專(zhuān)利名稱(chēng)：肝蘇糖漿的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明涉及一種肝蘇糖漿的質(zhì)量檢測(cè)方法，屬于對(duì)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝蘇糖漿原標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，藥品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)是 YBZ06542009，是以中藥材扯根菜為主要原料制成的中藥糖漿劑，具有降酶，保肝，退黃，健 脾的作用。臨床用于慢性活動(dòng)性肝炎、乙型肝炎，也可用于急性病毒性肝炎等的治療。具有 降酶退黃快、滴度下降快、體征癥狀改善快、食欲增進(jìn)快、精神復(fù)常快的特點(diǎn)。經(jīng)研究證明， 扯根菜的主要成份為沒(méi)食子酸、槲皮素等，其中沒(méi)食子酸為已知具有抗乙肝病毒和保肝作 用的有效成分，在對(duì)肝蘇糖漿的分析中也發(fā)現(xiàn)肝蘇糖漿中的主要成份是沒(méi)食子酸、槲皮素 等。原標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)簡(jiǎn)單易測(cè)定的槲皮素進(jìn)行了含量控制，而且對(duì)槲皮素的含量控制也是進(jìn)行 水解后測(cè)定槲皮素的含量，其中測(cè)得的僅是多種化合物的一個(gè)總的水解產(chǎn)物的量，而且槲 皮素等存在于多種植物中，所以?xún)H籠統(tǒng)地測(cè)定一個(gè)槲皮素不能全面反映肝蘇糖漿的有效成 份的量，更不能很好地控制肝蘇糖漿的質(zhì)量。由于以中藥材扯根菜為主要原料制成的中成 藥肝蘇糖漿等用于慢性活動(dòng)性肝炎、乙型肝炎、急性病毒性肝炎等的治療取得的很好的療 效，現(xiàn)在扯根菜藥材十分緊缺，不法廠商就可能以其它水解后主要成份為槲皮素的植物提 取物替代扯根菜而投料生產(chǎn)偽劣肝蘇糖漿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是針對(duì)原有技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中只籠統(tǒng)地測(cè)定一個(gè)槲皮素不能全面反映肝 蘇糖漿的有效成份的量，更不能很好地控制肝蘇糖漿的質(zhì)量的問(wèn)題，對(duì)其質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)行了 研究，提供一種肝蘇糖漿的質(zhì)量檢測(cè)方法，增加了高效液相色譜法測(cè)定肝蘇糖漿中沒(méi)食子 酸的含量，對(duì)制劑中主要成份進(jìn)行鑒別和測(cè)定，不僅能更好更全面地反映肝蘇糖漿的有效 成份的量，而且能有效地控制以其它水解后主要成份為槲皮素的植物提取物替代扯根菜而 投料生產(chǎn)的偽劣肝蘇糖漿的產(chǎn)生，從而保證了該藥品的質(zhì)量，使群眾用藥安全有效。本發(fā)明肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，主要包括鑒別、檢查、含量測(cè)定項(xiàng)目；其中，鑒別包括 對(duì)糖漿中槲皮素的鑒別、黃酮類(lèi)化合物的鑒別；含量測(cè)定包括對(duì)糖漿中槲皮素的含量測(cè)定、 沒(méi)食子酸的含量測(cè)定。沒(méi)食子酸的含量測(cè)定是以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，以甲醇和0. 磷酸及0. 三乙 胺水溶液的混合物為流動(dòng)相，甲醇-0. 磷酸0.1%三乙胺水溶液=10 90，用高效液 相色譜法測(cè)定。槲皮素的鑒別是以槲皮素為對(duì)照品，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物為展開(kāi) 齊U，甲苯乙酸乙酯甲酸=5 4 1，用薄層色譜法鑒別。槲皮素的含量測(cè)定是以槲皮素為對(duì)照品，以甲醇和0. 2%磷酸溶液的混合物為流動(dòng)相，甲醇0. 2%磷 酸溶液=45 55，用高效液相色譜法測(cè)定。
槲皮素的鑒別具體步驟是取本品(肝蘇糖漿)，加鹽酸甲醇溶液，置水浴中加熱回流，趁熱濾過(guò)，濾液蒸干， 殘?jiān)右宜嵋阴ナ谷芙猓盟礈靸纱?，棄去水液，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷?解，作為供試品溶液。另取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液， 分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物為展開(kāi)劑，甲苯乙酸乙 酯甲酸=5 4 1，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，揮干，置日光下檢視。 供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黃酮類(lèi)化合物的鑒別是取本品，以乙醇溶液為提取劑，以三氯化鋁溶液為鑒別劑 的鑒別方法；或取本品，以乙醇溶液為提取劑，以醋酸鉛試液為鑒別劑的鑒別方法。黃酮類(lèi)化合物的鑒別具體步驟是取本品，加乙醇，振搖提取，濾過(guò)，濾液加水，搖勻，取上述溶液置于試管中，加三氯 化鋁溶液，即顯黃色，再取溶液，點(diǎn)于濾紙上，置紫外光365nm下觀察，顯黃色或綠色熒光； 或取本品，加乙醇，振搖提取，濾過(guò)，濾液加水，搖勻，取上述溶液置于試管中，加醋酸 鉛試液，振搖，放置，生成黃棕色沉淀。槲皮素的含量測(cè)定具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0.2%磷酸溶液的混合液為流動(dòng) 相，甲醇0.2%磷酸溶液=45 55;檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低 于1800 ；精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥的槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制 成溶液，即得對(duì)照品溶液；再取本品(肝蘇糖漿)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加鹽酸甲醇 溶液，置水浴中加熱回流，趁熱濾過(guò)，濾液置量瓶中，用甲醇分次洗滌殘?jiān)?，洗液并入同一?瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液 與供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得本品中槲皮素含量。沒(méi)食子酸的含量測(cè)定具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 磷酸及0. 三乙胺水溶液 的混合物為流動(dòng)相，甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水溶液=10 90 ；檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm， 理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1800 ；取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸 對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品，精密加入水，稱(chēng)定重量，超 聲處理，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液， 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得本品中沒(méi)食子酸 的含量。更具體的檢測(cè)方法包括以下項(xiàng)目槲皮素的理化鑒別進(jìn)一步的步驟是取本品5g，加2. 3%鹽酸甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱濾 過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?0ml使溶解，用水洗滌兩次，每次20ml，棄去水液，合并乙 酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液；另取槲皮素對(duì)照品適量，加甲 醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同 一硅膠G薄層板上，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液為展開(kāi)劑，甲苯乙酸乙酯甲酸=5:4: 1，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，揮干，置日光下檢視，供試品色譜 中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；黃酮類(lèi)化合物的鑒別進(jìn)一步的步驟是取本品lg，加乙醇5ml，振搖提取，濾過(guò)，濾液加水5ml，搖勻，取上述溶液置于試管 中，加1 %三氯化鋁溶液5滴，即顯黃色，再取溶液2滴，點(diǎn)于濾紙上，置紫外光365nm下觀 察，顯黃色或綠色熒光；或取本品lg，加乙醇5ml，振搖提取，濾過(guò)，濾液加水5ml，搖勻，取上述溶液置于試管 中，加醋酸鉛試液4滴，振搖，放置，生成黃棕色沉淀；槲皮素的含量測(cè)定進(jìn)一步的步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0.2%磷酸溶液的混合液為流動(dòng) 相，甲醇0.2%磷酸溶液=45 55，檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低 于1800 ；精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時(shí)的槲皮素對(duì)照品適量，加50%甲 醇溶解并制成每Iml含5ug的溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品約lg，精密稱(chēng)定，置250ml具 塞錐形瓶中，加2. 3%鹽酸甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱濾過(guò)，濾液置 IOOml量瓶中，用甲醇分次洗滌殘?jiān)匆翰⑷胪涣科恐?，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取 續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜 儀，測(cè)定，即得本品種槲皮素含量；沒(méi)食子酸的含量測(cè)定進(jìn)一步的步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 磷酸及0. 三乙胺水溶液 為流動(dòng)相，甲醇0. 磷酸0. 三乙胺水溶液=10 90，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm，理論板數(shù) 按沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1800 ；取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品適 量，精密稱(chēng)定，加水制成每Iml含28 μ g的溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品約0. 4g，精密加入 50ml水，稱(chēng)定重量，超聲處理20min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)， 取續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入高效液 相色譜儀，測(cè)定，即得本品中沒(méi)食子酸的含量，本品每Ig含扯根菜以沒(méi)食子酸計(jì)，不得少于 3. 5mg0本發(fā)明的技術(shù)效果由于增加了高效液相色譜法測(cè)定肝蘇糖漿中沒(méi)食子酸的含量，通過(guò)以上幾個(gè)鑒別 以及含量測(cè)定，有了明確的質(zhì)量指標(biāo)以及各質(zhì)量指標(biāo)的鑒別和測(cè)定方法，這些方法科學(xué)合 理、切實(shí)可行。本發(fā)明使肝蘇糖漿中槲皮素、黃酮類(lèi)化合物、沒(méi)食子酸都得到了有效的質(zhì)量 控制，這不僅能更好更全面地反映肝蘇糖漿的質(zhì)量，而且有效地控制不法廠商生產(chǎn)偽劣肝 蘇糖漿，從而保證群眾用藥安全有效。
具體實(shí)施例方式制法取扯根菜1667g，切碎，加10倍量水煎煮三次，每次2小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)， 濾液濃縮成相對(duì)密度為1. 15 1. 18(60 65°C )的清膏，冷卻，加乙醇使含醇量達(dá)60%， 攪拌，靜置，濾過(guò)，沉淀用4倍沉淀量的60%乙醇洗滌三次，合并洗液與濾液，回收乙醇并濃 縮成相對(duì)密度為1. 10 1. 15的清膏，加入500g蔗糖，煮沸至完全溶解，加水至1000ml，攪 勻，靜置，濾過(guò)，灌封，即得。
性狀本品為棕褐色至深棕色的粘稠液體；味甜。鑒別(1)取本品lg，加乙醇5ml，振搖提取，濾過(guò)，濾液加水5ml，搖勻，取上述溶液各Iml 分置二支試管中，一管中加1 %三氯化鋁溶液5滴，即顯黃色，再取溶液2滴，點(diǎn)于濾紙上，置 紫外光(365nm)下觀察，顯黃色或綠色熒光；另一管中加醋酸鉛試液4滴，振搖，放置，生成 黃棕色沉淀.(2)取本品5g，加2. 3%鹽酸甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱 濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?0ml使溶解，用水洗滌兩次，每次20ml，棄去水液，合并乙 酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇 制成每Iml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附 錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙 酯-甲酸(5 4 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，揮干，置日 光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。檢查相對(duì)密度應(yīng)為1.22 1. 27 (中國(guó)藥典2005年版一部附錄VIIA)。ρΗ值應(yīng)為3. 5 5. 5 (中國(guó)藥典2005年版一部附錄VIIG)。其他應(yīng)符合糖漿劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(中國(guó)藥典2005年版一部附錄IH)。含量測(cè)定槲皮素照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VID)測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2% 磷酸溶液(45 55)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于 1800。對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時(shí)的槲皮素對(duì) 照品適量，加50%甲醇溶解并制成每Iml含5ug的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品約lg，精密稱(chēng)定，置250ml具塞錐形瓶中，加2. 3%鹽酸 甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱濾過(guò)，濾液置IOOml量瓶中，用甲醇分 次洗滌殘?jiān)匆翰⑷胪涣科恐?，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定， 即得。本品每Ig含扯根菜以槲皮素(C15HltlO7)計(jì)，不得少于0. 23mg。沒(méi)食子酸照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VID)測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水溶液(10 90)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰 計(jì)算應(yīng)不低于1800。對(duì)照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密 稱(chēng)定，加水制成每Iml含28 μ g的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品約0. 4g，精密加入50ml水，稱(chēng)定重量，超聲處理20min， 放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μ 1，注入高效液相色譜儀，測(cè) 定，即得。本品每Ig含扯根菜以沒(méi)食子酸(C7H6O5)計(jì)，不得少于3. 5mg。
功能與主治降酶，保肝，退黃，健脾。用于慢性活動(dòng)性肝炎、乙型肝炎，也可用于 急性病毒性肝炎。用法與用量口服，一次10ml，一日3次，小兒酌減。規(guī)格每瓶裝100ml。貯藏密封。為了驗(yàn)證用高效液相色譜法測(cè)定肝蘇糖漿中沒(méi)食子酸含量的方法是否可行，本申 請(qǐng)人進(jìn)行了如下研究具體實(shí)驗(yàn)資料如下方法高效液相色譜法；色譜柱Dikma Kromasil C18 柱(250mmX 4. 6mm, 5 μ m)；流動(dòng)相甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水溶液(10 90)；檢測(cè)波長(zhǎng)27Inm ；柱溫30°C;流速0· 8ml/min ；結(jié)果沒(méi)食子酸在0. 07 0. 56 μ g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r = 0. 9999)，平 均回收率為95. 23%, RSD為1. 08% ；結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可用于肝蘇糖漿的含量測(cè)定。肝蘇糖漿原標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，藥品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)是 YBZ06542009，是以中藥材扯根菜為主要原料制成的中藥糖漿劑，具有降酶，保肝，退黃，健 脾的作用。臨床用于慢性活動(dòng)性肝炎、乙型肝炎，也可用于急性病毒性肝炎等的治療。具有 降酶退黃快、滴度下降快、體征癥狀改善快、食欲增進(jìn)快、精神復(fù)?？斓奶攸c(diǎn)。經(jīng)研究證明， 扯根菜的主要成份為沒(méi)食子酸、槲皮素等，其中沒(méi)食子酸為已知具有抗乙肝病毒和保肝作 用的有效成分，在對(duì)肝蘇糖漿的分析中也發(fā)現(xiàn)肝蘇糖漿中的主要成份是沒(méi)食子酸、槲皮素 等。申請(qǐng)人建立一個(gè)高效液相色譜法測(cè)定其中的沒(méi)食子酸含量的方法，不僅能更好更全面 地反映肝蘇糖漿的有效成份的量，而且能有效地控制以其它水解后主要成份為槲皮素的植 物提取物替代扯根菜而投料生產(chǎn)的偽劣肝蘇糖漿的產(chǎn)生，從而保證群眾用藥安全有效。1儀器與試藥戴安高效液相色譜儀(P680A LPG四元低壓梯度泵，PDA-100 二極管陣列檢測(cè)器， TCC-100柱溫箱，Chromeleon色譜工作站)。CQX25-06超聲波清洗器(上海必能信超聲有限 公司，功率250W，頻率25kHZ)。甲醇為色譜純?cè)噭?，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。沒(méi) 食子酸對(duì)照品為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，肝蘇糖漿為四川逢春制藥有限公司生產(chǎn)。2方法與結(jié)果2. 1 色譜條件色譜柱Dikma KromasilC18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)；流動(dòng)相甲 醇-0. 磷酸及0. 三乙胺水溶液(10 90)；檢測(cè)波長(zhǎng)271nm;流速0.8ml/min ；柱 溫:30°C ；進(jìn)樣量:10μ 1。2. 2溶液的制備2. 2. 1對(duì)照品溶液取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密 稱(chēng)定，加水制成每Iml含28 μ g的溶液，即得。2. 2. 2供試品溶液取本品0. 3g，精密加入50ml水，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，放 冷，再稱(chēng)定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
2. 3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入高效 液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果沒(méi)食子酸的保留時(shí)間約為8. 4min，沒(méi)食子酸峰與其前后色譜 峰的分離度均大于1. 5，拖尾因子為0. 97，理論塔板數(shù)以沒(méi)食子酸峰計(jì)為12740。2. 4線性關(guān)系考察精分別精密吸取“2. 2. 1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2. 5,5,7. 5，10，15， 20 μ 1，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積值A(chǔ)對(duì)進(jìn)樣量C ( μ g)進(jìn)行 回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A = 58. 8878C-0. 2877，r = 0. 9999，結(jié)果表明沒(méi)食子酸進(jìn)樣量在 0. 07 0. 56 μ g范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。2. 5精密度試驗(yàn)精密吸取“2. 2. 1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μ 1，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得沒(méi) 食子酸峰面積RSD為0. 35% (η = 6)，表明儀器精密度良好。2. 6穩(wěn)定性試驗(yàn)取本品的供試品溶液，分別于制備后0，4，8，12，24，48h進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸峰面積RSD為1. 38%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。2. 7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，照“2. 2. 2”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶 液，分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸平均含量為0. 2876%, RSD為0. 77%。2.8回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量(0.2876% )的本品9份，每份0. 25g，分成3 組，每組3份，分別精密添加沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(0. 2206mg/ml)2，3，4ml，照“2. 2. 2”項(xiàng)下 方法制備供試品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)下表。肝蘇糖漿中沒(méi)食子酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(η = 9)
樣品含量 (mg)加入量 (mg)測(cè)得量 (mg)丨回收率(％)(%)RSD (%)0.64310. 44121.062795.10I 0.66490.44121.091496. 660.68420. 44121.102094. 690.67240. 66181. 292093.630.70030.66181. 327094. 6995. 231.08 0.72450.66181.361596. 260.71500.88241.560795.84； 0. 73510. 88241. 565694. 12；0.75010.8824 i1. 597596. 03試驗(yàn)結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。2. 9樣品含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μ 1，按“2. 2. 1”項(xiàng) 下色譜條件測(cè)定，記錄沒(méi)食子酸的峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算沒(méi)食子酸的含量。每Ig含扯根 菜以沒(méi)食子酸(C7H6O5)計(jì)，為3. 9mg。3 討論3. 1試驗(yàn)中針對(duì)配制供試品溶液的不同提取方法(超聲、回流及索氏提取)，不同 提取溶劑(甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水和流動(dòng)相)，不同濃度的酸水解(1%鹽 酸、5%鹽酸、10%鹽酸)，不同溶劑體積a0、25、50、75、100ml)及不同提取時(shí)間(15、30、45、 60min)分別考察。結(jié)果以50ml水不水解直接超聲提取45min含量最高，雜質(zhì)峰較少。3. 2采用二極管陣列檢測(cè)器在190 380nm范圍內(nèi)分別掃描對(duì)照品、樣品溶液 中沒(méi)食子酸峰的紫外吸收，對(duì)照品和樣品中的沒(méi)食子酸分別在215. 3、215. 4nm和271. 1、
9271. 2nm有最大吸收，由于215nm處干擾較大，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇271nm。
3. 3在流動(dòng)相選擇試驗(yàn)中，考察了甲醇-0. 磷酸溶液(5 95)；甲醇-0. 冰 醋酸溶液(15 85)；乙腈-0. 磷酸溶液(1 99)；甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水 溶液(10 90)等的不同比例、pH值、流速及柱溫。發(fā)現(xiàn)其它的分離效果均不理想，經(jīng)摸索 篩選采用本實(shí)驗(yàn)所用色譜條件為較好，樣品中沒(méi)食子酸與其他組分色譜峰得到較好分離。
權(quán)利要求
一種肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，包括性狀、鑒別、檢查、含量測(cè)定項(xiàng)目；其中，鑒別包括槲皮素的鑒別，黃酮類(lèi)化合物的鑒別；含量測(cè)定包括槲皮素的含量測(cè)定，其特征在于含量測(cè)定還包括沒(méi)食子酸的含量測(cè)定；所述沒(méi)食子酸的含量測(cè)定是以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，以甲醇和0.1％磷酸及0.1％三乙胺水溶液的混合物為流動(dòng)相，甲醇 0.1％磷酸∶0.1％三乙胺水溶液＝10∶90，用高效液相色譜法測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于所述沒(méi)食子酸的含量測(cè)定具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 磷酸及0. 三乙胺水溶液的混 合物為流動(dòng)相，甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水溶液=10 90 ；檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm，理論 板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1800 ；取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照 品適量，精密稱(chēng)定，加水制成溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品，精密加入水，稱(chēng)定重量，超聲處 理，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，分別 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得本品中沒(méi)食子酸的含 量，本品每Ig含扯根菜以沒(méi)食子酸計(jì)，不得少于3. 5mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于所述沒(méi)食子酸的含量測(cè)定更具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 磷酸及0. 三乙胺水溶液為流 動(dòng)相，甲醇-0. 磷酸0. 三乙胺水溶液=10 90，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm，理論板數(shù)按沒(méi) 食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1800 ；取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精 密稱(chēng)定，加水制成每Iml含28 μ g的溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品約0. 4g，精密加入50ml 水，稱(chēng)定重量，超聲處理20min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾 液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μ 1，注入高效液相色譜 儀，測(cè)定，即得本品中沒(méi)食子酸的含量，本品每Ig含扯根菜以沒(méi)食子酸計(jì)，不得少于3. 5mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于所述槲皮素的鑒別是以槲皮素為對(duì)照品，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物為展開(kāi)劑， 甲苯乙酸乙酯甲酸=5:4: 1，用薄層色譜法鑒別；所述槲皮素的含量測(cè)定是以槲皮素為對(duì)照品，以甲醇和0. 2%磷酸溶液的混合物為流 動(dòng)相，甲醇0.2%磷酸溶液=45 55，用高效液相色譜法測(cè)定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于所述槲皮素的鑒別具體步驟是取本品，加鹽酸甲醇溶液，置水浴中加熱回流，趁熱濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?使溶解，用水洗滌兩次，棄去水液，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，作為供試?溶液。另取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液，分別點(diǎn)于同 一硅膠G薄層板上，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物為展開(kāi)劑，甲苯乙酸乙酯甲酸= 5:4: 1，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，揮干，置日光下檢視。供試品色譜 中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；槲皮素的含量測(cè)定具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 2%磷酸溶液的混合液為流動(dòng)相，甲 醇0.2%磷酸溶液=45 55;檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于1800;精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成溶液， 即得對(duì)照品溶液；再取本品，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加鹽酸甲醇溶液，置水浴中加熱 回流，趁熱濾過(guò)，濾液置量瓶中，用甲醇分次洗滌殘?jiān)匆翰⑷胪涣科恐?，用水稀釋至?度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液，注入 液相色譜儀，測(cè)定，即得本品中槲皮素含量，本品每Ig含扯根菜以槲皮素(C15H1007)計(jì)，不 得少于0. 23mg ；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于槲皮素的鑒別更具體步驟是取本品5g，加2. 3%鹽酸甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱濾過(guò)，濾 液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?0ml使溶解，用水洗滌兩次，每次20ml，棄去水液，合并乙酸乙酯 液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液；另取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每 Iml含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄 層板上，以甲苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液為展開(kāi)劑，甲苯乙酸乙酯甲酸=5 4 1， 展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，揮干，置日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì) 照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，其特征在于槲皮素的含量測(cè)定更具體步驟是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇和0. 2 %磷酸溶液的混合液為流動(dòng)相，甲 醇0.2%磷酸溶液=45 55，檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于 1800 ；精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時(shí)的槲皮素對(duì)照品適量，加50%甲醇 溶解并制成每Iml含5ug的溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品約lg，精密稱(chēng)定，置250ml具塞 錐形瓶中，加2. 3%鹽酸甲醇溶液50ml，置85°C水浴中加熱回流1小時(shí)，趁熱濾過(guò)，濾液置 IOOml量瓶中，用甲醇分次洗滌殘?jiān)匆翰⑷胪涣科恐?，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取 續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜 儀，測(cè)定，即得本品種槲皮素含量，本品每Ig含扯根菜以槲皮素計(jì)，不得少于0. 23mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝蘇糖漿的檢測(cè)方法，包括槲皮素的鑒別，黃酮類(lèi)化合物的鑒別，槲皮素的含量測(cè)定，沒(méi)食子酸的含量測(cè)定。該檢測(cè)方法使肝蘇糖漿中槲皮素、黃酮類(lèi)化合物、沒(méi)食子酸都得到了有效的質(zhì)量控制，不僅能更好更全面地反映肝蘇糖漿的有效成份的量，而且能有效地控制以其它水解后主要成份為槲皮素的植物提取物替代扯根菜而投料生產(chǎn)的偽劣肝蘇糖漿的產(chǎn)生，從而保證群眾用藥安全有效。
文檔編號(hào)G01N30/90GK101904879SQ20101022779
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者古莉, 唐終國(guó), 林劍, 溫國(guó)梁, 鄒波, 鐘茂團(tuán), 黎勇 申請(qǐng)人:四川逢春制藥有限公司