專利名稱：細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體地說(shuō)是細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣 藻的方法。
背景技術(shù)：
生物光合制氫是未來(lái)清潔能源可持續(xù)生產(chǎn)的重要途徑之一，包括萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)在內(nèi)的許多微型綠藻和藍(lán)藻可以在缺氧的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞 核內(nèi)的氫酶(H2ase)基因表達(dá)，氫酶被運(yùn)到葉綠體中，將光合作用中產(chǎn)生的H+和e_合成H2， 釋放到細(xì)胞外，是利用太陽(yáng)能持續(xù)生產(chǎn)氫氣的理想模式。萊茵衣藻生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)成本 低，氫酶活性高，是很有開(kāi)發(fā)潛力的微藻光合制氫藻種。氫酶對(duì)氧氣敏感而導(dǎo)致萊茵衣藻產(chǎn) 氫率低，是限制這一技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要原因?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)對(duì)萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝的過(guò)程和 培養(yǎng)條件有了比較深入的研究，但是萊茵衣藻的產(chǎn)氫代謝過(guò)程與光合電子傳遞、非光合電 子傳遞、淀粉代謝、呼吸代謝、發(fā)酵代謝和光合作用等多個(gè)代謝過(guò)程關(guān)系密切，其產(chǎn)氫量很 大程度上受這些代謝的影響，所以一直無(wú)法解決萊茵衣藻產(chǎn)氫率低的技術(shù)難題。現(xiàn)有的萊茵衣藻產(chǎn)氫率低，限制了生物光合制氫技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。為了減輕環(huán)境污染、促進(jìn)人類社會(huì)長(zhǎng)久持續(xù)發(fā)展、開(kāi)發(fā)新的清潔能源，發(fā)明一種生 物制氫產(chǎn)量高的萊茵衣藻——細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法是十分 重要的。為了獲得具有應(yīng)用價(jià)值的高產(chǎn)氫萊茵衣藻工程藻種，本發(fā)明利用線性化的 PSP124S質(zhì)粒DNA對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行隨機(jī)插入誘變，在世界上首次獲得了一個(gè)產(chǎn)氫量 提高約7倍的高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株，而且該高產(chǎn)氫萊茵衣藻生長(zhǎng)未受到抑制。本發(fā)明方 法得到的高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株是世界生物制氫領(lǐng)域長(zhǎng)期尋求的目標(biāo)，同時(shí)該萊茵衣藻突 變株為利用其深入研究萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理和進(jìn)一步利用基因工程手段提高萊茵衣藻 產(chǎn)氫效率提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻培養(yǎng)A、選取細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849 ；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)萊茵衣藻培養(yǎng)條件溫度25 士 1°C ；日光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光量子 /平方米 秒；50 100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始 PH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天接種繼代培養(yǎng)；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5% ；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件使用氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅制備缺硫TAP培 養(yǎng)基；將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng) 基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶上方留100ml的空間，用翻口橡皮 塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)；然后放在光照強(qiáng)度50 100微摩爾光量子/平方米 秒 連續(xù)光照件下培養(yǎng)，溫度25士 1°C ；每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩型號(hào)5X1/8，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo) 檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度200°C，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C;測(cè)氣體的組 成和含量；(2)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體和玻璃珠的準(zhǔn)備A、取過(guò)夜培養(yǎng)的含有載體pSP124S質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，4°C下12000rpm離心 lmin收集菌細(xì)胞；進(jìn)行載體pSP124S DNA的提取和純化，_20°C冰箱保存?zhèn)溆?；B、質(zhì)粒pSP124S的線性化用限制性內(nèi)切酶Kpnl酶切上述提取純化的質(zhì)粒 PSP124S DNA,使pSP124S質(zhì)粒DNA線性化，酶切后的質(zhì)粒DNA用DNA凝膠回收試劑盒回收 純化；分光光度計(jì)法測(cè)量濃度和純度；C、玻璃珠的準(zhǔn)備取直徑0.45 0.52 iim玻璃珠，超凈臺(tái)中用無(wú)菌去離子水沖洗 三次，250°C烘干2h;分裝于1.5毫升離心管中，121°C高溫滅菌20min，密封備用；(3)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選A、萊茵衣藻細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期的萊茵衣藻，25°C下4000rpm離 心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP洗三次；再用新鮮TAP 重懸藻細(xì)胞使細(xì)胞濃度為2X108個(gè)細(xì)胞/ml ；吸取衣藻懸浮液到內(nèi)裝已滅菌玻璃珠的試管 里，取5 y g純化好的線性化質(zhì)粒PSP124S的DNA加入試管內(nèi)混合，振蕩器強(qiáng)烈震蕩、45度斜 角旋渦振蕩15 30秒；取混合藻液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)管中，加入無(wú)菌新鮮TAP培養(yǎng)液，25°C下水 平搖床lOOrpm震蕩、過(guò)夜黑暗培養(yǎng)；B、萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的篩選取上述過(guò)夜培養(yǎng)的萊茵衣藻細(xì)胞在室溫下4000rpm離 心5min收集藻細(xì)胞，用0. 5ml新鮮TAP液體培養(yǎng)基重懸，涂在含腐草霉素和瓊脂的TAP培 養(yǎng)基固體平板上，25 °C、100 200iimolphotons m^s"1光照、培養(yǎng)3 4周，平板上長(zhǎng)出綠 色的單克隆藻落；挑取有抗性的單藻落在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)；分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng) 并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量，使用氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品定義所測(cè)氣體的組成和含量；對(duì)產(chǎn)氫量變 化大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子鑒定；(4)分析萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子產(chǎn)氫培養(yǎng)的產(chǎn)氫量和耗氧量在缺硫培養(yǎng)基中分別對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)密封瓶子上方封存的 空氣中的氫氣和氧氣含量；與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849相比較，得產(chǎn)氫量明顯增加的萊茵 衣藻突變株最高產(chǎn)氫量為3386.4iU mg_1Chl，是未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最高產(chǎn)氫量 433. 6 u 1 mg_1Chl的7. 8倍；產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量為0. 2%，未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的 最低氧氣含量1.4% ；(5)分析萊茵衣藻突變株中ble基因的整合及其表達(dá)A、萊茵衣藻總DNA的提取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的衣藻培養(yǎng)液，4°C低速離心收集，加 入由 O.lmol/L NaCl,50mmol/L EDTA, 20mmol/LTris-HCl, pH 8. 0 組成的 NET 蛋白提取液重懸沉淀，加入25 ill 10mg/ml的蛋白酶K及25yl 20% SDS，混勻、37°C水浴過(guò)夜，冰上冷 卻；加入200 yl 5mol/L KAc，冰上靜置后高速離心，上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊 醇體積比為25 24 1的溶液抽提2次；再用等體積的氯仿抽提，總DNA用無(wú)水乙醇沉淀 和70%乙醇洗滌，干燥后溶于30 yl TE緩沖液，用于下述PCR檢測(cè)備用；B、ble基因整合到萊茵衣藻突變株Ml細(xì)胞核DNA上的檢測(cè)以具有腐草霉素抗 性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的總DNA為模板；用于擴(kuò)增ble基因的特異性引物是ble-F :5’ -CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’ ；ble-B :5’ -CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3’ ；PCR 反應(yīng)條件 為94°C預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延伸lmin ；共30個(gè)循 環(huán)；72°C延伸lOmin ；PCR產(chǎn)物分別用QIAGEN試劑盒純化回收，并測(cè)序鑒定正確性；C、萊茵衣藻突變株Ml中ble基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的萊茵衣藻 lml，室溫4000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞；提取萊茵衣藻的總RNA和合成cDNA，利用上述 ble基因的特異性引物和ble基因PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，ble基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，轉(zhuǎn)錄的ble 基因RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶約為400bp ；(6)分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長(zhǎng)的影響A、用雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度； B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95 %乙醇溶液，混合均勻， 室溫避光放置20min，4°C下12000rpm離心lOmin ；取上清，測(cè)定0D665及0D649的吸光值；C、計(jì)算總?cè)~綠素的含量，單位mg/L 葉綠素ChL = 20. 04X0D649+6. 10X0D665。本發(fā)明方法的要點(diǎn)是選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849 ；萊茵衣藻藻種培養(yǎng)條件溫度25士 1°C 日 光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光量子/平方米 秒(i! molphotonsnT2 s—1) ；50 100ml 三羥甲基氨基甲烷_(kāi)乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡(jiǎn)稱TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)， 初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天1 %接種繼代培養(yǎng)；固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5%;挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法 接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫 酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù) 期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫 培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下 培養(yǎng)24小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 100微摩爾光量子/平方米 秒 (umol photons mH，溫度25士 1°C ；每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩型號(hào)5X1/8，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo) 檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度200°C，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C;使用上?；?量標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品定義所測(cè)氣體的組成和含量。萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體的準(zhǔn)備和玻璃珠的準(zhǔn)備質(zhì)粒pSP124S的提取純化通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方 法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York :Cold Spring HarborLaboratory Press. 1998)和Lumbreras等對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化及其載體pSP124S描述的方法(The Plant Journal, 1998,14 441-448)以及 TIANGEN 質(zhì)粒提取試劑盒(TIANpr印 Mini kit)操作說(shuō)明書進(jìn)行載體PSP124S DNA的提取和純化。具體地，取1 5mL過(guò)夜培養(yǎng)的含有 PSP124S質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，4°C下12000rpm離心lmin收集菌細(xì)胞，然后按照TIANGEN 質(zhì)粒提取試劑盒(TIANpr印Mini kit)操作說(shuō)明書進(jìn)行載體pSP124S DNA的提取和純化， 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?質(zhì)粒pSP124S的線性化按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring HarborLaboratory Press. 1998)用限制 性內(nèi)切酶Kpnl酶切上述提取純化的質(zhì)粒pSP124S DNA,使pSP124S質(zhì)粒DNA線性化，酶切 后的質(zhì)粒DNA用TIANGEN公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的 分光光度計(jì)法測(cè)量濃度和純度，用于萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化。玻璃珠的準(zhǔn)備玻璃珠直徑為
0.45 0. 52 ii m,在超凈臺(tái)中用5ml無(wú)菌去離子水沖洗三次，250°C烘干2h，按0. 3g分裝于
1.5ml的印pendorf管中，121 °C高溫滅菌20min，密封備用。
萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選萊茵衣藻細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化通過(guò)Kindle (Proc. Natl Acad. Sci. U SA. 1990，87 :1228 1232)的玻璃珠轉(zhuǎn)化法對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體地，取100ml生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中后期 (約4 5X 106)、細(xì)胞健康有活力的萊茵衣藻，25°C下4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用 新鮮TAP洗三次，再用新鮮TAP重懸藻細(xì)胞使細(xì)胞濃度為2X 108個(gè)細(xì)胞/ml。吸取300 u 1 衣藻懸浮液到15ml的試管里，內(nèi)裝已滅菌的0. 3g玻璃珠，取5 y g純化好的線性化質(zhì)粒 PSP124S的DNA加入試管內(nèi)，混合物在振蕩器上以最大震蕩強(qiáng)度、45度斜角旋渦振蕩15 30秒。取混合藻液，轉(zhuǎn)移到新的15ml的培養(yǎng)管中，加入10ml無(wú)菌的新鮮TAP培養(yǎng)液，25°C 下水平搖床lOOrpm震蕩、過(guò)夜黑暗培養(yǎng)。萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的篩選上述過(guò)夜培養(yǎng)的萊茵衣藻細(xì)胞在室溫下4000rpm離 心5min收集藻細(xì)胞，用0. 5ml新鮮TAP液體培養(yǎng)基重懸，涂在含10mg L—1的腐草霉素 (Zeocin)和1. 5%瓊脂的TAP (即選擇培養(yǎng)基)固體平板上，25°C、100 200 y mol photons m^s-1光照、培養(yǎng)3 4周，平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落，挑取有抗性的單藻落分別在選擇 培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)，然后分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量，使用上?；繕?biāo) 準(zhǔn)氣體有限公司氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品定義所測(cè)氣體的組成和含量，對(duì)產(chǎn)氫量變化大的轉(zhuǎn)化子 進(jìn)行分子鑒定。分析萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子產(chǎn)氫培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)氫量和耗氧量。在缺硫培養(yǎng)基中分別對(duì)本發(fā)明得到的105個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)密封 瓶子上方封存的空氣中的氫氣和氧氣含量。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849相比， 有一個(gè)本發(fā)明命名為Ml突變株，其產(chǎn)氫量明顯增加，本發(fā)明條件下的最高產(chǎn)氫量約為 3386. 4 ill mg_1Chl，是未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最高產(chǎn)氫量433. 6 yl mg_1Chl的7. 8倍， 見(jiàn)圖3。突變株Ml的產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中的氧氣含量也最低，約為0.2%，而未轉(zhuǎn)基因的衣藻 cc849的最低氧氣含量為1.4%，見(jiàn)圖4。分析萊茵衣藻突變株Ml中ble基因的整合及其表達(dá)萊茵衣藻總DNA的提取取10ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的衣藻培養(yǎng)液，4°C低速離心收 集，加 350 ill NET(0. lmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)重懸沉 淀，加入 25 ii 1 lOmg/ml 的蛋白酶{((Proteinase K)及 25 ii 1 20% SDS，混勻并于 37°C水 浴過(guò)夜，冰上冷卻，加入200 ill 5mol/L KAc，冰上靜置后高速離心，上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無(wú)水乙醇 沉淀和70%乙醇洗滌，干燥后溶于30 ill TE緩沖液，用于下述PCR檢測(cè)。ble基因整合到萊茵衣藻突變株Ml細(xì)胞核DNA上的檢測(cè)因?yàn)檗D(zhuǎn)化之前pSP124S 質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Kpnl酶切成線性，它只有整合到萊茵藻細(xì)胞核DNA上才能正確表 達(dá)ble基因，才能在含腐草霉素的TAP平板上篩選到具有抗性的轉(zhuǎn)化子。所以，測(cè)定ble基 因存在于萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子中的合適方法是實(shí)施下文所述的PCR法以具有腐草霉素抗性的 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的總DNA為模板、以ble基因的特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物應(yīng)該有一條約 500bp的電泳條帶，而未轉(zhuǎn)基因的萊茵衣藻總DNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果則無(wú)條帶。其中用于 擴(kuò)增 ble 基因的特異性引物是 ble-F:5’-CAA GCT GAC CAGCGC CGT TC-3’ ;ble_B :5，-CAC GAA GTG CAC GCA GTT G_3，。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性 lmin， 62°C退火30s，72°C延伸lmin ；共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物分別用QIAGEN試劑 盒純化回收，并測(cè)序鑒定正確性。萊茵衣藻突變株Ml中ble基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的反轉(zhuǎn) 錄 PCR 的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的萊茵衣藻1ml左右，室溫4000rpm離心5分 鐘收集藻細(xì)胞。按照試劑盒制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書提取萊茵衣藻的總RNA(QIAGEN)和按照 Promega AMV RTProtocol說(shuō)明書合成cDNA(Promega)，利用上述ble基因的特異性引物和 上述ble基因PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行ble基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，正確轉(zhuǎn)錄的ble基因的 RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶約為400bp。分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長(zhǎng)的影響用TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度；取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95 %乙醇溶液，混合均勻，室 溫避光放置20min，4°C下12000rpm離心lOmin ；取上清，測(cè)定0D665及0D649的吸光值；計(jì)算總?cè)~綠素的含量，單位mg/L 葉綠素 Chi (mg/1) = 20. 04X0D649+6. 10X 0D665 ；本發(fā)明的要點(diǎn)是利用線性化的pSP124S質(zhì)粒DNA對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行隨機(jī)插入 誘變而獲得一個(gè)高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株的方法。本發(fā)明提供了一個(gè)利用線性化的PSP124S質(zhì)粒DNA對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行隨機(jī)插 入誘變而獲得高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株Ml。本發(fā)明高產(chǎn)氫突變株Ml的產(chǎn)氫量提高了 7倍以上，其產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量也 明顯降低，生長(zhǎng)卻未受到抑制。這種結(jié)果是世界生物制氫領(lǐng)域長(zhǎng)期努力尋求而未能得到的 結(jié)果。本發(fā)明中pSP124S 質(zhì)粒由 Saul Purton 教授(s. purtoniucl. ac. uk)提供，其序列 結(jié)構(gòu)特征是按照Lumbreras等(Plant Journal. 1998，14 441-448)所描述的內(nèi)容pSP124S 質(zhì)粒具有pBluescript SK-基本骨架、RBCS2啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記ble基因的編碼區(qū)(編碼腐 草霉素抗性蛋白)、3’ -RBCS2未翻譯區(qū)。本發(fā)明提供的RBCS2啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記b 1 e基因的編碼區(qū)、3，-RBCS2未翻譯區(qū)的基 因表達(dá)調(diào)控元件可以使ble基因穩(wěn)定且高效的在萊茵衣藻細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，使篩選轉(zhuǎn)化子的 準(zhǔn)確率和效率更高。所以優(yōu)選是本發(fā)明所用的PSP124S質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的基因表達(dá)調(diào)控元件。本發(fā)明中PSP124S質(zhì)粒DNA是按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的方法從大腸桿菌中提取、純化和進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切為線性DNA。本發(fā)明中用于酶切pSP124S質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶為Kpnl，但不限制于Kpnl， 只要它能夠?qū)SP124S質(zhì)粒DNA酶切開(kāi)并且使RBCS2啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記ble基因的編碼區(qū) 和3’ -RBCS2未翻譯區(qū)的連續(xù)結(jié)構(gòu)未被酶切斷開(kāi)就可以。本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)化包括玻璃珠振蕩轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法，更優(yōu)選 的是玻璃珠振蕩轉(zhuǎn)化法。在利于表達(dá)載體導(dǎo)入的條件下，將直徑0. 4-0. 5mm的玻璃珠和線 性pSP124S質(zhì)粒DNA與健康的、生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中期的萊茵衣藻細(xì)胞混勻，用漩渦振蕩器最大速 度振蕩15-30s，將含有包括RBCS2啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記ble基因的編碼區(qū)、3，-RBCS2未翻譯區(qū) 連續(xù)結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體導(dǎo)入萊茵衣藻細(xì)胞核中。本發(fā)明中通過(guò)抗生素的選擇性篩選出表達(dá)ble基因的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步在 抗生素平板上多次繼代培養(yǎng)，增加目的基因在萊茵衣藻細(xì)胞核DNA中的整合率，并進(jìn)一步 篩選出產(chǎn)氫量高的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻單克隆。本發(fā)明表達(dá)理解為將起始DNA或RNA的遺傳信息轉(zhuǎn)移至基因產(chǎn)物(多肽或蛋白 質(zhì)，在本文中是ble基因編碼的蛋白)。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因是將遺傳信息轉(zhuǎn)移至生物體，特別是萊茵衣藻。這意味著包括 引入所有對(duì)本領(lǐng)域熟練工作人員所公知信息的方法，例如粒子轟擊、電穿孔、化學(xué)介導(dǎo)、玻 璃珠振蕩或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的攝入、顯微注射等。遺傳信息可引入細(xì)胞，例如以DNA、RNA、質(zhì)粒 或以任何其它方式，并且通過(guò)重組摻入宿主基因組的方式。為了本發(fā)明目的實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因萊 茵衣藻是經(jīng)過(guò)遺傳修飾的萊茵衣藻。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明方法適用于所有產(chǎn)氫萊茵衣藻。2、本發(fā)明方法獲得的高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株M1，生物制氫產(chǎn)量高。3、本發(fā)明方法獲得的高產(chǎn)氫萊茵衣藻突變株Ml為深入研究萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī) 理提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。4、本發(fā)明方法為進(jìn)一步利用基因工程手段提高萊茵衣藻產(chǎn)氫效率提供了良好的 基礎(chǔ)和條件。經(jīng)廣泛查閱國(guó)內(nèi)外公開(kāi)出版物，檢索專利文獻(xiàn)，未見(jiàn)有使用與本發(fā)明方法完全相 同的技術(shù)選育出與本發(fā)明Ml高產(chǎn)氫萊茵衣藻完全相同的產(chǎn)氫效果的發(fā)明；未見(jiàn)有與本發(fā) 明方法完全相同的報(bào)道。因此本發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性；由于當(dāng)代社會(huì)發(fā)展對(duì)清潔能源 的迫切需求，本發(fā)明在生物制氫技術(shù)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)和研究中，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體PSP124S主要基因元件結(jié)構(gòu)圖。圖2為對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化PSP124S線性DNA后在含10mg. L—1腐草霉素的TAP 平板上篩選萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子。其中A、B為具有腐草霉素抗性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子；C為繼續(xù) 在含10mg. L—1腐草霉素的TAP平板上繼代培養(yǎng)的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子。圖3為部分具有腐草霉素抗性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下產(chǎn)氫量比較 圖，其中突變株Ml的產(chǎn)氫量最高。圖4為部分具有腐草霉素抗性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下耗氧量比較圖，產(chǎn)氫體系中突變株Ml的氧氣含量最低。圖5為萊茵衣藻突變株Ml細(xì)胞核中整合ble基因的PCR電泳圖(以總DNA為 模版)。圖中1 分子標(biāo)記DL2000 ；2 未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849 ；3 突變株Ml ；4 質(zhì)粒 PSP124S ；5 不含模版的陰性對(duì)照組。圖6為萊茵衣藻突變株Ml細(xì)胞核中整合ble基因并轉(zhuǎn)錄的PCR電泳圖(以cDNA 為模版)。圖中1 分子標(biāo)記DL2000 ；2 未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849 ；3 突變株Ml ；4 質(zhì)粒 PSP124S ；5 不含模版的陰性對(duì)照組。圖7為萊茵衣藻突變株Ml與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度比 較圖。圖8為萊茵衣藻突變株Ml與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849不同培養(yǎng)時(shí)間的葉綠素含 量比較圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 萊茵衣藻的培養(yǎng) 萊茵衣藻生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低、氫化酶活性高，所以是微藻光合制氫的代表物 種。為了使轉(zhuǎn)基因容易操作，本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞壁缺欠型的萊茵衣藻藻種cc849。①萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件按照Harris主編的《TheChlamydomonas Sourcebook a comprehensive guide to biology andlaboratory use.New York :Academic Press. 1989》，優(yōu)選是在25 士 1°C，日光燈光照強(qiáng)度(100 200umol photons mY1)，液體 培養(yǎng)是在50 100ml Tris-Acetate-Phosphate (TAP)培養(yǎng)基，初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速 100 130rpm，每5 6天1 %接種繼代培養(yǎng)；固體TAP平板培養(yǎng)基含1. 5%的瓊脂粉，藻種 的保存和純化是挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上，每3周繼代一 次。②萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件按照Melis等(Plant Physiology. 2000122 127-136) 的方法，萊茵衣藻的產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)基(TAP-S)中進(jìn)行。缺硫培養(yǎng)基(TAP-S)是把 正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、 氯化銅和氯化鋅。本實(shí)施例為了本發(fā)明在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，有目的的簡(jiǎn)化了其產(chǎn)氫培養(yǎng) 的操作步驟即將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用 TAP-S培養(yǎng)基洗3次，然后懸浮在TAP-S培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在600ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方 留100ml的空間，立刻用翻口橡皮塞塞緊培養(yǎng)瓶密閉培養(yǎng)，先放在黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)， 然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 100 iimol photons nrY1，溫度25 士 1°C。每24 小時(shí)用微量氣密進(jìn)樣器抽取瓶中氣體，進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)。③按照冉春秋等(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2006，27:62-66.)的方法用GC測(cè)定氫氣 和氧氣含量。氣相色譜儀為Agilent Technologies GC7890A, USA，分子篩型號(hào)5 X 1/8，柱 長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣。進(jìn)樣體積0. 5ml，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度 200°C，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C。用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的外標(biāo)法計(jì)算氫氣和氧氣體積。 氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品為上?；繕?biāo)準(zhǔn)氣體有限公司。實(shí)施例2
萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體的準(zhǔn)備和玻璃珠的準(zhǔn)備①質(zhì)粒pSP124S的提取純化通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方 法(Sambrook 等，Molecular Cloning.New York CoId Spring HarborLaboratory Press. 1998)和Lumbreras等對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化及其載體pSP124S描述的方法(The Plant Journal, 1998,14 441-448)以及 TIANGEN 質(zhì)粒提取試劑盒(TIANpr印 Mini kit) 進(jìn)行載體PSP124S提取和純化。具體地，取1 5mL過(guò)夜培養(yǎng)的含有pSP124S質(zhì)粒的大腸 桿菌菌液，4°C下12000rpm離心lmin收集菌細(xì)胞，分別加入250 yl的PI (事先加入RNase A)和250 ill的P2，溫和上下翻轉(zhuǎn)6 8使菌體充分裂解；再加入350 ill的P3，立即溫和 上下翻轉(zhuǎn)6 8使菌體充分混勻，4°C下12000rpm離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱CB3 中，12000rpm離心lmin，用500 u 1去蛋白液PD清洗一次，再分別加入700 yl和500 yl漂 洗液PW清洗吸附柱CB3兩次，12000rpm離心2min去除殘留的漂洗液后，用50-100 u 1的洗 脫液EB洗脫吸附在吸附柱CB3上的質(zhì)粒DNA，放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。②質(zhì)粒pSP124S的線性化用限制性內(nèi)切酶Kpnl酶切上述提取純化的質(zhì)粒pSP124S DNA，使質(zhì)粒pSP124S DNA線性化(圖1)，酶切后的質(zhì)粒DNA用DNA凝膠回收試劑盒(TIANGEN公司)回收純化，用 本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的分光光度計(jì)法測(cè)量濃度和純度，用于萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化 DNA在紫外光區(qū)260nm處有最大吸收峰值(即0D260)，0D260值為1相當(dāng)于40 y g mL-1單鏈 DNA。OD260/OD280 值大于 1. 8 為純凈 DNA。③玻璃珠的準(zhǔn)備玻璃珠直徑為0. 45 0. 52 um (Sigma)，在超凈臺(tái)中用5ml無(wú)菌去離子水沖洗三 次，250°C烘干2h，按0. 3g分裝于1. 5ml的印pendorf管中，121 °C高溫滅菌20min，密封備用。實(shí)施例3 萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選①萊茵衣藻細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化通過(guò)Kindle (Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 1990，87 :1228 1232)的玻璃珠轉(zhuǎn)化法 對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取100ml生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中后期(約4 5X 106)、細(xì)胞健康有 活力的萊茵衣藻，25°C下4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮TAP洗三次，再用新鮮TAP 重懸藻細(xì)胞使細(xì)胞濃度為2X 108個(gè)細(xì)胞/ml。吸取300 u 1衣藻懸浮液到15ml的試管里， 內(nèi)裝已滅菌的0. 3g玻璃珠，取5 u g純化好的線性化質(zhì)粒pSP124S的DNA加入試管內(nèi)，混合 物在WH-816 vortex shaker振蕩器上以最大震蕩強(qiáng)度、45度斜角旋渦振蕩15 30秒。取 混合藻液，轉(zhuǎn)移到新的15ml的培養(yǎng)管中，加入10ml無(wú)菌的新鮮TAP培養(yǎng)液，25°C下水平搖 床lOOrprn震蕩、過(guò)夜黑暗培養(yǎng)。②萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的篩選上述過(guò)夜培養(yǎng)的萊茵衣藻細(xì)胞在室溫下4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用0. 5ml 新鮮TAP液體培養(yǎng)基重懸，涂在含10mg L-1的腐草霉素(Zeocin)和1. 5%瓊脂的TAP(即 選擇培養(yǎng)基)固體平板上，25°C、100 200iimol photons m_2s_2光照、培養(yǎng)3 4周，平板 上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落(圖2，A、B)。挑取有抗性的單藻落分別在選擇培養(yǎng)基上多次繼 代培養(yǎng)(圖2，C)，然后分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量，使用氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品(上?；繕?biāo)準(zhǔn)氣體有限公司)定義所測(cè)氣體的組成和含量。對(duì)產(chǎn)氫量變化大的轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行分子鑒定。實(shí)施例4 分析萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子產(chǎn)氫培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)氫量和耗氧量因?yàn)樵谌绷蚺囵B(yǎng)基中，萊茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影響， 在密封條件下萊茵衣藻液體培養(yǎng)基中的氧氣含量因?yàn)楹粑亩焖傧陆?，致使液體培養(yǎng) 基中出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，誘導(dǎo)萊茵衣藻氫酶表達(dá)而開(kāi)始產(chǎn)生氫氣，通過(guò)檢測(cè)密封瓶子上方封存 的空氣中的氧氣和氫氣含量變化情況就能反映出萊茵衣藻的耗氧和產(chǎn)氫情況。結(jié)果表明， 與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849相比，本發(fā)明方法中所獲得的105個(gè)萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)氫培 養(yǎng)條件下，有的產(chǎn)氫量增加，有的產(chǎn)氫量下降，有的產(chǎn)氫量無(wú)顯著變化。本發(fā)明突變株Ml產(chǎn) 氫量明顯增加，最高產(chǎn)氫量為3386. 4 ill mg_1Chl，未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最高產(chǎn)氫量為 433.6iU mg_1Chl。相比突變株Ml產(chǎn)氫量為衣藻cc849的7. 8倍，見(jiàn)圖3。突變株Ml的產(chǎn) 氫培養(yǎng)體系中的氧氣含量最低，為0. 2 %，未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最低氧氣含量為1.4%， 見(jiàn)圖4。實(shí)施例5:分析萊茵衣藻突變株Ml中ble基因的整合及其表達(dá)①萊茵衣藻總DNA的提取通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)禾口 Rochaix 禾口 Erickson 的方法 (Trends in Biochemistry Science，1988，13 :56_59)，提取衣藻總 DNA。取 10ml 處于對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)后期的衣藻培養(yǎng)液，4°C低速離心收集，加350 ill NET (0. lmol/L NaCl, 50mmol/LEDTA, 20mmol/L Tris_HCl，pH 8. 0)重懸沉淀，加入 25 yl lOmg/ml 的蛋白酶 K (Proteinase K)及 25 u 1 20% SDS，混勻并于37°C水浴過(guò)夜，冰上冷卻，加入200 yl 5mol/L KAc，冰上靜置后 高速離心，上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提2次，再用等體積的 氯仿抽提1次，總DNA用無(wú)水乙醇沉淀和70%乙醇洗滌，干燥后溶于30iU TE緩沖液，用于 下述PCR檢測(cè)。②ble基因整合到萊茵衣藻突變株Ml細(xì)胞核DNA上的檢測(cè)測(cè)定ble基因存在于萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子中的方法是PCR法。質(zhì)粒PSP124SDNA用限制 性內(nèi)切酶Kpnl酶切成線性，其轉(zhuǎn)入衣藻細(xì)胞內(nèi)后如果不整合到核DNA上則不能表達(dá)ble基 因的活性，則篩選不到據(jù)有腐草霉素抗性的轉(zhuǎn)化子；如果ble基因通過(guò)隨機(jī)插入的方式整 合到萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞核DNA上，則以具有腐草霉素抗性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的總DNA 為模板、以ble基因的特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物應(yīng)該有一條500bp的電泳條帶，而未轉(zhuǎn)基 因的萊茵衣藻總DNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果則無(wú)條帶，見(jiàn)圖5。用于擴(kuò)增ble基因的特異性引 物是 ble-F :5’ -CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’ ；ble-B :5’ -CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3，。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延 伸lmin ；共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物分別用QIAGEN試劑盒純化回收，并測(cè)序 鑒定正確性。③萊茵衣藻突變株Ml中ble基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)檢測(cè)ble基因在萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子中是否轉(zhuǎn)錄的合適方法是按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的反轉(zhuǎn)錄PCR的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)實(shí)施部分。萊茵衣藻的取樣是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期 的萊茵衣藻1ml左右，室溫4000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞。按照試劑盒制造商的產(chǎn)品說(shuō) 明書(QIAGEN，Promega)提取萊茵衣藻的總RNA和按照Promega AMV RTProtocol說(shuō)明書合 成cDNA，利用上述ble基因的特異性引物和上述ble基因PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行ble基因 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，正確轉(zhuǎn)錄的ble基因的RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶約為400bp，見(jiàn)圖6。實(shí)施例6:分析萊茵衣藻突變株Ml的生長(zhǎng)情況本發(fā)明是通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)基因藻前后萊茵衣藻的細(xì)胞數(shù)和葉綠素含量的變化來(lái)比 較ble基因隨機(jī)插入到萊茵衣藻細(xì)胞核DNA中后對(duì)萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況的影響。藻 細(xì)胞數(shù)和葉綠素含量的測(cè)定是參照Harris主編的《The Chlamydomonas Sourcebook :a comprehensive guide to biologyand laboratory use. New York :Academic Press. 1989》 方法，因?yàn)槿R茵衣藻在750nm處的吸光度(0D75CI)與萊茵衣藻的細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，所以用 TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì)直接檢測(cè)培養(yǎng)的萊茵衣藻在750nm處的吸光度作為萊茵 衣藻細(xì)胞數(shù)的生長(zhǎng)指標(biāo)。葉綠素含量的測(cè)定是取1ml藻液，4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞， 加入同體積的95%乙醇溶液，混勻，室溫避光放置20min后，4°C下12000rpm離心lOmin，取 上清，按比例稀釋后，測(cè)定0D665及0D649的吸光值，根據(jù)下列公式計(jì)算出葉綠素a，葉綠素b 及總?cè)~綠素的含量，單位是mg/L。葉綠素Chi (mg/1) = 20. 04X (0D649)+6. 10X (0D665)。圖 7為萊茵衣藻突變株Ml與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度比較圖。圖8為 萊茵衣藻突變株Ml與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849不同培養(yǎng)時(shí)間的葉綠素含量比較圖。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Ml的生長(zhǎng)未受到抑制。本發(fā)明的結(jié)果顯示，利用線性化的pSP124S質(zhì)粒DNA對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行隨機(jī) 插入誘變，由于腐草霉素對(duì)衣藻具有很強(qiáng)的毒性，且PSP124S質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切以 后為線性DNA，其轉(zhuǎn)入到萊茵衣藻細(xì)胞核中以后，在毒性較強(qiáng)的腐草霉素選擇壓力下，只有 ble基因整合到萊茵衣藻細(xì)胞核DNA上才能有效復(fù)制和正確表達(dá)蛋白產(chǎn)物，才能在含有腐 草霉素的TAP平板上篩選到有抗性的萊茵衣藻突變株，利用此方法獲得突變株的準(zhǔn)確率很 高。通過(guò)對(duì)本發(fā)明獲得的突變株進(jìn)行產(chǎn)氫含量測(cè)定，得到一個(gè)產(chǎn)氫量提高7. 8倍的萊茵衣 藻突變株，且其產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中的氧氣含量也最低。該突變株為進(jìn)一步利用其研究萊茵衣 藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理提供了良好材料，并為進(jìn)一步利用基因工程手段改造衣藻產(chǎn)氫能力提供良 好材料，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。以上所述本發(fā)明的實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本 發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
1權(quán)利要求
一種細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻培養(yǎng)A、選取細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)萊茵衣藻培養(yǎng)條件溫度25±1℃；日光燈光照強(qiáng)度100～200微摩爾光量子/平方米·秒；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7.2，水平搖床轉(zhuǎn)速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養(yǎng)；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件使用氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅制備缺硫三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP培養(yǎng)基；將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶上方留100ml的空間；用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)；然后放在光照強(qiáng)度50～100微摩爾光量子/平方米·秒連續(xù)光照件下培養(yǎng)，溫度25±1℃；每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；D、用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩型號(hào)5×1/8，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50℃，進(jìn)樣溫度200℃，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300℃；測(cè)氣體的組成和含量；(2)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體和玻璃珠的準(zhǔn)備A、取過(guò)夜培養(yǎng)的含有載體pSP124S質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，4℃下12000rpm離心1min收集菌細(xì)胞；進(jìn)行載體pSP124S DNA的提取和純化，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；B、質(zhì)粒pSP124S的線性化用限制性內(nèi)切酶KpnI酶切上述提取純化的質(zhì)粒pSP124S DNA，使pSP124S質(zhì)粒DNA線性化，酶切后的質(zhì)粒DNA用DNA凝膠回收試劑盒回收純化；分光光度計(jì)法測(cè)量濃度和純度；C、玻璃珠的準(zhǔn)備取直徑0.45～0.52μm玻璃珠，超凈臺(tái)中用無(wú)菌去離子水沖洗三次，250℃烘干2h；分裝于1.5毫升離心管中，121℃高溫滅菌20min，密封備用；(3)萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選A、萊茵衣藻細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期的萊茵衣藻，25℃下4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽TAP培養(yǎng)液洗三次；再用新鮮TAP重懸藻細(xì)胞使細(xì)胞濃度為2×108個(gè)細(xì)胞/ml；吸取衣藻懸浮液到內(nèi)裝已滅菌玻璃珠的試管里，取5μg純化好的線性化質(zhì)粒pSP124S的DNA加入試管內(nèi)混合，振蕩器強(qiáng)烈震蕩、45度斜角旋渦振蕩15～30秒；取混合藻液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)管中，加入無(wú)菌新鮮TAP培養(yǎng)液，25℃下水平搖床100rpm震蕩、過(guò)夜黑暗培養(yǎng)；B、萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的篩選取上述過(guò)夜培養(yǎng)的萊茵衣藻細(xì)胞在室溫下4000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用0.5ml新鮮TAP液體培養(yǎng)基重懸，涂在含腐草霉素和瓊脂的TAP培養(yǎng)基固體平板上，25℃、100～200μmolphotons m-2s-1光照、培養(yǎng)3～4周，平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落；挑取有抗性的單藻落在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)；分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量，使用氫氣和氧氣標(biāo)準(zhǔn)品定義所測(cè)氣體的組成和含量；對(duì)產(chǎn)氫量變化大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子鑒定；(4)分析萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子產(chǎn)氫培養(yǎng)的產(chǎn)氫量和耗氧量在缺硫培養(yǎng)基中分別對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)密封瓶子上方封存的空氣中的氫氣和氧氣含量；與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻cc849相比較，得產(chǎn)氫量明顯增加的萊茵衣藻突變株最高產(chǎn)氫量為3386.4μl·mg-1Chl，是未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最高產(chǎn)氫量433.6μl·mg-1Chl的7.8倍；產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量為0.2％，未轉(zhuǎn)基因的衣藻cc849的最低氧氣含量1.4％；(5)分析萊茵衣藻突變株中ble基因的整合及其表達(dá)A、萊茵衣藻總DNA的提取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的衣藻培養(yǎng)液，4℃低速離心收集，加入由0.1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH 8.0組成的NET蛋白提取液重懸沉淀，加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％SDS，混勻、37℃水浴過(guò)夜，冰上冷卻；加入200μl 5mol/L KAc，冰上靜置后高速離心，上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇體積比為25∶24∶1的溶液抽提2次；再用等體積的氯仿抽提，總DNA用無(wú)水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌，干燥后溶于30μl TE緩沖液，用于下述PCR檢測(cè)備用；B、ble基因整合到萊茵衣藻突變株M1細(xì)胞核DNA上的檢測(cè)以具有腐草霉素抗性的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的總DNA為模板；用于擴(kuò)增ble基因的特異性引物是ble-F5’-CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’；ble-B5’-CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3’；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物分別用QIAGEN試劑盒純化回收，并測(cè)序鑒定正確性；C、萊茵衣藻突變株M1中ble基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的萊茵衣藻1ml，室溫4000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞；提取萊茵衣藻的總RNA和合成cDNA，利用上述ble基因的特異性引物和ble基因PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，ble基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，轉(zhuǎn)錄的ble基因RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶約為400bp；(6)分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長(zhǎng)的影響A、用雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度；B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測(cè)定OD665及OD649的吸光值；C、計(jì)算總?cè)~綠素的含量，單位mg/L葉綠素ChL＝20.04×0D649+6.10×OD665。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，細(xì)胞核插入誘變選育高產(chǎn)光合制氫萊茵衣藻的方法。現(xiàn)有的萊茵衣藻產(chǎn)氫率低，限制了生物光合制氫技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。本發(fā)明對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞核進(jìn)行隨機(jī)插入誘變而獲得高產(chǎn)氫突變株方法如下萊茵衣藻培養(yǎng)；萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化載體和玻璃珠的準(zhǔn)備；萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選；分析萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子產(chǎn)氫培養(yǎng)的產(chǎn)氫量和耗氧量；分析萊茵衣藻突變株中ble基因的整合及其表達(dá)；分析重組豆血紅蛋白hemH-1ba基因?qū)θR茵衣藻生長(zhǎng)的影響。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是方法是獲得的高產(chǎn)氫萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量是原有的7倍；為深入研究萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料和良好的基礎(chǔ)條件。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101864365SQ201010183660
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者吳雙秀, 王全喜, 王榮榮, 許麗麗, 黃瑞 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)