專利名稱：高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法，尤其是涉及一種高效液相色譜 串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法，主要用于對蜂膠中氯霉素藥物殘留量進行檢 查，同時也適用于對蜂王漿、蜂蜜中氯霉素藥物殘留量進行檢查。
背景技術：
氯霉素(Chloramphenicol)是由委內瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素，為廣譜抑菌劑。 由于其對血液系統(tǒng)的毒性較大，被歐盟、日本、美國等國禁止用于動物源性食品。氯霉素檢測方法主要有LC/MS/MS法、GC/MS法、GC法、ELISA法、HPLC法和CHARM II法等，如SN/T 2063-2008中的進出口蜂王漿中氯霉素殘留量的檢測方法和農(nóng)業(yè)部781 號公告-2-2006中的動物源食品中氯霉素殘留量的測定高效液相色譜均屬于LC/MS/MS 法，如農(nóng)業(yè)部781號公告-10-2006中的蜂蜜中氯霉素殘留量的測定氣相色譜法和GB/ T 22338-2008中的動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定均屬于GC/MS法，如農(nóng)業(yè)部 1025號公告-21-2008中的動物源食品中氯霉素殘留檢測氣相色譜法屬于GC法，如SN/T 2058-2008中的進出口蜂王漿中氯霉素殘留量測定方法屬于ELISA法，如由吳華、黃鴻和歐 劍峰等發(fā)表在四川化工2009年第12卷第3期第40-42頁上的高效液相色譜法測定蜂蜜 中氯霉素殘留量的研究和由潘瑩宇、許茜和康學軍等發(fā)表在色譜2005年第23卷第6期第 577-580頁上的高效液相色譜_熒光檢測法測定牛奶中氯霉素的殘留量均屬于HPLC法，如 SN/T1966-2007上的水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測方法屬于CHARM II法。由上可知，液相色譜-串聯(lián)質譜方法作為確證方法已經(jīng)廣泛被國內外政府監(jiān)督檢 驗機構運用，其在靈敏度、準確度、檢測效率上所具有的獨特優(yōu)勢，已成為目前最優(yōu)越性的 殘留檢測儀器設備，用于檢測動物源性食品中氯霉素殘留量時，其檢測限可以達到0. 1 μ g/ kg，相關文獻報道已經(jīng)很多。但是，由于不同種類的樣品成分不一樣，樣品凈化程度也不同， 在使用液相色譜-串聯(lián)質譜方法時，并非所有的樣品都能夠達到0. 1 μ g/kg這個檢出限， 例如使用已有的可以測定氯霉素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質譜方法測定蜂膠中氯霉素殘 留量時，其檢測限遠達不到0. 1 μ g/kg，這是因為蜂膠中的成分有近千種，國內還沒有理想 的方法作為蜂膠中氯霉素殘留量檢測標準，國內也未見蜂膠中氯霉素殘留量檢測的相關文 獻。綜上所述，目前還沒有一種方法簡單、準確，檢測成本低，檢測效率高，檢測限能達 0. 1 μ g/kg的用于測定蜂膠中氯霉素殘留限量的方法，在蜂膠檢測中難以滿足國外對蜂膠 中氯霉素殘留限量的要求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的上述不足，而提供一種方法簡單，檢測 成本低，檢測效率高，檢測限能達0. 1 μ g/kg的高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素 殘留量的方法。
本發(fā)明解決上述問題所采用的技術方案是該高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中 氯霉素殘留量的方法的特點在于該方法所用到的原料包括純度大于99.0%的氯霉素標 準品，濃度為100mg/l的D5-氯霉素標準品，為農(nóng)殘級的乙酸乙酯，為分析純的氫氧化鈉，為 優(yōu)級純的正己烷，為液相色譜純的乙腈，蜂膠樣品；該方法所用到的設備包括三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、數(shù)據(jù)處理軟件的高效液相色譜儀；所述三重四極桿串聯(lián)質譜儀中的離子源溫 度為600°C，輔助加熱氣為55. OOpsi，干燥氣為65. OOpsi，氣簾氣為25. OOpsi，碰撞氣 為5. OOpsi,電噴霧電壓為-4100. 00V,離子化法為負離子模式；所述高效液相色譜儀為 Agilent 1200series，色譜柱為 Hypersil 0DS2，色譜柱的規(guī)格為 4. 6mmX 150mm，5 μ m，柱溫 為30°C，進樣量為20μ 1 ；該方法包括標準溶液制備工序、標準曲線制作工序、蜂膠樣液制備工序和氯霉素 殘留量檢測工序；所述標準溶液制備工序如下a、氯霉素貯備標準溶液配制步驟稱取氯 霉素標準品IOmg用乙腈定容至IOml配成濃度為1000mg/L的氯霉素貯備標準溶液，將該氯 霉素貯備標準溶液置于-18°C以下保存待用；b、氯霉素中間標準液配制步驟取a中的氯霉 素貯備標準溶液100 μ 1用乙腈定容至IOml配成濃度為10mg/L的氯霉素中間標準液；C、氯 霉素氘代內標中間液配制步驟采用D5-氯霉素標準品代替氯霉素標準品，重復上述a步驟 和b步驟，制得濃度為10mg/L的氯霉素氘代內標中間液；d、臨時標準使用液配制步驟取 氯霉素中間標準液用體積濃度為30 %的乙腈水溶液配至5 μ g/kg和50 μ g/kg，取氯霉素氘 代內標中間液用體積濃度為30%的乙腈水溶液配至200μ g/kg ；所述標準曲線制作工序中，取標準溶液制備工序中制得的氯霉素貯備標準溶液、 氯霉素中間標準液、氯霉素氘代內標中間液和臨時標準使用液，通過高效液相色譜儀和三 重四極桿串聯(lián)質譜儀得到標準曲線；所述蜂膠樣液制備工序中，取蜂膠樣品2g和濃度為200μ g/kg的D5-氯霉素標準 品內標50ul置于一號50ml離心塑料瓶中并充分混合，然后靜置5min以上，再向一號50ml 離心塑料瓶中加入5ml濃度為lmol/L的NaOH溶液并不斷振蕩提取5min，使蜂膠樣品充分 溶解，然后向一號50ml離心塑料瓶中加入5ml水并搖勻，再向一號50ml離心塑料瓶中加入 IOml濃度為5%的HClO4進行酸化并充分搖勻而制得蜂膠液；該蜂膠液先在常溫下超聲提 取5min，再在轉速為3000rpm下離心5min而得到上層離心液，然后對上層離心液進行過濾 而制得濾液；取濾液IOml置于二號50ml離心塑料瓶中，用濃度為lmol/L的NaOH溶液將 濾液的PH值調節(jié)到10. 5，然后向二號50ml離心塑料瓶中加入IOml乙酸乙酯并充分混合 3min,在轉速為3000rpm下離心2min而得到乙酸乙酯層，然后將乙酸乙酯層置于15ml塑料 離心管中，該乙酸乙酯層在35°C下進行氮氣吹干，再向15ml塑料離心管中加入體積濃度為 30%的乙腈水溶液Iml并進行超聲溶解，然后向15ml塑料離心管中加入2ml正己烷并充分 混合而制得離心液，將該離心液在轉速為SOOrpm下離心2min而得到下層樣液，最后將下層 樣液過0. 22 μ m的濾膜而制得蜂膠樣液；所述氯霉素殘留量檢測工序中，取蜂膠樣液制備工序中制得的蜂膠樣液，通過高 效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)質譜儀，并結合標準曲線制作工序中得到的標準曲線而測 得蜂膠中氯霉素的殘留量；該方法的檢測限為0. 1 μ g/kg，定量限為0. 3 μ g/kg。本發(fā)明該方法所使用的水為雙重蒸餾水。
本發(fā)明所述蜂膠樣液制備工序中，向一號50ml離心塑料瓶中加入濃度為lmol/L 的NaOH溶液溶解蜂膠樣品，然后用水稀釋以釋出蜂膠樣品中的氯霉素殘留物，再用HClO4 進行酸化以沉淀蜂膠樣品中的蜂膠成分。本發(fā)明所述蜂膠樣液制備工序中，蜂膠樣液用濃度為lmol/L的NaOH溶液將濾液 的PH值調節(jié)到10. 5，乙酸乙酯層在35°C下采用氮吹儀進行氮氣吹干，再向15ml塑料離心 管中加入體積濃度為30%的乙腈水溶液Iml并采用超聲波儀進行超聲溶解。本發(fā)明與現(xiàn) 有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果本發(fā)明用于測定蜂膠中氯霉素藥 物的殘留量，與固相萃取方法相比不增加溶劑用量，不采用固相萃取小柱，凈化后的樣品無 色透明，在質譜圖上無干擾，連續(xù)進樣70次后，三重四極桿串聯(lián)質譜儀中的離子源氣簾板 仍保持干凈。本發(fā)明的檢測限為0. 1 μ g/kg，定量限為0. 3 μ g/kg，線性相關系數(shù)為0. 9999， 回收率在82. 0-108. 2 %，相對標準偏差在5. 35-14. 2 %，精密度良好，完全能夠滿足進口國 對蜂膠中氯霉素藥物殘留限量的要求。本發(fā)明充分發(fā)揮了質譜的優(yōu)勢，利用簡單、快捷的樣品凈化方法，通過優(yōu)化液相、 質譜條件，減少樣品基質干擾，使方法達到了足夠的靈敏度。本方法同時適用于蜂王漿、蜂 蜜中氯霉素藥物殘留量的檢測，由于樣品預處理的成本低廉，特別適合企業(yè)基層對收購、生 產(chǎn)全過程進行質量控制，有利于提高蜂王漿、蜂蜜的質量。


圖1是本發(fā)明實施例中蜂膠陰性樣品添加1. 0 μ g/kg標準濃度時，用LC/MS/MS測 定蜂王漿中硝基咪唑類藥物殘留的總離子流圖；圖2是本發(fā)明實施例中蜂膠陰性樣品添加1. 0 μ g/kg標準濃度時，用LC/MS/MS測 定蜂王漿中硝基咪唑類藥物殘留的提取離子流圖。
具體實施例方式下面結合附圖并通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā) 明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。實施例參見圖1和圖2，本實施例中高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的 方法包括標準溶液制備工序、標準曲線制作工序、蜂膠樣液制備工序和氯霉素殘留量檢測 工序。本實施例所用到的原料包括水，純度大于99. 0%的氯霉素標準品，濃度為IOOmg/ 1均來自德國Dr. Ehrenstorfer公司的D5-氯霉素標準品，為農(nóng)殘級的乙酸乙酯，為分析純 的氫氧化鈉、甲醇、氯化鈉和無水硫酸鈉，為優(yōu)級純的正己烷和甲酸，為液相色譜純的乙腈 和乙酸銨，待檢測的蜂膠樣品。其中所用的水為雙重蒸餾水。本實施例所用到的設備包括API3200三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配有二元泵、在線 脫氣機、自動進樣器、Analyst數(shù)據(jù)處理軟件的高效液相色譜儀，Sartorius BS224S分析天 平，PHS-3C雷磁精密pH計，無錫市瑞江分析儀器有限公司RJ-TDL-40B低速臺式大容量離 心機，Organomation N-EVAP 111氮吹儀，超聲波儀。其中三重四極桿串聯(lián)質譜儀中的離子 源溫度為600°C，輔助加熱氣為55. OOpsi，干燥氣為65. OOpsi，氣簾氣為25. OOpsi，碰撞氣 表2三重四極桿串聯(lián)質譜儀的氯霉素殘留測定參考質譜條件表 注表中帶下劃線黑體字為定量離子。本實施例的蜂膠樣液制備工序中，先稱取蜂膠樣品2g置于一號50ml離心塑料瓶 中，再取濃度為200y g/kg的氯霉素氘代內標臨時標準使用液50ul置于一號50ml離心塑 料瓶中，將200y g/kg的氯霉素氘代內標臨時標準使用液和蜂膠樣品充分混合，靜置5min 以上，然后向一號50ml離心塑料瓶中加入5ml濃度為lmol/L的NaOH溶液并不斷振蕩提取 5min，使蜂膠樣品充分溶解，再向一號50ml離心塑料瓶中加入5ml水并搖勻，然后向一號
為5. OOpsi,電噴霧電壓為-4100. 00V,罔子化法為負罔子模式；所用的高效液相色譜儀為 Agilent 1200series，色譜柱為 Hypersil 0DS2，色譜柱的規(guī)格為 4. 6mmX 150mm，5 ii m，柱溫 為30°C，進樣量為20iU。本實施例中的標準溶液制備工序包括如下步驟a、氯霉素貯備標準溶液配制步 驟稱取氯霉素標準品10mg置于10ml容量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成濃度為lOOOrng/ L的氯霉素貯備標準溶液，然后將該氯霉素貯備標準溶液置于_18°C以下保存待用；b、氯霉 素中間標準液配制步驟取a中的氯霉素貯備標準溶液100 yl置于10ml容量瓶中，用乙 腈定容至10ml而配成濃度為10mg/L的氯霉素中間標準液；c、氯霉素氘代內標中間液配制 步驟稱取D5-氯霉素標準品10mg置于10ml容量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成濃度為 1000mg/L的D5-氯霉素貯備標準溶液，然后取D5-氯霉素貯備標準溶液100 yl置于10ml容 量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成濃度為10mg/L的氯霉素氘代內標中間液；d、臨時標準使 用液配制步驟取氯霉素中間標準液用體積濃度為30%的乙腈水溶液配制成濃度為5 y g/ kg的氯霉素臨時標準使用液和濃度為50P g/kg的氯霉素臨時標準使用液，取氯霉素氘代 內標中間液用體積濃度為30%的乙腈水溶液配制成濃度為200y g/kg的氯霉素氘代內標 臨時標準使用液。本實施例的標準曲線制作工序中，取標準溶液制備工序中制得的氯霉素貯備標準 溶液、氯霉素中間標準液、氯霉素氘代內標中間液和臨時標準使用液，通過高效液相色譜儀 和三重四極桿串聯(lián)質譜儀測出相關參數(shù)，進而得到標準曲線。高效液相色譜儀采用液相梯 度程序，表1為高效液相色譜儀的液相梯度洗脫程序表，三重四極桿串聯(lián)質譜儀的氯霉素 殘留測定參考質譜條件見表2，表1和表2的內容如下表1高效液相色譜儀的液相梯度洗脫程序表50ml離心塑料瓶中加入10ml濃度為5%的HC104進行酸化并充分搖勻而制得蜂膠液。該蜂 膠液先在常溫下通過超聲波儀進行超聲提取5min，再通過離心機以轉速為3000rpm的條件 下離心5min，蜂膠液出現(xiàn)分層而得到上層離心液，然后對上層離心液進行過濾而制得濾液。 取濾液10ml置于二號50ml離心塑料瓶中，用濃度為lmol/L的NaOH溶液將濾液的pH值調 節(jié)到10. 5，通過對濾液pH的調節(jié)而達到凈化濾液的目的，而且濾液凈化的整個過程都無需 使用固相萃取小柱，然后向二號50ml離心塑料瓶中加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min，通 過離心機在轉速為3000rpm的條件下離心2min而得到乙酸乙酯層，然后將乙酸乙酯層置于 15ml塑料離心管中，并在35°C下采用氮吹儀對乙酸乙酯層進行氮氣吹干，再向15ml塑料離 心管中加入體積濃度為30%的乙腈水溶液1ml并通過超聲波儀進行超聲溶解，然后向15ml 塑料離心管中加入2ml正己烷并充分混合去脂而制得離心液，再通過離心機將該離心液在 轉速為800rpm下離心2min而得到下層樣液，最后將下層樣液過0. 22 y m的濾膜而制得蜂 膠樣液。本實施例氯霉素殘留量檢測工序中，取蜂膠樣液制備工序中制得的蜂膠樣液，使 用高效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)質譜儀，并結合標準曲線制作工序中得到的標準曲線 而測得蜂膠中氯霉素的殘留量。本實施例對蜂膠樣品的凈化方法進行了優(yōu)化，由于氯霉素在中性水溶液中不溶， 溶于有機溶劑，此為液液萃取凈化蜂膠樣品提供了理論支持，使得蜂膠中氯霉素殘留量的 測定方法可以不用固相萃取技術，降低了檢測成本，而溶劑的消耗量并沒有增加，本發(fā)明根 據(jù)這一特點，在藥物呈電中性時用有機溶劑進行液液萃取，從而達到對蜂膠樣品進行凈化 的目的。蜂膠樣品不溶于水，溶于質量濃度為2%的NaOH、甲醇、乙醇等，要提取、凈化與富 集蜂膠中的氯霉素，必須先將蜂膠樣品溶化方可用溶劑進行提取，由于絕大多數(shù)文獻資料 都采用乙酸乙酯來提取蜂膠樣品中的氯霉素，而乙酸乙酯與甲醇、乙醇是互溶的，與水是不 互溶的，氯霉素在堿性條件下又比較穩(wěn)定，故本發(fā)明優(yōu)先選用先將蜂膠樣品溶于NaOH溶液 中，再用乙酸乙酯來提取。經(jīng)過試驗，用NaOH溶解蜂膠樣品后直接用乙酸乙酯來提取蜂膠樣品中的氯霉素 時，提取的氯霉素中的雜質多，這是因為蜂膠樣品中的堿溶部分同時也溶于乙酸乙酯，故考 慮將堿溶解的蜂膠樣品進行酸化，去除蜂膠樣品中的大部分堿溶組分，此時蜂膠樣品中的 氯霉素仍溶解在水相中，過濾后樣液的PH值分別調節(jié)到4、6、8和10. 5，再使用乙酸乙酯對 蜂膠樣品中的氯霉素進行提取，發(fā)現(xiàn)樣液的PH值為10. 5時，凈化的樣液無色，表明凈化效 果良好。在進行定量分析時，若將蜂膠樣品進行酸化后采用水來定容就容易產(chǎn)生氣泡，若 此時采用甲醇、乙醇來消泡，則會導致雜質增多，故不易采用，不過可以考慮采用其它硅酮 類消泡劑。本發(fā)明采用內標方法進行定量，定量加入試劑，因為蜂膠樣品不溶于酸，所以可 以忽略蜂膠樣品帶來的體積影響，試劑的加入體積，即為樣液體積。為了進一步凈化蜂膠樣 品，本發(fā)明對進樣前的樣液進行脫脂處理，采用了烴類中的正己烷作為脫脂溶劑。本實施例對高效液相色譜儀的液相色譜條件進行了優(yōu)化，為了保證不同性質的多 殘留在色譜柱上的分離效率，本方法研究了 Hypersil、Akasil、Venusil MP,Shim-pack VP、 Intersil等型號的色譜柱，發(fā)現(xiàn)Hypersil 0DS2色譜柱的分離度好、靈敏度高、峰形窄而對
8稱。本發(fā)明的流動相采用了常用的酸性水相和有機相并作梯度洗脫，以提高分離度和 靈敏度，常用酸主要有甲酸、乙酸，我們根據(jù)掌握的信息和實際情況，研究流動相中不同濃 度的甲酸或乙酸對分離效果的影響，分別用體積濃度(V/V)為0. 1%、0.2%、0.4%、1.0% 的甲酸或乙酸，并選擇合適的揮發(fā)性鹽類，提高離子化效率，以獲得分離良好，峰形對稱、信 號強度大、靈敏度高的色譜圖，結果體積濃度為0. 的乙酸作為流動相的信號最強，加入 5mmol/L的乙酸銨后色譜信號得到增強，提高了靈敏度。本發(fā)明采用不同的梯度條件，分析色譜柱對多殘留的色譜行為，優(yōu)選出最佳的梯 度條件，同時優(yōu)化流動相的流速、柱溫，以取得最優(yōu)的色譜圖，優(yōu)化結果參見表1。本實施例對三重四極桿串聯(lián)質譜儀的質譜條件進行了優(yōu)化，配制濃度為lmg/L的 各種殘留標準溶液，用針泵以L/mL的流速進入質譜儀，以正離子模式進行QlMS(Ql)全 掃描，確定分子離子峰，調節(jié)離子源電壓、DP、FP參數(shù)，再以分子離子峰作為母離子，進行子 離子掃描，調節(jié)CE參數(shù)，使母離子的強度占子離子強度的1/3 1/4為最佳，從質譜圖中選 擇2-4個信號較強的子離子作為定性離子，離子豐度最強的子離子為定量離子，采用針泵 流動注射標準溶液，手動運行RAMP進行參數(shù)優(yōu)化。質譜參數(shù)確定后，連接液相色譜進樣，由于各種殘留的離子源溫度、輔助加熱氣、 干燥氣、氣簾氣、電噴霧電壓等參數(shù)在單純質譜條件下是不一樣的，因此選擇適中的一組參 數(shù)在液相條件下再進行優(yōu)化，在本實施例的液相條件下進樣2 u g/kg的混標，再逐個進行 優(yōu)化與微調，使各種物質的靈敏度、峰形達到最佳。下面來對本發(fā)明的線性范圍、檢出限、回收率和精密度進行分析，用體積濃度為 30 %的乙腈水溶液配制成氯霉素濃度為0. 3 u g/kg、0. 5 u g/kg、1 u g/kg,5 u g/kg、10 u g/ kg系列的標準溶液，含內標5 u g/kg,按照本發(fā)明設定的色譜條件進樣測定。以y表示峰 面積(A)，以x表示濃度C (u g/kg)，用EXCEL軟件求得回歸方程和線性相關系數(shù)，得到線性 范圍，氯霉素的線性范圍為0. 3 u g/kg-10 u g/kg,線性相關系數(shù)為0. 9999，以信噪比S/N = 3對應濃度確定氯霉素殘留的檢出限為0. 1 u g/kg,以信噪比S/N = 10對應濃度確定氯霉 素殘留的定量限為0. g/kg，此處所說的信噪比S/N為現(xiàn)有技術，采用信噪比S/N結合對 應濃度確定氯霉素殘留的檢出限和定量限對本領域技術人員來說為公知常識，此處不再詳 述。在蜂王漿陰性樣品中，分別添加0. 3 u g/kgUu g/kg,5 u g/kg這3個濃度的氯霉 素殘留標準品，按本方法進行樣品的處理與測定，確定本方法的回收率和相對標準偏差，具 體結果參見表3。表3氯霉素在蜂膠樣品中添加不同濃度的回收率表(n = 3) 本發(fā)明對蜂膠樣品預處理的成本低廉，操作簡單、快捷，連續(xù)進樣70次后，三重四 極桿串聯(lián)質譜儀中的離子源氣簾板仍保持干凈，特別適合企業(yè)基層對收購、生產(chǎn)全過程進 行質量控制。本發(fā)明的檢測限為0. 1 u g/kg，定量限為0. 3 u g/kg，線性相關系數(shù)為0. 9999， 回收率在82. 0-108. 2%，相對標準偏差在5. 35-14. 2%，精密度良好，完全能夠滿足進口國 對蜂膠中氯霉素藥物殘留限量的要求。雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護范圍，任何熟 悉該項技術的技術人員，在不脫離本發(fā)明的構思和范圍內所作的更動與潤飾，均應屬于本 發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法，其特征在于該方法所用到的原料包括純度大于99.0％的氯霉素標準品，濃度為100mg/l的D5-氯霉素標準品，為農(nóng)殘級的乙酸乙酯，為分析純的氫氧化鈉，為優(yōu)級純的正己烷，為液相色譜純的乙腈，蜂膠樣品；該方法所用到的設備包括三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、數(shù)據(jù)處理軟件的高效液相色譜儀；所述三重四極桿串聯(lián)質譜儀中的離子源溫度為600℃，輔助加熱氣為55.00psi，干燥氣為65.00psi，氣簾氣為25.00psi，碰撞氣為5.00psi，電噴霧電壓為-4100.00V，離子化法為負離子模式；所述高效液相色譜儀為Agilent 1200series，色譜柱為Hypersil ODS2，色譜柱的規(guī)格為4.6mm×150mm，5μm，柱溫為30℃，進樣量為20μl；該方法包括標準溶液制備工序、標準曲線制作工序、蜂膠樣液制備工序和氯霉素殘留量檢測工序；所述標準溶液制備工序如下a、氯霉素貯備標準溶液配制步驟稱取氯霉素標準品10mg用乙腈定容至10ml配成濃度為1000mg/L的氯霉素貯備標準溶液，將該氯霉素貯備標準溶液置于-18℃以下保存待用；b、氯霉素中間標準液配制步驟取a中的氯霉素貯備標準溶液100μl用乙腈定容至10ml配成濃度為10mg/L的氯霉素中間標準液；c、氯霉素氘代內標中間液配制步驟采用D5-氯霉素標準品代替氯霉素標準品，重復上述a步驟和b步驟，制得濃度為10mg/L的氯霉素氘代內標中間液；d、臨時標準使用液配制步驟取氯霉素中間標準液用體積濃度為30％的乙腈水溶液配至5μg/kg和50μg/kg，取氯霉素氘代內標中間液用體積濃度為30％的乙腈水溶液配至200μg/kg；所述標準曲線制作工序中，取標準溶液制備工序中制得的氯霉素貯備標準溶液、氯霉素中間標準液、氯霉素氘代內標中間液和臨時標準使用液，通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)質譜儀得到標準曲線；所述蜂膠樣液制備工序中，取蜂膠樣品2g和濃度為200μg/kg的D5-氯霉素標準品內標50ul置于一號50ml離心塑料瓶中并充分混合，然后靜置5min以上，再向一號50ml離心塑料瓶中加入5ml濃度為1mol/L的NaOH溶液并不斷振蕩提取5min，使蜂膠樣品充分溶解，然后向一號50ml離心塑料瓶中加入5ml水并搖勻，再向一號50ml離心塑料瓶中加入10ml濃度為5％的HClO4進行酸化并充分搖勻而制得蜂膠液；該蜂膠液先在常溫下超聲提取5min，再在轉速為3000rpm下離心5min而得到上層離心液，然后對上層離心液進行過濾而制得濾液；取濾液10ml置于二號50ml離心塑料瓶中，用濃度為1mol/L的NaOH溶液將濾液的pH值調節(jié)到10.5，然后向二號50ml離心塑料瓶中加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min，在轉速為3000rpm下離心2min而得到乙酸乙酯層，然后將乙酸乙酯層置于15ml塑料離心管中，該乙酸乙酯層在35℃下進行氮氣吹干，再向15ml塑料離心管中加入體積濃度為30％的乙腈水溶液1ml并進行超聲溶解，然后向15ml塑料離心管中加入2ml正己烷并充分混合而制得離心液，將該離心液在轉速為800rpm下離心2min而得到下層樣液，最后將下層樣液過0.22μm的濾膜而制得蜂膠樣液；所述氯霉素殘留量檢測工序中，取蜂膠樣液制備工序中制得的蜂膠樣液，通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)質譜儀，并結合標準曲線制作工序中得到的標準曲線而測得蜂膠中氯霉素的殘留量；該方法的檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。
2.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法，其特征在于該方法所使用的水為雙重蒸餾水。
3.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法， 其特征在于所述蜂膠樣液制備工序中，向一號50ml離心塑料瓶中加入濃度為lmol/L的 NaOH溶液溶解蜂膠樣品，然后用水稀釋以釋出蜂膠樣品中的氯霉素殘留物，再用HC104進行 酸化以沉淀蜂膠樣品中的蜂膠成分。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方 法，其特征在于所述蜂膠樣液制備工序中，蜂膠樣液用濃度為lmol/L的NaOH溶液將濾液 的PH值調節(jié)到10. 5，乙酸乙酯層在35°C下采用氮吹儀進行氮氣吹干，再向15ml塑料離心 管中加入體積濃度為30%的乙腈水溶液1ml并采用超聲波儀進行超聲溶解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜串聯(lián)質譜測定蜂膠中氯霉素殘留量的方法，目前還沒有檢測成本低，檢測限達0.1μg/kg的測定方法。本發(fā)明包括標準溶液制備、標準曲線制作、蜂膠樣液制備和氯霉素殘留量檢測工序；蜂膠樣液制備工序中加入1mol/L的NaOH溶液溶解蜂膠樣品，用水稀釋以釋出蜂膠樣品中的目標物，再用HClO4進行酸化以沉淀蜂膠樣品中的蜂膠成分，蜂膠樣液用1mol/L的NaOH溶液將濾液的pH值調節(jié)到10.5；最后將蜂膠樣液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)質譜儀測得氯霉素的殘留量。本發(fā)明檢測成本低，檢測效率高，檢測限能達0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg，線性相關系數(shù)為0.9999。
文檔編號G01N30/72GK101865886SQ201010181330
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權日2010年5月24日
發(fā)明者周萍, 毛增亮, 錢志來, 陳建清 申請人:杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司