專利名稱：反應(yīng)性的雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類以及它們的結(jié)合物的制作方法
反應(yīng)性的雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類以及它們的結(jié)合物發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包括反應(yīng)性染料和染料_結(jié)合物的熒光化學(xué)品；以及涉及它們的用途。相關(guān)技術(shù)的描述被分析物特異性熒光探測(cè)劑是分析樣品中的被分析物的有用試劑。被分析物通 過特異結(jié)合到探測(cè)劑上變成標(biāo)記的，并且標(biāo)記使得被分析物的檢測(cè)變得容易。用于分析 樣品內(nèi)被分析物的熒光探測(cè)劑的應(yīng)用包括熒光免疫分析，它包括通過流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、 熒光顯微鏡檢查鑒別和/或分離細(xì)胞混合物中的細(xì)胞亞群，和通過熒光染色使凝膠分離 的被分析物可視化。這些技術(shù)被Herzenberg等人，“CELLULAR IMMUNOLOGY 〃第3版， 第 22 章；Blackwell ScientificPublications (1978)；和被 Goldman，“ FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS" Academic Press,New York, (1968)；和被 Taylor 等人，APPLICATIONS 0FFLU0RESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES, Alan Liss Inc.，(1986)所描述，它們各 自在此引入作為參考。當(dāng)為上述目的使用熒光染料時(shí)，有許多需要考慮的因素影響熒光染料的選擇。其 中一個(gè)需要考慮的是熒光染料的吸收和發(fā)射特性，因?yàn)樵S多受試樣品例如血液、尿液、腦脊 髓液中的配體、受體和材料，將發(fā)熒光并干擾精確測(cè)定熒光標(biāo)記的熒光。這一現(xiàn)象被稱為自 發(fā)熒光或背景熒光。第二個(gè)需要考慮的因素是熒光染料與配體、受體以及其它生物或非生 物材料結(jié)合的能力，以及所述結(jié)合對(duì)熒光染料的影響。在許多情況下，同另一種分子的結(jié)合 可能導(dǎo)致熒光染料的熒光特性的本質(zhì)變化，并且在某些情況下，本質(zhì)上破壞或減少熒光染 料的量子效率。同熒光染料的結(jié)合也將有可能使被標(biāo)記的分子的功能失活。第三個(gè)需要考 慮的因素是熒光染料的量子效率，其優(yōu)選是對(duì)檢測(cè)高靈敏度的。第四個(gè)需要考慮的因素是 熒光染料的光吸收能力或吸光系數(shù)，其優(yōu)選盡可能大。進(jìn)一步需要考慮的因素是熒光分子 在十分接近時(shí)是否將彼此相互作用，從而導(dǎo)致自猝滅。另一個(gè)需要考慮的因素是是否存在 熒光染料與其它化合物或容器壁的非特異性結(jié)合，該結(jié)合是通過它們自身進(jìn)行的或同熒光 染料所結(jié)合的化合物共同進(jìn)行的。上述方法的適用范圍和重要性與合適熒光化合物的可得性緊密相聯(lián)系。具體地， 需要可以被商業(yè)上可行的活性激光源如紫激光(405nm)、氬激光(488nm)和He-Ne激光 (633nm)所激活的熒光物質(zhì)。有許多為氬激光(488nm激發(fā))和He-Ne激光(633nm激發(fā)) 所研發(fā)的熒光染料。例如，能很好地被488nm氬激光所激發(fā)的熒光素在綠色區(qū)域中是有用 的發(fā)射極。然而，很少有可用于405nm紫激光的熒光染料。一些香豆素染料已經(jīng)在多種生物檢測(cè)應(yīng)用中表現(xiàn)出其實(shí)用性。例如參見，美國(guó) 專利6，207，404，Miller等人；美國(guó)專利5，830，912，Gee等人；和美國(guó)專利4，956，480， Robinson。同其它熒光染料如熒光素類、若丹明類和青色素類相比，許多香豆素染料具有一 定的優(yōu)點(diǎn)。更小尺寸的香豆素染料減少了染料對(duì)染料標(biāo)記的抗原特異性試劑的親和性和特異性的影響。此外，更小的香豆素比熒光素類、若丹明類和青色素類具有更高標(biāo)記效率。然 而，已知許多香豆素染料均有一定的缺陷，例如由于它們很強(qiáng)的疏水性和高pKa，同蛋白質(zhì) 結(jié)合的羥基香豆素染料的熒光劇烈猝滅。香豆素的熒光猝滅起因于自猝滅(香豆素標(biāo)記間 的近距離)和/或由富含電子的氨基酸殘基(如組氨酸、色氨酸和酪氨酸等)引起的猝滅。 此外，香豆素類在405nm處的典型弱吸收嚴(yán)重限制了它們使用紫外激發(fā)激光來分析細(xì)胞的 應(yīng)用，例如在一些流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法中的使用。氯化的香豆素類已經(jīng)被用于標(biāo)記有機(jī)小分子(例如，Zlokarnik等人，1998， Science 279 84和美國(guó)專利5，955，604)。對(duì)于標(biāo)記有機(jī)小分子，自猝滅和由底物引起的 猝滅都不是嚴(yán)重的問題，因?yàn)樵诿總€(gè)結(jié)合物中僅存在單個(gè)香豆素分子。相反地，對(duì)于標(biāo)記抗 體，因?yàn)橄Ｍ讯喾N染料分子結(jié)合到各自抗體上去所以自猝滅和由底物引起的猝滅都是重 點(diǎn)關(guān)注的。通常認(rèn)為由于所謂“重原子作用”和增加的疏水性，香豆素類或熒光素類的氯化 將導(dǎo)致抗體的較差標(biāo)記(美國(guó)專利5，516，629, Park等人；美國(guó)專利5830912,Gee等人；美 國(guó)專利 6, 472, 205, Tsien and Zlokarnik ；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals, Molecular Probes,第 9 版，7-74 頁(yè)，2002)。于2008年7月29日遞交的共同待決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列12/220，939在此引入 作為參考，其中描述了結(jié)合了多種單氯化的7-羥基香豆素染料的抗體以及它們?cè)谏餃y(cè) 定中的應(yīng)用。這些單氯化的羥基香豆素染料在每個(gè)抗體多種染料情況下用作抗體標(biāo)記時(shí)出 人意料地展現(xiàn)出減少的自猝滅。這些染料標(biāo)記的抗體典型地表現(xiàn)出最大接近于405nm的吸 收并且在藍(lán)色區(qū)域表現(xiàn)出最大發(fā)射。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料以及水溶性、雜環(huán)取代的 7_羥基香豆素染料的衍生物，包括反應(yīng)性染料和染料結(jié)合物。本發(fā)明的水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料展現(xiàn)出新的性質(zhì)組合，這使得這 些熒光染料特別適于在生物測(cè)定中使用，包括用作生物聚合物的標(biāo)記。我們發(fā)現(xiàn)7-羥基香 豆素類中雜環(huán)的取代和水溶性基團(tuán)的加入出人意料地產(chǎn)生熒光香豆素類新品種，其用于生 物測(cè)定和制備在405nm有強(qiáng)吸收的生物結(jié)合物并且是高熒光的。此外，雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素類的鹵化顯著地降低香豆素染料的PKa從而使得到的香豆素結(jié)合物在生理學(xué)pH范 圍中具有它們的熒光極大值。這些雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料是強(qiáng)熒光的，并且本發(fā)明 的雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料結(jié)合物的增強(qiáng)了的熒光強(qiáng)度導(dǎo)致更高的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料典型地展現(xiàn)出接近于405nm的吸收最大 值，并且可以選擇本發(fā)明的染料去匹配紫激光的主要發(fā)射譜線，像例如在許多流式細(xì)胞計(jì) 數(shù)法中存在的那樣。本發(fā)明的反應(yīng)性染料和染料結(jié)合物的一個(gè)具體優(yōu)點(diǎn)是這一種類的染料 在綠色區(qū)域(約500-540nm)典型地展現(xiàn)出發(fā)射極大值。據(jù)我們所知，本發(fā)明提供了在綠色 區(qū)域發(fā)射并且在一般的生物測(cè)定反應(yīng)條件下用于標(biāo)記生物分子的一類小分子熒光染料的 第一次描述。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了化學(xué)反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素 化合物用作熒光染料。本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料可以與 多種有機(jī)或無(wú)機(jī)物(“底物”)反應(yīng)，所述底物含有或經(jīng)修飾而含有合適反應(yīng)性的官能團(tuán)，從 而使染料與所述物質(zhì)的結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的反應(yīng)性染料被直接用于熒光
10染色或標(biāo)記樣品從而使該樣品可以被檢測(cè)、鑒別或定量化。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供染料結(jié)合物，其含有一種或多種結(jié)合到底物上的本發(fā) 明的水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該染料結(jié)合物被用作熒 光檢測(cè)試劑以檢測(cè)、鑒別、定位或定量化樣品中的被分析物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，染料結(jié)合的底物為生物聚合物并且該生物聚合 物與本發(fā)明一種或多種或水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類結(jié)合以獲得熒光生物聚合 物。本發(fā)明的熒光生物聚合物染料_結(jié)合物作為或部分作為檢測(cè)試劑是有用的，包括作為 被分析物特異性檢測(cè)試劑。有用的生物聚合物包括，例如，氨基酸聚合物、核酸聚合物、多 糖、碳水化合物和脂類。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文廣泛定義的那樣，染料_生物聚 合物結(jié)合物的生物聚合物組分是氨基酸聚合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物聚合 物為單克隆的抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的反應(yīng)性染料或染料結(jié)合物的試劑盒。 本發(fā)明的試劑盒可以含有用于實(shí)現(xiàn)預(yù)期應(yīng)用的另外組分，例如其它試劑或緩沖液。本發(fā)明反應(yīng)性的、水溶性、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料具有式1的結(jié)構(gòu) 其中HC為雜環(huán)；R1, R2, R3, R4, R5和R6獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基 (alkylthiol)、芳硫基(arylthiol)、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；?、硼酸(boronic acid)、L-RG、WSG或其本身被鹵素、氨基、羥基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG — 次或多次取代的烷基或烷氧基；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；WSG是水溶性基團(tuán)；R1, R2, R3, R4, R5 和 R6 中的至少一個(gè)含有 L-RG ；禾口R1, R2, R3, R4, R5 和 R6 中的至少一個(gè)是 WSG。優(yōu)選地，雜環(huán)部分HC選自下列 優(yōu)選地，反應(yīng)性基團(tuán)RG是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活性酯、酰疊氮、酰基腈、醛、 烷基鹵、酐、芳基鹵、疊氮化物、氮丙啶、硼酸酯、重氮烷、鹵代乙酰胺、鹵代三嗪、胼、羥胺、亞 氨基酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、反應(yīng)性鉬絡(luò)合物、磺酰鹵或補(bǔ)骨脂素衍生物。優(yōu)選地，任選的連接體L是沒有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸 (sulfo amino acid)、多胺、聚乙二醇、芳基或雜芳基。優(yōu)選地，水溶性基團(tuán)WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、銨、吡啶鐺 (pyridium)、喹啉鐺(quinolium)或吖啶鐺(acridinium)基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素 染料具有式2的結(jié)構(gòu) 其中X 是 0、S、NH 或 NRlO ；Y 是 NH、NRll、CH 或 CRl2 ；R1, R2, R3, R4, R5, R6, R10, R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷 硫基、芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；㈧Ⅴ；⑴鹚?、L-RG、WSG或其本身任選地被鹵素、 氨基、羥基、磺?；?、膦?；Ⅳ驶?、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；WSG是水溶性基團(tuán)；R1、R2, R3, R4、R5, R6, R10, R11 和 R12 中的至少一個(gè)含有 L-RG ；禾口R1, R2, R3, R4, R5, R6, R10, R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素染料具有式3的結(jié)構(gòu) 其中X 是 0 或 S ；R1, R2, R3, R4, R10, R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、 芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；⑴鹚?、L-RG、WSG或其本身任選地被鹵素、氨基、 羥基、磺?；?、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；WSG是水溶性基團(tuán)；R1、R2, R3, R4、R10, R11 和 R12 中的至少一個(gè)含有 L-RG ；禾口
R1, R2, R3, R4, R10, R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素染料具有式4的結(jié)構(gòu)其中 X 是 0 或 S ；禮、1 2、1 3、1 4、Rltl和R11獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫 基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥 基、磺?；?、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；WSG是水溶性基團(tuán)；R1, R2, R3, R4, R10 和 R11 中的至少一個(gè)含有 L-RG ；R1、R2, R3, R4、R10 和 R11 中的至少一個(gè)是 WSG ；禾口R10和R11中的至少一個(gè)含有磺酸鹽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素染料具有式5的結(jié)構(gòu)其中 X 是 0 或 S ；禮、R2、R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；和其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素染料具有式6的結(jié)構(gòu) 其中禮、R2、R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；
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L是任選的連接體，它是沒有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、 聚乙二醇、芳基、芳烷基或雜芳基，和其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基 香豆素染料具有式7的結(jié)構(gòu)
其中
R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽；
η為1-10的整數(shù)；和
其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基
香豆素染料具有式8的結(jié)構(gòu)
其中
R3和R4獨(dú)立地是氫、氯、氟或磺酸鹽；和 R10和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。
在下表1中給出本發(fā)明所選擇的反應(yīng)性染料的實(shí)施方案。表1中反應(yīng)性染料的編 號(hào)對(duì)應(yīng)于實(shí)施例中所描述的化合物的編號(hào)。^ 1本發(fā)明的反應(yīng)性染料實(shí)例
本發(fā)明的染料結(jié)合物包括與本發(fā)明的一種或多種染料結(jié)合的底物。典型地，染料 結(jié)合物通過本發(fā)明反應(yīng)性染料和底物之間的反應(yīng)制備，該底物含有或已經(jīng)經(jīng)修飾從而含有 具有合適反應(yīng)性的官能團(tuán)，導(dǎo)致染料化學(xué)連接到該底物上。作為反應(yīng)性染料和底物上官能 團(tuán)之間結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果，染料反應(yīng)性基團(tuán)的一個(gè)或更多原子一般被結(jié)合入使染料連接到底 物上的新的鍵中。一般而言，本發(fā)明的染料結(jié)合物具有式9的結(jié)構(gòu)
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其中HC為雜環(huán)；R1, R2, R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫
基、疊氮基、氨基、羥基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身被鹵素、氨基、羥基、磺?；㈧??；Ⅳ驶?、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；WSG是水溶性基團(tuán)；η是1-35的整數(shù)；
SUB是底物；
禮、R2, R3、R4、R5和R6中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S上；和
R1、R2> R3> R4、R5和R6中的至少一個(gè)是WSG。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的染料結(jié)合物具有式10的結(jié)構(gòu)
SUB
式10其中X 是 0、S、NH 或 NR10 ；Y 是 NH、NR11、CH 或 CR12 ；R1, R2, R3, R4, R5, R6, R10, R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、燒 硫基、芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；?、硼酸、WSG或其本身任選地被商素、氨基、 輕基、磺?；㈧Ⅴ；?、羰基、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；WSG是水溶性基團(tuán)；η是1-35的整數(shù)；SUB 是底物；R1, R2, R3, R4, R5, R6, R10, R11和R12中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S 上；和R1, R2, R3>R4>R5>R6> R10^R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的染料結(jié)合物具有式11的結(jié)構(gòu)
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其中X是 或 S;禮、R2、R3、R4、R10, R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、
芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺酰基、膦?；?、硼酸、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥基、 磺?；?、膦?；?、羰基、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基團(tuán)； η是1-35的整數(shù)； SUB是底物；
R1, R2, R3>R4> R10^R11和R12中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S上；和 R1^ R2> R3> R4> R10> R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的染料結(jié)合物具有式12的結(jié)構(gòu)
-SUB 式 12
“10Rniη
R2 Ri其中X是 或 S;IVRyRyR4, Rltl和R11獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫 基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；⑴鹚?、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥基、磺酰 基、膦?；Ⅳ驶?、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基；WSG是水溶性基團(tuán)；
其中
X是 或 S;禮、R2、R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽；L是任選的連接體；SUB是底物；和其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。雜環(huán)部分、連接體和水溶性基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)施方案如以上對(duì)反應(yīng)性染料所描述的。


附圖1表示通過4-羰基間苯二酚類與雜環(huán)乙酸酯化合物的堿催化縮合反應(yīng)(方 法A)或基于乙酸酐的縮合反應(yīng)(方法B)合成反應(yīng)性香豆素的簡(jiǎn)圖。附圖2表示在pH = 9. 0緩沖液中的化合物7的吸收和發(fā)射光譜。化合物7在414nm 附近有它的最大吸收，這很好地與典型的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的405nm紫激光激發(fā)相匹配。附圖3表示使用CD3抗體結(jié)合化合物7的染料結(jié)合物在用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞的染料 與蛋白質(zhì)之比范圍內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。附圖4表示使用CD4抗體結(jié)合化合物7的染料結(jié)合物在用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞的染料 與蛋白質(zhì)之比范圍內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。附圖5表示表示使用CD8抗體結(jié)合化合物7的染料結(jié)合物在用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞的 染料與蛋白質(zhì)之比范圍內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。附圖6表示使用CD45抗體結(jié)合化合物7的染料結(jié)合物在用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞的染 料與蛋白質(zhì)之比范圍內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。發(fā)明詳述為了使本文所述的本發(fā)明可以被完全地理解，許多術(shù)語(yǔ)在下面被明確地定義。沒 有被明確定義的術(shù)語(yǔ)意味它們具有在化學(xué)和生物領(lǐng)域中通常的意思。本文所有在上面和下 面引用的參考資料，在此引入作為參考。術(shù)語(yǔ)“7-羥基香豆素”或“7-羥基香豆素衍生物”，自身或作為另一個(gè)基團(tuán)的一部 分在本文中使用，表示含有一個(gè)或多個(gè)下列稠環(huán)結(jié)構(gòu)或其衍生物的任意化合物或取代基
7-羥基香豆素可以理解的是本發(fā)明的香豆素染料可以以一個(gè)或另一個(gè)具體的電子共振結(jié)構(gòu)畫 出。本發(fā)明每一方面均等地適用于形式上繪制為其它允許的共振結(jié)構(gòu)的染料，因?yàn)樵谠撊?料上的電荷遍及染料自身離域分布。術(shù)語(yǔ)“雜原子”，自身或作為另一個(gè)基團(tuán)的一部分在本文中使用，表示氧原子 (“0”)、硫原子(“S”)或氮原子(“N”)。公認(rèn)當(dāng)雜原子是氮時(shí)，它可以形成NR1R2部分， 其中R1和R2彼此獨(dú)立地為氫或烷基，或同它們連接的氮一起形成飽和或不飽和的5-、6_或 7-元環(huán)。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”或“雜芳基”，自身或作為另一個(gè)基團(tuán)的一部分在本文中使用，是指 具有5至14個(gè)環(huán)原子并含有碳原子以及1、2、3或4個(gè)氧、氮或硫雜原子的基團(tuán)。雜環(huán)基 團(tuán)的例子包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、異 苯并呋喃基、苯丙噁唑基、色烯基、咕噸基、啡噁噻基(phnoxathiinyl)、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、噴嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、B引哚 基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶 啶基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮苯基、二氮雜菲基、吩嗪基、異噻唑基、吩噻嗪基、 異噁唑基、呋咱基(furazanyl)、吩噁嗪基和四唑基的基團(tuán)。雜環(huán)基已經(jīng)在文獻(xiàn)中被廣泛 地描述(參見，例如，Katritzky, Alan R.，Charles W. Rees，和 Colin J. Drayton. 1984. Comprehensive heterocyclicchemistry :the structure, reactions, synthesis, and uses of heterocycliccompounds.第 8 卷，第 6 部分·索引.Oxford [Oxfordshire] PergamonPress.,在此弓I入作為參考)。任意芳基和雜芳基環(huán)體系可以是未取代的或任選地和獨(dú)立地被合成上易取得的 和化學(xué)上穩(wěn)定結(jié)合的取代基所取代，例如H、鹵素、氰基、磺基、磺基的堿金屬或銨鹽、硝基、 羧基、烷基、全氟(代)烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基， 其烷基部分具有18個(gè)或更少的碳。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“取代的”，是指用可選擇的基團(tuán)對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)部分或官能團(tuán)上的 氫進(jìn)行的形式取代。在化合物、化學(xué)結(jié)構(gòu)部分或官能團(tuán)被描述為取代的時(shí)，可選擇的基團(tuán)
取代基部分通常選自羥基、氧代、硝基、三氟甲基、商素、烷氧基、烯基二氧基、氨基烷基、氨 基烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰基、羧 基、羥基烷氧基、烷氧基烷氧基、單烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基單(羧基烷基)氨 基、雙(羧基烷基)氨基、烷氧基羰基、炔基羰基、烷基磺?；?、烯基磺基?；?、炔基磺?；?、 芳基磺酰基、烷基磺酰基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰胺基，芳基磺酰胺基，烷基磺酰胺基、羧 基烷氧基、羧基烷基，羧基烷基氨基、氰基、三氟甲氧基、全氟(代)乙氧基、胍、脒基、氧胍 基、烷基亞氨基、甲?；鶃啺被Ⅴ；?、酰疊氮、乙酰基疊氮化物、二氯三氮烯、異硫氰酸 酯、磺酰鹵、磺基琥珀酰亞氨基酯、異氰酸酯、酰鹵、醛、鹵乙酰胺、馬來酰亞胺、氮丙啶基、烷 硫基(二硫化物)、丙烯酰(acrylo)、鹵烷基羰基、硼酸酯、酰胼、氨基脲、碳酰胼、芳烷基、雜 芳烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烯基烷基、環(huán)雜烷基烷基和環(huán)雜烯基烷基。本文所用的“反應(yīng)性基團(tuán)”，表示為“RG”，系指化合物上能夠與不同化合物上的官 能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)部分。本文所用的在兩個(gè)結(jié)構(gòu)部分之間的“連接體”，表示為“L”，如果這兩個(gè)結(jié)構(gòu)部分可 以直接彼此連接或通過該連接體作為中間物進(jìn)行連接，則稱為是“任選的”。使用這一文字 以簡(jiǎn)化對(duì)區(qū)別僅在于存在或不存在連接體的很多備選結(jié)構(gòu)的描述。在本發(fā)明中，例如香豆 素染料分子可以直接結(jié)合于生物聚合物或可選擇地通過連接體(L)間接結(jié)合于生物聚合 物。為了更簡(jiǎn)約的表示，這兩種選擇在本文描述為具有任選的連接體的單一結(jié)構(gòu)。具有任 選的連接體(L)的結(jié)構(gòu)的一個(gè)實(shí)施方案，其中連接體不存在時(shí)可以被描述為其中L是“沒 有”的結(jié)構(gòu)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“水溶性基團(tuán)”或“WSG”是指提高其所連接的化合物的水溶性的任 意取代基。優(yōu)選地，水溶性基團(tuán)(WSG)是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、銨、吡啶鐺、 喹啉鐺、吖啶鐺或多羥基(例如糖如葡萄糖)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“磺酸鹽”，自身或作為另一個(gè)基團(tuán)的部分，是指含有一個(gè)或多個(gè)具有下列結(jié) 構(gòu)的結(jié)構(gòu)部分的任意化合物或取代基
其中R是氫或其他反罔子，例如金屬罔子或銨罔子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“染料結(jié)合物”是指染料和“底物”或“物質(zhì)”之間的結(jié)合物。術(shù)語(yǔ)“被分析物”在本文廣泛用于指將被分析、檢測(cè)、測(cè)量或標(biāo)記的任意物質(zhì)。被 分析物的例子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽類、荷爾蒙、半抗原、抗原、抗體、受體、酶類、核酸、多 糖、化學(xué)品、聚合物、病原體、毒素、有機(jī)藥物、無(wú)機(jī)藥物、細(xì)胞、組織、微生物、病毒、細(xì)菌、真 菌、藻類、寄生蟲、變應(yīng)原、污染物質(zhì)及它們的組合。按慣例，將要被測(cè)定的特定細(xì)胞類型的 細(xì)胞，其細(xì)胞組分分子或細(xì)胞本身可以被描述為被分析物。本文使用術(shù)語(yǔ)“被分析物-特異性試劑”或“靶點(diǎn)-特異性試劑”來廣泛地指相對(duì) 于其它可能地存在于樣品中的被分析物優(yōu)先結(jié)合到感興趣的被分析物或靶點(diǎn)的任意試劑。 靴點(diǎn)(被分析物)和靶點(diǎn)特異性(被分析物特異性)試劑是結(jié)合對(duì)的成員，該結(jié)合對(duì)的任 一成員可以用作靶點(diǎn)特異性試劑以選擇性結(jié)合于該結(jié)合對(duì)的另一個(gè)成員。靶點(diǎn)和靶點(diǎn)特異 性試劑對(duì)的例子包括，但不限于，在下表2中提供的。優(yōu)選的靶點(diǎn)特異性試劑為抗體，其包 括特異性結(jié)合(與之免疫應(yīng)答)抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。彪 代表件的特異結(jié)合對(duì) 本文所用的“檢測(cè)試劑”是指用來使被分析物易于光學(xué)檢測(cè)的任意化合物。檢測(cè) 試劑一般包括結(jié)合于熒光標(biāo)記的被分析物特異性試劑，并且包括其中底物組分(一般為 生物聚合物)自身為被分析物_特異性試劑的染料_結(jié)合物，以及結(jié)合到充當(dāng)熒光標(biāo)記的 染料結(jié)合物上的被分析物_特異性試劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物聚合物，，一般用于指氨基酸聚合物、核酸聚合物、碳水化合 物、多糖類和脂類，其各自在此廣泛定義。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸聚合物”一般用于指氨基酸的任意聚合物，包括肽類、多 肽和蛋白質(zhì)，包括那些已經(jīng)接受過共轉(zhuǎn)譯或轉(zhuǎn)移后修飾的蛋白質(zhì)，例如糖蛋白類。氨基酸聚 合物可以包括標(biāo)準(zhǔn)(即，由標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼也稱為蛋白質(zhì)原所編碼的20種氨基酸中的一種) 和非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，可以由例如磷酸鹽、碳水化合物或C1至(25羧酸所衍生、保護(hù)或取代。術(shù) 語(yǔ)“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”根據(jù)聚合物的長(zhǎng)度在此處可無(wú)區(qū)別地交換使用，雖然氨基酸的 短聚合物一般稱為肽或多肽，和氨基酸的更長(zhǎng)聚合物尤其是那些天然存在和/或具有生物 學(xué)功能的稱為蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括衍生或可衍生自抗體或抗體基因的所有產(chǎn)品，其用作 靶點(diǎn)特異性結(jié)合試劑?！翱贵w”因此包括天然抗體、抗體片段、抗體衍生物和基因工程化的抗 體、抗體片段和抗體衍生物等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸聚合物”、“核酸”和“低聚核苷酸”是指聚脫氧核糖核酸類 (含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸類(含有D-核糖)、和為嘌呤或嘧啶堿或者經(jīng)過修 飾的嘌呤或嘧啶堿的N糖苷的任意其它類型的多核苷酸。在術(shù)語(yǔ)“核酸”和“低聚核苷酸” 之間在長(zhǎng)度上未打算進(jìn)行區(qū)分，并且這些術(shù)語(yǔ)可以互換使用。這些術(shù)語(yǔ)僅僅是指分子的一 級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。核酸聚合物旨在包括 肽核酸，例如N- (2-氨基乙基)甘氨酸單元(參見Nielsen等，美國(guó)專利5，539，082，在此弓| 入作為參考)。反應(yīng)性染料本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類具有在式1-8的任一 個(gè)中所示的通式結(jié)構(gòu)。具體例子在表1中表示并且在實(shí)施例中進(jìn)行描述。所述反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料含有一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán) RG，其通過任選的連接體L共價(jià)連接于染料。在某些實(shí)施方案中，連接染料至RG的共價(jià)鍵 含有多個(gè)充當(dāng)間隔物的插入原子。本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類染料可以與各種含有 或經(jīng)修飾含有具有適合反應(yīng)性的官能團(tuán)的有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致染料化學(xué)連接于該物 質(zhì)。一般地，反應(yīng)性染料和物質(zhì)上官能團(tuán)之間的結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致反應(yīng)性基團(tuán)RG上的一個(gè)或更
26多原子被包括到將染料連接至該物質(zhì)的新鍵中。一般地，反應(yīng)性基團(tuán)是親電基團(tuán)或親核基團(tuán)，它可以通過暴露于分別為親核基團(tuán) 或親電基團(tuán)的相應(yīng)的官能團(tuán)而形成共價(jià)鍵。所選擇的親電基團(tuán)和親核基團(tuán)反應(yīng)對(duì)、以及由 它們反應(yīng)產(chǎn)生的共價(jià)鍵的例子，表示在下表3中。 表3反應(yīng)性的親電基團(tuán)和親核基團(tuán)，以及產(chǎn)生的結(jié)合物 *活性酯類，如在現(xiàn)有技術(shù)中理解的那樣，通常具有式-C0W，其中W為好的 離去基團(tuán)(例如琥珀酰亞胺氧基(succinimidyloxy) (-OC4H4O2)磺基琥珀酰亞胺氧基 (-OC4H3O2-SO3H), -1-氧苯并三唑基(-OC6H4N3)；或用于形成活性芳基酯的芳氧基或被吸電 子取代基如硝基、氟、氯、氰基或三氟甲基或其組合一次或多次取代的芳氧基；或被碳化二 亞胺活化以形成酸酐或混合酸酐-OCOAlk或-OCN(Alk1)NH(Alk2)的羧酸，其中Alk1和Alk2 可以相同或不同的且SC1-C2tl烷基、C1-C2tl全氟(代)烷基或C1-C2tl烷氧基；或環(huán)己基，3-二 甲基氨基丙基或N-嗎啉代乙基)。**酰疊氮也可以重排為異氰酸酯類。用于使染料連接到被結(jié)合的物質(zhì)上的反應(yīng)性基團(tuán)的選擇一般取決于被結(jié)合的物 質(zhì)上的官能團(tuán)以及所希望的共價(jià)鍵的類型和長(zhǎng)度。在有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)中一般存在的官能團(tuán) 類型包括，但不限于，胺類、酰胺類、硫醇、醇類、酚類、醛類、酮類、磷酸鹽類、咪唑類、胼類、 羥胺類、二取代的胺類、鹵化物、環(huán)氧化物、羧化物酯類、磺酸酯類、嘌呤類、嘧啶類、羧酸、烯 鍵或這些基團(tuán)的組合。單個(gè)反應(yīng)點(diǎn)類型在該物質(zhì)上是可得的(一般對(duì)于多糖來說)，或可以 產(chǎn)生多種位點(diǎn)(例如胺類，硫醇類、醇類、酚類)，這對(duì)于蛋白質(zhì)來說是典型的。結(jié)合的物質(zhì) 可以結(jié)合于不止一種染料，染料可以是相同或不同的，或者結(jié)合于額外地被半抗原修飾的 物質(zhì)，例如生物素。雖然一些選擇性可以通過反應(yīng)條件的小心控制獲得，但是標(biāo)記的選擇性最好通過 適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性染料的選擇而獲得。一般地，反應(yīng)性基團(tuán)RG將與胺、硫醇類、醇、醛或酮反應(yīng)。優(yōu)選地，RG與胺或巰基 官能團(tuán)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RG為丙烯酰胺、反應(yīng)性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的 活性酯(一般為羧酸的琥珀酰亞胺基酯)、酰疊氮、酰基腈、醛、烷基商、酐、苯胺、芳基商、疊 氮化物、氮丙啶、硼酸酯、羧酸、重氮烷、鹵代乙酰胺、鹵代三嗪、胼(包括酰胼)、亞氨基酯、 異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、亞磷酰胺、反應(yīng)性鉬絡(luò)合物、磺?；u或巰基基團(tuán)?！胺?br> 29應(yīng)性鉬絡(luò)合物”尤其是指例如在美國(guó)專利5，580，990,5, 714，327,5, 985，566中所描述的化
學(xué)反應(yīng)性鉬絡(luò)合物，在此引入作為參考。當(dāng)RG為羧酸的活性酯時(shí)，反應(yīng)性染料具體地用于制備蛋白質(zhì)、核苷酸類、低聚核 苷酸類或半抗原的染料結(jié)合物。當(dāng)RG為馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺時(shí)，反應(yīng)性染料具體地用 于結(jié)合含有巰基的物質(zhì)。當(dāng)RG為酰胼時(shí)，反應(yīng)性染料具體地用于結(jié)合高碘酸鹽氧化的碳水 化合物和糖蛋白類，而且此外是用于細(xì)胞顯微注射的醛可固定的極性示蹤劑。優(yōu)選地，RG為 羧酸、羧酸的琥珀酰亞胺基酯、鹵代乙酰胺、胼、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺基團(tuán)、脂肪族胺、全 氟(代)苯甲酰氨基、疊氮基全氟(代)苯甲酰氨基或補(bǔ)骨脂素。更優(yōu)選地，RG為羧酸的 琥珀酰亞胺基酯、馬來酰亞胺、碘乙酰胺或反應(yīng)性的鉬絡(luò)合物?？蛇x擇地，反應(yīng)性基團(tuán)RG為可光活化的基團(tuán)，例如疊氮化物、雙吖丙啶基 (diazirinyl)、疊氮芳基或補(bǔ)骨脂素衍生物，在這一例子中染料只有在用適當(dāng)波長(zhǎng)的光照 射后才能變成化學(xué)反應(yīng)性的。反應(yīng)件染料的合成本發(fā)明的水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素類是通過4-羰基間苯二酚類與雜 環(huán)乙酸的基于乙酸酐的縮合或4-羰基間苯二酚類與活性亞甲基化合物的堿催化縮合而制 備的。這些基本結(jié)構(gòu)在合成期間或之后，被任選地進(jìn)一步取代，以給出相應(yīng)的如上所定義的 香豆素染料取代基。公認(rèn)的是其中有許多可以產(chǎn)生同等結(jié)果的可能變化。本發(fā)明的反應(yīng) 性香豆素染料的典型合成在圖1中被圖解說明。文獻(xiàn)中其它已知的香豆素合成方法可以 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的某些修改而適用于制備本發(fā)明的化學(xué)反應(yīng)性的香豆素類(參 見，例如，Bentsen 等，美國(guó)專利 6，566，508 ；Dittmer 等，2005，J. Org. Chem. 70 4682 ；Shi 等，2005，分析化學(xué) 33 1452 ； Sivakumar 等，2004，Org. Lett 6 4603 ； Zhao 等，2004，J.Am. Chem. Soc. 126 4653 ；Huang 等，1994, J. Chem. Soc. PerkinTrans. 1 102 ；以及 Kuznetsova 和Kaliya, 1992, Russ. Chem. Rev. 61 1243 ；它們各自在此引入作為參考)。合成含有反應(yīng)性基團(tuán)的染料的方法在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有很多文獻(xiàn)了。一般通過將 羥酸與相對(duì)酸性的“離去基團(tuán)”相結(jié)合而合成胺_反應(yīng)性染料，例如羧酸的“活性酯”。其它 優(yōu)選的胺-反應(yīng)性基團(tuán)包括磺?；u，其使用鹵化劑如PCI5或POCl3從磺酸來制備；鹵三嗪 類，其通過氰尿酰鹵(cyanuric halide)與胺類的反應(yīng)而制備；以及異氰酸酯類或異硫氰 酸酯類，其分別通過胺類和光氣或硫光氣而制備。具體地用于結(jié)合于羧酸、醛類和酮類的含有胺類和酰胼類的染料，最經(jīng)常通過羧 酸的活性酯或磺?；u與二胺如尸胺，或與胼反應(yīng)來合成。可選擇地，芳族胺類通常通過硝 基芳族化合物的化學(xué)還原而合成。胺類和胼類是通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成硫醇類_反應(yīng)性鹵乙酰 胺或馬來酰亞胺的特別有用的前體。染料結(jié)合物本發(fā)明的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料可以與各種含有或 經(jīng)修飾含有具有適合反應(yīng)性的官能團(tuán)的有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)(本文稱為“底物”)反應(yīng)，導(dǎo)致染 料與該物質(zhì)相結(jié)合。有用的染料結(jié)合物除此之外還包括底物為氨基酸、核苷酸、生物聚合 物(例如氨基酸聚合物，核酸聚合物，多糖，碳水化合物或脂類)、抗原、類固醇、維生素、藥 物、半抗原、代謝物、毒素、環(huán)境污染物質(zhì)、離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)部分或玻璃、塑料或者其它非生物 聚合物的結(jié)合物。在一些實(shí)施方案中，底物為細(xì)胞、細(xì)胞系統(tǒng)、細(xì)胞碎片或組分或亞細(xì)胞顆粒(例如，病毒顆粒，細(xì)菌顆?；蚱浣M分)。反應(yīng)性染料一般地標(biāo)記細(xì)胞表面上、細(xì)胞膜、細(xì) 胞器或細(xì)胞質(zhì)中的官能團(tuán)。在生物測(cè)定中所使用的底物一般地為氨基酸、核苷酸或生物聚合物，例如氨基酸 聚合物、核酸聚合物、碳水化合物或多糖。染料-聚合物結(jié)合物可以被制備得引入多種結(jié)合 到底物的染料分子以增加來自染料結(jié)合物的熒光信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是氨基酸或氨基酸聚合物，例如肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明可用 的氨基酸聚合物的例子包括，但不限于，抗體(如上廣泛定義)、IgG結(jié)合蛋白質(zhì)(例如蛋 白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A/G等等)、酶類、外源凝集素類、糖蛋白類、組蛋白質(zhì)類、白蛋白質(zhì) 類、脂蛋白質(zhì)類、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、藻膽蛋白質(zhì)以及其它熒 光蛋白質(zhì)、荷爾蒙類、毒素、趨化激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽類、細(xì)胞因子類、毒素、蛋白質(zhì)酶底 物以及蛋白質(zhì)激酶底物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物底物為單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物為核酸堿、核苷、核苷酸或核酸聚合物。核酸聚合物包 括經(jīng)修飾含有用于與本發(fā)明的染料結(jié)合的額外的連接體或間隔物的那些，例如炔基連接體 (美國(guó)專利5，047，519)、氨基烯丙基連接體(美國(guó)專利4，711，955)、雜原子取代的連接體 (美國(guó)專利5，684，142)或其它連接體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合的物質(zhì)為核苷或核苷酸 類物，其通過非環(huán)形間隔物連接嘌呤或嘧啶堿至磷酸酯或聚磷酸酯結(jié)構(gòu)部分。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，染料一般地通過羥基但是選擇性地通過巰基或氨基結(jié)合于核苷酸或核苷的碳水 化合物部分(例如，如美國(guó)專利5，659，025 ；5, 668，268 ；5, 679，785中所描述)。一般地，結(jié) 合的核苷酸為三磷酸核苷或脫氧三磷酸核苷或雙脫氧三磷酸核苷。向磷酸酯或聚磷酸酯結(jié) 構(gòu)部分中引入亞甲基結(jié)構(gòu)部分或氮或硫雜原子也是有用的。非嘌呤和非嘧啶堿諸如7-去 氮雜嘌呤(美國(guó)專利6，150，510)和含有這種堿的核酸也可以與本發(fā)明染料連接。通過脫 嘌呤核酸與胺、酰胼或羥胺衍生物反應(yīng)而制備的核酸加合物提供了額外的標(biāo)記和檢測(cè)核酸 的方法，例如"A methodfor detecting abasic sites in living cells :age_dependent changes in baseexcision repair，，Atamna 等，2000, Proc Natl Acad Sci 97:686-691。優(yōu)選的核酸聚合物結(jié)合物是標(biāo)記的，單鏈或多鏈的、天然或合成的DNA或RNA、DNA 或RNA低聚核苷酸類、或DNA/RNA混合物，或引入罕見的連接體如嗎啉衍生的磷酸酯類，或 肽核酸類如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單元。當(dāng)核酸為合成的低聚核苷酸時(shí)，其一般地含有 少于50個(gè)核苷酸，更為一般地少于25個(gè)核苷酸。肽核酸類(PNA)結(jié)合物(Nielsen等，美 國(guó)專利5，539，082)由于它們通常更快的雜交速率對(duì)于一些應(yīng)用可以是優(yōu)選的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物為碳水化合物，其一般地為多糖如葡聚糖、肝素、糖原 質(zhì)、支鏈淀粉、甘露聚糖、菊糖、淀粉、瓊脂糖和纖維素?？蛇x擇地，碳水化合物為多糖，其為 脂多糖。優(yōu)選的多糖結(jié)合物為葡聚糖或脂多醣結(jié)合物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物為脂質(zhì)(一般地具有6-60個(gè)碳)，包括糖脂類、磷脂類、 鞘脂類和類固醇?？蛇x擇地，結(jié)合的底物是脂質(zhì)集合體，如脂質(zhì)體?？梢允褂糜H脂性的結(jié)構(gòu) 部分以在細(xì)胞中保留結(jié)合的物質(zhì)，如在美國(guó)專利5，208，148中描述的那樣。本發(fā)明的某些 極性染料也可以被捕捉于脂質(zhì)集合體中。 底物為離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物用作鈣、鈉、鎂、鋅、鉀或其它生物學(xué)上重 要的金屬離子的指示劑。優(yōu)選的離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)部分為冠醚(美國(guó)專利5，405，975) ；1， 2_雙-(2-氨基苯氧基乙烷)-N，N，N'，N'-四乙酸的衍生物(BAPTA螯合劑；美國(guó)專利
315，453，517,5, 516，911 和 5，049，673) ；2-羧基甲氧基苯胺-N，N-二-乙酸的衍生物(APTRA 螯合劑；Am. J. Physiol. 256, C540(1989))；或基于吡啶和二氮雜菲的金屬離子螯合劑(美 國(guó)專利5，648，270)；或次氨基三乙酸的衍生物，參見例如“Single-step synthesis and characterization ofbiotinylated nitrilotriacetic acid, a unique reagent for the detectionof histidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose，，， McMahan 等，1996，Anal Biochem 236:101-106。優(yōu)選地，離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)部分為冠醚螯合劑、BAPTA螯 合劑、APTRA螯合劑或次氨基三乙酸的衍生物。其它非生物材料的結(jié)合物包括以下物質(zhì)的染料結(jié)合物有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合物、聚合 薄膜、聚合晶片(polymeric wafers)、高分子膜、聚合顆粒或聚合微粒；包括磁性或非磁性 微球；鐵、金或銀顆粒；傳導(dǎo)和非傳導(dǎo)金屬以及非金屬；以及玻璃和塑料表面及顆粒。通過 制備聚合物時(shí)含有合適官能團(tuán)的染料的共聚作用，或通過含有具有合適化學(xué)反應(yīng)性的官能 團(tuán)的聚合物的化學(xué)修飾，來任選地制備結(jié)合物。用于制備聚合物的染料結(jié)合物的其它類型 的反應(yīng)包括催化聚合作用或烯烴的共聚作用以及二烯與二烯親合物的反應(yīng)、酯交換作用或 轉(zhuǎn)氨基作用。在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合物進(jìn)一步被至少一種第二發(fā)光染料(其任選地為本 發(fā)明的額外染料)所標(biāo)記，以形成能量傳遞對(duì)。在本發(fā)明的某些方面，被標(biāo)記的結(jié)合物起到 酶底物的作用，并且酶水解作用使能量傳遞中斷。熒光染料-結(jié)合物，尤其其中底物是生物聚合物時(shí)，每一個(gè)底物分子可以引入多 個(gè)染料以增大熒光信號(hào)。優(yōu)選地，至少3個(gè)染料分子被引入染料生物-聚合物結(jié)合物中。在 生物聚合物為抗體的實(shí)施方案中，至少三個(gè)或更優(yōu)選至少6個(gè)染料分子被結(jié)合到抗體。在 一些實(shí)施方案中，多達(dá)約35個(gè)染料分子可以結(jié)合到抗體而不會(huì)有顯著的自猝滅，但是更通 常是多達(dá)約15-20個(gè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，每個(gè)結(jié)合物底物的染料各自所述的 范圍旨在描述為在這一范圍中的所有值。因此，例如，通過說明本發(fā)明的熒光生物聚合物含 有6-15個(gè)染料分子，含有6、7、8.....或15個(gè)染料分子的生物聚合物也是本發(fā)明的一部分。染料-結(jié)合物的制備本發(fā)明的熒光染料-結(jié)合物一般地作為底物和反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的 7_羥基香豆素染料之間的反應(yīng)產(chǎn)物而被合成。使用反應(yīng)性染料制備染料結(jié)合物有很多 文獻(xiàn)記載，例如 Hermanson, 1996, Bioco jugate Techniques (Academic Press, New York, NY) ；Haugland, 1995, Methods Mol. Biol. 45 205-21 -MR Brinkley 1992, Bioconjugate Chemistry 3 :2，各自在此引入作為參考。結(jié)合物一般由將合適的反應(yīng)性染料與待結(jié)合的物 質(zhì)在二者都在其中可溶的合適的溶劑中混合而得到。本文描述的反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán) 取代的7-羥基香豆素染料類的水溶液容易制造，使與大部分生物材料的結(jié)合反應(yīng)變得容 易。對(duì)于這些光活化的反應(yīng)性染料，結(jié)合作用需要照射反應(yīng)混合物以活化反應(yīng)性染料。本發(fā)明的熒光生物聚合物一般作為生物聚合物和反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代 的7-羥基香豆素染料之間的反應(yīng)產(chǎn)物而被合成，其中反應(yīng)條件導(dǎo)致多種染料分子結(jié)合于 每個(gè)生物聚合物。可選擇地，熒光生物聚合物可以通過亞單位分子的聚合反應(yīng)而被合成，其 中一種或多種亞單位分子已經(jīng)先于生物聚合物的聚合作用被結(jié)合至反應(yīng)性的、水溶性的、 雜環(huán)取代的7-羥基香豆素中。后面一種方法的例子為使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)作用合成 低聚核苷酸，其中至少一種亞磷酰胺是染料標(biāo)記的。
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應(yīng)用以及使用方法在發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的反應(yīng)性染料被用于直接染色或標(biāo)記樣品或樣品的組 分，以便可以鑒定或定量化該樣品。如上所述，化學(xué)反應(yīng)性染料化合物將共價(jià)結(jié)合于在各種 各樣材料上的相應(yīng)的官能團(tuán)，形成染料結(jié)合物。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的反應(yīng)性染料化合物被用于直接染色或標(biāo)記有生物 組分的樣品。樣品可以包括非均勻的組分混合物(包括完整的細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)菌、病 毒、細(xì)胞器及它們的混合物)、或單一的組分或均勻的組分組(例如天然或合成的氨基酸、 核酸或碳水化合物聚合物或類脂膜絡(luò)合物)。這些染料在一般使用的濃度內(nèi)通常對(duì)活細(xì)胞 以及其它生物組分是沒有毒性的。為了直接染色，染料化合物與樣品以有利于染料化合物與感興趣的樣品組分之間 的接觸的任意方式混合。一般地，染料化合物或含有染料化合物的溶液被簡(jiǎn)單地加入至樣 品。本發(fā)明的某些染料，尤其是被一個(gè)或多個(gè)磺酸結(jié)構(gòu)部分取代的那些，往往對(duì)生物細(xì)胞膜 是非滲透的，且一旦處于活細(xì)胞內(nèi)部就一般被很好地保留。使質(zhì)膜可滲透化的處理，例如電 穿孔、振動(dòng)處理或者高細(xì)胞外ATP可以用于將所選擇的染料化合物導(dǎo)入到細(xì)胞中?？蛇x擇 地，所選的染料化合物可以物理上插入細(xì)胞中，例如通過壓力顯微注射、刮除負(fù)載、修補(bǔ)鉗 方法或吞噬作用。引入脂族胺或胼殘基的染料可以被顯微注射入細(xì)胞中，其中它們可以通過醛固定 劑例如甲醛或戊二醛固定于某位置。這一固定能力使得所述染料對(duì)于細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用例如神經(jīng) 元追蹤是有用的。具有親脂性取代基例如磷脂的染料化合物將非共價(jià)結(jié)合入脂質(zhì)集合體中，例如用 作膜結(jié)構(gòu)的探針；或用于在脂質(zhì)體、脂蛋白質(zhì)、薄膜、塑料、親脂性微球體或類似材料中的引 入；或用于追蹤。親脂性染料作為膜結(jié)構(gòu)的熒光探針是有用的。為了在生物應(yīng)用中直接對(duì)被分析物進(jìn)行染色，本發(fā)明染料化合物一般在根據(jù)本領(lǐng) 域公知的方法制備的含水的、大部分含水的或可與水混溶的溶液中使用。染料化合物的準(zhǔn) 確濃度取決于試驗(yàn)條件以及所希望的結(jié)果，但是一般地是從約1納摩爾至1毫摩爾或更多 的范圍。通過系統(tǒng)性變化直至實(shí)現(xiàn)有最小背景熒光的滿意結(jié)果而測(cè)定最佳濃度。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的熒光染料_結(jié)合物作為檢測(cè)試劑或作為檢測(cè)試劑 的一部分用以促進(jìn)被分析物的光學(xué)檢測(cè)和分析，所述檢測(cè)試劑一般地為被分析物_特異性 檢測(cè)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，染料_結(jié)合物底物自身是被分析物_特異性試劑，并且熒光 染料結(jié)合物被用作檢測(cè)試劑以標(biāo)記感興趣的被分析物。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，熒光 染料_結(jié)合物被結(jié)合于被分析物_特異性試劑，并且該組合的實(shí)體被用作檢測(cè)試劑以標(biāo)記 感興趣的被分析物。在這一可選擇的實(shí)施方案中，染料結(jié)合物作為結(jié)合于被分析物-特異 性試劑的熒光標(biāo)記。其中使用被分析物特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記一種或多種感興趣的被分析物并且隨后 進(jìn)行光學(xué)分析的分析方法是本領(lǐng)域公知的，并且當(dāng)前的熒光染料-結(jié)合物在所述測(cè)定中 通常用作檢測(cè)試劑。例如，樣品中的蛋白質(zhì)可以使用由可以特異性結(jié)合于被分析物蛋白 質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)(一般為抗體)組成的檢測(cè)試劑來標(biāo)記。所得的被標(biāo)記的被分析物蛋白 質(zhì)的檢測(cè)可以使用許多公知的分析格式和儀器來實(shí)現(xiàn)，包括使用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、掃描細(xì) 胞計(jì)數(shù)法、圖像和凝膠分析。流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法在這一領(lǐng)域的大量文獻(xiàn)中被詳盡地描述，包括例如，Landy 等(eds. ), Clinical Flow Cytometry, Annals of the New York Academy of Sciences 677 卷(1993) ；Bauer 等(eds), Clinical Flow Cytometry Principles andApplicat ions, Williams & Wilkins (1993) ；Ormerod(ed.), Flow Cytometry :A Practical Approach,Oxford Univ. Press(1997) ；Jaroszeski 等(eds. ),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular Biology 第 91 期，HumanaPress (1997)；以及 Practical Shapiro, FlowCytometry，第4版，Wiley-Liss (2003)；所有在此引入作為參考。熒光顯微 成像公開在，例如，Pawley (ed)，Handbook of Biological Confocal Microscopy，第 2 版， Plenum Press (1989)中，其在此引入作為參考。用于激發(fā)本發(fā)明的熒光聚合物的照明光源包括，但不限于，手提式紫外燈、汞弧光 燈、氙氣燈、激光和激光二極管。這些照明光源任選地整合入激光掃描儀、熒光微板讀數(shù)儀、 標(biāo)準(zhǔn)或小型熒光計(jì)或者色譜檢測(cè)器中。本發(fā)明優(yōu)選的熒光聚合物在或接近于405nm處是可 激發(fā)的，并且可以使用相對(duì)廉價(jià)的紫激光激發(fā)源來激發(fā)。試劑盒本發(fā)明的一個(gè)方面為使得使用如上所述的本發(fā)明的任一種染料的各種分析實(shí)踐 容易進(jìn)行的試劑盒形式。本發(fā)明的試劑盒一般包括本發(fā)明的有色的或熒光染料，其或者以 用于制備染料-結(jié)合物的化學(xué)反應(yīng)性標(biāo)記物的形式存在，或者以染料結(jié)合物的形式存在， 其中結(jié)合的物質(zhì)為特異性結(jié)合對(duì)成員或者核苷、核苷酸、低聚核苷酸、核酸聚合物、肽或者 蛋白質(zhì)。該試劑盒任選地進(jìn)一步包括一種或多種緩沖試劑，其一般地以水溶液存在。本發(fā) 明的試劑盒任選地進(jìn)一步包括額外的檢測(cè)試劑、用于純化所得標(biāo)記的物質(zhì)的純化介質(zhì)、標(biāo) 準(zhǔn)光源(luminescence standards)、酶、酶抑制劑、有機(jī)溶劑或者用于進(jìn)行本發(fā)明分析的說 明書。下列實(shí)施例中提供所選染料的合成策略、所選熒光生物聚合物的合成、它們的特 征描述以及使用方法的例子。進(jìn)一步的修改以及變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見 的。給出下列實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明的實(shí)踐，并且不打算限制或限定本發(fā)明的整個(gè)范圍。實(shí)施例1 化合物1的制備將4-氯間苯二酚(50g)溶于無(wú)水乙醚中(200ml)。在攪拌下往溶液中加入精細(xì)粉 末化的氰化鋅(60g)以及氯化鉀(12g)。該懸浮液被冷卻至0°C。一股強(qiáng)烈的氯化氫氣體 流在劇烈攪拌下被吹入溶液中。在大約30-60分鐘后反應(yīng)物得到溶解。氯化氫氣體的加入 持續(xù)到它在乙醚溶液中的吸收停止為止。懸浮液在冰上繼續(xù)攪拌一個(gè)小時(shí)。該乙醚溶液從 被冰處理過的固體中傾倒而出并且水浴加熱至100°C。冷卻后，產(chǎn)品以有光澤的片的形式從 溶液中結(jié)晶出來，通過過濾移出產(chǎn)品并且風(fēng)干以給出所希望的醛。實(shí)施例2化合物2的制備
實(shí)施例
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2-噻吩乙酸乙酯(IOg)與6-溴己酸乙酯(12g)溶解于二氯甲烷(200ml)中。在 干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)下伴隨著劇烈攪拌于0°c下往溶液中加入無(wú)水AlCl3 (24g)。在干燥氮?dú)獗Ｗo(hù) 下于0°C下攪拌反應(yīng)混合物，并且當(dāng)通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成時(shí)加熱至室溫。反應(yīng)混合物 被倒入冰水中，并且用氯仿(3X200ml)進(jìn)行萃取。合并氯仿層，用無(wú)水Na2SO4干燥，并且在 真空下除去溶劑以給出粗固體。粗固體進(jìn)一步用一定梯度的氯仿/乙酸乙酯作為洗脫液在 硅膠柱上純化以生成所希望的化合物2。實(shí)施例3化合物3的制備 化合物2 (IOg)溶于乙醇中(IOOml)。往溶液中加入5M NaOH(65ml)。在室溫下攪 拌反應(yīng)混合物，并且當(dāng)通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成時(shí)用濃HCl中和。所得到的反應(yīng)混合物 用乙酸乙酯(3X200ml)進(jìn)行萃取。合并乙酸乙酯層，用無(wú)水Na2SO4干燥，并且在真空下除 去溶劑以給出所希望的化合物3。實(shí)施例4化合物4的制備 AcOK ^^ 眾 ^O 將化合物1 (6g)和化合物3 (5. Sg)懸浮于乙酸酐(IOOml)中。在室溫下往懸浮液 中加入三乙胺(6ml)。于120-140°C下加熱反應(yīng)混合物直至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成。冷 卻至室溫后，將混合物傾倒入冰水中，并且抽濾生成的沉淀物從而收集固體，風(fēng)干該固體。 重結(jié)晶粗產(chǎn)物以獲得所希望的化合物4。實(shí)施例5化合物5的制備
將化合物4(5g)懸浮于20% HCl (300ml)中。于60_70°C下加熱反應(yīng)混合物直 至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完全。用水(200ml)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行稀釋，并且用乙酸乙酯 (3X 300ml)進(jìn)行萃取。合并乙酸乙酯層，用無(wú)水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶劑以給 出粗化合物5。粗物質(zhì)進(jìn)一步用一定梯度的氯仿/甲醇作為洗脫液在硅膠柱上純化以生成 所希望的化合物5。實(shí)施例6化合物6的制備 HO. ^^ 眾 ^O 將化合物5(lg)懸浮于濃H2SO4(5ml)中。往懸浮液中加入20%發(fā)煙H2SO4(5ml)。 反應(yīng)混合物于0°C下攪拌直至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成。往冷乙醚(200ml)中滴加反應(yīng)混 合物并伴隨著劇烈攪拌以獲得作為黃色沉淀物的粗化合物6。粗物質(zhì)進(jìn)一步通過制備HPLC 使用在水中的0. 1% TFA-在MeCN緩沖系統(tǒng)中的0. 1% TFA進(jìn)行純化以產(chǎn)生所希望的化合 物6。實(shí)施例7化合物7的制備 化合物6 (IOOmg)和N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(85mg)溶于DMF (5ml)中。在 干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)下伴隨著劇烈攪拌于室溫下往溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(5mg)以及無(wú) 水三乙胺(0.1ml)。在干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)下在室溫下攪拌反應(yīng)混合物直至通過TLC表明反應(yīng)已 經(jīng)完成。反應(yīng)混合物被倒入乙醚中，并且通過過濾收集所得沉淀物。該固體用乙醚洗滌以 生成所希望的化合物7。實(shí)施例8化合物8的制備
往在DMF (0. 5ml)中的無(wú)水胼(100 μ 1)中加入在DMF (0. 5ml)中的化合物 7(100mg)?；旌衔镉诃h(huán)境溫度下攪拌15分鐘。將反應(yīng)溶液傾倒入水中，并且離心分離所得 沉淀物以收集固體，該固體用水洗滌并且風(fēng)干。粗產(chǎn)物進(jìn)一步用HPLC純化。實(shí)施例9化合物9的制備
化合物10從4-氯-2-氟間苯二酚(Fanbo Biochemicals公司，中國(guó)，北京)制備 得到，類似于制備化合物1的步驟。實(shí)施例11化合物11的制備
化合物11從化合物10與化合物3的縮合制備得到，類似于制備化合物4的步驟。實(shí)施例12化合物12的制備
化合物12從用20% HCl進(jìn)行的化合物11的酸性水解來制備，類似于制備化合物 5的步驟。
實(shí)施例13 化合物13的制備 F
化合物13從化合物12的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。 實(shí)施例14 化合物14的制備化合物14從化合物13與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例15化合物15的制備 化合物15從2，4_ 二氯間苯二酚(Fanbo Biochemicals公司)制備得到，類似于 制備化合物1的步驟。實(shí)施例16化合物16的制備化合物16 化合物17從用20% HCl進(jìn)行的化合物16的酸性水解來制備，類似于制備化合物
5的步驟。實(shí)施例18化合物18的制備
Cl
化合物16從化合物15與化合物3的縮合制備得到，類似于制備化合物4的步驟。 實(shí)施例Π 化合物17的制備
化合物17
化合物18化合物19從化合物18與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例20化合物20的制備
O OH
化合物18從化合物17的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。 實(shí)施例19 化合物19的制備
6 化合物19
OMe
化合物20
將2-噻吩乙酸乙酯(5g)與4-溴甲基苯甲酸甲酯(6. 2g)溶解于二氯甲烷(200ml) 中。在干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)下伴隨著劇烈攪拌于0°c下往溶液中加入無(wú)水AlCl3(12g)。在干燥氮 氣保護(hù)下于0°C下攪拌反應(yīng)混合物，并且當(dāng)通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成時(shí)加熱至室溫。反 應(yīng)混合物被倒入冰水中，并且用氯仿(3X200ml)進(jìn)行萃取。合并氯仿層，用無(wú)水Na2S04干 燥，并且在真空下除去溶劑以給出粗固體。粗固體進(jìn)一步用一定梯度的氯仿/乙酸乙酯作 為洗脫液在硅膠柱上純化以生成所希望的化合物20。實(shí)施例21化合物21的制備
化合物21將化合物20(5g)溶于乙醇(50ml)中。往溶液中加入5M Na0H(65ml)。在室溫下 攪拌反應(yīng)混合物，并且當(dāng)通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成時(shí)用濃HCl中和。反應(yīng)混合物用乙酸 乙酯(3X200ml)進(jìn)行萃取。合并乙酸乙酯層，用無(wú)水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶劑 以給出所希望的化合物21。實(shí)施例22化合物22的制備
化合物22
化合物22從化合物21與化合物1的縮合制備得到，類似于制備化合物4的步驟^ 實(shí)施例23 化合物23的制備
化合物23化合物23從用20 % HCl進(jìn)行的化合物22的酸性水解來制備，類似于制備化合物 5的步驟。實(shí)施例24化合物24的制備 化合物24從化合物23的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。實(shí)施例25化合物25的制備化合物25從化合物24與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例26化合物26的制備將化合物1 (Ig)和2，5- 二羧甲基噻吩(6g，Sigma-Aldrich)懸浮于乙酸酐 (IOOml)中。在室溫下往懸浮液中加入三乙胺(6ml)。于120_140°C下加熱所得到的反應(yīng)混 合物直至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成。冷卻至室溫后，將混合物傾倒入冰水中，并且抽濾得 到的沉淀物從而收集固體，風(fēng)干該固體。粗固體進(jìn)一步用一定梯度的氯仿/甲醇作為洗脫 液在硅膠柱上純化以生成所希望的化合物26。實(shí)施例27化合物27的制備
化合物27化合物27從用20% HCl進(jìn)行的化合物26的酸性水解來制備，類似于制備化合物 5的步驟。實(shí)施例28化合物28的制備 化合物28從化合物27的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。 實(shí)施例29化合物29的制各
化合物29化合物29從化合物24與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例30化合物30的制備
化合物30化合物30從2，4-二羥基-5-甲?；郊姿?Fanbo Biochemicals公司)與2-噻 吩乙酸的縮合制備得到，類似于制備化合物4的步驟。實(shí)施例31化合物31的制備
化合物31化合物31從用20% HCl進(jìn)行的化合物30的酸性水解來制備，類似于制備化合物 5的步驟。實(shí)施例32
化合物32的制備 HC HOOC
化合物32 化合物32從化合物31的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。實(shí)施例33化合物33的制備化合物33從化合物32與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例34化合物34的制備將2-苯并噻唑乙酸乙酯(5g，Sigma-Aldrich)、2，4-二羥基-5-甲酰基苯甲酸 (2g, Fanbo Biochemicals公司)，0. 5ml哌啶與0. 3ml乙酸在IOOml甲醇中在回流下加熱 至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成。冷卻至室溫后，過濾該混合物并且濃縮濾液。把濃縮的濾 液傾倒入水中，并且抽濾所得到的沉淀物從而收集固體，風(fēng)干該固體。粗產(chǎn)品進(jìn)一步用硅膠 色譜純化以生成所希望的化合物34。實(shí)施例35化合物35的制備 化合物35從化合物34的磺化作用制備得到，類似于制備化合物6的步驟。實(shí)施例36化合物36的制備
化合物36化合物36從化合物35與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例37化合物37的制備
化合物 37將甲基4-羧甲基吡啶(Methyl 4-carboxymethylpyridine) (5g)和 6_ 溴己酸甲 酯(8g)在1，2-二氯苯(50ml)中加熱至通過TLC表明反應(yīng)已經(jīng)完成。冷卻至室溫后，過濾 該混合物以收集固體，該固體用乙醚洗滌并且風(fēng)干。粗產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化被直接用于下 一步反應(yīng)中。實(shí)施例38化合物38的制備
化合物 38化合物38從化合物37與間苯二酚的哌啶催化的縮合制備得到，類似于制備化合 物34的步驟。實(shí)施例39 化合物39的制備
化合物39化合物39從化合物38的水解作用制備得到，類似于制備化合物5的步驟。實(shí)施例40化合物40的制備
Hv 化合物 40化合物40從化合物39與N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯的縮合制備得到，類似 于制備化合物7的步驟。實(shí)施例41蛋白質(zhì)-染料結(jié)合物的制備蛋白質(zhì)-染料結(jié)合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備得到，如那些在例如Haugland等， 1995, Meth. Mol. Biol. 45 205 ；Haugland, 1995, Meth.Mol.Biol.45 223 ；Haugland, 1995, Meth. Mol. Biol. 45235 ；Haugland,2000, CurrentProtocols In Cell Biology 16. 5. 1-16. 5. 22中描述的，其各自在此引入作為參考。例如，蛋白質(zhì)_染料結(jié)合物可以使用 本發(fā)明的琥珀酰亞胺基酯制備得到，如下所述。制備約lOmg/mL的蛋白質(zhì)在0. IM碳酸氫鈉中的溶液。將標(biāo)記試劑以約10mg/mL 的濃度溶于適合的溶劑例如水或DMF或DMSO中。在攪拌下將預(yù)定量的標(biāo)記試劑加入蛋白 質(zhì)溶液中。反應(yīng)混合物于室溫下培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)或于冰上培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)。染料-蛋白質(zhì)結(jié)合 物一般地通過尺寸排阻色譜例如用磷酸緩沖鹽水(PBS)平衡的Amersham PD-IO樹脂(GE Healthcare Bio-Sciences公司，Piscataway，NJ)與游離未反應(yīng)的試劑分離開。收集最初 的、含有蛋白質(zhì)的染色帶并且使用游離熒光團(tuán)的吸光系數(shù)由各熒光團(tuán)的吸光度極大值處的 吸光度測(cè)定取代的程度。由此獲得的染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物可以再分級(jí)以產(chǎn)生有更高、更低 或更均勻DOS的結(jié)合物。對(duì)于許多應(yīng)用，例如用于生產(chǎn)染料標(biāo)記的抗體，使用10至50當(dāng)量染料比1當(dāng)量 蛋白質(zhì)的摩爾比?？梢岳斫獾氖?，最佳的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來決定。染 料-蛋白質(zhì)結(jié)合的優(yōu)化方法在本領(lǐng)域是公知的，并且例如在此處引用的參考文獻(xiàn)中所描 述。實(shí)施例42抗體-染料結(jié)合物的制備下面描述制備IgG單克隆抗體的染料結(jié)合物的優(yōu)選方案。如下所注解的，基本上 使用該樣品方案制備化合物7、13、14、19、25和60的染料-結(jié)合物，并有微小變動(dòng)。步驟1.制備抗體溶液以約2-20mg/ml的濃度制備抗體在標(biāo)記緩沖液(0. 05M NaPi, pH 8. 0+0. 15M NaCl+20%甘油)中的溶液。溶液中抗體的濃度可以利用比爾_蘭伯特定律(A28tl = ep-C化)計(jì)算出來，其中 A28tl是在280nm(其為蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng))處測(cè)量的吸光度，ε p是抗體蛋白質(zhì)的摩爾 吸光系數(shù)，C是濃度，以及L是通過溶液的光程長(zhǎng)度。典型的IgG抗體有224，OOOcm-1M-1的 %值。步驟2.制備染料溶液通過將染料溶解在DMSO中制備染料溶液。如下所述測(cè)定 染料溶液的濃度。染料濃度測(cè)量的精確性可以通過先在PH 9. 6的IM甘氨酸中以1/100稀
45釋染料而得以提高。溶液中染料的濃度可以利用比爾-蘭伯特定律Amax = ε染料· C · L計(jì)算出來，其 中Amax是在染料的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量的吸光度，ε 是染料的摩爾吸光系數(shù)，C是濃度， 以及L是通過溶液的光程長(zhǎng)度。作為一個(gè)例子，化合物7酰胺的最大吸收波長(zhǎng)約為415nm。 對(duì)于其它染料化合物，反應(yīng)性染料的最大吸收波長(zhǎng)應(yīng)該在結(jié)合前測(cè)量。步驟3.進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)計(jì)算抗體和染料溶液的量以在反應(yīng)中獲得預(yù)期的摩爾過 量的染料。為了優(yōu)化研究，使用一定范圍摩爾過量的染料進(jìn)行反應(yīng)，一般介于2X和60X 之間的摩爾過量的染料。伴隨著有效的攪拌或振蕩，將抗體溶液加入到染料溶液中，并且保 持反應(yīng)混合物攪拌或振蕩1-2小時(shí)以獲得抗體_染料結(jié)合物。步驟4.純化結(jié)合物抗體-染料結(jié)合物可以使用Bio-Spin柱進(jìn)行純化。裝載 50 μ 1的抗體-染料結(jié)合物溶液以及50 μ 1的追蹤(chase)緩沖液(PBS+20%甘油+0. 1% NaN3)于Bio-Spin柱上，將Iml chase緩沖液放入旋轉(zhuǎn)(spin)柱的接收管中，并且分離。分 離后渦旋?？蛇x擇地，按照制造者的方案，抗體_染料結(jié)合物可以使用PD-IO柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)進(jìn)行純化。步驟5.測(cè)定抗體_染料結(jié)合物的取代度取代度(DOS)使用下列等式進(jìn)行計(jì)算DOS =[染料]/ [抗體]=Afflax · ε ρ/ ε 染料· (A280-O. 55 · Afflax))，其中[染料]是染料濃度，[抗體]是抗體濃度，Afflax是在染料的最大吸收波長(zhǎng)處 測(cè)量的吸光度，A28tl是在280nm處測(cè)量的吸光度，ε p是抗體蛋白質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，ε 是染料的摩爾吸光系數(shù)。應(yīng)當(dāng)注意到的是，為獲得準(zhǔn)確的DOS，結(jié)合物不應(yīng)該有未結(jié)合的染 料。為了有效地標(biāo)記，取代度一般應(yīng)落入3-20摩爾染料比一摩爾抗體的范圍之間。作 為本領(lǐng)域公知的，提供最佳標(biāo)記的DOS將取決于抗體，以及在某些情況下，更高的DOS可能 提供提高的標(biāo)記。通過制備一定范圍DOS的染料結(jié)合物并比較測(cè)得的熒光強(qiáng)度來經(jīng)驗(yàn)性地 決定最佳標(biāo)記。例子公開在圖中。實(shí)施例43高IM鹽氧補(bǔ)白類的染料結(jié)合4勿的泡丨備在pH 5. 5的ImL 0. IM乙酸鹽、0. 135M NaCl中的5mg山羊IgG抗體樣品(其具 有連接于蛋白質(zhì)的多糖鏈)用2. Img偏高碘酸鈉在冰上處理根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷的足以使糖蛋白 上有所希望量的醛基的一段時(shí)間，其隨后與化合物5反應(yīng)。通過加入30μ L乙二醇停止反 應(yīng)。在填充于PH 7. 2的PBS中的S印hadex G25柱上純化抗體。加入十分之一體積的IM碳 酸氫鈉以提高PH并且以50 1的染料與蛋白質(zhì)的摩爾比加入化合物5。反應(yīng)物在室溫下 攪拌根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷的足以產(chǎn)生所希望染料/蛋白質(zhì)比例的一段時(shí)間。加入氰基硼氫化鈉至 IOmM的最終濃度并且在室溫下攪拌反應(yīng)物4個(gè)小時(shí)。通過透析并在如上所述的S印hadex G25柱上純化抗體結(jié)合物。凝膠中和污漬上的高碘酸鹽氧化的糖蛋白也能被標(biāo)記，基本上如 Estep 和 Miller，1986，Anal. Biochem. 157 :100_105 中所述，在此引入作為參考。實(shí)施例44- /5M^wmsa JlT-染料結(jié)合奪勿制備β-半乳糖苷酶(一種富含游離巰基基團(tuán)的蛋白質(zhì))在PBS中的溶液(2. Omg在400 μ L中)。隨后用在DMF中的馬來酰亞胺衍生物化合物9的10mg/L溶液處理該蛋白 質(zhì)溶液。在旋轉(zhuǎn)柱上移除未反應(yīng)的染料。如實(shí)施例42中所描述的那樣，使用游離染料的吸 光系數(shù)估計(jì)被染料取代的程度。校正化合物9在280nm波長(zhǎng)處的吸光度，由280nm處的吸 光度估算蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例45氨基葡聚糖_染料結(jié)合物的制備如下所述制備氨基葡聚糖一染料結(jié)合物，使用用平均13個(gè)氨基衍生的70，000MW 氨基葡聚糖(50mg)作為例子進(jìn)行描述。將氨基葡聚糖(50mg)以10mg/mL溶解于0. IM NaHCO3中。加入化合物7、13、14、19、25或60以給出約10-15的染料/葡聚糖比例。6-12 個(gè)小時(shí)后，所得結(jié)合物在SEPHADEX G-50上純化并且用水洗脫。一般6_10摩爾染料被結(jié)合 至70，000MW葡聚糖上。實(shí)施例46染料標(biāo)記的微球體的制備可以使用許多公知方案的任意一種用本發(fā)明的染料來標(biāo)記微球體。例子在下面被 描述。進(jìn)行化學(xué)修飾使表面上有官能團(tuán)例如氨基、羧基或醛的微球體可以通過表面基團(tuán) 共價(jià)結(jié)合相應(yīng)的如表1中所列的反應(yīng)性染料而被表面標(biāo)記。例如，胺修飾的微球體可以容 易地通過琥珀酰亞胺基酯例如化合物7、13、14、19、25或60而結(jié)合本發(fā)明的染料。如上所述制備的染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以通過它的胺殘基使用乙基3_( 二甲氨基 丙基)碳化二亞胺(EDAC)被共價(jià)偶聯(lián)至微球體上的羧化物基團(tuán)。可選擇地，染料標(biāo)記的蛋 白質(zhì)可以被動(dòng)地吸附在微球體上。例如，羧化物修飾的微球體被懸浮于溶液染料標(biāo)記的蛋 白質(zhì)中，該蛋白質(zhì)允許被動(dòng)地吸附于微球體上，并且過量的蛋白質(zhì)通過離心分離作用以及 洗滌除去。不能被離心分離的這一尺寸的微粒利用經(jīng)過有高M(jìn)W截?cái)嗟陌胪改さ耐肝龌蚰?膠過濾層析與過量蛋白質(zhì)中分離開。如上所述，生物素化的微球體可以用結(jié)合至本發(fā)明的染料的鏈霉抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白或抗生物素進(jìn)行處理。實(shí)施例47核苷酸-染料結(jié)合物的制備與本發(fā)明的染料結(jié)合的核苷酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知或出版的步驟 例如那些公開在 M. Nimmakayalu 等，2000, Biotechniques 28，518-522 ；Muhlegger 等， 1990，Biol Chem Hoppe Seyler 371，953-965 ；和 Giaid 等，1989，Histochemistry 93， 191-196中的步驟輕易地制備得到，其各自在此引入作為參考。在下面描述了具體的結(jié)合的 例子。向在ΙΟΟμΙ水中的2mg 5_(3_氨基烯丙基)_2 ‘-脫氧尿苷5'-三磷酸酯 (Sigma-Aldrich)中，加入在 100 μ L DMF 中的化合物 7、13、14、19、25 或 60 和 5 μ L 三乙胺。 在3個(gè)小時(shí)后，蒸發(fā)溶液并且通過HPLC純化殘留物。對(duì)產(chǎn)物部分進(jìn)行凍干以給出熒光核苷 酸結(jié)合物?？蛇x擇地，脫氧尿苷5 ‘-三磷酸酯的熒光染料_結(jié)合物從5- (3-氨基-1-丙炔 基)_2'-脫氧尿苷5'-三磷酸鹽來制備，或者通過用本發(fā)明的巰基-反應(yīng)性的染料(例
47如馬來酰亞胺化合物9)處理巰基化的核苷酸或硫代磷酸酯核苷酸來制備?？蛇x擇地，2' _(或3' )-2-氨乙基氨基羰基腺苷5'-三磷酸酯與稍微過量的 化合物7、13、14、19、25或60進(jìn)行反應(yīng)，接著用乙醇沉淀，利用制備HPLC純化核糖修飾的產(chǎn) 物。實(shí)施例48低聚核苷酸_染料結(jié)合物的制備將5'-胺修飾的、18-堿M13引物序列(約100 μ g)溶解于4μ 1水中。往其中 加入在ρΗ 8. 5的100 μ 1 0. IM硼酸鈉中的250 μ g化合物7、13、14、19、25或60。在16個(gè) 小時(shí)后，加入10 μ 1 5Μ NaCl和3體積的冷乙醇。將混合物冷卻至_20°C、離心分離，將上清 液傾倒出，用乙醇洗滌顆粒，并且隨后將顆粒溶解于IOOyL水中。被標(biāo)記的低聚核苷酸通 過HPLC被純化。收集所希望的峰并且蒸發(fā)給出發(fā)熒光的低聚核苷酸_染料結(jié)合物。實(shí)施例49使用染料_抗體結(jié)合物通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法講行細(xì)胞分析結(jié)合了本發(fā)明的染料化合物的被分析物-特異性抗體(即標(biāo)記的抗體)用于通過 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行血細(xì)胞(例如，在全血樣品中)分析。所標(biāo)記的抗體用于標(biāo)記(染色) 細(xì)胞的蛋白質(zhì)，并且使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定所標(biāo)記的蛋白質(zhì)。全血的樣品(100 μ L)(優(yōu)選收集在EDTA中)一般在黑暗中以每0. Iml血液1 μ g 或更少的染料結(jié)合物濃度用抗體_染料結(jié)合物染色30-60分鐘。染色后，將2mL的1 X FACS 溶解溶液(Lysing Solution) (BD Bioscience, San Jose，CA)加入到樣品中，樣品在旋渦攪 拌器中以中等速度混合并且隨后室溫培養(yǎng)10分鐘。以2-500g(優(yōu)選2-300)離心樣品5分 鐘并且傾倒出上清液。洗滌樣品(在2mL 0.5%BSA/PBS洗滌緩沖液中再懸浮、混合并且離 心)兩次，在0. 5mL洗滌緩沖液或150 μ 1定色穩(wěn)定緩沖液中再懸浮，并且保持在4°C直至進(jìn) 行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。染色細(xì)胞的分析優(yōu)選使用配備有藍(lán)色(488nm)、紅色(-633nm)和紫色(405nm)激 光的BD LSR II流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BD Biosciences, San Jose，CA)來實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)光學(xué)包括 在525/50nm熒光檢測(cè)通道中進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合了染料化合物例如化合物7、13和25的熒光 生物聚合物顯示出密切匹配紫激光的405nm發(fā)射的激發(fā)極大值，并且來自生物聚合物的發(fā) 射在525/50nm檢測(cè)通道中進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)制造者的指令設(shè)定流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。染色細(xì)胞 樣品的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析根據(jù)制造者的方案進(jìn)行，并且使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析數(shù) 據(jù)以獲得感興趣的細(xì)胞群的中值熒光強(qiáng)度。將被理解的是，使用的具體的抗體結(jié)合物和所用的具體反應(yīng)組分和具體反應(yīng)條件 會(huì)對(duì)獲得的結(jié)果有影響。應(yīng)當(dāng)操作常規(guī)試驗(yàn)方法以測(cè)定優(yōu)選的反應(yīng)組分，例如緩沖液或溶 解溶液，以及反應(yīng)條件，包括染色時(shí)間和溫度。所述分析條件的常規(guī)優(yōu)化法是基于免疫染色 分析領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。實(shí)施例50抗⑶4、⑶8和⑶45抗體的染料結(jié)合物使用對(duì)CD4 和 CD45(分別為克隆 SK3 和 2D1，來自 BD Biosciences, San Jose, CA) 特異性的抗體制備染料-結(jié)合物，其各自在單獨(dú)的制劑中以一定范圍的染料與蛋白質(zhì)之比 結(jié)合至化合物7、13和25?？贵w-染料結(jié)合物基本上如在上面實(shí)施例42中所描述的那樣進(jìn)
48行制備。CD4和CD45抗體的抗體-結(jié)合物基本上如在上面實(shí)施例49中所描述的那樣被用 于分析全血樣品中的淋巴細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明了對(duì)于各抗體-染料對(duì)來說優(yōu)選的染料與蛋白質(zhì)之比。對(duì)于各抗體，最 佳的染料與蛋白質(zhì)之比對(duì)三種染料中的每一種出現(xiàn)在類似的比值處。比較與相同染料結(jié)合 的不同的抗體，最佳的染料與蛋白質(zhì)之比有顯著不同，其中對(duì)于CD4在更高比例處觀察到 最佳的熒光。在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于染料與蛋白質(zhì)之比高于最佳比值的(超出測(cè)試范圍)⑶4 染料結(jié)合物，沒有觀察到可察覺得到的自猝滅，熒光仍然保持著最佳水平。相比之下，對(duì)于 染料與蛋白質(zhì)之比高于最佳比值的CD45染料結(jié)合物，觀察到顯著的自猝滅。比較使用各染 料化合物獲得的最大熒光染色，化合物7產(chǎn)生比化合物13更好的熒光染色，化合物13產(chǎn)生 比化合物25更好的熒光染色。該結(jié)果表明所有三種染料結(jié)合物能用于制備用于通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析 的免疫熒光分析的抗原特異性檢測(cè)試劑。一般而言，對(duì)于將被標(biāo)記的各特異性抗體，各最佳 的染料與蛋白質(zhì)之比要經(jīng)驗(yàn)性地來加以確定(通過常規(guī)優(yōu)化法)。實(shí)施例51抗⑶3、⑶4、⑶8和⑶45抗體的染料結(jié)合物使用四種不同的抗體CD3、CD4、CD8和CD45抗體(分別為克隆SK7、SK3、SKl和 2D1，來自BD Biosciences, San Jose, CA)制備染料結(jié)合物，抗體各自在單獨(dú)的制劑中以一 定的染料/蛋白質(zhì)比值范圍結(jié)合至化合物7?？贵w-染料結(jié)合物基本上如在上面實(shí)施例42 中所描述的那樣進(jìn)行制備。CD3、CD4、CD8和CD45抗體的染料結(jié)合物基本上如在上面實(shí)施 例49中所描述的那樣被用于分析全血樣品中的淋巴細(xì)胞。分析結(jié)果概述在附圖3-6中，其表示為對(duì)于各染料結(jié)合物的染料與蛋白質(zhì)之比所 繪制的染料結(jié)合物標(biāo)記的淋巴細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度的曲線。在附圖3-5中，熒光強(qiáng)度被記 錄為“染色指數(shù)”，該染色指數(shù)提供了一種在測(cè)自未被染色、“負(fù)數(shù)”細(xì)胞群的信號(hào)(即，背 景)上的被染色細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度高于相對(duì)于由未染色細(xì)胞群測(cè)量的熒光分布寬度的量 度(參見Maecker等，2004，Cytometry PartA 62A 169-173，在此引入作為參考)。染色指 數(shù)如下定義染色指數(shù)=(S-U)/ (2*SD_ 負(fù)數(shù))，其中S是測(cè)量自染色細(xì)胞群的中值熒光強(qiáng)度(MFI)，U是未染色細(xì)胞群的MFI，以 及SD_負(fù)數(shù)是未染色細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在附圖6中，熒光強(qiáng)度被記錄為中值 熒光強(qiáng)度(MFI)。因?yàn)棰?5抗體結(jié)合至所有的淋巴細(xì)胞，所以其中沒有被用作這些實(shí)驗(yàn)中 背景的量度的未染色淋巴細(xì)胞群，且不能計(jì)算染色指數(shù)。在下表4中提供了對(duì)于各染料結(jié)合的抗體的最佳染料與蛋白質(zhì)之比。M4最佳的染料與蛋白質(zhì)之比
抗體特異性優(yōu)選的染料與蛋白質(zhì)之比CD35 附圖3表示使用結(jié)合于化合物7的CD3抗體的染料結(jié)合物在一定范圍的染料與蛋 白質(zhì)之比內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。所獲得的最大染色指數(shù)說明化合物7所標(biāo)記的這一 CD3抗 體的染料結(jié)合物使得在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光分析中有可能辨別出超出背景熒光的染色 的淋巴細(xì)胞群。對(duì)于這一抗體和染料組合，在高于最佳值的染料與蛋白質(zhì)之比處觀察到自 猝滅。附圖4表示使用結(jié)合于化合物7的CD4抗體的染料結(jié)合物在一定范圍的染料與蛋 白質(zhì)之比內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。所獲得的最大染色指數(shù)說明化合物7所標(biāo)記的這一 CD4抗 體的染料結(jié)合物使得在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光分析中有可能辨別出超出背景熒光的染色 的淋巴細(xì)胞群。對(duì)于這一抗體和染料組合，在高于最佳值的染料與蛋白質(zhì)之比處觀察到極 少的自猝滅，從而提供了寬范圍的可用比值。附圖5表示使用結(jié)合于化合物7的CD8抗體的染料結(jié)合物在一定范圍的染料與蛋 白質(zhì)之比內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。所獲得的最大染色指數(shù)說明化合物7所標(biāo)記的這一 CD8抗 體的染料結(jié)合物使得在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光分析中有可能辨別出超出背景熒光的染色 的淋巴細(xì)胞群。對(duì)于這一抗體和染料組合，在高于最佳值的染料與蛋白質(zhì)之比處觀察到極 少的自猝滅，從而提供了寬范圍的可用比值。附圖6表示使用結(jié)合于化合物7的CD45抗體的染料結(jié)合物在一定范圍的染料與 蛋白質(zhì)之比內(nèi)所獲得的數(shù)據(jù)曲線。由于MFI取決于，例如，光感測(cè)器的增益，所獲得的最大 值MFI并不直接表明染料結(jié)合物對(duì)于區(qū)別細(xì)胞群的用處。然而，觀察到用化合物7標(biāo)記的 這一 CD45抗體的染料結(jié)合物提供了在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光分析中使用的淋巴細(xì)胞群的 足夠標(biāo)記。對(duì)于這一抗體和染料組合，在高于最佳值的染料與蛋白質(zhì)之比處觀察到自猝滅， 這表明可用比值的范圍較窄。
50
權(quán)利要求
一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)其中HC為雜環(huán)；R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺酰基、膦?；?、硼酸、L RG、WSG或其本身被鹵素、氨基、羥基、磺?；?、膦酰基、羰基、硼酸、L RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體；WSG是水溶性基團(tuán)；R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一個(gè)含有L RG；和R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一個(gè)是WSG。FSA00000194309700011.tif
2.權(quán)利要求1的化合物，其中HC選自
3.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下結(jié)構(gòu) 其中X 是 O、S、NH 或 NRltl ； Y 是 NH、NR11、CH 或 CR12 ； R1>R2>R3>R4>R5>R6>Rio>RII和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、 芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；?、硼酸、L-RG、WSG或其本身任選地被鹵素、氨基、 輕基、磺?；㈧Ⅴ；Ⅳ驶?、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)； L是任選的連接體； WSG是水溶性基團(tuán)；R1^ R2> R3> R4> R5> R6> Rio> R11 和 R12 中的至少一個(gè)含有 L-RG ；和 禮、R2、R3> R4> R5> R6> R10、R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG0 4.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)其中 X是0或S ；
4. R1^ R2> R3> R4> R10> R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫 基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥 基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)； L是任選的連接體； WSG是水溶性基團(tuán)；禮、R2、R3> R4> R10> R11和R12中的至少一個(gè)含有L-RG ；和 R” R2、R3、R4、R10、R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。
5.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下化學(xué)式其中 X是0或S ；R1^ R2> R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、 疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；⑴鹚?、L-RG、WSG或其本身任選地被鹵素、氨基、羥基、磺 ?；?、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)； L是任選的連接體； WSG是水溶性基團(tuán)；禮、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一個(gè)含有L-RG ； 禮、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一個(gè)是WSG ；禾口R10和R11中的至少一個(gè)含有磺酸鹽。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的化合物，其中RG是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活性酯、酰疊 氮、?；?、醛、烷基鹵、酐、芳基鹵、疊氮化物、氮丙啶、硼酸酯、重氮烷、鹵代乙酰胺、鹵代三 嗪、胼、羥胺、亞氨基酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、反應(yīng)性鉬絡(luò)合物、磺酰鹵或補(bǔ) 骨脂素衍生物。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的化合物，其中L是沒有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基或雜芳基。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的化合物，其中WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、 銨、吡啶鐺、喹啉鐺或吖啶鐺。
9.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下化學(xué)式 其中X是0或S ；禮、R2、R3> R4> R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽； RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)； L是任選的連接體；和 其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中RG是羧酸的活性酯、酰疊氮、酰基腈、醛、烷基鹵、芳基 鹵、疊氮化物、氮丙啶、鹵代乙酰胺、鹵代三嗪、胺、胼、羥胺、亞氨基酯、異氰酸酯、異硫氰酸 酯或馬來酰亞胺。
11.權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)的化合物，其中L是沒有或具有3-20個(gè)碳原子的以下 物質(zhì)烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺或聚乙二醇。
12.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下化學(xué)式 其中禮、R2、R3> R4> R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽； RG是化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；L是任選的連接體，它是沒有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙 二醇、芳基、芳烷基或雜芳基，和其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中RG是羧酸的活性酯、酰疊氮、?；妗⑷?、烷基鹵、芳基 鹵、疊氮化物、氮丙啶、鹵代乙酰胺、鹵代三嗪、胺、胼、羥胺、亞氨基酯、異氰酸酯、異硫氰酸 酯或馬來酰亞胺。
14.權(quán)利要求1的化合物，其具有以下化學(xué)式 其中R3> R4> R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽； η為1-10的整數(shù)；和R1>R2>R3>R4>R5>R6>Rio>RII和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、 芳硫基、疊氮基、氨基、羥基、磺酰基、膦?；?、硼酸、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥基、其中Rltl和R11中的至少一個(gè)是磺酸鹽。
15. 一種染料結(jié)合物，其具有以下化學(xué)式其中 HC為雜環(huán)；禮、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、疊 氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦酰基、硼酸、WSG或其本身被商素、氨基、羥基、磺酰基、膦?；?羰基、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； WSG是水溶性基團(tuán)； η是1-35的整數(shù)； SUB是底物；禮、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S上；和 禮、R2、R3> R4> R5和R6中的至少一個(gè)是WSG。
16.權(quán)利要求15的染料結(jié)合物，其中HC選自 磺?；?、膦?；?、羰基、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； WSG是水溶性基團(tuán)； η是1-35的整數(shù)； SUB是底物；RrRyRyRpRpRpRlt^R11和R12中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到SUB上；和Ri> R2> R3> R4> R5> R6> Rio> Rn 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。
17.權(quán)利要求15的染料結(jié)合物，其具有以下結(jié)構(gòu)其中 X 是 0、S、NH 或 NRltl ； Y 是 NH、NR11、CH 或 CR12 ；
18.權(quán)利要求15的染料結(jié)合物，具有以下結(jié)構(gòu) 其中X是0或S ；R1^ R2> R3> R4> R10> R11和R12獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫 基、疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦?；?、硼酸、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥基、磺酰 基、膦?；Ⅳ驶?、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； WSG是水溶性基團(tuán)； η是1-35的整數(shù)； SUB是底物；H R3、R4、R10, R11和R12中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S上；和 R” R2、R3、R4、R10、R11 和 R12 中的至少一個(gè)是 WSG。
19.權(quán)利要求15的染料結(jié)合物，其具有以下化學(xué)式 其中X是0或S ；R1^ R2> R3、R4、R10和R11獨(dú)立地是H、鹵素、烷基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、 疊氮基、氨基、羥基、磺?；?、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任選地被商素、氨基、羥基、磺?；?膦?；?、羰基、硼酸或WSG —次或多次取代的烷基或烷氧基； WSG是水溶性基團(tuán)； η是1-35的整數(shù)； SUB是底物；R1^ R2> R3、R4、R10和R11中的至少一個(gè)通過任選的連接體L共價(jià)結(jié)合到S上；禮、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一個(gè)是WSG ；禾口R10和R11中的至少一個(gè)含有磺酸鹽。
20.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的染料結(jié)合物，其中L是沒有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨 基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基或雜芳基。
21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的染料結(jié)合物，其中WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、 硼酸根、銨、吡啶鐺、喹啉鐺或吖啶鐺。
22.權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的染料結(jié)合物，其中SUB為生物聚合物。
23.權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的染料結(jié)合物，其中SUB為抗體。
24.權(quán)利要求15的染料結(jié)合物，其具有以下化學(xué)式其中 X是0或S ；禮、R2、R3> R4> R10和R11獨(dú)立地是氫、氯、氟、氰基或磺酸鹽； L是任選的連接體； SUB是底物；和R10和R11的至少一個(gè)是磺酸鹽。
25.權(quán)利要求24的染料結(jié)合物，其中L是沒有或具有3-20個(gè)碳原子的以下物質(zhì)烷基、 烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺或聚乙二醇。
26.權(quán)利要求24的染料結(jié)合物，其中SUB為生物聚合物。
27.權(quán)利要求24的染料結(jié)合物，其中SUB為抗體。
28.檢測(cè)樣品中的被分析物的方法，包括a)使所述樣品與包含權(quán)利要求15-27中任一項(xiàng)的染料結(jié)合物的檢測(cè)試劑在所述檢測(cè) 試劑將與所述被分析物形成絡(luò)合物的條件下混合；b)檢測(cè)所述絡(luò)合物。
29.—種試劑盒，其包含至少一種具有化學(xué)式1、化學(xué)式2、化學(xué)式3、化學(xué)式4、化學(xué)式 5、化學(xué)式6、化學(xué)式7或化學(xué)式8結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性染料化合物。
30.一種試劑盒，其包含至少一種具有化學(xué)式9、化學(xué)式10、化學(xué)式11、化學(xué)式12或化 學(xué)式13結(jié)構(gòu)的染料結(jié)合物。
31.一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明描述了化學(xué)反應(yīng)性的、水溶性的、雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料、它們的生物結(jié)合物和用途。衍生自反應(yīng)性的雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料的結(jié)合物用于分析生物化合物。這些雜環(huán)取代的7-羥基香豆素染料特別用作生物聚合物檢測(cè)試劑例如抗體或核酸探針的熒光標(biāo)記。本發(fā)明的染料-抗體結(jié)合物特別用于使用配有紫激光作為激發(fā)光源的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)被分析物進(jìn)行分析，因?yàn)樗鼈冊(cè)?05nm處有強(qiáng)吸收且熒光量子收率高。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101914093SQ20101022895
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者B·阿布拉姆斯, T·杜布洛韋斯基, 孟慶林, 廖勁芳, 第五振君 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司