專利名稱：一種合成線粒體靶向自旋捕捉劑MitoPBN(自旋探針)系列化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種MitoPBN系列化合物的簡(jiǎn)便實(shí)用的制備方法，本發(fā)明具有合成步 驟較短，原料廉價(jià)易得，產(chǎn)物純度相對(duì)較高的特點(diǎn)。其功能可把捕捉自由基信號(hào)的探針進(jìn)入 細(xì)胞線粒體，通過對(duì)探針結(jié)合物的撿測(cè)，可早期觀察分析細(xì)胞氧化還原微環(huán)境的變化信息， 并可早期干預(yù)。從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)病變部位的預(yù)警和對(duì)疾病的早期防治。
背景技術(shù)：
機(jī)體中不停地產(chǎn)生含氧和含氮的自由基物質(zhì)(R0S和RNS)，它們?cè)谏顒?dòng)中扮 演著極為重要的角色。在生理情況下體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，使自由基濃度保 持在動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)某些因素導(dǎo)致這一平衡失調(diào)時(shí)，機(jī)體將出現(xiàn)相關(guān)病變，如癌癥、炎癥、 衰老等。自由基的危害主要是損傷生物大分子。⑴自由基對(duì)DNA的損傷研究證明，自由 基引起的細(xì)胞內(nèi)DNA氫鏈斷裂，堿基降解和主鏈解旋。這些損傷可能是永久性的，也可以被 修復(fù)，但修復(fù)后的DNA突變率遠(yuǎn)大于正常的DNA的突變率。(2)自由基對(duì)生物大分子的損 傷主要通過修飾氨基酸殘基，引起結(jié)構(gòu)和空間的構(gòu)象變化，導(dǎo)致肽鏈斷裂、聚合、變聯(lián)。(3) 自由基對(duì)其他大分子的毒性作用已有研究證明自由基可損傷生物多糖，透明質(zhì)酸.不飽 和脂肪酸等。氧自由基可使單糖發(fā)生自氧化，引起一系列疾病發(fā)作。自旋捕捉劑因其與高反應(yīng)活性的自由基結(jié)合生成穩(wěn)定自由基的特性，自%問世 以來便在檢測(cè)自由基，探索自由基及其生物機(jī)理的科學(xué)研究中大顯身手。近幾十年來，自 旋捕捉劑取得了迅速的發(fā)展，迄今文獻(xiàn)報(bào)道用于自旋捕捉的化合物已達(dá)數(shù)百種之多。另一 方面，由于自旋捕捉劑具有一定清除自由基的作用，所以其用于治療自由基損傷引起的疾 病具有非常好的前景。硝酮類化合物在降低和預(yù)防生物體系中自由基引起損傷方面的治 療作用已在 1990 年由 OliverC.，Starke-Read P.，StadmanE.，Liu G.，Carney J.，F(xiàn)loyd R. Natl. Acad. USA (1990) 87，5144-5147 證明。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，機(jī)體內(nèi)自由基最主要的產(chǎn)生場(chǎng)所位于線粒體內(nèi)，因?yàn)榫€粒體是細(xì) 胞能量的提供者。線粒體膜內(nèi)帶負(fù)電荷，膜外帶正電荷，所以帶正電荷的有機(jī)小分子可以 在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入線粒體膜內(nèi)?；谶@種理論，Martin D. Brand等將季膦鹽與自旋 捕捉劑PBN連接在一起，用以靶向定位于線粒體膜內(nèi)，干預(yù)其中的自由基情況。詳見文獻(xiàn) Speroxide Activates Uncoupling Proteins by Generating Carbon—centeredRadicals and initiating Lipid Peroxidation-studies using amitochondria-targeted spin trap derived from α -phenyl-N-tert-butylnitron. 2003 ；278 (49) 48534-48545.其合成
路線如式(I)所示。
式(I)此路線需要用到碘代化合物，金屬氫化物，存在原料昂貴，反應(yīng)條件苛刻，制備程 序繁瑣，產(chǎn)率不高，產(chǎn)品純度不高的缺點(diǎn)，這些都嚴(yán)重限制了該領(lǐng)域的研究。且尚未有脂質(zhì) 體處理可具對(duì)胞內(nèi)氧化還原微環(huán)境的探測(cè)和干預(yù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便，成本低廉的高純度的制備MitoPBN的方法。本發(fā)明提供制備線粒體靶向定位的自旋捕捉劑MitoPBN的方法可作為自旋探針 的制備，其步驟為1)將對(duì)羥基苯甲醛和二溴代直鏈烷烴在堿性條件下反應(yīng)，得到式結(jié)構(gòu)的化合物2)將式結(jié)構(gòu)的化合物與三苯基磷在溶劑中反應(yīng)得到式結(jié)構(gòu)的季膦鹽。3)在溶劑中，冰浴條件下，將式結(jié)構(gòu)的季膦鹽、2硝基-2烷基丙烷和鋅粉按1/3/10 的當(dāng)量比混合，再加入4A分子篩，然后滴加冰乙酸，冰乙酸與季膦鹽的當(dāng)量比為5/1，1小時(shí) 內(nèi)滴加完成，加完后繼續(xù)在冰浴下攪拌6小時(shí)，然后置于4攝氏度冰箱存放，再過柱分離。步驟1)所述堿為有機(jī)堿或無機(jī)堿，有機(jī)堿為二乙胺、三乙胺、吡啶、二異丙基胺、 2，4，6_三甲基吡啶、四丁基氟化銨；所述無機(jī)堿為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或 氫化鈉。步驟1)所述的反應(yīng)時(shí)間為10分鐘一兩周。
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步驟2)反應(yīng)的溶劑為乙醇、甲醇、苯、甲苯或者丙酮，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘一兩周。步驟3)所述的冰箱存放時(shí)間為1小時(shí)一兩周。步驟4)所述目標(biāo)物用脂質(zhì)體處理制備成20-500納米的自旋探針用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧 化還原微環(huán)境的檢測(cè)和干預(yù)。本發(fā)明原料價(jià)格低廉，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)步驟較短，中間體純化簡(jiǎn)便，產(chǎn)物純度 高，可應(yīng)用于對(duì)病變部位預(yù)警和早期干預(yù)。本方法易于實(shí)現(xiàn)大量合成，可實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。


圖1是4-(4-溴代正丁烷氧基)苯甲醛的核磁共振氫譜；圖2是(4- (4- 丁氧基)苯甲醛)三苯基膦溴鹽的核磁共振氫譜；圖3是MitoPBN的核磁共振氫譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例MitoPBN的合成1)4-(4-溴丁氧基)苯甲醛的合成在250mL反應(yīng)瓶中加入對(duì)羥基苯甲醛2.0克 (16. 4mmol)，4. 5 克(32. 8mmol,2eq)無水碳酸鉀，2. 5mL 的 1，4-二溴丁烷及 50 毫升 DMF， 反應(yīng)12小時(shí)后，反應(yīng)液倒入150mL冰水中，用乙酸乙酯萃取(50mLX4)，合并有機(jī)相，用 IOOmL水洗一次。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥后，過濾，減壓蒸餾得濃縮粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用 硅膠柱色譜進(jìn)行分離提純(洗脫劑乙酸乙酯/石油醚=1/3)。得產(chǎn)物3. lg，產(chǎn)率73%。 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 9. 84 (s, 1H)，7. 78 (d, J = 5. 6Ηζ，2Η)，6· 95 (d, J = 3. 2Hz，2H)， 4. 04 (t, 2H)，3. 46 (t, 2H)，2. 01-2. 05 (m, 2H)，1. 93-1. 97 (m, 2H)。2)季膦鹽A的合成 在IOOmL反應(yīng)瓶中，加入4_(4_溴丁氧基)2. 6克(IOmmol)，三苯基磷 7. 3g (30mmol, 3eq)，50mL乙腈，回流12小時(shí)。然后將反應(yīng)液蒸干，加入5mL 二氯甲烷 溶解，隨即傾入50mL乙酸乙酯，有白色沉淀析出，過濾得粗產(chǎn)品。用硅膠柱色譜純 化粗產(chǎn)品(洗脫劑二氯甲烷/丙酮/甲醇=10/2/1)，得純的季膦鹽A 4.3克，產(chǎn)率 82. 6 %。 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 9. 82(s, 1H), 7. 81-7. 85(m,6H) ,7. 74-7. 77 (m, 5H), 7. 63-7. 67(m，6H)，6. 91(d，J = 2. 6Hz，2H)，4. 19 (t, J = 4. 2Hz，2H)，3. 95 (t，J = 8. 4Hz, 2H)，2. 22-2. 27 (m, 2H)，1. 82-1. 89 (m, 2H)。3)MitoPBN的合成50mL反應(yīng)瓶中加入季膦鹽A 0. 5克(Immol)，活化鋅粉0. 65克 (IOmmol，IOeq)，2-硝基-2-甲基丙烷0. 3克(3mmol，3eq)，4A分子篩1克，無水乙醇IOmL0 滴液漏斗中加入5mL乙醇，0. 3克冰乙酸，在冰浴下，1小時(shí)內(nèi)將滴液漏斗中的溶液滴加至反 應(yīng)瓶中。冰浴下反應(yīng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至4°C冰箱冷藏7天。過濾，濾渣用5mL無水乙醇 洗滌，減壓濃縮濾液得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化(洗脫劑二氯甲烷/丙酮/甲醇=10/2/1)，得純的 MitoPBNO. 27 克，產(chǎn)率 48%。1H NMR(400MHz，CDCl3) δ 8. 24(d, J = 3. 8Hz, 1H)，7. 80-7. 84 (m, 6H)，7. 75-7. 76 (m, 3H)，7. 64-7. 68 (m, 6H)，7. 49 (s, 1H)，6. 84 (d, J = 3. 8Hz,2H) ,4. 15 (t, J = 4. 4Hz,2H),3. 91 (t, J = 11. 2Hz，2H)，2· 22—2. 27 (m，2H)， 1. 8-1. 88(m，2H)，1. 60(s，9H)。
權(quán)利要求
一種制備結(jié)構(gòu)的MitoPBN(自旋探針)系列化合物的合成方法，其特征在于包括以下步驟1)將對(duì)羥基苯甲醛和二溴代直鏈烷烴在堿性條件下反應(yīng)，得到式(I)結(jié)構(gòu)的化合物，其中n為2到18之間的整數(shù)。2)將式(I)結(jié)構(gòu)的化合物與三苯基磷在溶劑中反應(yīng)得到式(III)結(jié)構(gòu)的季膦鹽，其中n為2到18之間的整數(shù)。3)在溶劑中，冰浴條件下，將式(II)結(jié)構(gòu)的季膦鹽、2硝基 2烷基丙烷和鋅粉按1/3/10的當(dāng)量比混合，加入4A分子篩，然后滴加冰乙酸，冰乙酸與季膦鹽的當(dāng)量比為5∶1，1小時(shí)內(nèi)滴加完成，加完后繼續(xù)在冰浴下攪拌6小時(shí)，然后置于4攝氏度冰箱存放，再用色譜柱分離，得目標(biāo)產(chǎn)物。FSA00000111741300011.tif,FSA00000111741300012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)所述堿為有機(jī)堿或無機(jī)堿，有機(jī)堿 為二乙胺、三乙胺、吡啶、二異丙基胺、2，4，6_三甲基吡啶、四丁基氟化銨；所述無機(jī)堿為碳 酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或氫化鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)所述的反應(yīng)時(shí)間為10分鐘一兩周。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟2)反應(yīng)的溶劑為乙醇、甲醇、乙腈、苯、 甲苯或者丙酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟2)所述的反應(yīng)時(shí)間為10分鐘一兩周。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟3)所述的冰箱存放時(shí)間為1小時(shí)一兩周。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟4)把自旋探針目標(biāo)物經(jīng)脂質(zhì)體處理， 使粒徑做到20至500納米，用于進(jìn)入細(xì)胞捕捉自旋信號(hào)，改變細(xì)胞氧化還原微環(huán)境。全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備線粒體靶向定位的自旋捕捉劑MitoPBN(自旋探針)系列化合物的方法，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。合成流程如式(II)將4-羥基苯甲醛、二溴代直鏈烷烴在堿性條件下進(jìn)行消去反應(yīng)，得產(chǎn)物3；化合物3與三苯基磷反應(yīng)得到產(chǎn)物4；然后在乙醇中，將化合物4、2-硝基-2-甲基丙烷、4A分子篩和鋅粉在溶劑中混合，滴加冰乙酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，然后置于冰箱冷藏，再分離提純，得自旋探針MitoPBN；再做脂質(zhì)體包裹處理。本發(fā)明具有合成步驟較短，原料廉價(jià)易得，產(chǎn)物純度相對(duì)較高的特點(diǎn)。其功能可把捕捉自由基信號(hào)的探針進(jìn)入細(xì)胞線粒體。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101906118SQ20101016469
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者劉珊林, 施冬云, 王東林 申請(qǐng)人:劉珊林