專利名稱：一種羅丹明b酶聯(lián)免疫檢測方法
技術領域：
一種羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法，涉及一類色素殘留檢測方法，更具體的說是用 酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測羅丹明B的殘留。屬于酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)技術領域。
背景技術：
羅丹明B(Rhodamine B)為三苯甲烷類堿性染料，具有潛在的致癌和致突變性，我 國和歐盟等都不允許在食品中使用。它是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，在溶液中 有強烈的熒光，用作實驗室中細胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)，不容許用 作食品染色。羅丹明B具有脂溶性，會被非法用作調味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色 劑。使用了被污染的調味品制作食品時會造成殘留。調味品使用羅丹明B染色時含量較高， 甚至直接摻入，可進行現場檢測。食品中因其含量較低，需送實驗室檢測。羅丹明B殘留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)，盡管這些方法靈敏度較高， 但樣品的前處理步驟較多，相對費時且檢測費用較高，特別是不適用于大量樣品的篩選。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)提供了一種痕量羅丹明B的快速、靈敏、選擇性檢測 方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的建立了羅丹明B殘留ELISA檢測方法，為羅丹明B殘留檢測提供了 快速高效的檢測手段，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩(wěn)定性和重復性較好。檢測 限(IC90)為0. 028ng/mL、半數抑制量(IC50)為1. 3ng/mL和檢測范圍(IC20 IC80)為 0. 07 17. 5ng/mL。本發(fā)明的技術方案一種羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法，利用胥傳來，宋珊珊，林菲 (一種羅丹明B人工抗原的合成方法[P].中國專利CN200910031727. 5)合成的羅丹明B 免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗體，以羅丹明B為標準品，以羅丹明B半抗原與OVA的偶 聯(lián)物作為包被原，建立調味品中的羅丹明B的間接競爭酶聯(lián)免疫撿測方法。本發(fā)明通過以下步驟實現(1)以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋羅丹明B-0VA包被原，稀釋質量比為 1 1000 1 64000，稀釋后加入酶標板中，每孔lOOilL ;4°C孵育過夜，按照常規(guī)ELISA 方法封閉、洗滌；(2)將系列濃度梯度的羅丹明B標準品加入酶標板中，每孔50 y L ；同時加入以抗 體稀釋液稀釋為1 1000 1 4000的多克隆抗體，每孔50iiL;37°C競爭0. 5h后以含吐 溫的磷酸鹽緩沖液PBST洗滌3 5次，加入以抗體稀釋液稀釋為1 1000 1 3000的 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR-HRP)，每孔100 u L，37°C作用0. 5h后以PBST洗滌3 5次；所述PBST 溶液含 0. 05% Tween-20 的 0. 01M PBS 溶液；所述封閉液含0. 1 %明膠的pH 9.6,0. 05M碳酸鹽緩沖溶液；
所述抗體稀釋液含0. 1 %明膠的PBST溶液；(3)配置顯色液A 液配方為每 100mL 超純水中加入 0. 933g 檸檬酸，3. 68g Na2HP04 12H20,18 u L 30% H202 ；B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于lOOmL乙二醇中；使用前將A液與B液以5 1體積比混合。(4)加入顯色液100 u L，37°C顯色15min ；加入終止液2M硫酸溶液，酶標儀450nm 測吸光值(0D)；根據不同濃度羅丹明B標準液的吸光值繪制羅丹明B濃度-吸光值標準曲 線.
一入 ，(5)調味品的提取液作為樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定，酶標儀 450nm測吸光值0D，對照標準曲線測出調味品的羅丹明B濃度。調味品的提取方法為(1)以l-5ng/g水平的羅丹明B加入陰性樣品，在室溫下至少靜置15min ；(2)取辣椒粉lg，加入10mL含20%丙酮的正己烷，振搖lOmin，靜置或過濾使分離 出上層清液；殘渣加入10mL含20%丙酮的正己烷重復提取一次，合并2次提取液，混勻；(3)移取提取液于氮吹儀上吹干，用0. 01M的PBS重溶；(4)移取50 y L重溶液，作樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定。更詳細的步驟為主要溶液配制1)配制磷酸鹽0. OIM(PBS)緩沖液Na2HP04 12H203. 62gKH2P040. 2gNaCl0. 2gKC18. Og加超純水稀釋至1000mL。2)配制碳酸鹽(CBS)緩沖溶液(0. 05M)pH9. 6Na2C031. 59gNaHC032. 93g加超純水稀釋至1000mL。3)配制 PBST 溶液含 0. 05% Tween-20 的 PBS 溶液。4)配制封閉液含0. 1 %明膠的pH 9.6,0. 05M碳酸鹽緩沖溶液。5)配制抗體稀釋液含0. 1 %明膠的PBST溶液。6)顯色液A 液0.933g 檸檬酸，3.68g Na2HP04 12H20，18 y L 30 % H202 用超純水定容至 100mL。B液60mg 3，3，5，5_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于lOOmL乙二醇中。使用前將A液與B液以5 1體積比混合。7)終止液2M 的 H2S04。間接競爭ELISA實驗方法的步驟如下
4
預先將羅丹明B標準品配制成1000 u g/mL的甲醇溶液作為工作母液，在4°C保存 待用。配制 PBST 溶液(0. 01mol/L、pH7. 4、0. 15mol/L NaCl，0. 5% Tween-20)，以此為基礎 配制系列反應液，用以稀釋競爭物標準液和抗血清(多克隆抗體)。a、包被用設定濃度的包被原包被酶聯(lián)反應板，100 u L/孔，4°C過夜。b、洗滌用PBST洗滌反應板三次，每次3min，200 u L/孔，然后甩干反應板。c、封閉含 0. 明膠的 CBS,200u L/ 孔，37°C封閉 2h。d、洗滌同 b。e、競爭用PBS將羅丹明B母液稀釋成0. 25，0. 5,1,2. 5，5，10，20ng/mL系列濃度， 另設一個PBS空白對照，50 u L/孔。然后每孔加入50 y L稀釋4000倍的抗血清，于37°C溫 育 0. 5h。f、洗滌同 b。g、加酶標二抗(羊抗兔 HRP_IgG，l 3000)，1001117孔，371反應0.511。h、洗滌同 b。i、顯色加TMB配制的顯色液100 ii L/孔，顯色15min。j、終止加終止液100 ii L/孔。k、測定用酶標儀檢測0D 450nm。本發(fā)明的有益效果以羅丹明B半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立了羅丹明 B的間接ELISA方法，為羅丹明B的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于采用的是多 克隆抗體，費用較低并且穩(wěn)定性和重復性較好。檢測限(ICJ為0.028ng/mL、半數抑制量 (IC50)為 1. 3ng/mL 和檢測范圍(IC20 IC80)為 0. 07 17. 5ng/mL。


圖1羅丹明B的標準抑制曲線。
具體實施方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
一、儀器
TGL-40B臺式低速離心機上海安亭科學儀器廠
KFL0W純水機凱佛隆公司
ZD-9556水平搖床太倉科教器材廠
Costar 96孔8X 12可拆酶標板上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶標儀Thermo Labsystems 公司
可調試移液器Thermo Labsystems 公司
渦旋混合器上海滬西儀器分析
二、試齊U
辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-IgG) 康成生物工程公司
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)華美生物工程公司
其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
1、免疫原和包被原的合成用混合酸酐法合成免疫原(羅丹明B半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián))，用碳二亞 胺法偶聯(lián)合成包被原(羅丹明B半抗原與卵清蛋白OVA偶聯(lián)物)，具體步驟如下免疫原的制備A液20mg羅丹明B溶于lmL DMF中，全溶后冰浴下加10 y L三丁氨混勻后再加 10 U L氯甲酸異丁酯磁力攪拌lh ；B液40mg BSA溶于3mL pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液中，4°C保存?zhèn)溆?。冰浴下將A液逐滴加入B液中，然后置4°C下溫孵3h，即得羅丹明B完全抗原混合 液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；透析將羅丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L (每次2L，進行2次，下 同)的0. 01M的pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液和2X2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法 將透析袋中的液體制成粉末，即得到羅丹明B完全抗原；包被原制備A液10mg羅丹明B，6mg EDC (碳二亞胺)，4mg NHS (羥基琥珀酸亞胺)溶于2mL 卩85(0.0說)，磁力攪拌311。B液15mg OVA溶于3mL pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液中，4°C保存待用。將A液逐滴加入B液中，然后置4°C下溫孵3小時。即得包被原混合液。透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用。將人工包被原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0. 01M的PBS溶液和2 X 2L的去 離子水透析3天。最后使用冷凍干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到包被原羅丹明 B-0VA。2、抗血清(多克隆抗體)的制備1)實驗動物選14只2月齡、體重為1.5_2kg的健康新西蘭大白兔，雌雄各半，每 兩只為一個實驗組。2)抗原配置將免疫原用生理鹽水溶解，配成2mg/mL的溶液。3)乳化將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，直至 將一滴乳劑滴入水中，不散開漂在水面。4)免疫方法初次免疫將乳化好的試劑于兔子背部多點注射，lmL/只。初次免疫 后的免疫稱為加強免疫，加強免疫用福氏不完全佐劑乳化，加強免疫于肌肉注射，10d加強 免疫一次，劑量與初次免疫相同。5)采血4次加強免疫后從耳緣靜脈采血，采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。 待效價達到要求后，采用耳靜脈放血與心臟放血相結合獲得抗血清，收集于50mL滅菌塑料
離心管中。6)抗體的純化和保存以一定數量的DEAE52放入燒杯中，加入0. 01mol/L、pH 8.0PBS緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。用布氏漏斗(內放兩層濾紙)過濾。 以5g濕重的DEAE-纖維素加lmL血清及3mL蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。于4°C中放置lh，中間攪拌數次。用布氏漏斗抽濾，再用0. Olmol/L.pH 8. 0PBS緩沖液沖洗 纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。放于20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、ELISA 反應過程1)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標板，100 PL/孔，于4°C冰箱過 夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200 yLPBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌 液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同。2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標板，200 u L/孔，于37°C溫育箱內溫育2h后 取出烘干待用。3)將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血清， 100 u L/孔，37°C孵育lh后洗滌、拍干。4)每孔加入100 ii L，1 3000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37°C孵育lh后洗滌、拍干。5)每孔加入100 u L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應15min, 取出后每孔加入100 u L終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標儀測定吸光值A450。4、回收率及樣品提取方法的確定(1)以lng/g和5ng/g的水平加入羅丹明B樣品，在室溫下至少靜置15min。(2)取辣椒粉lg，加入10mL含20%丙酮的正己烷，振搖lOmin，靜置或過濾使分離 出上層清液，殘渣加入10mL含20%丙酮的正己烷重復提取一次，合并2次提取液，混勻。(3)移取提取液于氮吹儀上吹干，用PBS(0. 01M)重溶。(4)移取50yL樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定。(5)回收率的計算根據不同添加濃度的樣品0D值計算相應的抑制率，再根據相 應的抑制率從標準曲線上查到各自的濃度。檢測濃度與真實濃度之比為對應濃度的回收 率。試驗結果如下標準曲線本實驗所獲得的抗原檢測的線性范圍為0. 07 17. 5ng/mL，具體請見 圖1。靈敏度靈敏度是所得90%最大吸光值所對應的標準品的濃度，即IC9Q為 0. 028ng/mLo交叉反應率(CR % ):利用羅丹明B結構類似物進行交叉反應研究。
。由下表可知，此抗體特異性很好。符合多殘留ELISA方法檢測的要求。表1交叉反應率的測定 回收率測定
加標樣品回收后進行ELISA檢測，回收率分別是67 % 89 %，變異系數小于20 %。表2加標回收率的測定(n = 5)
權利要求
一種羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于利用合成的羅丹明B免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗體，以羅丹明B為標準品，以羅丹明B半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立調味品中的羅丹明B的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法；步驟如下(1)以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋羅丹明B-OVA包被原，稀釋質量比為1∶1000～1∶64000，稀釋后加入酶標板中，每孔100μL；4℃孵育過夜，封閉、洗滌；(2)將系列濃度梯度的羅丹明B標準品加入酶標板中，每孔50μL；同時加入以抗體稀釋液稀釋為1∶1000～1∶4000的多克隆抗體，每孔50μL；37℃競爭0.5h后以含吐溫的磷酸鹽緩沖液PBST洗滌3～5次，加入以抗體稀釋液稀釋為1∶1000～1∶3000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，每孔100μL，37℃作用0.5h后以PBST洗滌3～5次；所述PBST溶液含0.05％Tween-20的0.01M PBS溶液；所述封閉液含0.1％明膠的pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩沖溶液；所述抗體稀釋液含0.1％明膠的PBST溶液；(3)配置顯色液A液配方為每100mL超純水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前將A液與B液以5∶1體積比混合；(4)加入顯色液100μL，37℃顯色15min；加入終止液2M硫酸溶液，酶標儀450nm測吸光值OD；根據不同濃度羅丹明B標準液的吸光值繪制羅丹明B濃度-吸光值標準曲線；(5)調味品的提取液作為樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定，酶標儀450nm測吸光值OD，對照標準曲線測出調味品的羅丹明B濃度。
2.根據權利要求1所述的羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于調味品的提取方法為(1)以l-5ng/g水平的羅丹明B加入陰性樣品，在室溫下至少靜置15min；(2)取辣椒粉lg，加入IOmL含20%丙酮的正己烷，振搖lOmin，靜置或過濾使分離出上 層清液；殘渣加入IOmL含20%丙酮的正己烷重復提取一次，合并2次提取液，混勻；(3)移取提取液于氮吹儀上吹干，用0.OlM的PBS重溶；(4)移取50μ L重溶液，作樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定。
全文摘要
一種羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)技術領域。本發(fā)明公開了一種羅丹明B多克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，利用合成的羅丹明B免疫原免疫健康的新西蘭大白兔得到多克隆抗體，以羅丹明B為標準品，以羅丹明B半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立了羅丹明B的間接ELISA方法，為羅丹明B的殘留檢測提供了快速高效的檢測方法，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩(wěn)定性和重復性較好。檢測限(IC90)為0.028ng/mL、半數抑制量(IC50)為1.3ng/mL和檢測范圍(IC20～IC80)為0.07～17.5ng/mL。免疫反應的高特異性和親和性使ELISA檢測羅丹明B具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號G01N33/531GK101871936SQ201010196590
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權日2010年6月3日
發(fā)明者劉微波, 宋珊珊, 林菲, 胥傳來, 趙書閣, 趙媛 申請人:江南大學