測目標物單抗與生物素連接形成的復合體，通過鏈親和素連接得到的β亞基單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體具有捕捉功能的復合體。
9.一種用于食品安全檢測的生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括色素體制備步驟在60 80°C高溫搖床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時，然后在4°C、4000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時間為10分鐘的條件下進行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘去除細胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000轉/分鐘的條件下超速離心1小時，將沉淀用羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)ρΗ值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉， 濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)ρΗ值至8. 0 ；PH敏感熒光探針標記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉/分鐘的條件下離心 30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質量濃度為1 毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時間為3分鐘的條件下進行0 4°C水浴下超聲，之后用濃度為10毫摩爾的磷酸鹽緩沖液補滿試管；然后在4°C、 12000轉/分鐘的條件下離心30分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復執(zhí)行離心、 懸浮過程4次，后三次的離心時間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的ρΗ敏感熒光探針，得到標記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為ρΗ值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復合體、檢測目標物單抗-生物素復合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積1微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素_目標檢測物單克隆抗體捕捉復合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標板的每個孔中加入40微升的具有捕獲功能的β單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標檢測物單克隆抗體組成的復合體，以及10微升標記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時，得到可以捕獲檢測目標物的生物敏傳感器。
10.如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系構建步驟之前還包括 β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈式反應方法擴增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進行外源表達、純化，經(jīng)過單克隆抗體的制備得到 FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速高效檢測致病菌的方法、生物傳感器及其制備方法，其中，所述生物傳感器包括具有信號轉化功能的色素體和具有分子識別功能的捕獲體系；所述快速高效檢測致病菌的方法包括生物敏傳感器的制備，用生物敏傳感器捕獲樣品檢測液，同時設置空白對照和標準品陽性濃度對照，啟動腺苷三磷酸合成反應，然后用熒光掃描儀進行檢測。本發(fā)明方案的檢測限低，檢測時間短，其檢測限可達到100cfu/孔，若按1cfu/25g計算，整個檢測過程不超過12小時，至少比常規(guī)的微生物檢驗方法縮短60小時，比PCR方法縮短36小時；當樣品中菌濃度高于1cfu/25g時，所需時間更短，因此，可對食品安全和治病菌控制產(chǎn)生深刻影響。
文檔編號G01N33/52GK102221610SQ20101015061
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者亢子佳, 倫永志, 劉清珺, 武會娟, 魏玲 申請人:北京市理化分析測試中心