專利名稱：一種中藥生物芯片的基片及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)與化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物芯片是指高密度固定在固定相支持介質(zhì)上的生物信息分子的微陣列，陣列中 的每個(gè)分子及位置都是已知的。生物芯片技術(shù)起源于核酸分子雜交，即所謂的基因芯片，可 對生物的基因組及其表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，生物芯片已朝多元化方 向發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了對化合物、蛋白質(zhì)、多肽、DNA、生物組織等生物組分的準(zhǔn)確、快速和大信息量 的檢測。生物芯片由基片和探針兩部分組成?；话闶墙?jīng)過有機(jī)活 性基團(tuán)修飾的玻璃 片、硅片或尼龍膜等材料。探針是可與生物組分特異性結(jié)合的物質(zhì)，如核酸、抗體等，選擇不 同的類型探針可實(shí)現(xiàn)對不同生物組分的檢測，通過與基片表面上修飾的有機(jī)活性基團(tuán)結(jié)合 而固定在基片上。目前，市面上出售的生物芯片基片上按其與探針結(jié)合方式分類可分為兩 種一種是有機(jī)活性基團(tuán)通過靜電吸附方式與探針結(jié)合的(如聚賴氨酸修飾的基片)，由于 靜電作用較弱，這類基片與探針的結(jié)合不牢固，探針在雜交、洗脫過程容易脫落；另一種是 有機(jī)活性基團(tuán)通過共價(jià)方式與探針結(jié)合的(如氨基修飾的基片和醛基修飾的基片)，這類 基片與探針結(jié)合較為牢固，適用于含有豐富羥基或氨基的物質(zhì)，如DNA、蛋白質(zhì)。生物芯片技術(shù)的研究與發(fā)展為中草藥有效成分的大規(guī)模篩選提供了一個(gè)很好的 平臺。傳統(tǒng)芯片藥物篩選方法是先將藥物作用于腫瘤細(xì)胞，從其細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化上 觀察藥物的作用。這種篩選是從機(jī)理上對藥物進(jìn)行篩選、配伍，并不是一個(gè)靶向性篩選藥物 有效成份的系統(tǒng)，存在篩選的周期長，耗費(fèi)非常大，效率不高等缺點(diǎn)。中草藥的有效成分多 為醛酮類、苷類以及生物堿類等小分子有機(jī)物，但是目前市售的生物芯片基片的開發(fā)主要 是針對用來固定連接蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，對于專門固定有機(jī)小分子物質(zhì)的片基沒 有報(bào)道。如何利用新方法，制備一種能高效固定有機(jī)小分子物質(zhì)，并開發(fā)出以這些有機(jī)小分 子物質(zhì)為探針的中藥生物芯片用于靶向藥物的篩選，有著重要的社會和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可固定有機(jī)小分子的中藥生物芯片基片。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是—種中藥生物芯片的基片，該基片由硅烷化玻片和其表面的有機(jī)活性基團(tuán)構(gòu)成， 其特征在于所述有機(jī)活性基團(tuán)為-(CH2)2SO2CH = CH2，該基團(tuán)通過-0-與所述硅烷化玻片表 面上的硅烷基團(tuán)共價(jià)連接。本發(fā)明所述基片實(shí)際上是利用表面合成技術(shù)，在硅烷化玻片上的Si-O-鍵上衍生 活潑乙烯基得到(其結(jié)構(gòu)如說明書附圖的圖1所示)，其制備方法由以下步驟組成(1)清洗將玻片浸于濃度為0. 5 2M的強(qiáng)堿溶液中2 5小時(shí)，用無菌水清洗 干凈，然后置于體積百分比含量為1 10%的鹽酸或硫酸中浸泡過夜，最后用無菌水清洗；
(2)硅烷化將清洗后的玻片放入硅烷化溶液中浸泡0. 5 2小時(shí)，然后放入 0. 01 0. 5M的硫酸或鹽酸中水解1 2小時(shí)，再用滅菌水清洗3 5次，晾干，得到硅烷化 玻片；(3)活化將已硅烷化的玻片在含二乙烯基砜的活化液中浸泡1 2小時(shí)，使活化 液中的二乙烯基砜和硅烷化玻片表面的硅烷基團(tuán)反應(yīng)，將有機(jī)活性基團(tuán)-(CH2)2SO2CH = CH2 結(jié)合到硅烷化的玻片的表面，然后用丙酮洗去玻片表面未反應(yīng)的二乙烯基砜即可；上述步驟中，所述的強(qiáng)堿溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液；所述的硅烷化溶液是1 15% (ν/ν)的縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷(GOPS) 的乙醇溶液；所述的活化液是體積比為二乙烯基砜(DVS)碳酸鈉水溶液=1 10的混合溶 液，其中所述的碳酸鈉水溶液的濃度為0. 5mol/L。在上述步驟(3)的活化過程中，活化液中的二乙烯基砜分子一頭的碳碳雙鍵 斷裂后與硅烷化玻片表面的Si-O-共價(jià)結(jié)合，從而在硅烷化玻片表面引入有機(jī)活性基 團(tuán)-(CH2)2SO2CH = CH2。由于有機(jī)活性基團(tuán)-(CH2)2SO2CHCH2中的乙烯基十分活潑，可與醛酮 類、苷類以及生物堿類等小分子有機(jī)物中的醇羥基、酚羥基、羰基、氨基或不飽和雙鍵等發(fā) 生加成反應(yīng)形成共價(jià)鍵，因此本發(fā)明所述的基片可用于制備以小分子有機(jī)物為探針的篩選 中藥有效成份的生物芯片。本發(fā)明所述基片固定含羥基有機(jī)小分子物質(zhì)的過程如說明書附 圖的圖2所示。由于中藥的有效成分多為醛酮類、苷類以及生物堿類等小分子有機(jī)物，因此可用 中藥的有效成分作為本發(fā)明芯片基片的探針，獲得一種可對中草藥中有效成份進(jìn)行靶向性 篩選的生物芯片，本發(fā)明將此芯片稱為中藥生物芯片，其制備方法可參考以下步驟用生物芯片點(diǎn)樣儀將中藥提取物打印(點(diǎn)樣)于本發(fā)明所述中藥生物芯片的基 片上，然后迅速在120 130°C下干燥，最后用封閉液洗滌3 5次以封閉多余的活性乙烯 基；所述的封閉液是由碳酸鈉和2-巰基乙醇的混合水溶液，其中碳酸鈉的濃度為0. 5mol/ L，2-巰基乙醇的體積百分比含量為1 5%。本發(fā)明所述的中藥生物芯片實(shí)際上是將眾多的中藥化合物分子集成在固相載體 (即本發(fā)明所述的基片)上，可實(shí)現(xiàn)中草藥中有效的治療成份的靶向性及高通量篩選，其方 法如下將中藥分離的組份固定在化學(xué)處理過的玻璃片基上，制成中藥生物芯片，用靶蛋白 與芯片進(jìn)行雜交，然后再用抗體雜交檢測，找出與靶蛋白相互作用的組份。用本發(fā)明中藥生 物芯片可實(shí)現(xiàn)快速且高通量篩選中草藥中有治療作用的組分，有助于中醫(yī)藥學(xué)研究的快速 發(fā)展。


圖1是本發(fā)明所述中藥生物芯片基片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中矩形框選部分為硅烷化玻片，linker表示縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷。圖2是本發(fā)明所述中藥生物芯片基片固定含羥基有機(jī)小分子物質(zhì)的過程示意圖， 其中矩形框選部分為硅烷化玻片，linker表示縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷。圖3是本發(fā)明所述中藥生物芯片(即中藥生物芯片)與蛋白質(zhì)相互作用的雜交結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的例子來介紹本發(fā)明所具有的技術(shù)效^ ο例 1一、本發(fā)明所述中藥生物芯片基片的制備1、取玻片，在濃度為IM的氫氧化鈉溶液中浸泡2小時(shí)，用無菌水清洗干凈，然后置 于體積百分比含量為5%的稀鹽酸浸泡過夜，最后用無菌水清洗；
2、將清洗后的玻片放入體積百分比含量為10%的縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅 烷的95%乙醇溶液中浸泡1小時(shí)，然后放入0. 3M的鹽酸中水解1. 5小時(shí)，再用滅菌水清洗 3次，涼干；3、將已硅烷化的玻片在活化液中反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)時(shí)放在通風(fēng)櫥中不斷搖晃。反 應(yīng)結(jié)束后用丙酮清洗3次。步驟3中的活化液按如下方法配制取IOml 二乙烯基砜，溶于IOOml 0. 5mol/L的 碳酸鈉溶液中。二、中藥生物芯片的制備1、探針的制備(1)材料選取研究已證實(shí)的具有抗腫瘤作用或含有抗腫瘤組份的中藥來進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。中藥原材料品種主要有人參、黃芪、苦參、山豆根、半支蓮、紅豆杉、當(dāng)歸、澤瀉、決明子、 細(xì)辛、熟地黃、鹿角、菟絲子、枸杞子、天麻、苦杏仁、烏梅、白扁豆等作為材料，采用萃取、沉 淀或結(jié)晶等方法分離其有效組份。目前研究證實(shí)這些中草藥有抗腫瘤作用或含有抗腫瘤組 份。(2)有效成分的提取將中草藥粉碎至40目細(xì)粉投入萃取釜中，設(shè)定萃取路線如 下co2鋼瓶-冷凍系統(tǒng)-高壓泵-萃取釜-分離釜I-分離釜II-凈化器-CO2貯罐(循 環(huán)用)。按上述路線進(jìn)行萃取首先分別對萃取釜、分離釜I、分離釜II進(jìn)行加熱，當(dāng)溫度 分別達(dá)到45°C、40°C、33°C時(shí)，通過高壓泵對萃取釜、兩個(gè)分離釜進(jìn)行加壓，當(dāng)壓力分別達(dá)到 30MPa、16MPa、8MPa時(shí)(溫度和壓強(qiáng)為擬設(shè)定值)，開始循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓，CO2流速 3.3L/h(擬設(shè)定值)。萃取分離時(shí)每隔一定時(shí)間(30-60分鐘作用)放出萃取產(chǎn)物。萃取產(chǎn)物利用ABI BIOCAD 700E HPLC定量將不同化合物分離到2ml的96孔板， 然后分裝至0. 5ml的96孔板，真空抽干，備用。HPLC的色譜條件R120柱，流動相為甲醇 水(V V = 75 25)，紫外檢測波長260nm，流速l.Oml/min，溫度為室溫。上述分別分離提純后，先分別選取了 10個(gè)提取純度較好的中藥組份來進(jìn)行片基 表面的固定性的試驗(yàn)。2、芯片的制備將處理好中藥提取物上樣于96孔板上，除中藥組份外，另設(shè)二個(gè)陽性對照(P53的 抗體、MDM2抗體)，一個(gè)陰性對照(50%的DMSO溶液)。用Pixsys5500基因芯片點(diǎn)樣儀將 這些探針將探針按13X10的陣列分別點(diǎn)樣于本發(fā)明所述基片上，每個(gè)組分點(diǎn)樣4次，點(diǎn)與 點(diǎn)間距300 μ m;將打印后的芯片迅速在120°C的熱玻璃盤中干燥，然后用含3% (ν/ν) 2-巰基乙醇的0. 5mol/L碳酸鈉溶液洗滌3次以封閉多余的活性乙烯基(注因?yàn)殛栃詫φ諡榈?白質(zhì)，分子中富含游離的氨基，可以和玻片表面發(fā)生共價(jià)連接而被固定)。三、中藥生物芯片與受體蛋白的雜交和檢測1、材料試驗(yàn)蛋白P53和MDM2，購自Sigma公司；P53抗體和MDM2抗體(鼠抗 人單克隆抗體)，購自 SANTACRUZ 公司；TBST :50mMTris · HCl, ρΗ7· 5,0. 15MNacl，0. 05% Tween20o2、雜交(1)取P53蛋白和MDM2蛋白，用TBST溶解后在37°C下與生物芯片雜交2小時(shí)；(2)用TBST洗滌去未結(jié)合的蛋白，干燥，然后加入P53抗體和MDM2抗體，在37°C 下雜交1小時(shí)；(3)用TBST洗滌去未結(jié)合的抗體，干燥，然后加入CY3標(biāo)記的二抗(羊抗鼠)，在 37°C下雜交1小時(shí)；(4)用TBST反復(fù)洗滌，ddH20漂洗；干燥后將芯片置于Scanarray Lite掃描儀中 以激光強(qiáng)度90 %，PMT70 %，分辨率5 μ m進(jìn)行掃描檢測。3、結(jié)果掃描結(jié)果如圖3所示。通過掃描背景的熒光信號判斷，該芯片的背景 低，雜交點(diǎn)圓潤，同一性好。從激光掃描結(jié)果數(shù)據(jù)表明平均背景信號強(qiáng)度為861. 5，空 白對照中平均信號強(qiáng)度為1029. 3，陰性對照中平均信號強(qiáng)度為1117. 4，有明顯雜交信號 的樣品其平均信號強(qiáng)度在3350. 1-5768. 6之間，不能明顯判斷的樣品其平均信號強(qiáng)度在 1350. 1-2768. 6之間，由此確定固定探針是否與中藥活性分子有作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)為掃描 點(diǎn)清晰可見，且當(dāng)探針的熒光信號為陰性對照的3倍以上，則判定為陽性。從圖3明顯可見 有5個(gè)樣品顯示出陽性結(jié)果。此外，該結(jié)果說明了中藥中的有效成分能被固定在片基上。上 述結(jié)果也提示，可以對被靶向篩選出的中藥成分進(jìn)一步去進(jìn)行細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。例 2本發(fā)明所述中藥生物芯片基片的制備1、取玻片，在濃度為IM的氫氧化鈉溶液中浸泡3小時(shí)，用無菌水清洗干凈，然后置 于體積百分比含量為3%的稀H2SO4浸泡過夜，最后用無菌水清洗；2、將清洗后的玻片放入體積百分比含量為15%的縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅 烷的95%乙醇溶液中浸泡1. 5小時(shí)，然后放入0. 3M的硫酸中水解1小時(shí)，再用滅菌水清洗 3次，涼干；3、將已硅烷化的玻片在活化液中反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)時(shí)放在通風(fēng)櫥中不斷搖晃。反 應(yīng)結(jié)束后用丙酮清洗3次。步驟3中的活化液按如下方法配制取IOml 二乙烯基砜，溶于IOOml 0. 5mol/L的 碳酸鈉溶液中。例 3本發(fā)明所述中藥生物芯片基片的制備1、取玻片，在濃度為2M的氫氧化鉀溶液中浸泡3小時(shí)，用無菌水清洗干凈，然后置 于體積百分比含量為10%的稀HCl浸泡過夜，最后用無菌水清洗；2、將清洗后的玻片放入體積百分比含量為10%的縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅 烷的95%乙醇溶液中浸泡2小時(shí)，然后放入0. 4M的鹽酸中水解1小時(shí)，再用滅菌水清洗3次，涼干；3、將已硅烷化的玻片在活化液中反應(yīng)1. 5小時(shí)，反應(yīng)時(shí)放在通風(fēng)櫥中不斷搖晃。反應(yīng)結(jié)束后用丙酮清洗3次。步驟3中的活化液按如下方法配制取IOml 二乙烯基砜，溶于IOOml 0. 5mol/L的 碳酸鈉溶液中。
權(quán)利要求
一種中藥生物芯片的基片，該基片由硅烷化玻片和其表面的有機(jī)活性基團(tuán)構(gòu)成，其特征在于所述有機(jī)活性基團(tuán)為-(CH2)2SO2CH＝CH2，該基團(tuán)通過-O-與所述硅烷化玻片表面上的硅烷基團(tuán)共價(jià)連接。
2.權(quán)利要求1所述的基片的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)清洗將玻片浸于濃度為0.5 2M的強(qiáng)堿溶液中2 5小時(shí)，用無菌水清洗干凈， 然后置于體積百分比含量為1 10%的鹽酸或硫酸中浸泡過夜，最后用無菌水清洗；(2)硅烷化將清洗后的玻片放入硅烷化溶液中浸泡0.5 2小時(shí)，然后放入0. 01 0. 5M的硫酸或鹽酸中水解1 2小時(shí)，再用滅菌水清洗3 5次，晾干，得到硅烷化玻片；(3)活化將已硅烷化的玻片在含二乙烯基砜的活化液中浸泡1 2小時(shí)，使活化液中 的二乙烯基砜和硅烷化玻片表面的硅烷基團(tuán)反應(yīng)，將有機(jī)活性基團(tuán)-(CH2) 2S02CH = CH2結(jié)合 到硅烷化的玻片的表面，然后用丙酮洗去玻片表面未反應(yīng)的二乙烯基砜即可；上述步驟中，所述的強(qiáng)堿溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液；所述的硅烷化溶液是1 15% (v/v)的縮水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷(G0PS)的乙 醇溶液；所述的活化液是體積比為二乙烯基砜(DVS)碳酸鈉水溶液=1 10的混合溶液，其 中所述的碳酸鈉水溶液的濃度為0. 5mol/L。
3.權(quán)利要求1所述基片在高通量篩選中草藥有效成份中的應(yīng)用。
4.一種用于篩選中藥有效成份的中藥生物芯片，該芯片是以權(quán)利要求1所述基片為固 相載體，以中藥有效成分中的含羥基、羰基、氨基或不飽和雙鍵的小分子有機(jī)物為探針。
5.權(quán)利要求4所述中藥生物芯片的制備方法，該方法由以下步驟組成用生物芯片點(diǎn)樣儀將從中藥中分離出來的多個(gè)組分分別點(diǎn)于權(quán)利要求1所述中藥生 物芯片的基片上，點(diǎn)與點(diǎn)間距3001 u m ；然后迅速在120 130°C下干燥，最后用封閉液洗 滌3 5次以封閉多余的活性乙烯基；所述的封閉液是由碳酸鈉和2-巰基乙醇的混合水溶 液，其中碳酸鈉的濃度為0. 5mol/L，2-巰基乙醇的體積百分比含量為1 5%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中藥生物芯片的基片，該基片由硅烷化的玻片和有機(jī)活性基團(tuán)通過-O-連接構(gòu)成，其特征在于所述的有機(jī)活性基團(tuán)為-(CH2)2SO2CHCH2，該基團(tuán)末端為活潑的乙烯基，可與醛酮類、苷類以及生物堿類等小分子有機(jī)物發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使上述有機(jī)小分子固定到基片上，制成以小分子有機(jī)物為探針的中藥生物芯片，如高通量篩選中草藥有效成份的生物芯片。
文檔編號G01N33/50GK101832996SQ20101015191
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者吳清華, 張寶, 沈群, 鄭文嶺, 馬文麗 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)