專利名稱：一種應(yīng)用Rv3872新型融合蛋白制備的牛結(jié)核抗體鑒別檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，是一種借助膠體金 標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，快速、鑒別檢測(cè)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病是一種由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組 織(OIE)定的必須通報(bào)的疾病之一。2001年和2002年的部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明我國(guó)個(gè)別省市 奶牛結(jié)核病陽性率高達(dá)10%以上。牛結(jié)核病的防制措施是“檢疫-撲殺”，即采用牛提純結(jié) 核菌素(PPD)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行檢疫，對(duì)檢出的陽性牛進(jìn)行撲殺。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的基本過程是 剃毛、量皮厚、注射結(jié)核菌素、72小時(shí)后再量皮厚。該方法具有較多缺陷，如牛結(jié)核菌素成 分復(fù)雜，與環(huán)境分枝桿菌和卡介苗具有共同成份而使變態(tài)反應(yīng)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；感染后 期的敏感性降低；結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)；操作復(fù)雜，勞動(dòng)強(qiáng)度大，需要時(shí)間長(zhǎng)等，這些均使我 國(guó)“檢疫-撲殺”政策的實(shí)施效果大打折扣；此外，皮試反應(yīng)只能進(jìn)行活體現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不能 保存樣品并進(jìn)行回顧性分析。除牛外，其它動(dòng)物的皮試反應(yīng)未進(jìn)行過標(biāo)準(zhǔn)化。野生動(dòng)物因 為難以捕捉，很難進(jìn)行皮試反應(yīng)。因此，臨床上需要一種適合于不同動(dòng)物、操作簡(jiǎn)便、能鑒別 卡介苗免疫和環(huán)境分枝桿菌感染的靈敏特異的檢測(cè)方法。膠體金試紙條就是一種被認(rèn)為適 合于“欄圈旁”檢測(cè)的簡(jiǎn)易方法。該方法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫分析 方法，是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫 標(biāo)記技術(shù)。它具有簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。依據(jù)膠體金免疫層析技 術(shù)，在國(guó)內(nèi)外無論人醫(yī)應(yīng)用方面，還是獸醫(yī)應(yīng)用方面，都已經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析 快速檢測(cè)試紙條。由于牛結(jié)核感染過程中抗體產(chǎn)生較晚，且不同時(shí)期出現(xiàn)針對(duì)不同蛋白的抗體，因 此，針對(duì)單個(gè)蛋白設(shè)計(jì)的抗體檢測(cè)方法雖然簡(jiǎn)便但靈敏度不高。各個(gè)科學(xué)家都在通過同時(shí) 應(yīng)用多種診斷抗原以提高靈敏度，這種方法被稱為“雞尾酒”法(Siguo Liu, Sheping Guo, Chunlai Wang, Meili Shao, Xiuhua Zhang, YangGuo and Qiang Gong. A novel fusion protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay forthe detection of bovine tuberculosis. Tuberculosis, 2006, 3 ；C. Aagaard, Μ. Govaerts, V. Meikle, A. J. Vallecillo, J. A. Gutierrez-Pabello, F. Suarez-Giiemes, [J]. McNair, A. Cataldi, C. Espitia, P.Andersen, and J.M. Pollock, Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovisin Herds with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis :ESAT6_CFP10 Mixture Shows OptimalSensitivity and Specificity, [J],Clin Microbiol,2006,44(12) 4326-4335 ；Cockle PJ, GordonSV, Hewinson RG, Vordermeier HM. Field evaluation of a novel differential diagnostic reagentfor detection of Mycobacterium bovis in cattle[J]. Clin Vaccine Immunol,2006, 13(10) 1119-1124 ； Kanaujia GV, Garcia MA, Bouley DM, et al. Detection of earlysecretory antigenic target-6 antibodyfor diagnosis of tuberculosis in non-human primates [J], Comp Med 2003,53(6) =602-606) 本課題組前期研究中，進(jìn)行了多種牛分枝 桿菌特異性抗原蛋白的融合表達(dá)，最后發(fā)現(xiàn)，RV3872、CFP10、ESAT6的融合蛋白作用牛結(jié)核 診斷抗原具有靈敏度高、特異性好、可區(qū)別卡介苗免疫與非結(jié)核分枝桿菌的干擾。Rv3872和CFP10及ESAT6蛋白同屬牛分枝桿菌的差異基因區(qū)(RDl區(qū))，是 ESAT6-CFP10復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，敲除Rv3872會(huì)中止復(fù)合體的合成與分泌， 可能參與了復(fù)合體的合成、分泌過程(Priscille Brodin, Laleh Majlessi, Laurent Marsollier, Marien I. de Jonge, Daria Bottai, Caroline Demangel, Jason Hinds, Olivier Neyrolles, Philip D. Butcher, Claude Leclerc, Stewart T.Cole, and Roland Brosch, Dissection of ESAT—6 System 1 of Mycobacterium tuberculosis and Impact on Immunogenicity and Virulence. Infection and Immunity,2006,74(1) :88_98)。有 研究證明結(jié)核分枝桿菌的Rv3872能誘導(dǎo)結(jié)核病人產(chǎn)生顯著的抗體反應(yīng)(P.Mukherjee， Μ. Dutta, P. Datta, A. Dasgupta, R. Pradhan, Μ. Pradhan, Μ. Kundu, J. Basu andP. Chakrabarti, The RDl-encoded antigen Rv3872 of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate forserodiagnosis of tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection, 2007，13 (2) 146-152)，鑒于牛分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌在基因組水平上 有99. 95%的同源性，提示該蛋白可能具有應(yīng)用于牛結(jié)核血清學(xué)診斷的潛力。申請(qǐng)者的前期工作即授權(quán)專利(專利號(hào)ZL 2006101665510 ；發(fā)明名稱檢測(cè)牛結(jié) 核抗體的免疫膠體金試紙條，授權(quán)公告日2009年6月3日)也是一種牛結(jié)核抗體檢測(cè)方 法，但該方法不具備鑒別診斷功能，不能區(qū)分卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌感染，而本發(fā)明是針 對(duì)毒力型牛分枝桿菌的特異性早期分泌蛋白設(shè)計(jì)的免疫膠體金試紙條，除了具上已授權(quán)專 利的靈敏度與特異性外，還具有鑒別診斷的新功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種一種應(yīng)用Rv3872新型融合蛋白 制備的牛結(jié)核抗體鑒別檢測(cè)試紙條，該試紙條適合于早期鑒別診斷，具有特異性強(qiáng)、靈敏度 高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，專門用于檢測(cè)牛結(jié)核病的抗體的免疫層次試紙條，為 我國(guó)牛結(jié)核病防制提供一種新型試劑盒和新方法。鑒于以上三種牛分支桿菌特異性分泌蛋白的Rv3872、CFP10和ESAT6的特性，以及 現(xiàn)階段牛結(jié)核診斷方法研究現(xiàn)狀，本發(fā)明以牛分支桿菌全基因組為模板克隆了 Rv3872(基 因登錄號(hào)NC 002945)、CFP10基因(基因登錄NC 002945)和ESAT6基因(基因登錄號(hào) NC002945)，并構(gòu)建了三種基因融合表達(dá)的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)。在所述的每 種蛋白(Rv3872、CFP10和ESAT6)之間加入了連接序列以最大限度地保證融合蛋白中各個(gè) 蛋白的空間構(gòu)像和活性不受影響(見圖8)。對(duì)純化的Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白活性 進(jìn)行了鑒定和ELISA初步驗(yàn)證(劉冬光，郭愛珍等，融合蛋白R(shí)v3872/CFP-10/ESAT-6的制 備及在牛結(jié)核診斷中的初步應(yīng)用，中國(guó)奶牛，2009(10) :7-11)，表明上述三蛋白融合抗原的 牛結(jié)核抗體檢出率顯著高于由申請(qǐng)人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行克隆表達(dá) 的CFP10-ESAT6 二蛋白融合抗原(張桂榮、郭愛珍等，間接ELISA檢測(cè)牛分枝桿菌抗體方法 的建立及初步應(yīng)用.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007,29(29) :555_560 ；張書環(huán)、郭愛珍等，牛分枝桿菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表達(dá)及相關(guān)特性分析.中國(guó)人獸共患病學(xué) 報(bào)，2007,23(12) :1238-1242)，因此，本發(fā)明應(yīng)用新型融合蛋白制備成牛結(jié)核抗體鑒別診斷 膠體金免疫層析試紙條，證實(shí)該產(chǎn)品具有簡(jiǎn)便、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，為牛結(jié)核病的快速鑒別 診斷提供了更加有效的工具。本發(fā)明總體技術(shù)路線如附圖1所示。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種牛結(jié)核抗體的檢測(cè)試紙條，其包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和 PVC背襯。在PVC背襯(7)上按順序依次粘附有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、 吸水墊(4)；所述的結(jié)合墊(2)上包被有保藏號(hào)為CCTCC NO :M208244的重組大腸桿菌所表 達(dá)的Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白與膠體金的標(biāo)記物；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被 有Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白的檢測(cè)線(5)、抗Rv3872-CFP10_ESAT6蛋白IgG構(gòu)成的質(zhì)控線 (6)；其中，RV3872-CFP10-ESAT6蛋白是以牛分支桿菌全基因組為模板克隆Rv3872、 CFPlO和ESAT6基因，并構(gòu)建三種基因融合表達(dá)的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)得 到。一種適用于檢測(cè)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括1)克隆牛分枝桿菌特異性分泌蛋白R(shí)CE基因并在重組大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)牛分 枝桿菌RCE蛋白的重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET_28a-RCE，該重組大腸桿 菌已于2008年12月4日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏號(hào)為 CCTCC NO :M208244。2)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；3)將RCE蛋白加入步驟2)制備的膠體金中，得到RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物；4)將得到RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合墊(3)上；5)將步驟1)表達(dá)純化RCE蛋白包被在硝酸纖維素膜(4)上構(gòu)成檢測(cè)線(5)；并將 純化RCE蛋白的IgG包被在硝酸纖維素膜(3)上構(gòu)成質(zhì)控線(6)；6)在所述的PVC背襯(7)上按順序依次粘附所述的樣品墊(1)、結(jié)合墊(3)、硝酸 纖維素膜(4)、吸水墊(7)，得到所述的檢測(cè)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙條、將試紙條裝 到專門的透明外殼(9)中、血清稀釋液(8)專指用于該檢測(cè)試紙條血清樣本稀釋的溶液。本發(fā)明選用牛分枝桿菌特異性分泌蛋白R(shí)CE作為檢測(cè)線，牛分枝桿菌特異性分泌 蛋白R(shí)CE作為膠體金標(biāo)記物，利用間接法來檢測(cè)待測(cè)血清樣品中是否含有RCE抗體。當(dāng)待 檢樣品中為牛結(jié)核抗體陽性時(shí)，血清RCE抗體與RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物結(jié)合之后，在檢測(cè) 線處遇到RCE抗原就會(huì)出現(xiàn)顏色深淺不同的紅色條帶，質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶，表示陽性 反應(yīng)(二條帶)。否則只有質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶(一條帶)，表示陰性反應(yīng)。本檢測(cè)試紙條(如附圖2所示結(jié)構(gòu)圖)由樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜 (4)、吸水墊(7)按圖示的順序依次粘附在PVC背襯(1)上組裝而成的。結(jié)合墊上包被有 本發(fā)明制備的RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線(5)和質(zhì)控線(6)， 其中檢測(cè)線為本發(fā)明制備的牛分枝桿菌特異抗原蛋白R(shí)CE，質(zhì)控線為本發(fā)明制備的提純抗 RCE蛋白IgG。所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC背襯均購(gòu)自Millipore公 司ο
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)1、與專利號(hào)ZL 2006101665510的授權(quán)專利比較，本發(fā)明具有鑒別和檢測(cè)雙重功 能，可區(qū)分卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌，同時(shí)具有早期檢測(cè)功能。2、本發(fā)明具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短(5-10分鐘)的特點(diǎn)。3、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測(cè)成本低。4、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)便，不需由專業(yè)人員操作。5、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在2 8°C下有效保存期可達(dá) 兩年。


SEQ ID NO=I是牛分枝桿菌特異性融合抗原蛋白的核苷酸序列表圖1 本發(fā)明的總體技術(shù)路線2 本發(fā)明檢測(cè)試紙條的組裝示意中1為PVC背襯，2為樣品墊，3為結(jié)合墊，4為硝酸纖維素膜，5為檢測(cè)線，6為 質(zhì)控線，7吸收墊圖3 本發(fā)明檢測(cè)試紙條結(jié)果判定示意中A 為陽性標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，B 為陽性樣品結(jié)果，C 為陰性樣品結(jié)果，D、E 為試紙 條失效。圖4:本發(fā)明檢測(cè)試紙條結(jié)果判定中A 為陽性結(jié)果，D 為陰性樣品結(jié)果，B和C 為試紙條失效。圖5 :PET-28a(+)原始質(zhì)粒載體物理圖譜。圖6 是本發(fā)明PCR擴(kuò)增Rv3872電泳圖譜；圖中M為DL2000 ；1為陰性對(duì)照；2為 擴(kuò)增后得到的321bp的Rv3872片段，其中包括酶切位點(diǎn)和連接序列(Linker)長(zhǎng)度。圖7 為PCR擴(kuò)增CFPlO和ESAT6電泳圖譜。圖中M為DL2000 ；1,3為陰性對(duì)照； 2為348bp的CFPlO目的片段，其中包括酶切位點(diǎn)和連接序列(Linker)長(zhǎng)度；4為341bp的 ESAT6目的片段，其中包括酶切位點(diǎn)和連接序列(Linker)長(zhǎng)度。圖8 是本發(fā)明中三基因融合重組原核表達(dá)載體 pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即 pET_28a_RCE)構(gòu)建流程圖。圖9:是本發(fā)明中所構(gòu)建包含CFP10-ESAT6融合基因的中間質(zhì)粒 pET-28a-CFP10-ESAT6(即 pET_28a_CE)的圖譜。圖10 是本發(fā)明中所構(gòu)建包含Rv3872-CFP10_ESAT6三基因的重組表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6 (即 pET_28a_RCE)的圖譜。圖11 是本發(fā)明中重組中間融合基因CFP10-ESAT6PCR擴(kuò)增后的電泳圖譜。圖中 M為DL2000 ；1為擴(kuò)增后643bp的CFP10-ESAT6融合基因片段(包括連接序列和兩端酶切 位點(diǎn))；2為陰性空白對(duì)照。圖12 是重組中間融合質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6構(gòu)建后酶切鑒定電泳圖譜。 圖中Ml 為 DL2000 ；M2 為 DL15000 ；1 為 HindIII 和 NotI 雙酶切 pET-28a-CFP10_ESAT6 質(zhì)粒后出現(xiàn)5363bp和636bp左右的兩個(gè)片段；2，3為NotI和HindIII分別單酶切 pET-28a-CFP10-ESAT6質(zhì)粒出現(xiàn)5999bp左右的片段。圖13:是本發(fā)明中制備的RCE蛋白表達(dá)形式鑒定圖譜。圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為IPTG誘導(dǎo)的空載體對(duì)照；2為菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的情況；3為超聲波破碎菌體離心 后上清取樣；4為超聲波破碎菌體離心后沉淀取樣。圖14 是本發(fā)明中制備的RCE蛋白最佳表達(dá)條件。在圖12A中M為蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1為0. 8mmol/L IPTG (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南建議濃度)誘導(dǎo)空載體對(duì)照；2為IPTG終濃度 為0. 4mmol/L誘導(dǎo)；3為IPTG終濃度為0. 6mmol/L誘導(dǎo)；4為IPTG終濃度為0. 8mmol/L誘 導(dǎo)；5為IPTG終濃度為1. Ommol/L誘導(dǎo)。在圖12B中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為0. 4mmol/ L IPTG 誘導(dǎo)空載體；2 為0. 4mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 2h ;3 為 0. 4mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 3h;4 為 0. 4mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 5h ；5 為 0. 4mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 6h。圖15 是本發(fā)明中制備的RCE蛋白Western-Blot圖。圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1為牛結(jié)核陽性血清；2為正常牛血清。圖16 是本發(fā)明中制備的RCE蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖16A和圖16B為蛋白 標(biāo)準(zhǔn)品做兩次重復(fù)分別所得標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式。圖17 制備好的膠體金電鏡照片。圖18 牛結(jié)核RCE抗體快速檢測(cè)試紙條。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (制備實(shí)施例)(一 )牛分枝桿菌特異性分泌蛋白R(shí)CE基因的克隆及在重組大腸桿菌中表達(dá)并純 化的方法參見(專利申請(qǐng)?zhí)?00910060913. 1 ；公開號(hào)CN101538578，公告日2009年9月 23日)報(bào)道的方法。(二)提純RCE蛋白的I gG抗體將含有RCE抗體的血清4000r/min離心10分鐘取上清用于提純?nèi)Oml上清于 40C，12000r/min離心10分鐘，棄雜質(zhì)，然后加入40ml 0. 06M ρΗ4· 5的醋酸鹽緩沖液，再在 室溫(25°C )下緩慢加入330 μ 1辛酸，邊滴加邊攪拌。緩慢加入飽和硫酸銨至終濃度為 45%，用0. OlM PBS(ρΗ7. 4)溶解后透析過夜。SDS-PAGE電泳分析(如附圖11所示)顯示 有兩條帶，一條為IgG重鏈，一條為IgG輕鏈。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化多抗在280nm和 260nm波長(zhǎng)時(shí)的光吸收值(OD)，按公式1. 45X0D280-0. 74X0D260計(jì)算多抗?jié)舛?。調(diào)整溶 液體積，使其終濃度為2. 5mg/ml。利用該抗體作為質(zhì)控線。實(shí)施例2 (制備實(shí)施例)牛分枝桿菌特異性分泌蛋白R(shí)CE抗體診斷試紙條組裝及制備方法1、RCE試紙條包括樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(7)和PVC背襯(1)為商購(gòu)， 其具體結(jié)構(gòu)是在PVC背襯(1)上按順序依次粘附有樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜 (4)、吸水墊(7)；所述的結(jié)合墊(3)上包被有MPBrce蛋白-膠體金標(biāo)記物；所述的硝酸纖 維素膜(4)上分別包被有純化的RCE蛋白的檢測(cè)線(5)、純化RCE蛋白IgG構(gòu)成的質(zhì)控線 (6)。2膠體金的制備用超純水將氯金酸稀釋成0. 01%，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，按每IOOml 0. 01%氯金酸加入2. Oml 檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈橙紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一年，膠體 金電鏡照片如附圖17。3RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物制備磁力攪拌下，用0. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8. 0，按每ml膠體金加入2. 3 μ L 1. Omg/mL MPBrce蛋白，繼續(xù)攪拌混勻60min，加入10 % PEG20000至終濃度為1 %，繼續(xù)攪 拌混勻30min。3500rpm、4°C離心30min，棄沉淀，上清7500rpm、4°C離心30min，棄上清，沉 淀用0. 02M pH8. O的硼酸鹽緩沖液(配方硼酸0. 1237g，PEG-200001g，用超純水定容至 1000ml，調(diào)pH至8. 0)洗滌兩次，用二十分之一初始膠體金體積的0. 02M pH8. 0的硼酸鹽緩 沖液(配方硼酸0. 1237g，聚乙二醇(PEG)-200001g，用超純水定容至1000ml，調(diào)pH至8. 0) 將沉淀重懸，置4°C備用，有效期60天。4結(jié)合墊的包被將結(jié)合墊浸泡于0. OlM pH 7. 4磷酸緩沖液(配方及制備20g牛血清白 蛋白(BSA)，25g 蔗糖，3g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10,0. 2gNaN3 NaCl 8g，KCl 0. 2g， Na2HP04 · 12H20 2. 9g, KH2PO4O. 2g，用超純水定容至 1000ml)中 30min 后，于 37°C烘干。然 后用Biodot點(diǎn)膜儀將制備好的RCE蛋白-膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合墊上，每厘米結(jié)合 墊包被9 μ IMPBrce蛋白-膠體金標(biāo)記物，冷凍真空干燥，真空封裝，置4°C備用。5樣品墊的處理將樣品墊浸泡于0. OlM pH 7. 4磷酸緩沖液(配方及制備20g BSA，25g蔗糖， 3gPVP-10,0. 2gNaN3 NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, KH2PO4O. 2g，用超純水定容至 1000ml)中30min后，于37°C烘干，真空封裝，置4°C備用。6硝酸纖維素膜的包被用Biodot點(diǎn)膜儀將純化的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白R(shí)CE (濃度為2mg/mL)包 被于硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線，包被量為0. 6 μ 1/cm，檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端，距結(jié)合墊墊端 約8mm ；用Biodot點(diǎn)膜儀將純化的豬IgG抗體(濃度2mg/ml)包被于硝酸纖維素膜作為質(zhì) 控線，包被量為0.8 μ 1/cm，質(zhì)控線靠近吸水墊，距吸收墊約8mm，兩線距離5 8mm。室溫干 燥，封裝備用。7試紙條的組裝將樣品墊⑵、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜⑷、吸水墊(7)按圖2所示的順序依次 粘附在PVC背襯(1)上，切成3mm寬的小條，裝到塑料通明外殼(9)中真空封裝。2 8°C 保存，有效期2年；常溫保存，有效期12個(gè)月。實(shí)施例3 (應(yīng)用實(shí)施例)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙條使用方法1、血清樣品的預(yù)處理血清樣品經(jīng)4000rpm/min離心IOmin去掉血細(xì)胞，_20°C長(zhǎng)期保存，4°C短期保存。2、檢測(cè)步驟用吸管吸取40 μ 1待檢血清與40 μ 1血清稀釋液混合均勻后緩慢滴加在膠體金試 紙條的樣品墊上，20分鐘后觀察結(jié)果。3、結(jié)果判定如圖3所示，若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線顏色明顯深于陽性標(biāo)準(zhǔn)品試紙條檢測(cè)線顏色，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測(cè)樣品中有牛結(jié)核分枝桿菌特異 性分泌蛋白R(shí)CE的抗體，說明該牛為結(jié)核病牛；若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線無顏色出現(xiàn)，同時(shí) 質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性樣品，即待測(cè)樣品中沒有牛結(jié)核分枝桿菌特異性分泌 蛋白R(shí)CE的抗體，說明該牛為結(jié)核陰性牛；若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線顏色介于陽性標(biāo)準(zhǔn)品 和陰性標(biāo)準(zhǔn)品試紙條檢測(cè)線顏色之間，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為可疑樣品，說 明該牛疑似結(jié)核?。蝗绻|(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。實(shí)施例4 (應(yīng)用實(shí)施例)本發(fā)明的應(yīng)用效果舉例(如附圖18)本例中所指的檢測(cè)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙檢測(cè)方法參照實(shí)施例3所述的 操作步驟，其檢測(cè)結(jié)果如表1、表2和表3。1、特異性試驗(yàn)按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)牛結(jié)核陽性陽性血清，牛結(jié)核陰性血清(按照 常規(guī)的PPD皮試、ELISA和病理學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法操作)、副結(jié)核病牛血清、布病牛血清、 弓形蟲病牛血清和口蹄疫牛血清(均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)。試驗(yàn)結(jié)果表明(見表1)，副 結(jié)核病牛血清、布病牛血清、弓形蟲病牛血清和口蹄疫牛血清樣品檢測(cè)線無顏色出現(xiàn)，同時(shí) 質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。本發(fā)明試紙條與牛的其他疾病無交叉反應(yīng)，顯示本發(fā)明試紙條具 有好的特異性。表1特異性試驗(yàn) 注“ + ”表示陽性，“ _ ”表示陰性。2、敏感性試驗(yàn)按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，將200份臨床牛血清樣品用牛結(jié)核病抗體檢測(cè)試 紙條檢測(cè)，并且與TST檢測(cè)做比較。牛結(jié)核病抗體檢測(cè)試紙條與TST的比較(結(jié)果見表2)。 TST陽性牛100頭，其中試紙條檢測(cè)判斷85頭為陽性，陽性符合率為68%。TST陰性牛100 頭，其中試紙條檢測(cè)判斷115頭為陰性，陰性符合率為83%?？偡下蕿?5. 5%。表2牛結(jié)核RCE抗體檢測(cè)試紙條與TST的比較 用牛分枝桿菌RCE抗體檢測(cè)膠體金試紙條與韓國(guó)進(jìn)口的牛結(jié)核抗體檢測(cè)膠體金 試紙條同時(shí)檢測(cè)了 240份臨床牛血清樣品，結(jié)果顯示本發(fā)明的試紙條檢測(cè)62為陽性，韓國(guó) 試紙條陽性牛61頭，共同檢出60份，其中陽性符合率為97% (59/61)。韓國(guó)試紙條陰性牛 179頭，其中本研究試紙條檢測(cè)判斷為陰性的有176頭，陰性符合率為98% (176/179)?？?符合率為98% (59+176/240)。說明本發(fā)明的試紙條與韓國(guó)試紙條具有很高的符合率(表 2)。表3本發(fā)明的試紙條與同類韓國(guó)試紙條的比較 3、臨床樣品的檢測(cè)按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)湖北省黃R地區(qū)11個(gè)牛場(chǎng)的1003份血清進(jìn)行 檢測(cè)，結(jié)果見表4。檢測(cè)樣品陽性率為7. 00%-65. 00% (見表4)，由此可見牛結(jié)核病分布 較廣。臨床應(yīng)用證明該試劑盒準(zhǔn)確性、重復(fù)性、敏感性、特異性良好，適合臨床大量血清抗體 檢測(cè)和疾病診斷，在清除牛結(jié)核病傳染源和控制牛結(jié)核病的臨床實(shí)踐中具有重要的意義。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限 制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定 的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍 內(nèi)。表4本發(fā)明的牛結(jié)核病抗體檢測(cè)試紙條的臨床應(yīng)用情況
權(quán)利要求
一種牛結(jié)核抗體的檢測(cè)試紙條，其包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，其特征在于，在PVC背襯(7)上按順序依次粘附有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)；所述的結(jié)合墊(2)上包被有保藏號(hào)為CCTCC NOM208244的重組大腸桿菌所表達(dá)的Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白與膠體金的標(biāo)記物；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白的檢測(cè)線(5)、抗Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)；其中，Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白是以牛分支桿菌全基因組為模板克隆Rv3872、CFP10和ESAT6基因，構(gòu)建三種基因融合表達(dá)的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)得到。
2.一種表達(dá) Rv3872-CFP10-ESAT6 蛋白的重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/ pET28a-RCE，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M208244。
3.權(quán)利要求2所述的的重組大腸桿菌在制備牛結(jié)核抗體檢測(cè)試紙條上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病基因工程技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種利用RV3872、ESAT6和CFP10三基因融合蛋白制備的檢測(cè)牛結(jié)核抗體的免疫膠體金試紙條及制備方法與應(yīng)用。以融合蛋白作為膠體金標(biāo)記抗原和硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)的捕獲抗原建立膠體金免疫層析試紙條。本發(fā)明試劑條對(duì)牛結(jié)核抗體的檢測(cè)具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的突出優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)鑒別檢測(cè)卡介苗免疫和非結(jié)核分枝桿菌感染。本發(fā)明包括一種重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-MPBrce，該菌株表達(dá)牛分枝桿菌RCE蛋白，其保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM208244。
文檔編號(hào)G01N33/532GK101900727SQ20101019473
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者于清龍, 凌潔玉, 劉冬光, 廖娟紅, 涂玲玲, 郭愛珍, 陳煥春, 陳穎鈺 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)