專利名稱：用高效液相色譜測定水蕨dna甲基化含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種DNA甲基化含量的測定方法，具體是指一種用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法。
背景技術：
DNA甲基化已成為分子生物學研究熱點之一。有研究表明，逆境(如冷、熱脅迫、光 照、干旱、鹽脅迫、重金屬脅迫)對DNA的甲基化水平會造成影響。DNA甲基化水平在不同組 織和不同生長時期以及不同環(huán)境下可能有差異。并且，基因表達活性同DNA胞嘧啶甲基化 程度之間存在負相關性，DNA甲基化程度越低，基因表達活性越高；反之，DNA甲基化程度越 高，基因表達活性也就越低。同時，DNA甲基化對植物生長和發(fā)育都有重要影響。如果甲基 化不足或太高，都會導致植物生長發(fā)育的不正常和形態(tài)異常。因此，研究植物DNA甲基化對 探討植物生長發(fā)育的機制和指導實際生產(chǎn)有重要的意義。水蕨是一種名貴的菜肴。因其為二型葉，造型美觀，也常用作園藝觀賞植物。同時 它還是重要的藥用植物，有活血、解毒、治痞積、痢疾、胎毒和跌打等功效。因此在基礎研究 和應用中起了很重要的作用。開展對瀕危水生蕨類植物水蕨DNA甲基化水平的研究，有利 于指導水蕨人工栽培條件的優(yōu)化，促進其正常生長和發(fā)育，有利于水蕨的食用、藥用和觀賞 資源的合理利用與開發(fā)，有利于促進“菜藍子工程”和人民身體健康工作的開展，有利于“兩 型社會”的構建。目前，測定DNA甲基化含量的方法有微陣列方法(DNAMicroarray)、基因芯片、和 甲基化敏感擴增多態(tài)性(Mthylation-Sensitive Amplified Polymorphism，MSAP)方法，甲 基化敏感性斑點分析(MS-DBA)等多種測定方法，但由于技術復雜，成本高，在實際生產(chǎn)中 很難推廣應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種方法簡單，并且節(jié)省成本，又能準確測定水蕨DNA甲基 化含量的測定方法。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步驟包括1)采集待測的水蕨樣品并提取樣品中的DNA，得到待測DNA樣品，溶解于緩沖液后 于-20°C保存?zhèn)溆茫?)將待測DNA樣品水解并離心，取上層清液，得到待測樣品溶液；3)配制胞嘧啶標準樣品溶液和5-甲基胞嘧啶標準樣品溶液，在相同的高效液相 色譜測定條件下，通過標準樣品溶液和待測樣品溶液的峰的保留時間和峰面積來確定待測 DNA樣品中的DNA甲基化含量。所述高效液相色譜的流動相為質量分數(shù)為5%的甲醇溶液， 質量分數(shù)為0. 2%的三乙醇溶液和質量分數(shù)為94. 8%且摩爾濃度為5mmol/L的戊烷磺酸鈉 混合組成，并且用磷酸調節(jié)混合溶液PH值到4的混合溶液。
所述流動相的流速為lmL/min。所述高效液相色譜的檢測器為紫外檢測器，檢測紫外光波長為273nm。所述將待測DNA樣品水解并離心的方法為，向待測DNA樣品加入0.2mmol/L的鹽 酸溶液，在80°C水浴上加熱水解2h，再加入0. 4mmol/L的氫氧化鈉水溶液進行中和，最后在 10000r/min的轉速下離心IOmin后即完成待測DNA樣品水解并離心的過程。本發(fā)明利用高效液相色譜(HPLC)來進行水蕨的DNA甲基化含量的測定，不僅方法 簡便，成本較低，并且測定快速準確，定量分析效果較好。通過對水蕨DNA甲基化含量的測 定，可以為分析水蕨的生長發(fā)育狀況提供了技術上的支撐，有利于指導實際生產(chǎn)與應用。同 時，由于HPLC技術本身已經(jīng)應用非常廣泛，技術相對成熟，并且水蕨中提取DNA也為常規(guī)方 法可以達到，因此可以推廣應用。


圖1為混合標準溶液的HPLC色譜圖；圖2為待測樣品溶液的HPLC色譜圖。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明實施例1取江蘇吳江太湖水蕨，每株幼嫩葉約50mg，置于密封的塑料袋中用硅膠快速干燥 后，用CTAB法提取水蕨DNA，再用紫外分光光度法檢測DNA的純度和濃度。最后將沉淀DNA 溶于50 μ 1緩沖液TE中，于-20°C下保存?zhèn)溆?。取上述待測DNA樣品20 μ 1，加入0. 2mmol/ L的HCl溶液20 μ 1，在80°C水浴上水解2h，再加入0. 4mmol/L的NaOH溶液10 μ 1來中和 水解液，在lOOOOr/min的轉速下離心lOmin，取上層清液，得到待測樣品溶液。稱取購于Sigma公司的胞嘧啶(C)標準樣品和購于北京鼎國生物技術有限責任公 司的5-甲基胞嘧啶(5MeC)標準樣品各15mg，然后各自用甲醇定容5ml，得到標準溶液。
所述用高效液相色譜(HPLC)儀器使用DIONEX公司出品的P680HPLC，檢測器型號 為UVD170U，色譜柱型號為TOLCHR0N-C18，檢測器波長為273nm，柱溫為30°C。流動相為質 量分數(shù)為5%的甲醇溶液，質量分數(shù)為0. 2%的三乙醇溶液和質量分數(shù)為94. 8%且摩爾濃 度為5mmol/L的戊烷磺酸鈉混合組成，并且用磷酸調節(jié)混合溶液pH值到4的混合溶液，以 lml/min的速度洗脫。由于在273nm的紫外光下，胞嘧啶和5_甲基胞嘧啶的含量和HPLC中相應峰面積 是成正比的。因此吸取含量確定的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的標準樣品溶液，可以根據(jù)峰面 積的大小來確定胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的保留時間。吸取胞嘧啶標準溶液5 μ 1，5-甲基胞 嘧啶標準溶液2μ 1，用甲醇定容1L，配制成混合標準溶液?；旌蠘藴嗜芤哼M樣量為20μ 1， 通過HPLC儀器測得的色譜圖如圖1所示。峰1的保留時間為4. 176，峰面積為0. 821，峰2 的保留時間為5. 041，峰面積為0. 330。根據(jù)含量和HPLC中相應峰面積是成正比的原理可 知，峰1與胞嘧啶對應，峰2與5-甲基胞嘧啶對應。待測樣品溶液進樣量為50 μ 1，通過HPLC儀器測得的部分色譜圖如圖2所示。通過 與標準樣品的保留時間對比，可以找到峰3的保留時間為4. 10，與標準樣品里胞嘧啶的保留時間4. 176相近，應該對應胞嘧啶。而峰4的保留時間為4. 98，與標準樣品里5-甲基胞嘧 啶的保留時間5. 041相近，應對應5-甲基胞嘧啶。而峰3的峰面積為0. 173，峰4的峰面積為 0. 117。由于在273nm的紫外光下，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量和HPLC中相應峰面積是 成正比的。因此待測樣品溶液中5-甲基胞嘧啶的質量分數(shù)為0. 117/(0. 173+0. 117)*100% =40. 3%。從而，該水蕨DNA中的甲基化含量為40. 3%。實施例2
用重金屬Cu2+濃度為0. 1和0. 5mmol/L處理杭州臨安的水蕨。然后按照實施例1 中相同的方法測定此兩種水蕨DNA中的甲基化含量為16. 2%和3. 23%。由此表面隨著重 金屬濃度的升高，DNA甲基化水平降低，這點與植物的生長 狀況一致。
權利要求
用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步驟包括1)采集待測的水蕨樣品并提取樣品中的DNA，得到待測DNA樣品，溶解于緩沖液后于-20℃保存?zhèn)溆茫?)將待測DNA樣品水解并離心，取上層清液，得到待測樣品溶液；3)配制胞嘧啶標準樣品和5-甲基胞嘧啶標準樣品的混合標準樣品溶液，在相同的高效液相色譜測定條件下，通過混合標準樣品溶液和待測樣品溶液的峰的保留時間和峰面積來確定待測DNA樣品中的DNA甲基化含量；所述高效液相色譜的流動相為質量分數(shù)為5％的甲醇溶液，質量分數(shù)為0.2％的三乙醇溶液和質量分數(shù)為94.8％且摩爾濃度為5mmol/L的戊烷磺酸鈉混合組成，并且用磷酸調節(jié)混合溶液pH值到4的混合溶液。
2.如權利要求1所述的用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述流動相的流速為lmL/min。
3.如權利要求1所述的用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述高效液相色譜的檢測器為紫外檢測器，檢測紫外光波長為273nm。
4.如權利要求1所述的用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述將待測DNA樣品水解并離心的方法為，向待測DNA樣品加入0. 2mmol/L的鹽酸溶液，在 80°C水浴上加熱水解2h，再加入0. 4mmol/L的氫氧化鈉水溶液進行中和，最后在IOOOOr/ min的轉速下離心IOmin后即完成待測DNA樣品水解并離心的過程。
全文摘要
用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步驟包括采集待測的水蕨樣品并提取樣品中的DNA，得到待測DNA樣品，溶解于緩沖液后于-20℃保存?zhèn)溆?；將待測DNA樣品水解并離心，取上層清液，得到待測樣品溶液；配制胞嘧啶標準樣品和5-甲基胞嘧啶標準樣品的混合標準樣品溶液，在相同的高效液相色譜測定條件下，通過混合標準樣品溶液和待測樣品溶液的峰的保留時間和峰面積來確定待測DNA樣品中的DNA甲基化含量。本發(fā)明利用高效液相色譜來進行水蕨的DNA甲基化含量的測定，不僅方法簡便，成本較低，并且測定快速準確，定量分析效果較好。同時，由于高效液相色譜技術本身已經(jīng)應用非常廣泛，技術相對成熟，并且水蕨中提取DNA也為常規(guī)方法可以達到，因此可以推廣應用。
文檔編號G01N30/74GK101813681SQ20101015443
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權日2010年4月20日
發(fā)明者萬昆, 張金安, 董元火 申請人:江漢大學