專利名稱：一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使 用方法。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒病是由西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)引起的傳染病，是一種 人獸共患病。人類感染西尼羅病毒后并不互相傳播，通常為隱性感染.潛伏期為3 15 天，大部分感染者癥狀輕微，伴有發(fā)熱，頭痛，喉嚨痛，背痛，肌肉疼痛，關(guān)節(jié)痛，疲勞，結(jié)膜 炎，皮疹，淋巴結(jié)腫大，納差，腹痛，腹瀉及呼吸道癥狀等。對(duì)于老年人和兒童可能引起高熱 (^ 40°C )，劇烈頭痛及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，如頸項(xiàng)強(qiáng)直，昏睡，昏迷，抽搐，麻痹等，甚 至引起死亡。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測(cè)抗體、雙抗體夾心測(cè)抗原、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等。間接法測(cè)抗體 的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合 物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記抗體-抗體-固相抗原 復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平 臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測(cè)定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸 研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和方法評(píng)價(jià)及優(yōu)化，以縮 短檢測(cè)時(shí)間，降低方法的檢測(cè)成本。但是懸浮芯片方法是否能夠檢測(cè)人血清中的西尼羅抗 體，其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片 包括編碼微球，作為包被編碼微球抗原的西尼羅E蛋白、生物素標(biāo)記的二抗和SPA作為捕 獲抗體，鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)及相關(guān)緩沖溶液。本發(fā)明提供上述檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，該方法具體為在 相關(guān)緩沖溶液中，編碼微球用西尼羅E蛋白抗原包被、用生物素標(biāo)記的檢測(cè)物為羊抗兔IgG 或/和Biotin-SPA、用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號(hào)檢測(cè)物，所述編碼微球優(yōu)選 025號(hào)編碼微球。本發(fā)明提供一種采用蛋白懸浮芯片檢測(cè)血清樣樣本中西尼羅抗體的間接免疫學(xué) 檢測(cè)方法，該方法采用間接法檢測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)原理，具體為在檢測(cè)過(guò)程中所有反應(yīng) 可在96孔濾板上或在微量離心管中進(jìn)行，其中包括下列步驟(1)將西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來(lái)包被編碼微球；(2)每孔或管中加入含有已包被捕獲抗原，即西尼羅E蛋白抗 原的編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測(cè)血清樣品，孵育后清洗；(4)加入用 生物素化的檢測(cè)物，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(6) 加入檢測(cè)緩沖液后混勻，(7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值(即平均熒光強(qiáng)度)并分析數(shù) 據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果陰性或陽(yáng)性。該方法中，采用生物素標(biāo)記的SPA作為檢測(cè)物，并且其與西尼羅E蛋白組 合組成間接法檢測(cè)體系；包被編碼微球的捕獲抗原西尼羅E蛋白抗原用量為0. 1 240 μ g/1. 25 X IO6個(gè)編碼微球或0. 02 960ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，標(biāo)記檢測(cè)抗體 羊抗兔IgG的生物素為羧基活性的生物素。步驟(4)中采用2mg/mL生物素化的檢測(cè)抗體 Bioin-SPAWl 2500稀釋作為檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供一種采用蛋白懸浮芯片定 量檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的方法，該方法包括下列步驟(1)加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品或 標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)4倍梯度倍比系列稀釋，(2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測(cè)讀取對(duì)應(yīng)熒 光值(MFI) ； (3)制作樣品濃度對(duì)應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，(4)用分析軟件擬合劑 量-反應(yīng)曲線和方程，(5)根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線可判定方法的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，未知濃度樣品 可根據(jù)劑量_反應(yīng)方程判斷檢測(cè)樣品的濃度。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分 析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。其在以下懸浮芯片 系統(tǒng)中完成檢測(cè)，標(biāo)記探針的微球與待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后，利用機(jī)器自動(dòng) 將反應(yīng)液吸起并通過(guò)一微細(xì)管檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中 設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目； 一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定 微球的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物， 則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測(cè)到。再通過(guò)機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的 微球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本中有無(wú)待 測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)， 克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用 激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重 復(fù)性好等特點(diǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)和深入的研究，對(duì)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢 測(cè)條件作了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗原包被量的改進(jìn)西尼羅E蛋白抗原的包被量是成功檢測(cè)的關(guān)鍵，本發(fā)明對(duì)包被微球的抗原包被量 進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測(cè)效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很 低，本發(fā)明的抗原包被量為0. 1 240 μ g/1. 25 X IO6個(gè)編碼微球或0. 02 960ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為1 μ g/測(cè)試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)通常，標(biāo)記抗體需要使用過(guò)量的生物素。理論上講，在檢測(cè)過(guò)程中，過(guò)量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接，清洗時(shí)被抽濾掉，不會(huì)與隨后加 入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，偶爾遇到過(guò)檢測(cè)信號(hào)可能過(guò)高的現(xiàn) 象，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記2mg/mL的 IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍本發(fā)明的血清樣品西尼羅抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片定量檢測(cè)方法與經(jīng)典的免疫學(xué) ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果有著很好的吻合性(相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 964)。同時(shí)，懸浮芯片方法靈敏 度為血清滴度4. 9 X 10_6，其高于ELISA方法的檢測(cè)滴度7. 8 X 10_5，靈敏度增高10倍以上； 并且懸浮芯片方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為4. 9Χ 10_6 2Χ 10_2，其高于ELISA方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍 (即7. 8 X 10_5 2 X IO"2) 1個(gè)數(shù)量級(jí)。4、方法的特異性本發(fā)明通過(guò)選用西尼羅E蛋白為包被抗原，以兔抗西尼羅抗體為待測(cè)抗體，以生 物素化的羊抗兔為檢測(cè)抗體。本研究試驗(yàn)證明，在存在鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感Η5血 清、兔抗土拉FopA多克隆抗體、兔抗登革熱NS3抗體等干擾抗體存在的條件下，本方法具有 良好的特異性。5、樣品的檢測(cè)能力本發(fā)明評(píng)價(jià)了懸浮芯片方法對(duì)人血清的檢測(cè)能力。通過(guò)對(duì)人血清的檢測(cè)，初步證 實(shí)了該方法在檢測(cè)人血清中西尼羅抗體的實(shí)用性。


圖1為025號(hào)微球包被西尼羅E蛋白檢測(cè)西尼羅抗體示意圖；圖2為蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為蛋白懸浮芯片與ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式如圖1至圖4所示，本發(fā)明涉及的檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢測(cè) 及定量方法通過(guò)下面的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不以任何方式受該實(shí)施例的 限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ； KH2P042mmol/L。用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HPO4 和 0. 24g ΚΗ2Ρ04。用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘， 或過(guò)濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05M MES，pH 5. 0 2. 44g MES，5N NaOHO. 15mL，定容于
5250mL。(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%疊氮化物，pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測(cè)緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS,1% BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11)生物素化檢測(cè)物稀釋液PBS-TBN(PBS，0. 1% BSA, 0. 02% TWEEN-20,0. 05% NaN3, pH7. 4)。(12) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA。2.抗原與抗體本發(fā)明所使用的抗原為西尼羅E蛋白，可購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物流行病 研究所。本發(fā)明所使用檢測(cè)抗體為兔抗西尼羅IgG，可購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物流 行病研究所，檢測(cè)抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，所述的羊抗兔IgG可購(gòu)自北 京鼎國(guó)生物技術(shù)公司、SPA可購(gòu)自Sigma公司。二、待測(cè)樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗西尼羅IgG，干擾樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣品是目標(biāo)檢 測(cè)物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗土拉抗 體、兔抗登革熱NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液 中，-4°C保存。兔抗西尼羅IgG的儲(chǔ)備液滴度為0.08。比較實(shí)驗(yàn)中，相同樣品用于ELISA和 懸浮芯片的檢測(cè)。將待分析的兔抗西尼羅IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品， 以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè)的敏感度，高濃度樣 品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測(cè)。實(shí)施例1、檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備
1、捕獲抗原包被編碼微球本發(fā)明采用的025號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，編碼微球用于標(biāo)記可以捕 獲西尼羅抗體的西尼羅E蛋白抗原，即利用西尼羅E蛋白包被微球。Α、編碼微球的活化取100 μ L (1. 25 X IO6個(gè))編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出 并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室 溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7· 4)，震蕩后，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清
6液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7· 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原西尼羅E蛋白抗原1 50 μ g加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩 沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時(shí)。14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L 的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液 懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微 球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。 根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。2、檢測(cè)物標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì)算好體 積的生物素加入到待標(biāo)記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時(shí))，過(guò)柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存?zhèn)溆?。B、抗體的用量以標(biāo)記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實(shí)施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 1 μ g、2y g、4y g、6y g、8y g、10y g、12y g、16y g、20y g、24y g 的量包被 100 μ L編碼為025號(hào)的微球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以1 24μ g/1. 25 X IO6個(gè)編碼微球或 0. 2 96ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存待 用。如圖1所示，包被西尼羅E蛋白抗原的025號(hào)微球均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，并且獲得 高信噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000)，說(shuō)明優(yōu)化的懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于西尼羅抗體 的檢測(cè)。2、生物素化檢測(cè)物的優(yōu)化本發(fā)明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性 的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，經(jīng)質(zhì)控過(guò)程檢測(cè)效 果比較，本實(shí)驗(yàn)中Sulfo-NHS-生物素標(biāo)記檢測(cè)物檢測(cè)效果較好，檢測(cè)效果的方法采用本領(lǐng) 域的常規(guī)方法或按照制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1 500稀釋 作為檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)兔血清中的西尼羅抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物Bio-羊抗 兔抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果；2mg/mL生物素化的檢測(cè)物Biotin-SPA 以1 2500稀釋作為檢測(cè)人血清中西尼羅抗體的檢測(cè)物，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物 Biotin-SPA可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果。實(shí)施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測(cè)及結(jié)果判定1、待測(cè)樣品制備
用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配制為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定檢測(cè)過(guò)程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程如下1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用檢測(cè)物稀釋液稀釋后的生物素化檢測(cè)物，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明定義蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測(cè)西尼羅 抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)物濃度。其中， Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即 Cutoff值為=MFI (空白對(duì)照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢測(cè)結(jié)果高于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定 為西尼羅抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果低于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為西尼羅抗體檢 測(cè)結(jié)果陰性。實(shí)施例4、懸浮芯片對(duì)西尼羅蛋白抗原特異性檢測(cè)應(yīng)用懸浮芯片檢測(cè)方法分別對(duì)兔抗西尼羅IgG、鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5血 清、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例3 中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗西尼羅IgG為陽(yáng)性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說(shuō)明本發(fā) 明所建立的西尼羅抗體的懸浮芯片檢測(cè)方法與其它測(cè)試抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異 反應(yīng)。實(shí)施例5、懸浮芯片定量檢測(cè)模型的建立1、兔抗西尼羅IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗西尼羅IgG標(biāo)準(zhǔn)品由滴度為0. 08以4倍倍比梯度稀釋至滴 度為3. 125X 10_7成系列濃度樣品。2、劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)結(jié) 果繪制劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表滴度，Y軸代表懸浮芯片儀檢 測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系設(shè)定， 圖2中兔抗西尼羅血清的滴度分別為=Sl 3. 125X IO"7, S2 :1· 25X IO"6, S3 :5Χ10_6，S4 2Χ 10_5，S5 :8. OX 10_5，S6 :3. 12Χ 10_4，S7 :1. 25Χ 10_3，S8 :5Χ 10_3，S9 :2Χ 10_2，SlO :0. 08。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合兔抗西尼羅IgG劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程FI = -2. 07898+(13723. 6+2. 07898) / [1+(Conc/0. 141595)37795J0'7153133、懸浮芯片檢測(cè)兔抗西尼羅IgG的最低檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本發(fā)明即蛋白懸浮芯片方法檢 測(cè)兔抗西尼羅IgG的最低檢測(cè)限即血清滴度為0. 000035。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃度。根
8據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗西尼羅IgG濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)兔抗西尼羅 IgG滴度度超過(guò)0. 08時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值開始進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明 樣品中的待檢物濃度過(guò)高，需要將樣品稀釋后再檢測(cè)。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測(cè)兔抗西 尼羅血清的動(dòng)態(tài)范圍為8. OX 1(Γ50. 08。實(shí)施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)西尼羅血清的比較1、生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測(cè)方法作為對(duì)比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟1)向普通ELISA微孔板每 孔加入50 μ L用PBS緩沖液稀釋的西尼羅E蛋白1 50 μ g，4°C靜止過(guò)夜；2)加入封閉液，在37°C封閉2小時(shí)；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測(cè)樣品，每孔50 μ L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測(cè)物，每孔50 μ L，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP (辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素)，50 μ L/孔，室溫放置3分鐘；洗液 洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50 μ L/孔，室溫放置10 分鐘；8)用 2M H2SO4 終止反應(yīng)；9)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)讀A450nm數(shù)值。2、樣品的懸浮芯片檢測(cè)方法采用間接法測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)模式，檢測(cè)過(guò)程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn) 行。1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽 濾3次；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、兩種檢測(cè)方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍及相關(guān)性的比較制備的相同一組兔抗西尼羅血E蛋白血清樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時(shí)應(yīng)用 懸浮芯片和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。繪制ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖中 橫坐標(biāo)為樣品滴度，縱坐標(biāo)為吸光度值，坐標(biāo)軸取對(duì)數(shù)_對(duì)數(shù)關(guān)系)，并與懸浮芯片方法結(jié) 果進(jìn)行比較。根據(jù)兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線懸浮芯片方法如，靈敏度為4. 9Χ 10_6(血清滴度)，線性 檢測(cè)范圍4. 9 X 10_6 2 X 10_2 ；ELISA方法如圖3所示，靈敏度為7. 8 X 10_5 (血清滴度)，線 性檢測(cè)范圍7.8Χ10_5 2Χ10_2?？梢缘贸鼋Y(jié)論檢測(cè)相同兔抗西尼羅血清樣品，蛋白懸浮 芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測(cè)靈敏度，即高10倍；并且具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，
9即高1個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果在10_6 10_2范圍內(nèi)進(jìn)行比較，如圖4所示可以判定蛋 白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0. 964。實(shí)施例7、人血清樣品的檢測(cè)1、人血清樣品的準(zhǔn)備將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5μ L加樣品稀釋液50μ L混 勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、人血清樣品的檢測(cè)1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測(cè)人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化SPA，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待檢測(cè)人血清中西尼羅抗 體的濃度。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，生物素化SPA稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例選 用1 300稀釋，經(jīng)過(guò)對(duì)94份人血清的檢測(cè)，所得的MFI值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和為 作為判斷陰陽(yáng)性的界值，即C utoff值為1103，檢測(cè)得到的MFI值如果大于1103，即血清中 的西尼羅濃度過(guò)高，可視為西尼羅抗體陽(yáng)性可能被西尼羅病毒感染，如果MFI值小于1103， 即血清中的西尼羅抗體濃度低正常值可判斷為西尼羅抗體陰性，未感染西尼羅病毒或西尼 羅病毒隱性攜帶者。
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權(quán)利要求
一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片，其特征在于，該芯片包括編碼微球，作為包被編碼微球抗原的西尼羅E蛋白，生物素標(biāo)記的二抗和SPA作為檢測(cè)物，鏈親和素 藻紅蛋白和相關(guān)緩沖溶液。
2.一種檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于，該方法具體為在 相關(guān)緩沖溶液中，編碼微球用西尼羅E蛋白抗原包被，用生物素標(biāo)記的檢測(cè)物為羊抗兔IgG 或/和Biotin-SPA、用鏈親和素-藻紅蛋白作為信號(hào)檢測(cè)物。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于，所 述編碼微球優(yōu)選為025號(hào)編碼微球。
4.一種采用蛋白懸浮芯片檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的間接免疫學(xué)檢測(cè)方法，其特征 在于，該方法包括下列步驟1)將西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來(lái)包被編碼微球；2)向檢測(cè)載體內(nèi)加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；3)加入待測(cè)血清樣品，孵育后清洗；4)加入用生物素標(biāo)記的二抗，孵育后清洗；5)加入鏈親和素_藻紅蛋白，孵育后清洗；6)加入檢測(cè)緩沖液后混合均勻；7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強(qiáng)度數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，采用生物素標(biāo)記的SPA作為檢測(cè)物，并 且其與西尼羅E蛋白組合組成間接法檢測(cè)體系。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟1)中包被所述編碼微球的西 尼羅E蛋白抗原用量為0. 1 240μ g/1. 25 X IO6個(gè)編碼微球或0. 02 960ng/2500 5000 個(gè)微球/測(cè)試。
7.一種采用蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的方法，其特征在于，該方 法包括下列步驟1)加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度倍比稀釋；2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測(cè)讀取對(duì)應(yīng)熒光值；3)制作樣品濃度對(duì)應(yīng)熒光值的劑量-反應(yīng)曲線；4)用分析軟件擬合劑量_反應(yīng)曲線和方程；5)根據(jù)劑量_反應(yīng)曲線判定動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，根據(jù)劑量_反應(yīng)方程判斷樣本中西尼羅抗 體的濃度。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中梯度倍比稀釋為4倍。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品為兔抗 西尼羅抗體。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用2mg/mL生物素化的檢 測(cè)抗體Bio-羊抗兔抗體以1 500稀釋作為檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法。本發(fā)明的方法檢測(cè)能力好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)態(tài)范圍寬，并建立了以西尼羅抗體為代表的病毒性抗體蛋白懸浮芯片檢測(cè)的開放性檢測(cè)模式化平臺(tái)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101936988SQ20101023566
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者姚李四, 孫肖紅, 楊宇, 楊永莉, 王靜, 胡孔新 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院