專利名稱：熒光標記免疫抗體測定非洲豬瘟病毒試劑盒的制作方法
熒光標記免疫抗體測定非洲豬瘟病毒試劑盒免疫熒光技術是近年來發(fā)展起來的一門廣泛應用于現(xiàn)代生物學和醫(yī)學中的新興技術，免疫熒光技術具有靈敏度高、特異型好、顯色特別、檢測速度快和在細胞水平定位準確等優(yōu)點，已在免疫學、微生物學、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等許多方面得到廣泛應用。免疫熒光技術根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素， 再用這種熒光標記抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合體上含有標記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，已輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高率，可高達100%，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷時極易誤診，表現(xiàn)高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、 /K月中及臟器出血。(Wi lliam, Hess Adv. African swine fever a reassessment [J]. Vet Sci Comp Med，1981，25 :39 69)世界動物組織(ΟΙΕ)列為A類疫病，我國規(guī)定為動物一類疾病，受到世界各國的高度重視(孫懷昌.中國預防獸醫(yī)學報，1999,21 ) :117 119)。本病自1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)以來，一直存在于撒哈拉以南的非洲國家，1957年先后流傳至西歐和拉美國家，多數(shù)被及時撲滅，單在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家流行，而且有不斷蔓延趨勢。2007 年，亞美尼亞連續(xù)發(fā)生六起非洲豬瘟，我國尚無該病。非洲豬瘟在國際病毒分類委員會第四次報告中歸于虹彩病毒科，在該委員會第五次報告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動物痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表明它不屬于國際病毒分類委員會所核定的任何一科，是個新科，1995年第9次國際病毒分類委員第六次報告，將非洲豬瘟病毒列入“類非洲豬瘟病毒屬”，非洲豬瘟是唯一已知的代表種。非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒。其基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長為1701Λ 1901Λ，中央有1251Λ左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn)重復序列，這些重復序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長度差異的主要原因(Rafael，Yancz, Javier Μ, et al. Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus [J]. Virology, 1995,208 :249 279)。ASF病毒基因組有5個編碼基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復)以及蛋白修飾的酶，整個基因組含有151個 0RF，可以編碼150 200種蛋白質(zhì)，已從ASFV感染的細胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研究進展，中國獸醫(yī)科技，1998，觀(11) :42 43)。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原性。實驗證明，P30蛋白為具有較好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量約為36KD。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于測定法醫(yī)物證血型的熒光標記抗體試劑盒，是由分離包裝的抗A和抗B熒光標記抗體和0. 01MPH7. 2的PBS緩沖洗脫液組成，抗A和抗B的抗體均采用單克隆抗體。本發(fā)明采用熒光標記的方法，抗A熒光抗體由四甲基異硫氰酸羅達明(tetramethyl rodamine isothiocyamite，TMRITC，最大吸收光譜為 550nm，最大發(fā)射光譜620nm呈橙紅色熒光)進行標記，抗B熒光抗體用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC，最大吸收光譜為490_495nm，最大發(fā)射光譜為520_530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光)進行標記。需要說明的是兩種熒光標記物可以互換。
具體實施例方式一、熒光抗體的標記1、單克隆抗體熒光標記(1)單克隆抗體血清在0. Olmol/1 PH9. 5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。(2)將四甲基異硫氰酸羅達明溶于二甲亞砜(lmg/ml)，取此溶液300μ 1，逐滴加入單克隆抗A抗血清溶液中(每毫克IgG加入5 μ 1)同時磁力攪拌。(3)在室溫中攪拌12h，避光。(4)把結(jié)合物移入直徑3cm，高30cm大小的Bio-gelP-6層析柱(用0. 01mol/l PH8. 0的PBS平衡過)，流速為1. 5ml/min。(5)收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標記抗體，稀釋到0. 0mg/ml，分裝，4°C保存。2、單克隆抗體熒光標記(1)抗體的準備取適量單克隆抗血清(5mg/ml)溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌(速度適當以不起泡沫為宜)5 IOmin0(2)熒光素的準備根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0. Olmg熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。(3)邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入單克隆抗血清溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5 IOmin內(nèi)加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌12 18h。結(jié)合期間應保持蛋白溶液于4°C左右。(4)透析集合完畢后，將溶液離心O500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物， 裝于透析袋中后再置于燒杯中，用PH8. 0緩沖鹽水透析(0 4°C )過夜。(5)過柱取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G_50柱，分離游離熒光素， 收集標記的熒光抗體，稀釋到0. lmg/ml，分裝，4°C保存。二、試劑盒的制作熒光標記單克隆抗體Ι-aiil，包裝；0. OlM PH7. 2的PBS緩沖洗脫液20_50ml單獨包裝。三、試劑盒的使用欲檢驗的檢材制備冰凍切片，經(jīng)過常規(guī)方法固定后，每份檢材加熒光標記的抗體一滴，37°C吸收30分鐘；用0. OlM PH7. 2的PBS緩沖液洗脫沒有結(jié)合的抗血清；熒光顯微鏡鏡檢。呈現(xiàn)紅色或綠色熒光反應的為陽性。 本發(fā)明可快速、準確測定非洲豬瘟病毒，可廣泛用于相關領域。
權利要求
1.熒光標記免疫抗體測定非洲豬瘟病毒試劑盒，試劑盒包括a)熒光標記免疫抗體， b)0. OlM PH7. 2的PBS緩沖洗脫液，其特征是熒光標記免疫抗體由分別包裝的非洲豬瘟 P54或P30單克隆抗體組成。
2.根據(jù)權利要求1所述熒光標記免疫抗體測定非洲豬瘟病毒試劑盒，其特征為熒光抗體由四甲基異硫氰酸羅達明(tetramethyl rodamine isothiocyanate, TMRITC)或由異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)進行標記，兩種熒光標記物可替換使用。
3.權利要求1所述的熒光標記免疫抗體測定非洲豬瘟病毒試劑盒，在測定非洲豬瘟病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測定非洲豬瘟病毒的試劑盒，是由分離包裝熒光標記抗體和0.01MPH7.2的PBS緩沖洗脫液組成，抗體均采用單克隆抗體。本發(fā)明采用熒光標記的方法，熒光抗體由四甲基異硫氰酸羅達明(tetramethyl rodamine isothiocyanate，TMRITC)或異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)進行標記。熒光標記抗體和相應的抗原結(jié)合后，通過熒光顯微鏡，在特定激光的激發(fā)下，發(fā)出穩(wěn)定的熒光。本發(fā)明可快速、準確測定非洲豬瘟病毒。
文檔編號G01N33/577GK102236018SQ201010153709
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權日2010年4月23日
發(fā)明者王濤, 董志珍, 陳文剛 申請人:陳文剛