專利名稱：基于量子點(diǎn)技術(shù)的一種非洲豬瘟檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體說是一種基于量子點(diǎn)技術(shù)的一種非洲豬瘟檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還需要借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸、及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。作為一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果可靠的組織樣本中蛋白檢測(cè)方法，免疫組化正越來(lái)越多的地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷中。用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的方法之一，包括熒光抗體和熒光抗原技術(shù)，具有抗原抗體反應(yīng)的特異性，染色技術(shù)的快速性，在細(xì)胞或組織上定位的準(zhǔn)確性，以及熒光效應(yīng)的靈敏性等優(yōu)勢(shì)。但是，目前常用的熒光素多是有機(jī)染料，存在熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消退，結(jié)果不易長(zhǎng)期保存等缺點(diǎn)，在普及應(yīng)用上受到一定的限制。量子點(diǎn)(QDs)特指半徑小于或接近激子波爾半徑的半導(dǎo)體納米顆粒，由于其具有發(fā)射光譜窄且具有尺寸“調(diào)諧”特性，用單個(gè)波長(zhǎng)即可激發(fā)不同的量子點(diǎn)，熒光量子產(chǎn)率高， 穩(wěn)定性好，很好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)藥標(biāo)識(shí)方面，量子點(diǎn)巨大的研究和應(yīng)用價(jià)值逐步被看好。通過將量子點(diǎn)連接在抗原或者抗體上，形成量子點(diǎn)標(biāo)記的抗原(抗體)復(fù)合物，借助于組織化學(xué)方法直接進(jìn)行顯色反應(yīng)，可以顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)或者組織中發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布及其含量。另外，量子點(diǎn)寬的吸收峰和窄的吸收峰使得在一個(gè)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中進(jìn)行多色多通道分析檢測(cè)成為可能。量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析方法，具有以下有點(diǎn)光穩(wěn)定性增加，高靈敏度，與現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光比較靈敏度高或者相當(dāng)；線性強(qiáng)，提高蛋白表達(dá)量；與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)相容， 不用專用設(shè)備；節(jié)約實(shí)踐和成本；多色檢測(cè)，可以在同一個(gè)檢測(cè)窗口觀測(cè)到多個(gè)抗體的存在并決定他們的濃度，比單色檢測(cè)降低成本。用量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫組化檢測(cè)方法，可以大大加速并且提高檢測(cè)的靈敏度和分析的準(zhǔn)確度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于基于量子點(diǎn)技術(shù)的一種非洲豬瘟檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法用熒光顯微鏡直接進(jìn)行觀察判斷，省去了染色、復(fù)染、脫水、 透明等操作，更簡(jiǎn)單易行，節(jié)約時(shí)間和成本；而且熒光光穩(wěn)定性增加，與現(xiàn)有免疫組織化學(xué)顯色方法相比較，分析的準(zhǔn)確度和檢測(cè)的靈敏度有所提高。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟一，將表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)與非洲豬瘟單克隆抗體連接(1)如果是表面帶有羧基的水溶性量子點(diǎn)，則首先將量子點(diǎn)分散在硼酸鹽緩沖溶液中，然后加入硫化二亞胺和單克隆抗體，混合，25°C下反應(yīng)3小時(shí)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的單克隆抗體復(fù)合物；其中，量子點(diǎn)硫化二亞胺單抗的摩爾比為60 15 1 ；(2)如果是表面帶有氨基的水溶性量子點(diǎn)，則首先將量子點(diǎn)分散在含有體積分?jǐn)?shù)為1.25%的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，超聲使之完全分散，25°C下?lián)u床活化反應(yīng)3小時(shí)，加入單抗，在4°C下反應(yīng)M小時(shí)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗復(fù)合物；其中，量子點(diǎn) 戊二醛單抗的摩爾比為60 15 1 ；步驟二，將切片標(biāo)本先放入二甲苯中脫蠟2次，然后置入無(wú)水乙醇中梯度水化， 水洗，過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復(fù)，水洗后用BSA封閉，4°C反應(yīng)過夜， 磷酸緩沖溶液洗后加入量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟單克隆抗體復(fù)合物，避光條件下37°C反應(yīng) 30-60分鐘，磷酸緩沖溶液漂洗，甘油封片；磷酸緩沖溶液替代抗體復(fù)合物作為陰性對(duì)照， 在熒光顯微鏡下觀察樣本。步驟一中，所述硼酸鹽緩沖溶液的PH為8. 32。步驟一中，所述磷酸緩沖溶液的PH為7. 2。步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)為hP，InAs, InCaAs, InAs/ Cdse, InAs/ZnSe, InAs/InP, ZnS, CdS, HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, PbSe, HgTe, CaAs, CdS/ZnS, CdS/Pbs, ZnS/CdS, ZnS/CdS, CdSe/CdS, CdSe/Cuse, CdSe/HgTe, CdSe/ZnSe, CdSe/HgSe, CdTe, MgS, Mgse，MgTe, CaS, Case 或 CaTe 中的一種或幾種的組合。步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm-680nm。步驟二中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟單克隆抗體復(fù)合物具體為，將步驟一得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物稀釋200倍。本發(fā)明利用量子點(diǎn)的熒光特性，將其與抗體(抗原)偶聯(lián)，直接與細(xì)胞或者組織中的相關(guān)抗原(抗體)反應(yīng)并顯色，以確定細(xì)胞或者組織中的化學(xué)成分及其分布。本發(fā)明根據(jù)量子點(diǎn)半徑的不同，以細(xì)胞出現(xiàn)各種綠色、黃色、橙紅色的熒光信號(hào)的為陽(yáng)性。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明是基于標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)方法基礎(chǔ)上的， 利用納米量子點(diǎn)的熒光性能，不用傳統(tǒng)的顯色過程，而是用熒光顯微鏡直接進(jìn)行觀察判斷， 省去了染色、復(fù)染、脫水、透明等操作，更簡(jiǎn)單易行，節(jié)約時(shí)間和成本；而且熒光光穩(wěn)定性增加，與現(xiàn)有免疫組織化學(xué)顯色方法相比較，分析的準(zhǔn)確度和檢測(cè)的靈敏度有所提高。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例
檢測(cè)方法分析非洲豬瘟病毒在豬脾臟及扁桃體中是否存在，使用量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟病毒單克隆抗體，磷酸緩沖溶液(PBS)替代該單抗做陰性對(duì)照。硼酸鹽緩沖溶液的配方為十水四硼酸鈉3. 81g，加雙蒸水定容到1000ml，PH為8. 32。磷酸緩沖溶液的配方為氯化鈉8g氯化鉀0. 2g磷酸氫二鈉 1. 44g磷酸二氫鉀 0. 24g加雙蒸水至IOOOml，PH調(diào)至7. 2。步驟一，將表面帶有羧基的水溶性CdTe量子點(diǎn)分散在硼酸鹽緩沖溶液(PH = 8.32)中，加入硫化二亞胺(EDC)和非洲豬瘟病毒單克隆抗體，漩渦混合振蕩均勻，25°C反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)溶液高速離心，用磷酸緩沖溶液(PBS，0. 1M，PH= 7. 2)多次洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗復(fù)合物(QDl-antibody)；或者將表面帶有氨基的CcKeOZnS水溶性量子點(diǎn)分散在含有體積分?jǐn)?shù)為1. 25%的戊二醛濃度的磷酸緩沖溶液(PH = 7. 2)中，超聲使之完全分散，搖床活化25°C反應(yīng)3小時(shí)， 加入非洲豬瘟病毒單克隆抗體，在4°C下反應(yīng)M小時(shí)，反應(yīng)溶液離心，用磷酸緩沖溶液(PH =7. 2)多次洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗復(fù)合物(QD2-antib0dy)。步驟二，選取多種豬的脾臟和扁桃體作為樣本，以豬的肌肉組織為對(duì)照，應(yīng)用基于量子點(diǎn)的免疫組織化學(xué)的方法來(lái)定性分析檢測(cè)非洲豬瘟病毒。將取得的豬脾臟、扁桃體及肌肉組織切片標(biāo)本先放入二甲苯中脫蠟兩次；然后置于無(wú)水乙醇中梯度水化，水洗，過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復(fù)，水洗后用正常山羊非免疫血清封閉，磷酸緩沖溶液洗后加入1 300稀釋的用量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟病毒單克隆抗體(QDl-antiibody或者QD2-antiiib0dy)，在避光條件下孵育，37°C反應(yīng) 30-60分鐘；磷酸緩沖溶液漂洗3次，甘油封片，在熒光顯微鏡下直接觀察樣本，ASFV陽(yáng)性顯色為紅色熒光，定位于細(xì)胞漿，少量定位于細(xì)胞核，磷酸緩沖溶液替代量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗作為陰性對(duì)照。本實(shí)例以連接有非洲豬瘟病毒單克隆抗體的量子點(diǎn)作為免疫組織化學(xué)的優(yōu)良的熒光成像劑，可以大大加速并且提高檢測(cè)的靈敏度和分析的準(zhǔn)確度。
權(quán)利要求
1.基于量子點(diǎn)技術(shù)的一種非洲豬瘟檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)與非洲豬瘟單克隆抗體連接，(1)如果是表面帶有羧基的水溶性量子點(diǎn)，則首先將量子點(diǎn)分散在硼酸鹽緩沖溶液中， 然后加入硫化二亞胺和二抗，混合，25°C下反應(yīng)3小時(shí)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物；其中，量子點(diǎn)硫化二亞胺二抗的摩爾比為60 15 1 ；(2)如果是表面帶有氨基的水溶性量子點(diǎn)，則首先將量子點(diǎn)分散在含有體積分?jǐn)?shù)為 1. 25 %的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，超聲使之完全分散，250C下?lián)u床活化反應(yīng)3小時(shí)，加入抗體，在4°C下反應(yīng)M小時(shí)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物；其中，量子點(diǎn)戊二醛二抗的摩爾比為60 15 1 ；步驟二，將切片標(biāo)本先放入二甲苯中脫蠟2次，然后置入無(wú)水乙醇中梯度水化，水洗， 過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復(fù)，水洗后用BSA封閉，40C反應(yīng)過夜，磷酸緩沖溶液先后加入量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物，避光條件下37 V反應(yīng)30-60分鐘，磷酸緩沖溶液漂洗，甘油封片；磷酸緩沖溶液替代一抗作為陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀察樣本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，其特征是，步驟一中，所述硼酸鹽緩沖溶液的PH為8. 32。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，其特征是，步驟一中，所述磷酸緩沖溶液的PH為7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，其特征是，步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)為hP，InAs, InCaAs, InAs/Cdse, InAs/ ZnSe, InAs/InP, ZnS, CdS, HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, PbSe, HgTe, CaAs, CdS/ZnS, CdS/Pbs, ZnS/ CdS, ZnS/CdS, CdSe/CdS, CdSe/Cuse, CdSe/HgTe, CdSe/ZnSe, CdSe/HgSe, CdTe, MgS, Mgse, MgTe, CaS, Case或CaTe中的一種或幾種的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，其特征是，步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點(diǎn)，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm-680nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，其特征是，步驟二中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物具體為，將步驟一得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物稀釋200倍。
全文摘要
一種納米材料領(lǐng)域的基于量子點(diǎn)基礎(chǔ)上的免疫組化分析檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)首先將量子點(diǎn)分散在硼酸鹽緩沖溶液中，然后加入硫化二亞胺和二抗，混合，反應(yīng)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟單克隆抗體復(fù)合物；其中，量子點(diǎn)∶硫化二亞胺∶二抗摩爾比為60∶15∶1；或者(2)首先將量子點(diǎn)分散在含有體積分?jǐn)?shù)為1.25％的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，分散，反應(yīng)，加入二抗，反應(yīng)，離心，洗滌，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的非洲豬瘟單克隆抗體復(fù)合物；其中，量子點(diǎn)∶戊二醛∶二抗摩爾比為60∶15∶1；之后按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組化檢測(cè)方法進(jìn)行免疫反應(yīng)和觀察。本發(fā)明的方法用熒光顯微鏡直接進(jìn)行觀察，簡(jiǎn)單易行，熒光光穩(wěn)定性增加，分析的準(zhǔn)確度和檢測(cè)的靈敏度有所提高。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102279265SQ20101019536
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者陳文剛 申請(qǐng)人:陳文剛