專利名稱：以icam-1為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)妊娠期婦女胎膜早破 (PrematureRupture of Fetal Membrane，簡(jiǎn)稱PROM)的夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒及其 制備方法。
背景技術(shù)：
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane，簡(jiǎn)稱ROM)可能在孕期隨時(shí)發(fā)生，在臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂稱為胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周)PROM發(fā)生率約為10%;足月前 (37孕周前)PROM的發(fā)生率為2-3.5%。胎膜早破是引起產(chǎn)科病人產(chǎn)前、產(chǎn)后并發(fā)癥的主要 因素，是導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)和新生兒必須入住重癥監(jiān)護(hù)室的主要原因。由于醫(yī)務(wù)人員不得不在 延長(zhǎng)孕周與宮內(nèi)及孕婦感染的風(fēng)險(xiǎn)和胎兒肺發(fā)育問(wèn)題之間求平衡，因而對(duì)胎膜早破患者的 管理成本高、難度大，準(zhǔn)確及時(shí)診斷孕婦是否發(fā)生胎膜早破至關(guān)重要?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用金標(biāo)準(zhǔn)是診斷胎膜早破的一種準(zhǔn)確方法，即在孕婦羊膜腔內(nèi)注 入染料(如美藍(lán))，若陰道內(nèi)有被染料著色的液體流出即可診斷為胎膜早破，但采用金標(biāo)準(zhǔn) 檢測(cè)臨床很難操作，并且造成患者的痛苦，故臨床很少使用。臨床上通常采用詢問(wèn)病史、患 者自訴陰道有羊水流出、陰道分泌物PH值變?yōu)槠珘A性(正常陰道分泌物pH為4. 5 5. 5)、 顯微鏡下查見陰道分泌物涂片中出現(xiàn)羊水結(jié)晶等方法，這些方法雖然操作簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性、 敏感性均較低。細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1，簡(jiǎn)稱 ICAM-1，權(quán)利要 求書和說(shuō)明書中，以“ICAM-1”表示細(xì)胞間黏附分子-1)屬于黏附分子的免疫球蛋白超家 族，是分子量76kD 114kD的單鏈糖蛋白。ICAM-I廣泛表達(dá)在機(jī)體的血管內(nèi)皮細(xì)胞、胸腺 上皮細(xì)胞和其他種類的上皮細(xì)胞等非血源性細(xì)胞的表面，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突狀 細(xì)胞等血源性細(xì)胞的表面，以及成纖維細(xì)胞的表面，與淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。雖然在妊娠晚 期(孕周28-40)，受胎膜和羊水中的單核細(xì)胞上ICAM-I的表達(dá)和中性粒細(xì)胞活化的影響， 妊娠婦女的羊水中ICAM-I水平升高，但目前尚未發(fā)現(xiàn)以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢 測(cè)試劑盒及其制備方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒及其制 備方法，以提高胎膜早破檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減輕患者的痛苦。本專利申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)=ICAM-I是妊娠晚期出現(xiàn)在羊水中的主要蛋 白質(zhì)之一，含量為13. 08士6. llng/mL。胎膜早破時(shí)將有羊水從羊膜腔中滲漏至陰道，羊水中 的ICAM-I則會(huì)出現(xiàn)在陰道分泌物/宮頸粘液(Cervical-Vaginal Fluid,CVF)中。蛋白芯 片篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)確診的PROM產(chǎn)婦與確診的非PROM產(chǎn)婦相比(兩組產(chǎn)婦的年齡與妊娠周 齡匹配，無(wú)基礎(chǔ)疾病，無(wú)妊娠合并癥)，陰道分泌物/宮頸黏液樣本中ICAM-I的濃度具有明 顯差異。因此，可將ICAM-I作為胎膜早破的檢測(cè)指標(biāo)。
本發(fā)明所述以ICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，包括包被有ICAM-1單 克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)檢測(cè)液、與生物 素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)結(jié)合的親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底 物3'，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和ICAM-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)表明，上述試劑盒所含包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板，優(yōu)選每孔包被 ICAM-1單克隆抗體0. 9 ii g 1 ii g。上述試劑盒中，所述生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)檢測(cè)液 主要由生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)、牛血清白蛋白、甘油和磷酸 鹽緩沖液組成，生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)的濃度為24mg/ml，牛 血清白蛋白的濃度為1. 5g 3g/100ml，甘油的濃度為50ml/100ml。所述生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)由生物素酰-N羥基丁 二酰亞胺酯和ICAM-1單克隆抗體耦聯(lián)而成，酰-N羥基丁二酰亞胺酯與ICAM-1單克隆抗體 的質(zhì)量比為0. 5 1 7。為了方便用戶使用，本發(fā)明所述試劑盒還可配備樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是 在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的 三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋 白的濃度為lg 2g/100ml。本發(fā)明所述以ICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒的制備方法，工藝步驟 如下(1)制備包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板用pH = 8 10的碳酸鹽緩沖液將ICAM-1單克隆抗體稀釋為濃度10 u g/ml的稀 釋液，然后將所述ICAM-1單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被至少12小時(shí)； 包被時(shí)間屆滿后，將濃度為lg/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C 進(jìn)行封閉反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間至少為1小時(shí)；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用pH = 7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌 多孔板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板，其保 存溫度為4°C ；(2)制備生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)檢測(cè)液①以N，N- 二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度 為50 y g/ yl的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸鹽緩沖液為溶劑，ICAM-1 單克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為24mg/ml的ICAM-1單克隆抗體溶液，將所述酰_N羥基丁二 酰亞胺酯溶液和所述ICAM-1單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下于室溫反應(yīng)至少4小時(shí)， 即獲得生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)；反應(yīng)結(jié)束后，將含生物素標(biāo) 記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)的反應(yīng)液裝入透析袋中，用pH = 9. 2的磷酸 鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時(shí)間至少為12小時(shí)，其間更換透析液至少3次；繼后在透 析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到3g 6g/100ml 為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)和牛 血清白蛋白的透析后反應(yīng)液與甘油按體積比1 1計(jì)量，在室溫下混合均勻即形成生物素 標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-lAb)檢測(cè)液，其保存溫度為_20°C ；
(3)配備親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和 ICAM-I蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。所述親和素-辣根過(guò)氧化物酶、3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和 ICAM-I蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均為市售商品，可直接從市場(chǎng)購(gòu)買。本發(fā)明所述方法中，制備包被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板時(shí)，所述ICAM-I單克 隆抗體稀釋液的加入量?jī)?yōu)選100 μ 1/孔，所述濃度為lg/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入 量為120 μ 1/孔。本發(fā)明所述方法中，制備生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(Biotin-ICAM-IAb) 時(shí)，優(yōu)選按酰-N羥基丁二酰亞胺酯與ICAM-I單克隆抗體的質(zhì)量比=0.5 1 7量取所 述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述ICAM-I單克隆抗體溶液形成混合液。為方便用戶，本發(fā)明所述方法還配備了樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度 0. Olmol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲 基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白 的加入量以其濃度達(dá)到Ig 2g/100ml為限。本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明為胎膜早破的檢測(cè)提供了一種采用新檢測(cè)指標(biāo)的試劑盒及其制備方法。(2)使用本發(fā)明所述試劑盒，可定量檢測(cè)出妊娠婦女陰道分泌物/宮頸粘液 (Cervical-Vaginal Fluid, CVF)中 ICAM-I 的準(zhǔn)確含量。(3)使用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)確診胎膜破裂組和確診胎膜未破組妊娠婦女進(jìn)行采 樣檢測(cè)(見實(shí)施例2)，檢測(cè)結(jié)果表明該試劑盒的敏感性為100%，特異性為90%左右，因 而可提高胎膜早破檢測(cè)的準(zhǔn)確性。(4)由于檢測(cè)樣品是妊娠婦女的陰道分泌物，因而是一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。本發(fā)明所述試劑盒適用于所有妊娠期婦女，尤其是存在早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)、腹部受到損傷 的妊娠期婦女。


圖1是本發(fā)明所述以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒中多孔板的一種 形狀構(gòu)造示意圖。圖2為A450值-ICAM-1濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒及其 制備方法和使用方法作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中涉及的材料來(lái)源如下ICAM-I單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)R&D公司；I CAM-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自美國(guó)R&D公司；碳酸鹽緩沖液(CB)，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；
牛血清白蛋白，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；酰-N羥基丁二酰亞胺酯，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；甘油的規(guī)格是分析醇，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；
3'，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；多孔板為96孔的多孔板，其形狀和構(gòu)造如圖1所示。實(shí)施例1本實(shí)施例中，采用以下工藝步驟制備以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑
ιπτ.(1)制備包被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板用ρΗ = 9的碳酸鹽緩沖液將ICAM-I單克隆抗體稀釋為濃度10 μ g/ml的稀釋液， 然后將所述ICAM-I單克隆抗體稀釋液按100 μ 1/孔的量加入96孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被 12小時(shí)；包被時(shí)間屆滿后，將濃度lg/100ml的牛血清白蛋白溶液按120 μ 1/孔的量加入多 孔板上的各孔并在37°C進(jìn)行封閉反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用ρΗ = 7. 2、 濃度為0. 05mol/l的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包 被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板，然后將其置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)制備生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(Biotin-ICAM-IAb)檢測(cè)液①以N，N- 二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度 為50 μ g/ μ 1的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以PH = 9. 6、濃度為lmol/1的碳酸鹽緩沖液 為溶劑、ICAM-I單克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為24mg/ml的ICAM-I單克隆抗體溶液，按酰-N 羥基丁二酰亞胺酯與與ICAM-I單克隆抗體的質(zhì)量比=1 7量取所述酰-N羥基丁二酰亞 胺酯溶液和所述ICAM-I單克隆抗體溶液形成混合液，將所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液 和所述ICAM-I單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下(磁力攪拌器，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分)于 室溫反應(yīng)4小時(shí)，即獲得生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(Biotin-ICAM-IAb)；反應(yīng)結(jié)束 后，將含生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(Biotin-ICAM-IAb)的反應(yīng)液裝入透析袋中，用 PH = 9. 2、濃度為0. 05mol/l的磷酸鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時(shí)間為12小時(shí)，其間更 換透析液3次；繼后在透析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加 入量以其濃度達(dá)到4g/100ml為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(Biotin-ICAM-IAb)和牛 血清白蛋白的透析后反應(yīng)液與甘油按體積比1 1計(jì)量，在室溫下混合均勻即形成生物素 標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體(BiOtin-ICAM-IAb)檢測(cè)液，其保存溫度為_20°C ；(3)每個(gè)試劑盒配備親和素-辣根過(guò)氧化物酶12ml、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四 甲基聯(lián)苯胺12ml、ICAM-l蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(ICAM-1的濃度為lOng/ml) Iml和樣本稀釋液30ml， 樣本稀釋液是在濃度濃度0.02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)中加 入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到2g/100ml為限；所述 親和素-辣根過(guò)氧化物酶與生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體檢測(cè)液的體積比為1 1。實(shí)施例2本實(shí)施例以實(shí)施例1制備的胎膜早破檢測(cè)試劑盒對(duì)待側(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。
1、待測(cè)樣本(1)標(biāo)樣準(zhǔn)備 將實(shí)施例1所述試劑盒中配備的ICAM-I蛋白標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為含ICAM-I濃度最高的標(biāo) 樣，命名為標(biāo)樣1，其ICAM-I的濃度為lOng/ml，然后用實(shí)施例1所述試劑盒中配備的樣本 稀釋液將所述ICAM-I蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成ICAM-I濃度為5ng/ml、2. 5ng/ml、l. 25ng/ml、 0. 63ng/ml、0. 32ng/ml、0. 16ng/ml的標(biāo)樣，依次命名為標(biāo)樣2、標(biāo)樣3、標(biāo)樣4、標(biāo)樣5、標(biāo)樣6 和標(biāo)樣7，共計(jì)有7個(gè)標(biāo)樣。(2)試樣以四川大學(xué)華西第二醫(yī)院門診及住院的產(chǎn)婦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)現(xiàn)有檢測(cè)方法的檢 測(cè)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為破膜組和未破膜組，收集兩組產(chǎn)婦臨產(chǎn)發(fā)動(dòng)時(shí)的陰道分泌物/宮頸 粘液(Cervical-Vaginal Fluid, CVF)作為試樣，共計(jì)40個(gè)試樣，其中，試樣1_20取自于破 膜組，試樣21-40取自于未破膜組。(3)空白對(duì)照實(shí)施例1所述試劑盒中配備的樣本稀釋液——為空白對(duì)照。2、樣本檢測(cè)(1)檢測(cè)前將試劑盒的所有試劑、待測(cè)樣本緩慢均衡至室溫(18°C 25°C )；(2)將步驟1所準(zhǔn)備的標(biāo)樣、空白對(duì)照、試樣分別加入包被有ICAM-I單克隆抗體 的96孔板上的相應(yīng)加樣孔中，各標(biāo)樣、空白對(duì)照、試樣均設(shè)復(fù)孔對(duì)照；各加樣孔中的加樣量 為100 μ 1。用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上在振搖狀態(tài)下室溫孵 育2. 5小時(shí)，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分。(3)孵育時(shí)間屆滿后，吸盡各加樣孔中的液體，在自動(dòng)洗板機(jī)上設(shè)置清洗程序，以 400 μ 1/孔洗液(濃度0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度為0. 02mol/L的Tris緩沖液)將 每個(gè)加樣孔清洗兩次，每次清洗時(shí)，洗液需在孔中停留10秒 15秒；清洗完畢后，將96孔 板翻轉(zhuǎn)，使各加樣孔孔口向下，在吸水濾紙上輕拍使各加樣孔中殘留的洗液完全去除。(4)向96孔板上的各加樣孔中分別加入100 μ 1生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體 (Biotin-ICAM-IAb)檢測(cè)液，然后用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上 在振搖狀態(tài)下室溫孵育1. 5小時(shí)，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分；孵育時(shí)間屆滿后，吸盡各加樣孔 中的液體，按步驟(3)所述方法清洗所述96孔板。(5)向所述96孔板上的各加樣孔中分別加入100 μ 1親和素-辣根過(guò)氧化物酶，然 后用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上在振搖狀態(tài)下室溫孵育1. 5小 時(shí)，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分；孵育時(shí)間屆滿后，吸盡各加樣孔中的液體，按步驟(3)所述方法 清洗所述96孔板。(6)向所述96孔板上的各加樣孔中分別加入ΙΟΟμΙ 3,3,5,5'-四甲基聯(lián)苯 胺，然后在室溫避光孵育10分鐘，孵育時(shí)間屆滿后，向各加樣孔中分別加入100μ 1終止 液，所述終止液為硫酸和亞硫酸鈉配制的水溶液，硫酸的濃度為2mol/L，亞硫酸鈉的濃度為 0.lmol/L0(7)將所述96孔板放置在酶標(biāo)儀中，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的A450值(光密度值或吸光 度值)，所測(cè)結(jié)果見下表(表中的A450值為兩孔的加權(quán)平均值)。表1:標(biāo)樣的A450值
表2 試樣1 20的Α450值 表3 試樣21 40的Α450值 空白對(duì)照的Α450值為0. 11045。(8)根據(jù)各標(biāo)樣的Α450值與各標(biāo)樣中ICAM-I的濃度，制作Α450值-ICAM-I濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，并得到計(jì)算公式y(tǒng) = 0. 2863X-0. 3038，式中，y為被測(cè)樣品的A450值， X為被測(cè)樣品中ICAM-I的含量。(9)根據(jù)所測(cè)各試樣的A450值，用公式y(tǒng) = 0. 2863χ-0. 3038計(jì)算各試樣中ICAM-I 的濃度，計(jì)算結(jié)果見下表表4 試樣1 20的計(jì)算結(jié)果(ICAM-1濃度單位ng/ml) 表5 試樣21 40的計(jì)算結(jié)果(ICAM-1濃度單位ng/ml) 計(jì)算表4中試樣1 20的ICAM-I平均濃度，其計(jì)算結(jié)果為5. 06士4. 17ng/ml。計(jì) 算表5中試樣21-40的ICAM-I平均濃度，其計(jì)算結(jié)果為1. 34士0. 20ng/mL·從計(jì)算結(jié)果可 以看出，取自于破膜組的試樣1 20中的ICAM-I平均濃度與取自于未破膜組的試樣21 40中的ICAM-I平均濃度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)未破膜組的均數(shù)士2*標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算結(jié)果設(shè)為檢測(cè)限，因此，本發(fā)明所述試劑 盒設(shè)置的ICAM-I檢測(cè)限為1. 8ng/ml,即待測(cè)樣本中ICAM-I濃度高于1. 8ng/ml判定為陽(yáng)性 (即發(fā)生胎膜早破)，ICAM-I濃度低于1. 8ng/ml判定為陰性(即未發(fā)生胎膜早破)。
權(quán)利要求
一種以ICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體檢測(cè)液、與生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體結(jié)合的親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺和ICAM-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征在于所 述多孔板每孔包被ICAM-I單克隆抗體0. 9 μ g 1 μ g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征 在于所述生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體檢測(cè)液主要由生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗 體、牛血清白蛋白、甘油和磷酸鹽緩沖液組成，生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體的濃度為 24mg/ml，牛血清白蛋白的濃度為1. 5g 3g/100ml，甘油的濃度為50ml/100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征在于所 述生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體由生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯和ICAM-I單克隆抗 體耦聯(lián)而成，酰-N羥基丁二酰亞胺酯與ICAM-I單克隆抗體的質(zhì)量比為0.5 1 7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征 在于還包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖 液或濃度O.Olmol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而 成，牛血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征在于還 包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃 度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛 血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，其特征在于還 包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃 度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛 血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100ml。
8.—種以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于工藝步 驟如下(1)制備包被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板用PH = 8 10的碳酸鹽緩沖液將ICAM-I單克隆抗體稀釋為濃度10 μ g/ml的稀釋液， 然后將所述ICAM-I單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被至少12小時(shí)；包被 時(shí)間屆滿后，將濃度為lg/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C進(jìn)行 封閉反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間至少為1小時(shí)；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用pH = 7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔 板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板；(2)制備生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體檢測(cè)液①以N，N- 二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度為 50 μ g/ μ 1的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸鹽緩沖液為溶劑，ICAM-I單 克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為24mg/ml的ICAM-I單克隆抗體溶液，將所述酰-N羥基丁二酰 亞胺酯溶液和所述ICAM-I單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下于室溫反應(yīng)至少4小時(shí)，即獲 得生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體；反應(yīng)結(jié)束后，將含生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體的反應(yīng)液裝入透析袋中，用PH = 9. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時(shí)間至少為12小 時(shí)，其間更換透析液至少3次；繼后在透析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血 清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到3g 6g/100ml為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體和牛血清白蛋白的透析后反應(yīng) 液與甘油按體積比1 1計(jì)量，在室溫下混合均勻即形成生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體 檢測(cè)液；(3)配備親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和ICAM-I 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于還配備樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽 緩沖液或濃度0. Olmol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配 制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到Ig 2g/100ml為限。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的以ICAM-I為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒的制備方 法，其特征在于(1)制備包被有ICAM-I單克隆抗體的多孔板時(shí)，所述ICAM-I單克隆抗體稀釋液的加入 量為100μ 1/孔，所述濃度為lg/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入量為120μ 1/孔；(2)制備生物素標(biāo)記的ICAM-I單克隆抗體時(shí)，按酰-N羥基丁二酰亞胺酯與ICAM-I單 克隆抗體的質(zhì)量比=0.5 1 7量取所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述ICAM-I單 克隆抗體溶液形成混合液。
全文摘要
一種以ICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的胎膜早破檢測(cè)試劑盒，包括包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-1Ab)檢測(cè)液、與生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體結(jié)合的親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺和ICAM-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。上述試劑盒的制備方法有以下工藝步驟(1)制備包被有ICAM-1單克隆抗體的多孔板；(2)制備生物素標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體(Biotin-ICAM-1Ab)檢測(cè)液；(3)配備親和素-辣根過(guò)氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺和ICAM-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101871942SQ20101018966
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
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