專利名稱：一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油菜檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè) 方法。
背景技術(shù)：
油菜是我國(guó)主要的油料作物和蜜源作物之一，油菜的種植面積占全國(guó)油料作物總 面積的40%以上，產(chǎn)量占全國(guó)食用植物油總產(chǎn)量的60%以上，居世界首位。油菜不同時(shí)期 的生長(zhǎng)狀況影響到油菜籽的產(chǎn)量和質(zhì)量。油菜葉片中的乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase, ALS)的活力是油菜生長(zhǎng)過程中一項(xiàng)非常重要的生理指標(biāo)。ALS能夠反映油菜葉 片的生長(zhǎng)狀況，因此可以通過檢測(cè)油菜葉片中的ALS，得到油菜的生長(zhǎng)狀況。近年來，由于農(nóng) 村勞動(dòng)力的減少，油菜種植中使用了大量的除草劑。有些除草劑是一種ALS抑制劑，例如丙 酯草醚，可以阻止直鏈氨基酸的生物合成，具有對(duì)油菜安全、殺草譜較廣、除草活性高、持效 期長(zhǎng)，且低毒、低殘留，與環(huán)境相容等特點(diǎn)。對(duì)油菜葉片中ALS活力的檢測(cè)，可以反映出某些 除草劑對(duì)油菜生長(zhǎng)狀況的影響，對(duì)實(shí)現(xiàn)油菜生長(zhǎng)狀況的大田檢測(cè)和連續(xù)監(jiān)測(cè)，提高油菜籽 的產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義。傳統(tǒng)的乙酰乳酸合成酶(ALS)檢測(cè)方法，需將油菜葉片離體采回，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行破壞性的試驗(yàn)。剪取油菜葉片，稱量，剪碎，加人液氮速凍樣品，研磨成粉末狀。再按 1 2(mL)比例加入提取緩沖液，充分研磨后，浸提過濾出粗酶液，待用。整個(gè)提取過程 在-4°C的低溫冰浴條件下進(jìn)行。1. OmL酶促反應(yīng)緩沖液中加入ALS粗酶液0. 5mL，立即置于 37°C恒溫水槽中啟動(dòng)反應(yīng)，水浴Ih后加入0. ImL的3mol/L濃硫酸溶液終止反應(yīng)(空白對(duì) 照試管在反應(yīng)前加濃硫酸)；將待測(cè)液置于60°C的恒溫水浴槽中脫羧反應(yīng)15min ；再順次加 人0.5%肌酸和5% α-萘酚的10% NaOH溶液各l.OmL，置于60°C的恒溫水浴槽中顯色反 應(yīng)15min。取出后，冷卻至室溫，5000g離心IOmin ；上清液用紫外分光光度儀在530nm波長(zhǎng) 下測(cè)定其吸光度，得到ALS活力，單位用(0D53CI/g Fff/h)表示。該方法測(cè)量過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、 化學(xué)消耗品昂貴，且對(duì)環(huán)境造成一定污染。因此，急需研究一種簡(jiǎn)單、快速、無損的ALS檢測(cè) 方法和技術(shù)?？梢?近紅外光譜可以反映物質(zhì)內(nèi)部的有機(jī)成分，特別是C-H、0-H、N-H等基團(tuán)的 倍頻和合頻吸收，可用于定量測(cè)定物質(zhì)有機(jī)物質(zhì)的含量。光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食 品、石油化工、制藥、飼料等行業(yè)。在植物生命信息快速檢測(cè)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，解決了現(xiàn)有檢測(cè) 方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、操作復(fù)雜、成本高、污染環(huán)境等問題。一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；(2)分別采集波長(zhǎng) 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm 和 2052nm 光波所對(duì)應(yīng)的葉片粉末
的反射率；(3)將各反射率分別代入多元線性回歸方程y = 10100λ1+10890λ 2+11830 λ3-6870 λ 4-8123 λ 5-6991 λ 6-9756 λ 7-4364 λ 8+1123 λ 9-360· 601 λ 1(ι+4608 λ η-5178 λ 12+2310 λ 13-2548 λ 14+3639 λ 15+99. 385，計(jì)算得到油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力；方程中y為油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力；A1 λ15分別為波長(zhǎng)2366nm、 1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、 1400nm、2106nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣本的反射率。步驟(1)中，葉片粉末為40 80目，殺青溫度為95 115°C，殺青時(shí)間為20 40min。該殺青溫度和殺青時(shí)間較為適宜，有利于油菜葉片中主成分的保留，特別是乙酰乳 酸合成酶。步驟(1)中，烘干溫度為70 90°C，將葉片烘干至恒重，該烘干溫度適宜，不會(huì) 烤焦葉片。因?yàn)橛筒巳~片粉末樣本是非透明介質(zhì)，當(dāng)光波照射在其表面時(shí)，除部分被吸收外， 其余均發(fā)生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟油菜葉片內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)含量是相 關(guān)的，而針對(duì)乙酰乳酸合成酶這類具體物質(zhì)的活力僅僅跟少數(shù)某些特征波長(zhǎng)光波的反射率 相關(guān)。應(yīng)用連續(xù)投影算法在1100 2500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行特征波長(zhǎng)的選取，得到這些 特征波長(zhǎng)分別為 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、 1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm。將上述波長(zhǎng)的反射率值作為多元線性
回歸模型的輸入變量，乙酰乳酸合成酶活力作為輸出變量，計(jì)算得到上述多元線性回歸方程。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長(zhǎng)進(jìn)行多元線性回歸分析，快速準(zhǔn)確檢測(cè)油菜葉片中乙酰 乳酸合成酶活力，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本。


圖1為本發(fā)明建模集樣本預(yù)測(cè)結(jié)果散點(diǎn)分布圖；圖2為本發(fā)明預(yù)測(cè)集樣本預(yù)測(cè)結(jié)果散點(diǎn)分布圖。
具體實(shí)施例方式隨機(jī)收集248片油菜葉片，為使所采集的油菜葉片樣本更具有代表性和多樣性， 所采集的248片葉片中不僅包括正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的油菜葉片(共62片)，還包括噴施過不 同濃度(100，500，1000mg/L)丙酯草醚除草劑的油菜葉片186片(100，500，1000mg/L每個(gè) 濃度梯度采集油菜葉片62片)，噴灑時(shí)間為五葉一心期，噴灑方式為葉面噴施。丙酯草醚除 草劑是一種ALS抑制劑，對(duì)油菜葉片ALS具有抑制作用，可以使油菜葉片中的ALS含量具有 更大的范圍，使得所建模型具有更好的適應(yīng)性和魯棒性。將248片油菜葉片放在105°C的烘箱中殺青30分鐘后于80°C下烘干至恒重。再 用研缽將烘干后的油菜葉片樣品磨成粉末，并過60目篩。在室溫下測(cè)定油菜葉片粉末樣本 在波長(zhǎng) 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、 1190nm、1346nm、1400nm、2106nm 和 2052nm 處的反射率值(Foss NIR Systems 5000)，然后隨機(jī)選擇186個(gè)油菜葉片樣本作為建模集樣本，其余62個(gè)作為預(yù)測(cè)集樣本，利用背景技術(shù) 所提及的傳統(tǒng)方法測(cè)量上述248片油菜葉的乙酰乳酸合成酶活力。以建模集樣本186片油 菜葉片的各特征波長(zhǎng)反射率值作為輸入變量，以相應(yīng)的乙酰乳酸合成酶活力測(cè)量值作為輸 出變量，利用多元線性回歸法(Multiple linear regression,MLR)得到如下多元線性回歸 方程y = 10100 λ !+10890 λ 2+11830 λ 3_6870 λ 4_8123 λ 5_6991 λ 6_9756 λ 廠4364 λ 8+11 23 λ 9-360· 601 λ 1(ι+4608 λ η-5178 λ 12+2310 λ 13-2548 λ 14+3639 λ 15+99. 385，計(jì)算得到油菜 葉片乙酰乳酸合成酶活力。方程中y為油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力，單位為0D53Q/g Fff/h ； λ i λ 15分別 為波長(zhǎng) 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、 1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣本的反射率。然后利用上述多元線性回歸方程對(duì)建模集和預(yù)測(cè)集油菜葉片樣本的乙酰乳酸合 成酶活力進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)中相關(guān)系數(shù)和斜率越接近于1，均方 根誤差、偏差的絕對(duì)值和截距的絕對(duì)值越小，說明預(yù)測(cè)值越接近于測(cè)量值，模型預(yù)測(cè)性能越 好，預(yù)測(cè)值評(píng)價(jià)結(jié)果如下表所示 對(duì)建模集和預(yù)測(cè)集進(jìn)行預(yù)測(cè)，油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力的預(yù)測(cè)值與真實(shí)化學(xué) 方法測(cè)量值之間的相關(guān)系數(shù)均大于0. 92，獲得了滿意的預(yù)測(cè)精度。建模集和預(yù)測(cè)集樣本預(yù) 測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)分布圖如圖1和圖2所示，圖中樣本靠近分布于回歸直線兩側(cè)，具有很好的線 性預(yù)測(cè)效果。上述結(jié)果說明應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)油菜葉片乙酰乳酸合成 酶活力的檢測(cè)。
權(quán)利要求
一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；(2)分別采集波長(zhǎng)2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的葉片粉末的反射率；(3)將各反射率分別代入多元線性回歸方程y＝10100λ1+10890λ2+11830λ3 6870λ4 8123λ5 6991λ6 9756λ7 4364λ8+1123λ9 360.601λ10+4608λ11 5178λ12+2310λ13 2548λ14+3639λ15+99.385，計(jì)算得到油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力；方程中y為油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力；λ1～λ15分別為波長(zhǎng)2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣本的反射率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，其特征在于 所述的葉片粉末為40 80目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟(1)中，殺青溫度為95 115°C，殺青時(shí)間為20 40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟(1)中，烘干溫度為70 90°C。全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力快速檢測(cè)方法，包括以下步驟將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；分別采集波長(zhǎng)2366、1494、1776、1730、2292、1424、1528、2432、2266、1676、1190、1346、1400、2106和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的葉片粉末的反射率；將各反射率分別代入多元線性回歸方程，計(jì)算得到油菜葉片乙酰乳酸合成酶活力。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長(zhǎng)進(jìn)行多元線性回歸分析，快速準(zhǔn)確檢測(cè)油菜葉片中乙酰乳酸合成酶活力，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本。
文檔編號(hào)G01N21/49GK101900676SQ20101021899
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者何勇, 劉飛, 孔汶汶 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)