專利名稱::人n端b型利鈉肽原免疫分析試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明提供了一種人N端B型利鈉肽原(Nt-proBNP)化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù):
:心血管疾病無(wú)論在我國(guó)或者在全球,都是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重要疾病。世界衛(wèi)生組織在2004年9月26日第5個(gè)“世界心臟日”時(shí),在日內(nèi)瓦發(fā)表的一份公報(bào)中指出,全球每年有1700萬(wàn)人死于心臟病和其他心血管疾病,約占全球死亡人數(shù)的1/3,預(yù)計(jì)到2020年這個(gè)數(shù)字將突破2000萬(wàn),心血管疾病和中風(fēng)將成為人類死亡和致殘的首要原因。其中,心力衰竭(心衰,HeartFailure,HF)是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病中的一種病理綜合征,如今已不再被簡(jiǎn)單地看作是獨(dú)立的臨床疾病,而是作為心血管疾病發(fā)展到后期的一個(gè)階段。從始發(fā)危險(xiǎn)因子(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病)到左心室肥大、心肌細(xì)胞功能紊亂、冠心病,最后發(fā)展成為心力衰竭。2003年,中國(guó)心血管健康多中心合作研究組應(yīng)用四階段整群隨機(jī)抽樣方法,在中國(guó)10省市抽樣調(diào)查,結(jié)果顯示心衰患病率為0.9%,隨著年齡增高,心衰患病率顯著上升,北方明顯高于南方(1.4%Vs0.5%),女性略高于男性(1.0%Vs.0.9%)o由于我國(guó)冠心病和高血壓發(fā)病仍呈上升趨勢(shì),人口老齡化趨勢(shì)明顯,HF正成為我國(guó)心血管領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。在發(fā)達(dá)國(guó)家,HF是一種常見(jiàn)情況,影響著2%的人口,并且有著很高的死亡率,特別是在老年患者中。有學(xué)者統(tǒng)計(jì),心力衰竭患者一旦出現(xiàn)典型癥狀,5年存活率男性為25%,女性為38%,與惡性腫瘤病人相仿。目前慢性心臟衰竭在70歲以上老年人群中的發(fā)病率約為10%以上。有資料顯示,由于飲食習(xí)慣的改變等原因,中國(guó)目前有2億人超重、7000萬(wàn)人肥胖,高血壓和高血脂的人數(shù)都超過(guò)1.6億,所有這些,導(dǎo)致了中國(guó)的冠心病、中風(fēng)等心血管疾病患者呈爆發(fā)性增長(zhǎng)。在發(fā)達(dá)國(guó)家,約有7%的人群患有此病,但只有2%的人被診斷出來(lái),還沒(méi)有特異的生化參數(shù)和治療監(jiān)測(cè)方法。HF的不良預(yù)后,使越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始考慮應(yīng)打破傳統(tǒng)的觀念,于尚未出現(xiàn)明顯“充血性”癥狀之前就著手干預(yù)治療,從根本上防治HF,延緩HF發(fā)展進(jìn)程,提高患者的遠(yuǎn)期存活率。HF盡早發(fā)現(xiàn)是非常重要的,因?yàn)?,如果被發(fā)現(xiàn)得早,通常它是能用藥物控制的。因此,對(duì)心衰的預(yù)防和及時(shí)正確的診斷和治療非常重要。傳統(tǒng)根據(jù)病史和體征對(duì)心衰患者的診治及長(zhǎng)期監(jiān)控是非常不完善的,常需住院來(lái)調(diào)節(jié)體液的潴留。如果有一個(gè)能有效監(jiān)控心衰的生化標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷,那將是非常有效的。因此,心臟生物化學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確有效的應(yīng)用,顯得更加重要。目前研究證實(shí),腦利鈉肽或B型鈉尿肽(brainnatriureticpeptide,B-typenatriureticpeptide;BNP)或非活性的腦利鈉肽肽原N末端(NT-ProBNP)是較好的心衰標(biāo)志物,能反映心室容積擴(kuò)大、心室超負(fù)荷和心臟功能有無(wú)損傷及損傷程度。早在2000年“Heart”雜志在一篇名為“BNP:很快成為治療心衰患者的常規(guī)措施”的編者評(píng)論中就明確認(rèn)為BNP有助于診斷心衰,可作為心衰患者預(yù)后標(biāo)志物,是一種較新的監(jiān)控心衰的方法。BNP是一種鈉尿肽,由心室分泌的類肽化合物,具有利鈉、利尿、舒血管、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的作用。研究表明容量負(fù)荷引起的心室壓力改變以及室壁張力的增加是刺激BNP分泌的因素。BNP是含有32個(gè)氨基酸殘基的多肽,是從氨基酸前體蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而來(lái),同時(shí)產(chǎn)生76個(gè)氨基酸非活性的N端B型利鈉肽原(NT-proBNP),在血中濃度隨BNP升高而升高。MuellerT與Hervas等研究發(fā)現(xiàn)血漿BNP、NT-proBNP濃度的升高對(duì)于心衰的診斷具有很高敏感性,可作為心力衰竭診斷的敏感指標(biāo),并能評(píng)估心功能損害嚴(yán)重程度。NT-proBNP和含有C端32個(gè)氨基酸的具有生物活性的BNP是等摩爾釋放,因此二者在心血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后方面有著相似的臨床應(yīng)用。但與BNP相比,NT-proBNP因其半衰期長(zhǎng)(半衰期為120min)、心衰時(shí)升高幅度大而更有利于臨床應(yīng)用。美國(guó)FDA在2000年11月22日首次批準(zhǔn)了BiositeDiagnostics公司用于幫助診斷充血性心力衰竭的BNP試劑盒“BiositeDiagnosticsTriageBNP”。這是一種床旁檢驗(yàn)(POCT),使用六滴全血或血漿可在15分鐘完成此項(xiàng)檢測(cè)。如以100pg/ml為診斷心衰判斷值時(shí),特異性為95.6%,靈敏度為82.4%。與紐約心臟學(xué)會(huì)(NYHA)的心衰功能分級(jí)分相比,發(fā)現(xiàn)BNP的檢驗(yàn)具有敏感、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn),能夠準(zhǔn)確地反映心衰的嚴(yán)重程度,并與心衰的功能分級(jí)有良好的相關(guān)性,而且更能診斷出早期的心臟功能紊亂。早期實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象多是急診室呼吸困難、肺病、心臟病患者,結(jié)果顯示BNP、NT-proBNP與心衰具有很好的相關(guān)性,有些心力衰竭患者BNP正常,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到90%-95%,其陰性預(yù)測(cè)能力更具有診斷價(jià)值。當(dāng)急性心力衰竭出現(xiàn)左室充盈壓增加的臨床綜合征以及如缺血、肺栓塞等任何導(dǎo)致肌細(xì)胞伸展的情形,檢驗(yàn)NT-proBNP非常有益,同時(shí)對(duì)于鑒別呼吸困難是否為心源性原因具有重要意義,優(yōu)于常規(guī)臨床判斷。另外,NT-proBNP還能輔助判斷進(jìn)展期心衰患者的預(yù)后,以及對(duì)左心室功能不全的治療進(jìn)行監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)。2000年前后,國(guó)際上已經(jīng)認(rèn)定NT-proBNP是測(cè)定心衰的一個(gè)具有劃時(shí)代意義的特異性標(biāo)志物。2002年11月19日,F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市NT-proBNP,一種用于實(shí)驗(yàn)室?guī)椭\斷充血性心力衰竭(congestiveheartfailure)的新的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。這種檢測(cè)試劑,ElecsysproBNP測(cè)定(ElecsysproBNPImmunoassay),是由印地安納州Indianapolis的羅氏診斷學(xué)公司(RocheDiagnostics,Inc)制造的。FDA批準(zhǔn)這種檢驗(yàn)試劑是基于生產(chǎn)廠商在美國(guó)和歐洲16個(gè)醫(yī)學(xué)中心對(duì)2000多位健康和病患男女進(jìn)行的臨床研究。此項(xiàng)研究顯示充血性心力衰竭癥狀的嚴(yán)重性與NT-proBNP的水平有關(guān)。目前,國(guó)內(nèi)的醫(yī)院使用的同類產(chǎn)品,全部依賴進(jìn)口,而且國(guó)際上只有少數(shù)幾家公司擁有此項(xiàng)技術(shù)。如前所述,NT-proBNP作為一種良好的心肌標(biāo)志物已經(jīng)獲得臨床認(rèn)可,得到廣泛的應(yīng)用,但由于目前的相關(guān)檢測(cè)試劑依賴進(jìn)口,導(dǎo)致患者使用成本相對(duì)較高,進(jìn)口的NT-proBNP的ELISA檢測(cè)試劑盒的價(jià)格為7200元人民幣/96次檢測(cè)、RIA檢測(cè)試劑盒的價(jià)格為9800元/125次檢測(cè)。通過(guò)檢索,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到NT-proBNP檢測(cè)試劑相關(guān)專利及新藥申報(bào),因此,自主研發(fā)具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的特異性NT-proBNP單克隆抗體,生產(chǎn)我國(guó)自己的NT-proBNP檢測(cè)試劑,改變目前依賴國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品的狀況,具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。近十年來(lái)標(biāo)記免疫分析技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展迅速,已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究及臨床疾病診斷各領(lǐng)域。其中技術(shù)工藝成熟,具有先進(jìn)性且實(shí)用性強(qiáng),易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等四種。這些超微量檢測(cè)技術(shù)的基本理論大體相同,但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號(hào)各不相同。根據(jù)大量的試驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料,從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來(lái)看,依次為化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析方法存在諸多缺點(diǎn),如操作復(fù)雜、測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時(shí)間短、放射性污染、儀器昂貴寸?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是一種較先進(jìn)而有效的方法,然而,目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在NT-proBNP免疫分析產(chǎn)品的高效性和穩(wěn)定性方面存在問(wèn)題。另一方面,現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒均為封閉式全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量系統(tǒng),需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x,從而限制了推廣使用,無(wú)法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決了上述問(wèn)題,即將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與NT-proBNP的免疫分析學(xué)有效地結(jié)合,提供了一種能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測(cè)NT-proBNP的試劑盒,該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明的其中一個(gè)目的是提供一種人N端B型利鈉肽原(NT-proBNP)化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;2)包被有人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體的載體;3)酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;以及4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。進(jìn)一步,根據(jù)本發(fā)明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以重組人N端B型利鈉肽原純品配制人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;2)用酶標(biāo)記人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;3)以人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體包被載體;4)分裝上述人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物;以及5)組裝為成品。在上述根據(jù)本發(fā)明的試劑盒及其制備方法中,所述載體可為固相載體,優(yōu)選為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。所述酶可以為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。所述化學(xué)發(fā)光底物可以為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾,其中所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2_二氧乙烷、3-(2:螺旋金剛烷)-4_甲氧基-4-(3”_磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。根據(jù)本發(fā)明的方法中,其中所述包被載體的步驟3)包括以下步驟1)包被基于IOOOmL所述包被液包含10.60g的碳酸鈉,配制包被液,所述包被液的pH值為9.4-9.6,然后將制備的包被液與人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體混合,并將所得混合液負(fù)載于載體上;2)用生理鹽水洗滌上述載體;以及3)封閉基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P042H20,2.9gNaH2P0412H20、lOg胰蛋白胨、和lmL生物防腐劑,配制封閉液,所述封閉液的pH值為7.0-7.5,然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的載體上。具體的上述試劑盒可以包括人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品、抗體包被板、酶標(biāo)記物與化學(xué)發(fā)光底物液、20倍濃縮洗滌液等。其中,所述人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)級(jí),純度不低于90%、抗體包被板為48孔或96孔的微孔條、酶標(biāo)記人N端B型利鈉肽原單抗為偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶、化學(xué)發(fā)光底物液為魯米諾、濃縮洗滌液為Tris-HCl(含Tween20)。本發(fā)明“人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒”可以特異地定量檢測(cè)出病人標(biāo)本中人N端B型利鈉肽原的含量,可以根據(jù)人N端B型利鈉肽原含量的多少判斷是否發(fā)生心衰以及對(duì)心臟功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。它具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該人N端B型利鈉肽原測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到酶聯(lián)免疫分析法的標(biāo)準(zhǔn)。并且,根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)為開(kāi)放式操作,簡(jiǎn)便快速,不需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x,特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用,為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒,酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原單抗與載體上包被的人N端B型利鈉肽原多抗和被測(cè)樣品的人N端B型利鈉肽原抗原形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu),因此本發(fā)明采用的“雙抗體夾心一步法”反應(yīng)模式,既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理、又確保了檢測(cè)的靈敏性。另外,這種模式還便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用的是酶催化發(fā)光底物,通過(guò)檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物,因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性,而靈敏度大大提高,比現(xiàn)今的酶聯(lián)免疫吸附分析靈敏度提高約10倍,可為心衰及其它相關(guān)心臟疾病的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂,下文特舉較佳實(shí)施例,并配合附圖,作詳細(xì)說(shuō)明根據(jù)下。圖1為本發(fā)明組裝成的板式NT-proBNP化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒,其中包含以重組人N端B型利鈉肽原純品配制人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;用酶標(biāo)記人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;以人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體包被載體;分裝上述人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物、洗滌液、使用說(shuō)明等;圖2為本發(fā)明在使用時(shí)在威海威高集團(tuán)的JR-1型發(fā)光儀上檢測(cè),同時(shí)在該儀器上直接完成數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析;圖3為正常人人N端B型利鈉肽原含量及臨界值的確定,其中168例健康人血清,求得的平均值為44.96pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)偏差為25.93pg/ml,計(jì)算的平均值加上2.7倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度值作為臨界值,結(jié)果為114.96pg/ml;圖4為本發(fā)明與Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒相關(guān)性比較結(jié)果從重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院收集的血清標(biāo)本使用本發(fā)明的“人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒”和Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢定量檢測(cè)血清標(biāo)本234份,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明,該兩種方法檢測(cè)的結(jié)果高度相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.9459;圖5為檢測(cè)靈敏度的測(cè)定結(jié)果選擇已知濃度樣本(21000pg/ml),用臨床確定陰性血清倍比稀釋,檢測(cè)結(jié)果表明該發(fā)明檢測(cè)下限<100pg/ml,上限接近30000pg/ml,能滿足臨床人N端B型利鈉肽原的檢測(cè)需要。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備發(fā)明的板式N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒一、抗NT-proBNP抗體的制備將本實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)的NT-proBNP蛋白(公開(kāi)于公開(kāi)號(hào)為CN101230101A的專利申請(qǐng)中)從-80°C冰箱取出,溶解后過(guò)濾,Lowry法測(cè)定蛋白含量,用pH5.8的20mmol/LPBS將其稀釋到0.5mg/ml。選取10只6周齡、體重約20g的雌性Balb/c小鼠??乖榛x用雙注射器互推法。首次免疫時(shí),將重組表達(dá)的NT-proBNP蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化混合,每只小鼠按100ugNT-proBNP的量皮內(nèi)多點(diǎn)加腹腔注射。第14和第28天分別進(jìn)行第二次第三次免疫,佐劑改用不完全弗氏佐劑,抗原量、注射體積和途徑不變,第3次免疫后間接ELISA法測(cè)定效價(jià)。融合前3天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,每只小鼠腹腔注射不加佐劑的lOOygNT-proBNP,3天后細(xì)胞融合。篩選的陽(yáng)性克隆經(jīng)多次克隆化穩(wěn)定后,采用腹水法制備純化單抗,抗體經(jīng)亞類鑒定、特異性分析、表位鑒定及親和力測(cè)定后選擇位于N端的高親和力抗體備用。本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)分析,綜合考慮蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性及柔韌性,綜合蛋白分子的糖基化情況預(yù)測(cè)與上述單抗最佳配對(duì)的線性表位序列,采用多肽合成及偶聯(lián)BSA的方式獲得免疫原(選擇NT-proBNP氨基酸序列C端約15個(gè)氨基酸送上海吉爾生化委托合成,純度>95%,并偶聯(lián)BSA的方式獲得免疫原),免疫新西蘭大白兔,經(jīng)過(guò)多次免疫,待兔血清中的抗NT-proBNP抗體達(dá)到較高效價(jià)后放血,經(jīng)過(guò)抗原親和層析純化后得到了高效價(jià)、高親和力的NT-proBNP特異性的多克隆抗體。二、酶標(biāo)記抗體制備將上述一中制備的NT-proBNP單克隆抗體用改良高碘酸法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶,用PBS充分透析后加入等體積甘油和防腐劑在-20°C分裝保存。三、NT-proBNP校準(zhǔn)品的制備用重組NT-proBNP純品(公開(kāi)于公開(kāi)號(hào)為CN101230101A的專利申請(qǐng)中)配置,設(shè)置0、100、500、2500、10000、30000pg/ml共6瓶。四、酶標(biāo)抗體濃度選定采用方陣法(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)選擇酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度大于15000(大約0.2-0.5ug/ml)五、固相包被板的制備(1)包被無(wú)水碳酸鈉10.60g充分溶解后,用鹽酸調(diào)整pH至9.4-9.6,加入適量NT-proBNP多克隆抗體(至終濃度為1.5yg/ml),然后加入微孔板各孔中,每孔100ia,4°C24小時(shí)。(2)洗滌用生理鹽水在Bio-RAD洗板機(jī)上洗滌一次。7(3)封閉封閉液配方NaH2P042H200.2gNaH2P0412H202.9g胰蛋白胨lOgProclin300lmL雙蒸水定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入清潔容器中,加雙蒸水定容,混勻后調(diào)節(jié)pH為7.0。將包被好的ELISA板每孔加滿封閉液,室溫放置3小時(shí)。甩掉封閉液,在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時(shí)。立即進(jìn)行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無(wú)漏氣,如果有漏氣需要重新封袋。置2-8°C保存。六、酶標(biāo)抗體稀釋液的配制Tris12.120g小牛血清10mlProclin300lmL雙蒸水定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入清潔容器中,加雙蒸水定容,混勻后調(diào)節(jié)pH為7.4。七、化學(xué)發(fā)光底物液A液Tris0.2mMLuminol0.15mM羥基香豆素0.59mM沒(méi)食子酸0.35mMB液氨基酸氧化酶0.85mMDTPA0.5mM維生素C0.12mM乙酸-乙酸緩沖液200mMTween20(V/V)0.8%八、20X洗滌液Tris24.240gNaCl160gKC14gHC115mlTween2020ml去離子水定容至1000ml調(diào)節(jié)pH7.4左右。九、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品,批量制備后用于考察試劑盒的特異性度、精密度及穩(wěn)定性,合格才能組裝成NT-proBNP定量檢測(cè)試劑盒成品。實(shí)施例2制備本發(fā)明的管式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒除以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的NT-proBNP單抗,以相同條件準(zhǔn)備化學(xué)發(fā)光底物、包被液及封閉液,只是選用以塑料珠和塑料管為載體,其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒。實(shí)施例3制備本發(fā)明的基于磁微粒子的人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒除以磁性顆粒作為載體外,其余均與以實(shí)施例1相同的方法制備人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒。實(shí)施例4本發(fā)明的板式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒的使用方法以上實(shí)施例1制備的板式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒的具體操作如下1)試劑盒保存于4°C冰箱中,使用前取出室溫平衡15分鐘。2)取出包被板條,插入板條架中。3)反應(yīng)孔中分別加各濃度校準(zhǔn)品,每孔分別加0、100、500、2500、10000、30000pg/ml各50iil,每孔加酶標(biāo)記物50iU,用微量震蕩器充分振蕩混勻,37°C溫育1小時(shí)。4)甩去反應(yīng)液,每孔加滿稀釋液后的洗滌液,洗板5次,最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學(xué)發(fā)光底物液100iil,用微量震蕩器充分振蕩混勻,室溫避光反應(yīng)5分鐘。6)在加化學(xué)發(fā)光底物液后的第5分鐘后,在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x依序測(cè)定各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。7)以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),發(fā)光強(qiáng)度(RLU)值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的NT-proBNP的濃度。實(shí)施例5本發(fā)明的板式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程(請(qǐng)?zhí)峁┮贸鎏?(參考2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》中有關(guān)體外診斷試劑的制檢規(guī)程格式,主要包括以下幾個(gè)方面1.定義、組成及用途。2.制造包括基本要求、專用原材料和制造程序。3.半成品檢定。4.成品檢定。5.保存及有效期。)對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定,相關(guān)結(jié)論見(jiàn)下表1:表1試劑盒總體評(píng)價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>選擇已知濃度樣本(21000pg/ml),用臨床確定陰性血清倍比稀釋,檢測(cè)結(jié)果如下表2檢測(cè)靈敏度測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論說(shuō)明板式人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度和穩(wěn)定性完全合格,并達(dá)到臨床人N端B型利鈉肽原檢測(cè)的要求。實(shí)施例6正常人人N端B型利鈉肽原含量及臨界值的確定隨機(jī)取168例健康人血清用實(shí)施例13中制備的“人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒”測(cè)定結(jié)果如下168例健康人血清,測(cè)得NT-proBNP平均值為44.96pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)偏差為25.93pg/ml,以平均值加上2.7倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度值作為臨界值,結(jié)果為114.96pg/ml。實(shí)施例7本發(fā)明的板式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒與Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒比較從重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院收集經(jīng)Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過(guò)的血清標(biāo)本,使用實(shí)施例1的板式人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè),以比較兩種試劑盒的相關(guān)性。一、臨床血清標(biāo)本的來(lái)源從重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院收集正常人血清168份,Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢定量檢測(cè)過(guò)的血清標(biāo)本234份。二、使用板式人N端B型利鈉肽原定量檢測(cè)試劑盒與Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒比較1、方法所有收集的血清標(biāo)本使用本發(fā)明實(shí)施例1的“人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒”(按說(shuō)明書(shū)操作)和Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢定量檢測(cè)血清標(biāo)本234份,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明,該兩種方法檢測(cè)的結(jié)果高度相關(guān),結(jié)果如圖3-5。2、結(jié)果人N端B型利鈉肽原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒JR-1型發(fā)光儀上測(cè)試,與Roche的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果對(duì)照見(jiàn)表3:表3234例臨床樣本NT-proBNP檢測(cè)結(jié)果編號(hào)羅氏(Pg/ml)本發(fā)明(Pg/ml)編號(hào)羅氏(pg/ml)本發(fā)明(pg/ml)1742.474211810680576222797279011930572883339865268120546350504365.6727121330446465106604140122809.41070627.8571231236136571301113000124325631758954.869112584.243511<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>①符合率分析以本發(fā)明測(cè)定的臨界值為標(biāo)準(zhǔn),判斷陽(yáng)性和陰性,將檢測(cè)結(jié)果對(duì)照見(jiàn)表4表4234例臨床樣本NT-proBNP檢測(cè)結(jié)果符合率統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>陽(yáng)性符合率=205/206X100%=99.51%;陰性符合率=28/29X100%=96.6%;總符合率=(205+28)/234X100%=99.5%。(P<0.01)結(jié)論本發(fā)明與Roche的電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)同樣樣本的比較結(jié)果,兩種方法均高度相關(guān),P均值<0.01。說(shuō)明兩種方法均有同等的使用價(jià)值。上述結(jié)果表明試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)并滿足了NT-proBNP臨床檢測(cè)的需求。相對(duì)于目前國(guó)內(nèi)進(jìn)口使用的Roche的電化學(xué)發(fā)光試劑盒,具有相同的檢測(cè)效果,但不需要昂貴的全自動(dòng)化檢測(cè)分析儀,試劑成本低廉的優(yōu)勢(shì),適合在國(guó)內(nèi)普及推廣。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露根據(jù)上,然其并非用以限定本發(fā)明,任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域:
的技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi),當(dāng)可作些許之更動(dòng)與改進(jìn),因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。權(quán)利要求一種人N端B型利鈉肽原免疫分析試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括1)人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;2)包被有人N端B型利鈉肽原多克隆抗體的載體;3)酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,2)中所述載體為固體載體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于,所述固體載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,3)中所述酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,4)中所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2_二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾,所述1,2_二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2_二氧乙烷、3--螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-、-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法,其特征在于包括以下步驟1)以重組人N端B型利鈉肽原純品配制人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;2)用酶標(biāo)記人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;3)以人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體包被載體;4)分裝人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物;以及5)組裝為成品。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述步驟3)所述的包被載體包括以下步驟1)包被基于IOOOmL所述包被液包含10.60g的碳酸鈉,配制包被液,所述包被液的pH值為9.4-9.6,然后將制備的包被液與人N端B型利鈉肽原的多克隆抗體混合,并將所得混合液負(fù)載于載體上;2)用生理鹽水洗滌上述載體;3)封閉基于IOOOmL所述封閉液包含0.2gNaH2PO42H20,2.9gNaH2PO412H20、IOg胰蛋白胨、和ImL生物防腐劑,配制封閉液,所述封閉液的pH值為7.0-7.5,然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的載體上。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2_二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾,所述1,2_二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2_二氧乙烷、3-(2:螺旋金剛烷)-4_甲氧基-4-(3”_磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明提供一種人N端B型利鈉肽原免疫分析試劑盒,其主要包括1)人N端B型利鈉肽原校準(zhǔn)品;2)包被有人N端B型利鈉肽原多克隆抗體的載體;3)酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原的單克隆抗體;4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。本發(fā)明還提供上述試劑盒的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒,酶標(biāo)記的人N端B型利鈉肽原單抗與載體上包被的人N端B型利鈉肽原多抗和被測(cè)樣品的人N端B型利鈉肽原抗原形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu),既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理、又確保了檢測(cè)的靈敏性。另外,本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于開(kāi)放式的化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x,使用成本低,更易推廣應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/577GK101819205SQ20101019086公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2010年6月3日優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日發(fā)明者易維京,胡川閩,賈向陽(yáng),陳安申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)