專利名稱：一種用于檢測非洲豬瘟病毒的間接elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種動物檢疫中檢測抗體的ELISA試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高率，可高達100%，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷時極易誤診，表現(xiàn)高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、 /K月中及臟器出血。(Wi lliam, Hess Adv. African swine fever a reassessment [J]. Vet Sci Comp Med，1981，25 :39 69)世界動物組織(ΟΙΕ)列為A類疫病，我國規(guī)定為動物一類疾病，受到世界各國的高度重視(孫懷昌.中國預(yù)防獸醫(yī)學報，1999,21 ) :117 119)。本病自1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)以來，一直存在于撒哈拉以南的非洲國家，1957年先后流傳至西歐和拉美國家，多數(shù)被及時撲滅，單在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家流行，而且有不斷蔓延趨勢。2007 年，亞美尼亞連續(xù)發(fā)生六起非洲豬瘟，我國尚無該病。非洲豬瘟在國際病毒分類委員會第四次報告中歸于虹彩病毒科，在該委員會第五次報告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動物痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表明它不屬于國際病毒分類委員會所核定的任何一科，是個新科，1995年第9次國際病毒分類委員第六次報告，將非洲豬瘟病毒列入“類非洲豬瘟病毒屬”，非洲豬瘟是唯一已知的代表種。非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒。其基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長為1701Λ 1901Λ，中央有1251Λ左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長度差異的主要原因(Rafael，Yancz, Javier Μ, et al. Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus [J]. Virology, 1995, 208 :249 279)。ASF病毒基因組有5個編碼基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復(fù))以及蛋白修飾的酶，整個基因組含有151個 0RF，可以編碼150 200種蛋白質(zhì)，已從ASFV感染的細胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研究進展，中國獸醫(yī)科技，1998，觀(11) :42 43)。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原性，其中P^蛋白為具有較好抗原性的蛋白之一。ASFV P54蛋白是由E183L基因編碼的，約25kD的多肽，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。PM蛋白可以在體外培養(yǎng)，并能感染細胞。而且在感染細胞后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處短暫表達。PM蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體時起著十分重要的作用(Rodriguez JM, Garcia EscuderoAfrican Swine Fever VirusStructural Protein p54 Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors toAssembly Sites. Journal of Virology, 2004, 78 (8) :4299 4313)。另夕卜 ASFV P54 蛋白與8kD的輕鏈細胞質(zhì)動力蛋白DLC8存在特殊的交叉反應(yīng)，并在細胞內(nèi)攝作用及病毒加工過程中起重要作用。感染病毒后復(fù)制早期，病毒可激活細胞凋亡蛋白酶而誘發(fā)細胞脫噬作用(AlonsoC, J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding to Light-Chain Dynein. Journal ofVirology 2001,75 :9819 9827)。為了分析結(jié)構(gòu)蛋白P54在細胞脫噬中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G將其在非洲綠猴腎細胞內(nèi)短暫表達，實驗表明可激活細胞凋亡蛋白酶，誘發(fā)細胞脫噬作用(Hernaez B,Diaz Gil G The African swine fever virus dynein-binding protein p54 induces infected cellapoptosis. FEBS Letters 2004,569(123) 224 228)。但P54的突變體缺失13aa而失去激活細胞凋亡蛋白酶的功能(Alejo A,GAndres,ML Salas. African Swine Fever Virus Proteinase Is Essential for Core Maturation andlnfectivity Journal of Virology, 2003, 77 :5571 557)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA方法，可用于非洲豬瘟病毒抗體的大量篩查。本發(fā)明還提供了一種PM基因載體構(gòu)建、蛋白的表達及純化的工藝。本發(fā)明還提供了一種兔抗豬IgG多克隆抗體的制備工藝及辣根過氧化物酶標記方法。本發(fā)明的目的是以原核表達的重組蛋白為基礎(chǔ)，通過酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，所述的試劑盒包括由辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體。還包括ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。上述用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒包括所述ELISA板條每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為原核表達的PM蛋白，規(guī)格為8孔X 12 條；所述血清稀釋液和濃縮洗滌液血清稀釋液為即用型，洗滌液為25倍濃縮，使用前稀釋；所述底物顯色液即用型TMB顯色液，50mL ；所述終止液2mol/L的溶液，50mL ；所述酶標多克隆抗體所述辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體，使用前100倍稀釋；陽性對照；陰性對照。
所述的間接ELISA試劑盒在檢測非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案如下一、抗原制備1.非洲豬瘟PM蛋白的表達根據(jù)GenBank中非洲豬瘟(ASFV)PM基因序列，設(shè)計合成了 1對引物，采用PCR方法從ASFV DNA中擴增出PM基因片段，將其克隆到表達載體pET28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 PET-P54,測序驗證后轉(zhuǎn)化入表達宿主菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達。設(shè)計的引物為P54-1-5，-GCGGATCCCATTATTATCATCGTT-3 ’P54-2-5，-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3 ’下劃線部分為引入的酶切位點，P54-1為ASFV P54基因上游擴增引物，引入的酶切位點為BamHIPM-2為ASFV P54基因下游擴增引物，引入的酶切位點為)(hoI。2.非洲豬瘟PM蛋白的純化。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用PBS洗滌重懸菌體，超聲裂解(超聲ls，間隔 ls，共IOmin)，12000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。蛋白純化時使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)SDS-PAGE、western blotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用BCA法測定純化后蛋白含量，標準品濃度及其對應(yīng)的OD值見表1。純化后PM蛋白的OD值為1. 583，與標準品比較后，其濃度為900 μ g/ml。表IBCA法測定標準品蛋白含量
樣品 名稱Α(μ g/ml)Β(μ g/ml)C(ug/ml) (μ g/ml)Ε(μ g/ml)F(μ g/ml)G(ug/ml)H(ug/ml)0( μg/ml)濃度200015001000750500250125250OD值2. 68942. 23781.64931.32781. 0414〇.6454〇.4062〇.1893〇.1251二、辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG的制備1.純化豬IgG的制備取經(jīng)檢驗合格的肥育豬作為采血用豬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常， 無其他疾病。消毒后，頸靜脈與動脈采血，分離血清，純化IgG方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。取1份預(yù)處理過的血清加2份0. 06mol/L pH5. 0醋酸緩沖液，用lmol/L HCl調(diào)pH 至4. 8 ；按每毫升稀釋血清加Ilul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4°C靜置2小時，取出12000r/min離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125um)，加入 1/10體積的0. Olmol/LPBS,用Imol/LNaOH調(diào)pH至7. 2 ；在4°C下加入飽和硫酸銨至45% 飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS 中，對50-100倍體積的PBS透析，4°C過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀， 分裝，凍存?zhèn)溆谩?br> 2.兔抗豬IgG多克隆抗體的辣根過氧化物酶標記上述制備的純化豬IgG作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗豬IgG多克隆抗體。純化后的多克隆抗體的酶標記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下稱取5mg HR溶解于Iml蒸餾水中；向其中加入0. 2ml新配的0. IM NaI04溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液中透析，4°C過夜；向其中再加入20 μ 1 0. 2Μ ρΗ9. 5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ρΗ升高到9. 0，然后立即加入溶于0. OlM碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg(10mg/ml)，室溫避光輕柔攪拌2小時；加入0. Iml新配的％ig/ml NaBH4，混勻，4°C放置2小時；所得產(chǎn)物對0. 15M pH7. 4PBS中4°C透析過夜。透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時。3000r/min離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0. 15M pH7. 4的PBS 中。將上述溶液裝入透析袋中，對0. 15M ρΗ 7.4的PBS緩沖液透析，取出銨離子，IOOOOr/ min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。三、標準ASFV陽性血清及標準ASFV陰性血清的制備在ELISA檢測過程中，不同的操作人員和不同的檢測批次間會存在一定的誤差， 操作誤差會導(dǎo)致檢測樣品OD值的誤差。本發(fā)明研制了標準ASFV抗體陽性對照血清和標準 ASFV抗體陰性對照血清，用于檢測條件的優(yōu)化和檢測結(jié)果的判定。1.標準陽性血清的制備取健康成年家兔，體重2_3kg，剪去兩后腳掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮膚。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐劑(FCA)乳化的抗原(純化后重組P30)(以下稱FCA-P30) 液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0. 5ml。間隔10-14天后，進行第二次免疫，與兩側(cè)胭窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入弗式不完全佐劑(FIA-P30)，每個淋巴結(jié)0. 1ml，其余注入淋巴結(jié)附近的皮下共1ml。間隔7-10天后，從耳靜脈采血0. 5-1. 0ml，分離血清，采用ELISA方法檢測血清效價，抗體效價可達到1 100以上。采用心臟采血法采血，將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中。將三角燒瓶的血置37°C溫箱1小時，再置4°C冰箱3小時。待血液凝固血塊收縮后，用滴管吸取血清，3000r/ min離心15min，取上清，加入終濃度為0. 01 %的硫柳汞防腐，分裝后，-20°C保存。2.標準陰性血清的制備取經(jīng)檢驗合格的肥育豬作為采血用豬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常， 無其他疾病。消毒后，頸靜脈與動脈采血，分離血清，加入萬分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml 分裝于無菌管中，-20°C保存。四、試劑盒的建立1.本發(fā)明試劑盒的檢測原理采用間接法，將重組的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白PM包被于微孔板中，然后用 BSA將酶標板封閉，加入待測樣本及標準陽性對照、陰性對照。樣本或標準品中的非洲豬瘟病毒抗體能與酶標板中包被的即4抗原反應(yīng)，加入酶標兔抗豬IgG多克隆抗體后，酶標抗體與上一步反應(yīng)結(jié)束的PM抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物TMB顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標儀在450nm波長下，測定各孔吸光度值，OD值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測樣本中非洲豬瘟病毒抗體的含量成正比。
2.本發(fā)明試劑盒的組成a)酶標板的最佳制備方法用pH9. 60. 05M的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組PM蛋白稀釋后，按IOOul/孔加入微孔板中，保證每孔中的PM含量為0.2ug。4°C包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1 % BSA的封閉液，37°C靜置2小時，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。b)工作試劑的配置洗滌液(pH7. 4,0. 15M PBS) =KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4-12H20 2. 9g, NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，Tween-20 (0. 05% )0. 5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲液。血清稀釋液牛血清白蛋白0. lg，加洗滌緩沖液至IOOml底物緩沖液(pH5. 0 磷酸檸檬酸)0. 2M Na2HP0425. 7ml, 0. IM 檸檬酸 24. 3ml，加蒸餾水50mlTMB (四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB (10mg/5ml無水乙醇)0. 5ml，底物緩沖液10ml， 0. 75% H2O2 32ul 終止液(2MH2S04)蒸餾水 178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7mlc)檢測非洲豬瘟的間接ELISA試劑盒的組建組建檢測非洲豬瘟的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含以下組分PM重組蛋白包被的96孔酶標板辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體標準陽性對照標準陰性對照濃縮洗滌液血清稀釋液TMB 底物終止液產(chǎn)品說明書五、樣品中非洲豬瘟病毒抗體的檢測1.用上述制備的試劑盒進行檢測1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μ 1加入酶標板，37°C孵育1小時。洗滌液清洗3-5次。2)每孔加入稀釋后酶標兔抗豬IgG多克隆抗體100μ 1，37°C孵育30min，洗滌液清洗3-5次。3)每孔加入TMB底物液100 μ 1，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。4)每孔加入100 μ 1 2Μ H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀檢測450nm吸光度值。2.檢測結(jié)果分析1)測中陽性對照血清(PC)的OD值與陰性對照血清(NC)的OD值之差必須大于 0.4時，檢測被認為有效。PC-NC 彡 0. 4陽性 Cut Off = NC+0. 05其中NC =陰性對照血清OD值
PC =陽性對照血清OD值2)檢測時使用復(fù)孔，最終使用OD值為兩個的平均值。當血清樣本的OD值低于陽性Cut Off值時，該樣本為ASFV抗體陰性。當血清樣本的OD值高于陰性Cut Off值是，該樣本為ASFV抗體陽性。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體，借助該酶標記抗體，建立間接ELISA法檢測非洲豬瘟病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，還包括ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述ELISA板條每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為原核表達的PM蛋白，規(guī)格為8孔X 12條; 所述血清稀釋液和濃縮洗滌液血清稀釋液為即用型，洗滌液為25倍濃縮，使用前稀釋；所述底物顯色液即用型TMB顯色液，50mL ； 所述終止液2mol/L的溶液，50mL ；所述酶標單克隆抗體所述辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體，使用前100 倍稀釋；陽性對照； 陰性對照。
4.權(quán)利要求1所述的辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體的制備工藝，其特征在于采用辛酸-硫酸銨法純化豬血清IgG，制備純化的豬IgG，并用此純化IgG免疫家兔，制備兔抗豬IgG多克隆抗體；采用過碘酸鈉法對上述多克隆抗體進行辣根過氧化物酶標記。
5.權(quán)利要求1所述的間接ELISA試劑盒在檢測非洲豬瘟病毒抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒及其用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。試劑盒采用原核表達的重組P54蛋白作為包被抗原，依據(jù)間接ELISA原理檢測豬血清中非洲豬瘟病毒的抗體。試劑盒中96孔板中的包被抗原為原核表達的重組P54蛋白，其具有良好的抗原性。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒包括P54蛋白包被的96孔板、陽性對照、陰性對照、辣根過氧化酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體、濃縮洗滌液、血清稀釋液、TMB底物、終止液。本發(fā)明試劑盒可用于大批樣品的篩查，試劑盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便。
文檔編號G01N33/535GK102236019SQ20101015371
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者王濤, 董志珍, 陳文剛 申請人:陳文剛