專利名稱：一種菝葜皂苷元含量的elisa測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，簡寫SAR)含量的方法，具體 說來就是用酶聯(lián)免疫的分析方法定量檢測藥材及相關(guān)樣品中SAR的含量，此方法特別適合 于大批量樣本中SAR含量的快速檢測。屬于酶聯(lián)免疫領(lǐng)域的一種新的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。SAR為知 母中的代表性留體皂苷元，具有多種藥理活性，能提高記憶，抗抑郁，抗腫瘤。由于SAR無紫外吸收，目前對其的檢測方法主要是比色法、薄層掃描法和高效液 相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)。這些方法靈敏度低，步驟繁瑣耗時，制約了該微 量成份的快速分析檢測，也制約了其在體內(nèi)作用機理方面的深入研究。比色法檢測易受糖 類等物質(zhì)的干擾，誤差大，只能測定能被顯色劑顯色的總皂苷類成分，無法用于藥材鑒定、 中藥復(fù)方及生物樣品中該類化合物的測定；HPLC-ELSD對皂苷類的檢測前期處理程序復(fù) 雜，靈敏度較低，且需要樣品與雜質(zhì)的分離，難以滿足該類成分吸收、代謝等研究；高效液相 色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)方法采用末端吸收測定，干擾大，不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果。因而目 前的檢測方法難以滿足該類成分在藥材、復(fù)方及體內(nèi)過程中快速、微量特異性檢測的需求， 嚴重制約了含此活性成分藥物的質(zhì)量控制、作用機理等方面的研究，至今國內(nèi)外對這類化 合物吸收、代謝、分布及其作用機制研究鮮有報道。ELISA這種新的分析方法，具有靈敏、快速、樣品前處理簡單，利于批量測定的優(yōu) 點。這種新的分析方法，不需要高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等儀器分析中對樣品前處理的要 求，也不需高效液相分析中樣品與雜質(zhì)分離。因而它的優(yōu)勢是比HPLC-ELSD更加靈敏，省時 方便，尤其是在大批量樣品的分析中。建立SAR快速、微量特異性檢測方法，對于含有該活 性成分中藥及復(fù)方質(zhì)量控制和臨床用藥監(jiān)測、探索SAR作用機理及研究化學(xué)成分清晰、作 用機理明確的現(xiàn)代中藥具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有分析技術(shù)的不足，提供一種靈敏、快速、 有效的檢出SAR的方法。本發(fā)明所解決的問題1.知母藥材中SAR含量的ELISA檢測方法。2.藥材中SAR的含量測定及生物樣本中微量測定。3.現(xiàn)有分析方法靈敏度低，步驟繁瑣的問題。實現(xiàn)本目的的方法載體蛋白與SAR偶聯(lián)形成的完全抗原用于免疫動物，另一種 載體蛋白與SAR偶聯(lián)形成的完全抗原用作固相抗原間接競爭酶聯(lián)免疫法測定藥材中SAR的含量。本發(fā)明SAR含量的ELISA測定方法，其特征在于主要步驟如下
第一步、琥珀酸酐和SAR反應(yīng)使SAR羧基化；第二步、采用活潑酯法將SAR琥珀酰衍生物與N，N' _ 二環(huán)己基碳酰亞胺，N-羥基 丁二酰亞胺，在N，N-二甲基甲酰胺中攪拌反應(yīng)2-8小時，最后與10-50mg載體蛋白攪拌反 應(yīng)4-48小時，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫動物，獲得SAR的多克隆抗體；第四步、檢測抗體效價；第五步、建立間接競爭ELISA分析方法，用此方法檢測中藥材及相關(guān)樣品中SAR的含量。其中，第一步包括以下步驟A. SAR 10-200mg，琥珀酸酐 0. l_4g，吡啶 l_2mL 60_100°C水浴反應(yīng) 4-10 小時；B.反應(yīng)后產(chǎn)物經(jīng)過溶劑萃取，凝膠柱純化，得到白色粉末。所述第二步中，載體蛋白為牛血清白蛋白，羧基化后的SAR與牛血清白蛋白偶聯(lián) 產(chǎn)物作為免疫抗原。所述第二步中，載體蛋白為卵清白蛋白，羧基化后的SAR與卵清白蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物 作為檢測抗原。本發(fā)明采用琥珀酸酐法將SAR衍生化成SAR琥珀酰酯，再采用活潑酯法與牛血清 白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分別偶聯(lián)成完全抗原后免疫新西蘭大耳兔，產(chǎn)生多克隆 抗體。以SAR偶聯(lián)OVA的作為包被抗原，SAR偶聯(lián)BSA的作為免疫抗原，間接ELISA法檢 測抗體的效價，間接競爭ELISA方法作為檢測樣品中SAR含量的方法。此ELISA分析方法 檢測的線性范圍為20 1311ng/mL。與其它結(jié)構(gòu)類似的甾體皂苷元有一定程度的交叉反 應(yīng)。SAR加樣回收實驗表明重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、達到生物分析的要求。且此測定含量方法 與HPLC-ELSD具有良好的相關(guān)性。在本發(fā)明的第一方面，提供一種SAR完全抗原的合成方法。在本發(fā)明的第二方面，提供一種免疫球蛋白，其特征在于，是一種能特異性結(jié)合 SAR的多克隆抗體，此免疫球蛋白來源于兔。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種基于此多克隆抗體的ELISA檢測方法。在本發(fā)明的第四方面，提供了基于此SAR多克隆抗體的ELISA檢測方法的用途，它 被應(yīng)用于含有SAR的樣品如中藥知母、大鼠血漿等樣品中SAR含量的測定。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可制備成皂苷元ELISA檢測試劑盒，用于大批量樣本的快速、 簡便的檢測。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.檢測的靈敏度高，所需樣品量少。2.檢測過程簡化，檢測時間短，尤其適合大批量樣品的同時檢測。3.儀器設(shè)備成本低，只需酶標(biāo)儀，因此投入少、成本低。本發(fā)明可為質(zhì)檢部門，加工生產(chǎn)企業(yè)提供大批量檢測藥材中SAR含量的方法。


圖1是大鼠灌胃SAR后血藥濃度隨時間變化曲線
具體實施例方式材料試劑琥珀酸酐(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，N，N' - 二環(huán)己基碳酰亞胺(簡 稱DCC)、N-羥基丁二酰亞胺(簡稱NHS)、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑均為Sigma產(chǎn)品， SAR(純度> 98%，購自蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京中杉金 橋，TMB為Amresco產(chǎn)品。甲醇為色譜純，N, N- 二甲基甲酰胺(簡稱DMF)購自江蘇永華精 細化學(xué)品有限公司。動物新西蘭大耳兔購自南通大學(xué)實驗動物中心，SD大鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué) 中心。菝葜皂苷元酶聯(lián)免疫分析方法的建立過程和檢測過程如下實施例1抗SAR多克隆抗體的制備1.完全抗原的合成(1) SAR與BSA偶聯(lián)產(chǎn)物的制備(用于免疫動物)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小時，產(chǎn)物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合并氯仿層。再用活潑酯法將SAR琥珀酰衍生物(SAR-HS)分別和BSA 和OVA偶聯(lián)。具體方法為:SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室溫磁力攪拌 反應(yīng)4小時。此反應(yīng)產(chǎn)物加到含有30mgBSA的lOmlPBS中，室溫磁力攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng) 后的產(chǎn)物經(jīng)雙蒸水4度透析72小時，凍干即得SAR-HS-BSA的復(fù)合物。(2) SAR與OVA偶聯(lián)產(chǎn)物的制備(用作ELISA檢測抗原)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小時，產(chǎn)物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合并氯仿層。再用活潑酯法將SAR-HS分別和BSA和OVA偶聯(lián)。具體方 法為SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室溫磁力攪拌反應(yīng)4小時。此反應(yīng) 產(chǎn)物加到含有23mg0VA的lOmlPBS中，室溫磁力攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)雙蒸水4°C 透析72小時，凍干即得SAR-HS-BSA的復(fù)合物。2.多克隆抗體的制備新西蘭大耳兔，皮下多點注射lmg SAR-HS-BSA和弗氏完全佐劑混合后的乳劑。此 后的加強免疫劑量同上，注射SAR-HS-BSA和弗氏不完全佐劑混合后的乳劑。加強免疫后的 第10天取血測效價。6次免疫后，收集兔血清。3.抗體效價的檢測采用間接ELISA方法1)包被抗原包被酶聯(lián)板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍后，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加入從1 1000開始倍比稀釋的抗血清，37度 反應(yīng)2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37度反應(yīng)1小 時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。根據(jù)抗體效價判定原則陽性(P)，陰性(N)，P/N > 2. 1，P-N > 0. 2，6免后抗體效價達到32000。實施例2間接競爭ELISA分析方法的建立1. ELISA檢測線性范圍的確定1)包被抗原包被酶聯(lián)板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍后，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍后，同時加入SAR標(biāo)準(zhǔn)品配成的5000ng/mL, lOOOng/ mL，500ng/mL, lOOng/mL, 50ng/mL, lOng/mL, 5ng/mL 的各濃度梯度溶液和 SAR 多克隆抗體， 37度反應(yīng)2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37度反應(yīng)1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。加入競爭藥物SAR時的吸光值為B，不加SAR的吸光值為By B/B0為縱坐標(biāo)，競爭 藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，得到競爭抑制曲線。以lnGB/B^/d-B/Bj)為縱坐標(biāo)，競爭 藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，得到直線方程y = -1. 5337x+3. 3954，在20 1311ng/ mL范圍內(nèi)線性良好，R2 = 0. 9868。2.多克隆抗體特異性分析按上述3中的方法，將第3步反應(yīng)的各濃度的SAR標(biāo)準(zhǔn)品替換成其它結(jié)構(gòu)類似的 標(biāo)準(zhǔn)品，其它步驟同上?？贵w的交叉反應(yīng)測定結(jié)果如下表1菝葜皂苷元多克隆抗體交叉反應(yīng)實驗 3. ELISA檢測方法與HPLC-ELSD檢測方法的相關(guān)性色譜條件采用Diamonsil 柱(250X4. 6mm，5ii) ；Shimadzu LC-10A型高效液相色 譜儀；Alltech 2000ES型蒸發(fā)光檢測器。甲醇-水(95 5)為流動相；流速為l.OmL/min;漂移管溫度63 °C ；載氣流 速1. 7L/min。對照品溶液稀釋成濃度為 100 u g/mL, 150 u g/mL, 200 u g/mL, 250 u g/mL 300 u g/mL, 350 u g/mL的溶液，用HPLC-ELSD測定，此各濃度溶液稀釋500倍后，用ELISA測 定，考察ELSD測定值和ELISA測定值之間的相關(guān)性。各濃度梯度樣品ELISA測定結(jié)果與ELSD的測定結(jié)果基本一致，具有相關(guān)性，相關(guān)性方程為 y = 1. 0108x-ll. 711，R2 = 0. 9853。實施例3中藥知母中SAR含量的ELISA測定1.知母藥材處理方法取知母藥材，粉碎，過60目篩，精密稱取藥材粉末0. Sg，置具塞錐形瓶中，加入甲 醇25mL，靜置過夜，超聲處理40min，過濾，精密量取續(xù)濾液10mL，加入10%鹽酸加熱回流2 小時，提取液加入40% NaOH中和。氯仿萃取兩次，每次30mL。合并氯仿層，回收溶劑，殘渣 用甲醇溶解定容至2mL。2.重復(fù)性試驗精密稱取知母藥材粉末0. 5g，平行6份，按知母藥材處理方法制備供試品溶液，間 接競爭ELISA法測定含量，計算6份藥材含量之間的RSD值。同一來源知母樣品6份，測得 SAR 含量為 0. 6%, RSD 值為 3. 7%03.加樣回收試驗精密稱取知母藥材粉末0. 25g，平行9份，置具塞錐形瓶中，精密加入SAR標(biāo)準(zhǔn)品 0. 9mg、l. 5mg、2. lmg,制備供試品溶液，間接競爭ELISA方法測定含量，計算回收率和日內(nèi) 精密度。同時精密稱取知母藥材粉末0.25g，連續(xù)3天精密加入0.9mg SAR，測定含量，計算 日間變異系數(shù)。表2ELISA測定SAR加樣回收率(n = 3) a SAR測量值為3份樣品的平均值士 SD ；b相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；c加樣回收率計算公式回收率(％ )=(測定值-1.5)/添加量X 1004.知母藥材中SAR含量測定不同產(chǎn)地知母藥材樣品處理方法如上所述，各樣品溶液用ELISA方法和ELSD方法 同時測定。間接競爭ELISA測定含量步驟如下1)包被抗原包被酶聯(lián)板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍后，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍后，同時加入SAR標(biāo)準(zhǔn)品配成的標(biāo)曲各濃度梯度溶 液，適當(dāng)稀釋的待測樣品和SAR多克隆抗體，37度反應(yīng)2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37度反應(yīng)1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。每份樣品檢測3次取平均值，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)和0D值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品 的含量。每塊96孔板，可同時檢測20份以上的樣品。測定結(jié)果如下表
表3ELISA和HPLC-ELSD方法測定不同產(chǎn)地知母藥材中SAR含量(又士SD) 實施例4大鼠血漿中SAR含量測定1.血漿標(biāo)曲的建立10 PL不同濃度的SAR標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到大鼠空白血清中，渦旋儀上渦旋混合 20s,配成 5000ng/mL，1000ng/mL, 500ng/mL, 100ng/mL, 50ng/mL, lOng/mL 的血漿標(biāo)曲溶液。 血漿標(biāo)曲的ELISA建立步驟1)包被抗原包被酶聯(lián)板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍后，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍后，同時加入SAR標(biāo)準(zhǔn)品配成的血漿標(biāo)曲各濃度梯 度溶液和SAR多克隆抗體，37度反應(yīng)2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37度反應(yīng)1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。以血漿中加入競爭藥物SAR時的吸光值為B，不加SAR的吸光值為By B/B0為縱 坐標(biāo)，競爭藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，得到競爭抑制曲線。以lnGB/B^/d-B/Bj)為 縱坐標(biāo)，競爭藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，得到直線方程y = -1. 1097x+1.8125，在 2. 4-763ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，R2 = 0. 9879。2.血漿加樣回收實驗200iiL空白大鼠血漿中，添加lOiiL的SAR標(biāo)準(zhǔn)品，使配成終濃度為500ng/mL， 100ng/mL，10ng/mL的血漿樣品溶液。采用間接競爭ELISA方法測定。此各濃度樣品連續(xù)3 天測定。計算日內(nèi)日間精密度以及回收率。結(jié)果如表4所示表4ELISA測定大鼠血漿中SAR含量的精密度和準(zhǔn)確度 a測定值=平均值士 SD(n = 6)b回收率=SAR測定值/SAR添加量X100%c變異系數(shù)3.大鼠灌胃SAR后血漿中SAR含量測定SD大鼠6只，提前12小時禁食，口服灌胃SAR100mg/kg,分別于給藥后0.5,1,2,4, 6，8，10，12，24，48，72h取血。血漿樣本8000rpm離心10分鐘，上層血清_20°C保存。采用 上述間接競爭ELISA方法測定血藥濃度，計算的藥代動力學(xué)參數(shù)如表5所示，血藥濃度隨時 間變化見附圖。表5大鼠灌胃SAR100mg/kg后藥代動力學(xué)參數(shù)
權(quán)利要求
一種菝葜皂苷元含量的酶聯(lián)免疫(ELISA)測定方法，其特征在于主要步驟如下第一步、琥珀酸酐和菝葜皂苷元反應(yīng)使菝葜皂苷元羧基化；第二步、采用活潑酯法將菝葜皂苷元琥珀酰衍生物與N，N′-二環(huán)己基碳酰亞胺，N-羥基丁二酰亞胺，在N，N-二甲基甲酰胺中攪拌反應(yīng)2-8小時，最后與10-50mg載體蛋白攪拌反應(yīng)4-48小時，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫動物，獲得抗菝葜皂苷元的多克隆抗體；第四步、檢測抗體效價；第五步、建立間接競爭ELISA分析方法，用此方法檢測中藥材及相關(guān)樣品中菝葜皂苷元的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是所述第一步 包括以下步驟A.菝葜皂苷元10-200mg，琥珀酸酐0.l_4g，吡啶l_2mL，60_100°C水浴反應(yīng)4_10小時；B.反應(yīng)后產(chǎn)物經(jīng)過溶劑萃取，凝膠柱純化，得到白色粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是所述第二步 中，載體蛋白為牛血清白蛋白，羧基化后的菝葜皂苷元與牛血清白蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物作為免疫 抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是所述第二步 中，載體蛋白為卵清白蛋白，羧基化后的菝葜皂苷元與卵清白蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物作為檢測抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是其檢測過程 是包被酶標(biāo)板，封閉酶標(biāo)板，酶標(biāo)板中加入待測藥物和抗體，加入酶標(biāo)二抗，底物顯色，終止 反應(yīng)測定吸光值包含有能特異性識別菝葜皂苷元的免疫球蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是所述免疫球 蛋白來自兔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特征是第五步所述 的分析方法為間接競爭ELISA。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測菝葜皂苷元含量的酶聯(lián)免疫分析方法，涉及菝葜皂苷元抗體的制備，酶聯(lián)免疫分析方法的建立及其在含有菝葜皂苷元中藥材或相關(guān)樣品含量測定中的應(yīng)用。本發(fā)明用與載體蛋白偶聯(lián)的菝葜皂苷元作為完全抗原，獲得針對抗菝葜皂苷元的抗體，并且用于藥材及相關(guān)樣品中菝葜皂苷元含量的測定。目的是提供一種新的菝葜皂苷元檢測分析方法。本分析方法靈敏度高，樣品前處理簡單，測定過程簡便，快速，適合于研究單位，檢驗部門，貿(mào)易大批量樣品分析檢測的需要。
文檔編號G01N33/566GK101852801SQ20101017182
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者余伯陽, 劉吉華, 王晶 申請人:中國藥科大學(xué)