專利名稱：一種蘇丹黑b用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適宜檢測(cè)微型藻類(lèi)油脂含量的技術(shù)方法，具體是屬于微藻油脂含量的快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微藻是體積微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快的單細(xì)胞藻類(lèi)，目前已知的微藻種類(lèi)達(dá)10 多萬(wàn)種，各種不同類(lèi)型的微藻具有特定的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，它們能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種生物化學(xué)反應(yīng)和代謝途徑，合成許多具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和特異功能的高價(jià)值細(xì)胞活性物， 例如肽類(lèi)物，蛋白質(zhì)，脂肪酸，多糖，天然色素，維生素等，因此，微藻被廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝品，基因工程、生物質(zhì)燃料，水產(chǎn)養(yǎng)殖，環(huán)境保護(hù)等行業(yè)領(lǐng)域，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。自20世紀(jì)70年代爆發(fā)了石油危機(jī)后，人類(lèi)開(kāi)始尋找可再生能源。在化石燃料日益枯竭、環(huán)境污染逐漸威脅人類(lèi)生存的今天，清潔的可再生能源的開(kāi)發(fā)已成為各國(guó)研發(fā)的戰(zhàn)略方向和重點(diǎn)。微藻具有生物量大、生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)控?cái)U(kuò)增培養(yǎng)微藻并采收生物量，提取微藻油脂成分，再進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，可制備出具有良好燃性和環(huán)保特性的生物燃油，因此，微藻是產(chǎn)生可再生性綠色清潔能源的良好生物質(zhì)材料。微藻細(xì)胞個(gè)體小，通常細(xì)胞壁較厚實(shí)，提取油脂成分較困難，需要采用特殊有效的翠取方法才能達(dá)到翠取高的效果。傳統(tǒng)上，生物樣品的油脂提取方法采用的是索氏提取法、 有機(jī)溶劑法、酸熱法等。雖然這些方法簡(jiǎn)便易行，但分析測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)，例如索氏提取法往往需數(shù)小時(shí)。由于微藻細(xì)胞個(gè)體小，通常細(xì)胞壁較厚實(shí)，提取油脂成分困難，通常需要采用其它形式的特殊處理方法，例如進(jìn)行細(xì)胞破壁，加壓加溫等，操作過(guò)程往往需要十幾小時(shí)才能翠取較完全。而且這些傳統(tǒng)的油脂提取方法存在一個(gè)要害問(wèn)題，即翠取過(guò)程中要耗用大量有毒害作用的有機(jī)溶劑，這不僅造成分析成本高，而且有機(jī)溶劑容易造成損害人體健康并產(chǎn)生環(huán)境污染等問(wèn)題。超臨界CO2萃取法(SCF-CO2)目前也有用于提取生物樣品的油脂，但該法亦須用到有機(jī)溶劑，而且需要具備昂貴的儀器設(shè)備才能完成樣品分析。利用微藻制備生物燃油，首先應(yīng)提取微藻的油脂成分，然后進(jìn)一步采用相關(guān)的程序，制備出目標(biāo)產(chǎn)物，因此，尋求操作快速簡(jiǎn)便、成本低、準(zhǔn)確檢測(cè)微藻油脂含量的技術(shù)方法，是開(kāi)發(fā)利用微藻油脂成分的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蘇丹黑B是一種高效價(jià)廉的染色劑，它能有效地與微藻細(xì)胞中的油脂成分結(jié)合并對(duì)某一波長(zhǎng)的光具有吸收峯值，通過(guò)建立微藻細(xì)胞蘇丹黑B染色后的吸光值與對(duì)應(yīng)的油脂含量的關(guān)系，得出相應(yīng)的線性回歸方程，則可由測(cè)出的樣品液吸光值，通過(guò)回歸方程計(jì)算獲知樣品的油脂含量，因此，蘇丹黑B非常適用于微藻油脂含量的分析檢測(cè)。采用本發(fā)明提出的蘇丹黑B染色法處理微藻樣品，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備、快速簡(jiǎn)便(僅需數(shù)十分鐘就可測(cè)定一個(gè)樣品)，就可達(dá)到檢測(cè)微藻樣品的油脂含量。 尤其是適用于較大量樣品的微藻油脂含量檢測(cè)分析，而且沒(méi)有毒害作用和造成環(huán)境環(huán)境污染等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)上面所述的背景技術(shù)，建立操作快速簡(jiǎn)便、 成本低、能準(zhǔn)確檢測(cè)微藻油脂含量的技術(shù)方法。即采用高效價(jià)廉的染色劑蘇丹黑B，對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行適宜的染色處理過(guò)程，并通過(guò)染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的關(guān)系方程式，建立適宜的染色程序和檢測(cè)方法，達(dá)到能快速、方便檢測(cè)微藻油脂含量的效果。 迄今為止，尚無(wú)采用染色劑蘇丹黑B快速分析檢測(cè)微藻油脂含量的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明采用的材料和方法微藻細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，采收藻細(xì)胞，藻液離心濃縮，稱取經(jīng)離心底部沉淀的-定重量的藻濕重，重復(fù)用蒸餾水洗滌、離心數(shù)次后，配制成不同濃度的藻溶液，藻溶液中的藻細(xì)胞再經(jīng)蘇丹黑B染色和相關(guān)的后續(xù)處理過(guò)程，得到對(duì)645nm波長(zhǎng)光有最大吸收峯的藻溶液。通過(guò)測(cè)定不同濃度藻溶液在645nm波長(zhǎng)光的吸光值以及相應(yīng)濃度藻溶液藻細(xì)胞的油脂含量值，建立染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的關(guān)系方程式，相應(yīng)濃度的藻溶液微藻細(xì)胞的油脂含量是通過(guò)采用酸熱萃取法獲得。一旦建立了染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的關(guān)系方程式后，對(duì)于任一待檢微藻樣品，只要測(cè)定其經(jīng)蘇丹黑B染色后的645nm波長(zhǎng)光的吸光值，代入關(guān)系方程式，就可方便地獲知微藻樣品的油脂含量。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方法具體為蘇丹黑B染色液配制稱取0. 3-0. 5g蘇丹黑B粉末，溶于100-200ml 70%乙醇， 室溫下放置4-6d，期間經(jīng)常搖動(dòng)，讓其充分溶解后過(guò)濾，4°C保存?zhèn)溆?。微藻?xì)胞去除鹽分微藻細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，采收藻細(xì)胞，藻液離心濃縮，重復(fù)用蒸餾水洗滌、離心數(shù)次，以便去除微藻細(xì)胞的鹽分。建立染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的關(guān)系方程式稱取 0. 5-1. Og經(jīng)脫鹽分的濕藻樣，加入50-100ml蒸餾水，充分混合均勻，然后稀釋成5個(gè)藻濃度(1/2，1/3，1/4，1/5，1/10)。每個(gè)濃度分別取2支試管，各加入5-lOmL藻液和5-lOml Imol的HC1，充分混合后，一管加入0. 4-0. 8ml的蘇丹黑B染色液，另一管加入0. 4-0. 8ml 70%乙醇(對(duì)照管)，充分混勻，沸水浴煮2-lOmin(不時(shí)搖動(dòng)，使加熱均勻)，冷卻后 8000-12, OOOrpm離心5_10min，取沉淀，50%乙醇洗滌2_4次后，用5_10ml 70%乙醇混勻微藻細(xì)胞，在645nm波長(zhǎng)光測(cè)定其吸光值，通過(guò)測(cè)得的吸光值及所對(duì)應(yīng)的微藻細(xì)胞油脂含量(毫克/克藻濕重)，獲得染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的回歸關(guān)系方程式。為獲得回歸關(guān)系方程式時(shí)，染色后微藻細(xì)胞的吸光值所對(duì)應(yīng)的微藻細(xì)胞油脂含量的確定是通過(guò)采用酸熱萃取法，即稱取一定量的相應(yīng)微藻細(xì)胞濕重，按每克濕藻體加入10-20mL 4mol鹽酸的比例混和均勻，室溫下靜置處理20-30小時(shí)，然后沸水浴處理20-40min，冷卻后加入等體積的氯仿、甲醇，混勻搖動(dòng)、充分萃取，離心后取上層液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上揮發(fā)除去溶劑后得到微藻油脂，稱取微藻油脂重量。一旦建立了染色后微藻細(xì)胞的吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的回歸關(guān)系方程式后， 對(duì)于任一待檢微藻樣品，只要測(cè)定其經(jīng)蘇丹黑B染色后的645nm波長(zhǎng)光的吸光值，代入關(guān)系方程式，就可方便地獲知微藻樣品的油脂含量。采用本發(fā)明的技術(shù)方法得到的結(jié)果如下表一、微藻細(xì)胞染色后藻液吸光值A(chǔ)645、微藻細(xì)胞油脂含量及相關(guān)回歸分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是建立適宜的染色程序和檢測(cè)方法，達(dá)到能快速、方便檢測(cè)微藻油脂含量的效果。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的微藻細(xì)胞染色劑為蘇丹黑B。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的被染色的微藻可以是微綠球藻、小球藻、扁藻、鹽藻、金藻、角毛藻、褐指藻等微藻，或由各種微藻組成的混合物。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的蘇丹黑B染色液配制方法為稱取0. 3-0. 5g蘇丹黑B粉末，溶于100-200ml 70 %乙醇，室溫下放置4-6d，期間經(jīng)常搖動(dòng)，讓其充分溶解后過(guò)濾，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的微藻細(xì)胞染色程序?yàn)殡x心收集培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞，用蒸餾水洗滌2-3次，依次再離心，去除鹽分和其它成分。稱取0. 5-1. Og重的濕藻樣，加入50-100ml蒸餾水，混合均勻。 取所得到的藻液5-10mL，加入5-10ml Imol濃度的HCl，充分混合均勻后，加入0. 4-0. 8ml 的蘇丹黑B染色液，再充分混合均勻。然后沸水浴煮2-lOmin(不時(shí)搖動(dòng)，使加熱均勻)，冷卻后8000-12，OOOrpm離心5-lOmin，收集底部微藻細(xì)胞，經(jīng)50%乙醇洗滌2_4次后，收集底部微藻細(xì)胞加入5-10ml 70%乙醇，混合均勻后即為可用于測(cè)定吸光值的經(jīng)蘇丹黑B染色后的微藻細(xì)胞溶液。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的經(jīng)蘇丹黑B染色后的微藻細(xì)胞溶液吸光值的測(cè)定波長(zhǎng)為580-700nm。
7.按照權(quán)利要求1所述的一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，其特征是所述的微藻樣品油脂含量的獲知，是通過(guò)測(cè)定經(jīng)蘇丹黑B染色后的微藻細(xì)胞吸光值，并通過(guò)所建立的吸光值與微藻細(xì)胞油脂含量的相關(guān)回歸方程式計(jì)算得出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘇丹黑B用于快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法，屬于微藻油脂含量的快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。采用染色效果好、成本低的蘇丹黑B，通過(guò)建立適宜的染色程序和檢測(cè)方法，達(dá)到能快速、方便檢測(cè)微藻油脂含量的效果。具體實(shí)施過(guò)程為用蘇丹黑B染色微藻細(xì)胞，確定出染色后的微藻細(xì)胞最大光吸收波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下微藻細(xì)胞油脂含量與吸光值呈線性關(guān)系。通過(guò)建立染色后吸光值和微藻細(xì)胞油脂含量的關(guān)系方程式，對(duì)于待檢測(cè)的微藻樣品，先測(cè)定染色后的微藻細(xì)胞在645nm波長(zhǎng)的吸光值，然后通過(guò)相關(guān)方程式的計(jì)算，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出微藻樣品的油脂含量。本發(fā)明的方法具有快速準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便易行、成本低的優(yōu)點(diǎn)，是值得采用的檢測(cè)微藻油脂含量的好方法。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102297842SQ20101020917
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者林汝榕, 林錫煌, 柯秀蓉, 蔡文旋, 邢炳鵬 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所