專利名稱：檢測方法和在所述檢測方法中使用的含有磁性材料的介電粒子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中檢測目標(biāo)物質(zhì)的檢測方法。本發(fā)明還涉及在所述檢測 方法中使用的包封磁體的介電粒子。
背景技術(shù)：
檢測方法例如雙抗夾心法和競爭法是生物測量領(lǐng)域所公知的。在雙抗夾心法中， 與抗原(其是包含在樣品中的檢測目標(biāo)物質(zhì))特異性結(jié)合的第一抗體被固定在基質(zhì)表面 上。將樣品施加在基質(zhì)上，以使檢測目標(biāo)物質(zhì)與第一抗體特異性結(jié)合。然后，將與抗原特異 性結(jié)合且具有連接其上的熒光標(biāo)記的第二抗體與抗原結(jié)合，由此形成由第一抗體、抗原和 第二抗體構(gòu)成的所謂夾心結(jié)構(gòu)。之后，檢測連接在第二抗體上的熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光。其中通過衰減光(evanescent light)激發(fā)熒光標(biāo)記的衰減熒光檢測法被提出作 為檢測由熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的方法。在衰減熒光檢測法中，使激發(fā)光束從基質(zhì)的后表面 進(jìn)入并在基質(zhì)的前表面被完全反射。熒光標(biāo)記被漏出到基質(zhì)前表面的衰減光激發(fā)。之后， 檢測由熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光。同樣的，日本未審專利公開文本No. 10(1998)-307141和“Surface Plasmon Fluorescence Measurements of Human Chorionic Gonadotrophin :Role of Antibody Orientation in Obtaining Enhanced Sensitivity and Limit of Detection", M. L. M. Vareiro et al. ,Analytical Chemistry，Vol. 77，No. 3，pp. 2426-2431，2005 提出了 利用等離子體共振的電場增強(qiáng)效應(yīng)來改善衰減熒光檢測法的靈敏性的方法。在這個(gè)表面等 離子體增強(qiáng)熒光法中，在基質(zhì)上提供了金屬層，使激發(fā)光以大于或等于總反射角的入射角 進(jìn)入基質(zhì)和金屬層之間的界面。由激發(fā)光在金屬層產(chǎn)生表面等離子體，通過表面等離子體 的電場增強(qiáng)效應(yīng)放大熒光信號，以改善S/N比。此夕卜，"High—sensitivity sensing of catechol amines using by optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy，，，K. Tsuboi et al. , Abstracts of the Spring 2007Conference of the Academy of Applied Physics, No. 3, pp.1378, 28p-SA-4中提出了利用光波導(dǎo)模(optical waveguide mode)的電場增強(qiáng)效應(yīng)來增強(qiáng)傳感 器部分的電場的方法，其與表面等離子體增強(qiáng)熒光法類似。在光波導(dǎo)模增強(qiáng)熒光光譜法中， 在傳感器部分依次提供金屬層和由電介質(zhì)或類似物構(gòu)成的光波導(dǎo)層。在光波導(dǎo)層產(chǎn)生光波 導(dǎo)模，通過它的電場增強(qiáng)效應(yīng)放大熒光信號。此外，美國專利申請公開文本No. 20050053974 and "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy", Τ. Liebermann and W. Knoll, Colloids and Surfaces A, Vol. 171，pp. 115-130，2000 提出了用于檢測發(fā)射光(radiant light)的 方法(SPCE 表面等離子體耦合發(fā)射)，所述發(fā)射光是通過由熒光標(biāo)記產(chǎn)生的熒光在金屬層 誘導(dǎo)的表面等離子體產(chǎn)生的，而不是如前述的熒光法中檢測由熒光標(biāo)記發(fā)射并由表面等離 子體放大的熒光。
如上所述，在生物測量領(lǐng)域提出了多種用于檢測由熒光標(biāo)記所標(biāo)記的檢測目標(biāo)物 質(zhì)的方法。同樣地，在與固定在基質(zhì)上的第一抗體形成夾心之后檢測熒光的情況下，則需要 分離夾心結(jié)合體和與檢測目標(biāo)物質(zhì)未進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)的第二抗體。因此，洗去這種未反應(yīng)的 第二抗體的清洗操作對于實(shí)施測量是必需的。不僅清洗操作是麻煩的，它們還是增加測量 所需時(shí)間的一個(gè)因素。此外，在一些情況下一部分檢測目標(biāo)物質(zhì)會在清洗操作期間隨上清 液一起被丟棄掉。因此，如果在樣品中檢測目標(biāo)物質(zhì)是微量成分，檢測靈敏度有可能會降 低。此外，檢測目標(biāo)物質(zhì)和第一抗體之間的反應(yīng)是第一抗體所結(jié)合的固體相表面與含有檢 測目標(biāo)物質(zhì)的溶液(液體相)之間的反應(yīng)。因此，反應(yīng)效率較差，這是阻礙快速測量的另一 因素。在這方面，日本未審專利公開文本No. 2005-077338提出了實(shí)現(xiàn)高速測量的方法， 該方法不需要清洗操作，能夠定量檢測目標(biāo)物質(zhì)，并進(jìn)一步解決了固體相和液體相之間延 遲反應(yīng)的問題。特別地，在這個(gè)方法中，第一抗體由磁性粒子標(biāo)記，第二抗體由熒光色素標(biāo) 記，不需要將第一抗體固定在基質(zhì)上即可在液體相中形成第一抗體、檢測目標(biāo)物質(zhì)、和第二 抗體的結(jié)合體。通過磁體將結(jié)合體定位以將它們與未反應(yīng)的第二抗體分離，用衰減光照射 定位的結(jié)合體以測量熒光信號，而無需清洗操作。從日本未審專利公開文本No. 2005-077338的W030]段的描述注意到從在液體 樣品中的分散特性的角度，即為了預(yù)防粒子相互聚集，磁性粒子的粒徑優(yōu)選100nm(0. Ιμπι) 或更小。同樣地，日本未審專利公開文本No. 5(1993)-264547提出了采用磁性粒子的傳感 方法。一個(gè)實(shí)施例描述了粒徑為IOOnm或更小的細(xì)粒子被用作磁性粒子。然而，在我們進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用粒徑為IOOnm或更小的磁性粒子不能重復(fù)進(jìn)行 快速定位(濃縮)結(jié)合體。即，在幾分鐘內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)濃縮，而這是實(shí)際應(yīng)用所要求的水平。同樣地，日本未審專利公開文本No. 1(1989)-272970公開了采用粒徑為幾十納米 的磁性粒子的方法。在該方法中，通過在對磁體的反應(yīng)上的差異，即通過濃縮速度上的差 異，將單個(gè)磁性粒子和磁性粒子與檢測目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合體分離，以測量來自的結(jié)合體的信 號。采用通過磁性粒子定位的檢測方法是極具吸引力的生物測量方法，因?yàn)樗鼈兡茉?液體相中反應(yīng)且避免了分離物質(zhì)結(jié)合體和未反應(yīng)的第二抗體的清洗操作。但是，這些方法 僅限于概念層面，仍未進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。通過對這些方法為何不實(shí)用的原因的研究，發(fā)明人揭示了當(dāng)實(shí)際上使用磁性粒子 定位結(jié)合體時(shí)所面臨的以下問題。1)取決于磁性粒子的儲存條件，磁性粒子有可能在用于檢測之前就磁化和聚集， 這會導(dǎo)致使用期間分散特性的劣化。2)如果磁性粒子包含金屬材料，，當(dāng)磁性粒子在光敏標(biāo)記附近時(shí)有可能發(fā)生金屬 淬滅，這是一種光學(xué)信號被金屬吸收的現(xiàn)象。這會導(dǎo)致被檢測光學(xué)信號量降低，從而導(dǎo)致信 號定量特性的劣化(波動(dòng))。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有的技術(shù)情況開發(fā)了本發(fā)明。本發(fā)明的目標(biāo)是提供通過磁性粒子定位結(jié)合 體的檢測方法，其解決了前述問題并適宜于實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟制備賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)，它是與檢測目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)， 其上連接有包封磁體的介電粒子，所述介電粒子具有包封于其中的磁性粒子并且其表面被 在液體樣品中表現(xiàn)極性的官能團(tuán)修飾；制備標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)，它是與檢測目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)和與檢測目 標(biāo)物質(zhì)競爭地與第一結(jié)合物質(zhì)特異性結(jié)合的第三結(jié)合物質(zhì)中的一種，其上連接有光敏標(biāo)記；將作為檢查目標(biāo)的液體樣品、所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)、和所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì) 混合，以進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；在含有所述液體樣品的樣品池(其中混合有賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記結(jié)合 物質(zhì))內(nèi)產(chǎn)生磁場，以使賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)移動(dòng)至樣品池內(nèi)的局部區(qū)域；在賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)移動(dòng)至所述局部區(qū)域的情況下，僅在包含所述局部區(qū)域 的預(yù)定區(qū)域上照射激發(fā)光，以引發(fā)由存在于所述預(yù)定區(qū)域內(nèi)的光敏標(biāo)記產(chǎn)生的光學(xué)信號；檢測所述光學(xué)信號；和基于測得的光學(xué)信號的量，確定液體樣品中檢測目標(biāo)物質(zhì)的量。修飾包封磁體的介電粒子的表面的官能團(tuán)的例子包括堿性官能團(tuán)例如氨基和季 銨基團(tuán)，和使粒子帶負(fù)電荷的酸性官能團(tuán)例如羧基，磺酸基，和磷酸基。此處，如果是按照雙抗夾心法進(jìn)行檢測，優(yōu)選賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)、檢測目標(biāo)物 質(zhì)、和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合體(夾心結(jié)合體)的最大長度大于或等于200nm，其中所述標(biāo)記 結(jié)合物質(zhì)是其上連接有光敏標(biāo)記的第二結(jié)合物質(zhì)。如果是按照競爭方法進(jìn)行檢測，優(yōu)選賦 予了磁性的結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合體(競爭性結(jié)合體)的最大長度大于或等于 200nm，其中所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)是其上連接有光敏標(biāo)記的第三結(jié)合物質(zhì)。此處，最大長度是 指結(jié)合體的長直徑，是基于相互連接形成結(jié)合體的多個(gè)組成部分的總長度。優(yōu)選包封磁體的介電粒子的粒徑為100nm-1 μ m,更優(yōu)選150nm-l μ m。優(yōu)選樹脂、SiO2粒子等作為電介質(zhì)。單個(gè)磁性粒子或多個(gè)磁性粒子可被包封在每個(gè)介電粒子內(nèi)?？墒褂萌魏未判圆牧?只要它能夠被磁體等產(chǎn)生的磁場吸引至局部區(qū)域。優(yōu)選鐵系磁性材料或鉬系磁性材料作為 磁性粒子的材料。如果采用鐵系磁性材料或鉬系磁性材料作為磁性粒子，希望采用紅外線 作為激發(fā)光。光敏標(biāo)記可以是在受激發(fā)光照射時(shí)發(fā)射熒光作為光學(xué)信號的那些?？蛇x地，光敏 標(biāo)記可以是在受激發(fā)光照射時(shí)產(chǎn)生散射光的那些。進(jìn)一步可選地，光敏標(biāo)記可以是在受激 發(fā)光照射時(shí)產(chǎn)生局部等離子體作為光學(xué)信號的那些。光敏標(biāo)記的具體實(shí)例包括熒光色素分 子，具有被包封在電介質(zhì)材料內(nèi)的熒光色素分子的細(xì)熒光粒子，和細(xì)金屬粒子。當(dāng)被激發(fā)光 照射時(shí)，細(xì)金屬粒子產(chǎn)生散射光并在其表面產(chǎn)生局部等離子體。在這種情況下，散射光可作 為光學(xué)信號檢測，或由局部等離子體引發(fā)的發(fā)射光可作為光學(xué)信號檢測。一部分壁具有與液體樣品接觸的樣品接觸表面的樣品池可用作樣品池，所述一部 分壁由透明電介質(zhì)板構(gòu)成。在這種情況下，所述樣品接觸表面的附近作為所述的局部區(qū)域，在全反射的條件下從由電介質(zhì)板構(gòu)成的壁的外部，將光照射在電介質(zhì)板的樣品接觸表面 上，使得在所述樣品接觸表面產(chǎn)生衰減光，而所述衰減光可作為激發(fā)光。在電介質(zhì)板的樣品接觸表面上形成金屬膜的樣品池可用作樣品池。此外，在金屬 膜上還提供有光波導(dǎo)層的樣品池可作為樣品池?？芍苯訖z測或間接檢測光學(xué)信號。如果采用裝配有其上形成金屬膜的電介質(zhì)板的樣品池，檢測由于受光學(xué)信號激發(fā) 在金屬膜上的表面等離子體所發(fā)射的發(fā)射光是用于間接檢測受激發(fā)光照射由光敏標(biāo)記產(chǎn) 生的光學(xué)信號的優(yōu)選方法。如果采用裝配有其上形成光波導(dǎo)層的金屬膜的樣品池，檢測由 于受光學(xué)信號激發(fā)光波導(dǎo)層的光波導(dǎo)模所發(fā)射的發(fā)射光是用于間接檢測受激發(fā)光照射由 光敏標(biāo)記產(chǎn)生的光學(xué)信號的優(yōu)選方法。如果光敏標(biāo)記是產(chǎn)生熒光的那些，熒光激發(fā)金屬層的表面等離子體，或光波導(dǎo)層 的光波導(dǎo)模。在另一方面，如果光敏標(biāo)記是細(xì)金屬粒子，通過激發(fā)光在細(xì)金屬粒子表面產(chǎn)生 的局部等離子體可作為激發(fā)金屬層的表面等離子體或光波導(dǎo)層的光波導(dǎo)模的光學(xué)信號。本發(fā)明的包封磁體的介電粒子包括包封其中的磁性粒子；和在液體樣品內(nèi)顯示出極性的、用于表面修飾的官能團(tuán)。優(yōu)選所述官能團(tuán)是羧基。此外，優(yōu)選磁性粒子是由鐵系磁性材料或鉬系磁性材料 形成的。本發(fā)明的檢測方法采用具有被包封在電介質(zhì)內(nèi)的磁性粒子的包封磁體的介電粒 子，其表面被在液體樣品中表現(xiàn)極性的官能團(tuán)修飾。因此，即使介電粒子內(nèi)的磁性粒子被磁 化且介電粒子在儲存期間聚集，其表面的官能團(tuán)的極性會使它們在液體樣品中相互排斥， 以改善其分散特性。此外，因?yàn)榇判粤Ｗ颖话庠陔娊橘|(zhì)內(nèi)，磁性粒子和光敏標(biāo)記在一定程 度上被分離。因此，在由金屬材料形成磁性粒子的情況下可以抑制金屬淬滅，以抑制信號強(qiáng) 度的降低和信號量的波動(dòng)。此外，與修飾磁性粒子表面的情況相比，有機(jī)物質(zhì)更易于作為介 電粒子的表面修飾。因此，可以很容易地提供官能團(tuán)作為表面修飾以及將介電粒子連接至 第一結(jié)合物質(zhì)，而不用考慮磁性粒子的材料。如果按照雙抗夾心法進(jìn)行檢測，夾心結(jié)合體的最大長度可以是200nm或更大。如 果按照競爭方法進(jìn)行檢測，競爭性結(jié)合體的最大長度可以是200nm或更大。在這些情況中， 聚集特性得到了改善，并且測量所需要的時(shí)間可縮短至實(shí)用水平(幾分鐘)。此外，包封磁體的介電粒子的粒徑可以是1OOnm或更大。在這種情況下，結(jié)合體的 大小可以很容易地變成200nm或更大，由此聚集特性得到了改善，測量所需要的時(shí)間可縮 短至實(shí)用水平(幾分鐘)。如“背景技術(shù)”部分所描述的，在本發(fā)明人所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，存在以下問題，布朗 運(yùn)動(dòng)所帶來的擾動(dòng)導(dǎo)致了慢的濃縮速度，這造成在聚集量足以進(jìn)行測量之前經(jīng)過了太長時(shí) 間。另一方面，如日本未審專利公開文本No. 2005-077338所描述的，磁性粒子的粒徑優(yōu)選 是IOOnm或更小，如果粒子粒徑超過IOOnm會出現(xiàn)分散特性劣化的問題。S卩，極難實(shí)現(xiàn)磁性 粒子的分散和聚集(獲得的磁力克服布朗運(yùn)動(dòng))。在這方面，本發(fā)明采用在其表面具有在 液體樣品內(nèi)表現(xiàn)極性的官能團(tuán)的包封磁體的介電粒子。由此，保證了在液體樣品內(nèi)的分散 特性，同時(shí)通過將結(jié)合體的最大長度設(shè)定在200nm或更大且包封磁體的介電粒子的粒徑為1OOnm-1μ m，聚集特性得到了改善。即，通過實(shí)現(xiàn)分散特性和聚集特性，本發(fā)明改善了實(shí)際 應(yīng)用的適應(yīng)性。


圖1是說明包封磁體的介電粒子的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2是解釋磁濃縮指數(shù)(magnetic concentration index)的測量方法的圖。圖3是說明磁濃縮指數(shù)對粒徑的依賴特性的圖。圖4A是說明在磁濃縮之前包封磁體的介電粒子的分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖。圖4B是說明在磁濃縮期間包封磁體的介電粒子的分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖。圖4C是說明在磁濃縮之后包封磁體的介電粒子的再分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡 圖。圖5A是說明在磁濃縮之前磁性粒子的分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖(對照實(shí)施 例)。圖5B是說明在磁濃縮期間磁性粒子的分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖(對照實(shí)施 例)。圖5C是說明在磁濃縮之后磁性粒子的再分散狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖(對照實(shí)施 例)。圖6是說明用于執(zhí)行本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法的檢測裝置的結(jié)構(gòu)示 意圖。圖7A是說明本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法的步驟圖(施加磁場之前)。圖7B是說明本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法的步驟圖(施加磁場之后)。圖8是說明用于執(zhí)行本發(fā)明第二實(shí)施方式所述的檢測方法的檢測裝置的結(jié)構(gòu)示 意圖。圖9是說明用于執(zhí)行本發(fā)明第三實(shí)施方式所述的檢測方法的檢測裝置的結(jié)構(gòu)示 意圖。
具體實(shí)施例方式下文，將參照附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方式。請注意為了方便描述，附圖中所示組成 部件的尺寸不同于實(shí)際尺寸。[包封磁體的介電粒子]首先，描述在本發(fā)明檢測方法中所用的包封磁體的介電粒子P。如圖IA和圖IB所 示的，包封磁體的介電粒子P具有一個(gè)或多個(gè)包封在其中的磁性粒子M，以及用于表面修飾 的在液體樣品內(nèi)表現(xiàn)極性的官能團(tuán)。磁性粒子M的形狀沒有特定限制，可能的形狀的實(shí)例包括球形和棒形。但是，優(yōu)選 其粒徑為IOOnm或更小，如果在包封磁體的介電粒子P中包封了多個(gè)磁性粒子M，優(yōu)選其粒 徑為15nm-40nm。磁性粒子M的材料沒有特定限制，磁性粒子M的材料的實(shí)例包括四氧化 三鐵；三氧化二鐵；多種鐵氧體(ferrite)；金屬例如鐵，錳，鎳，鈷，鉻，和鉬；和前述金屬的 合金。鐵系磁性材料例如氧化鐵和鉬系磁性材料例如含有鉬的合金是特別優(yōu)選的。電介質(zhì)材料的實(shí)例包括樹脂材料和Si02。樹脂材料的實(shí)例包括聚苯乙烯；聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；和乳膠，其中橋連材料(形成聚合物鏈之間的橋鍵的試劑，例如二乙 烯基苯和1，4_ 丁二烯)一起聚合。在圖1所示的實(shí)施例中，官能團(tuán)是羧基，其是帶有負(fù)電荷的酸性官能團(tuán)。但是，可 采用任何官能團(tuán)，只要它們在液體樣品中表現(xiàn)極性。其他官能團(tuán)的實(shí)例包括堿性官能團(tuán)例 如氨基和季銨基團(tuán)，和酸性官能團(tuán)例如磺酸基和磷酸基。包封磁體的介電粒子P的形狀沒有特定限制，可能的形狀的實(shí)例包括球形和棒 形。此外，優(yōu)選包封磁體的介電粒子的粒徑為IOOnm-I μ m,更優(yōu)選150nm-l μ m。此處請注 意，粒徑是指粒子的最大尺寸。通過進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)得出包封磁體的介電粒子P的優(yōu)選粒徑。如圖2所示的，在實(shí) 驗(yàn)中，包封磁體的介電粒子P被分散在溶液5中。然后，將磁體7放置在樣品容器6的底面 之下，以實(shí)施磁分離步驟(聚集)。在磁分離步驟之前和之后通過移液管8抽吸樣品溶液5 的上清液。用波長為500nm的光測量所抽吸上清液的光吸收程度(透明程度)。在放置磁體后一分鐘測量光吸收程度A，放置磁體之前測量樣品溶液的光吸收程 度B，作為磁分離步驟之后和之前的光吸收程度。由測量值通過公式100 · (B-A)/B (% )計(jì) 算磁濃縮指數(shù)。聚集能力(磁濃縮指數(shù))對包封磁體的介電粒子P的粒徑依賴特性如圖3 所示。在圖3中，縱軸表示磁濃縮指數(shù)，并表明隨著數(shù)值增加聚集能力越高(即磁濃縮步驟 之后的透明程度更高)。如圖3所示的，如果粒徑是IOOnm或更小，在磁分離步驟一分鐘后幾乎不發(fā)生包封 磁體的介電粒子P的聚集(定位)。在另一方面，隨著粒徑超過IOOnm濃縮指數(shù)逐漸增加。 磁分離步驟一分鐘之后，粒徑為150nm濃縮指數(shù)是約50%，粒徑200nm為80%，粒徑300nm 基本為100%。即，很明顯粒徑大于IOOnm會很快發(fā)生聚集?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為200nm或更大的粒徑是在實(shí)際可用水平(此處一分 鐘)進(jìn)行定位所必需的。請注意，通過將粒徑調(diào)整為200nm-l μ m可以實(shí)現(xiàn)足以用于實(shí)際應(yīng) 用的濃縮速度。但是，如果粒徑過大，會存在降低分散特性的問題。從分散特性的角度，優(yōu) 選更小粒徑。因此，粒徑為200nm是最佳的。然而，前述實(shí)驗(yàn)僅測量包封磁體的介電粒子P的聚集能力。事實(shí)上，聚集的實(shí)施是 在形成通過抗原抗體反應(yīng)形成的夾心結(jié)合體或競爭性結(jié)合體的狀態(tài)下進(jìn)行的。因此，認(rèn)為 每個(gè)夾心結(jié)合體或每個(gè)競爭性結(jié)合體作為整體的粒徑(最大長度)是200nm或更大。艮口， 即使包封磁體的介電粒子的粒徑小于200nm，只要根據(jù)檢測方法與標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合體 的粒徑為200nm或更大，就可實(shí)現(xiàn)足以用于實(shí)際應(yīng)用的濃縮速度。如果TF抗體是檢測目標(biāo)物質(zhì)，構(gòu)成夾心結(jié)合體的抗體的大小是大約15nm和幾納 米(不超過lOnm)。如果包封磁體的介電粒子的粒徑是lOOnm，通過采用大約IOOnm的熒光 微球作為標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)中的標(biāo)記，結(jié)合體可實(shí)現(xiàn)200nm或更大的最大長度。如果包封磁體 的介電粒子的粒徑是大約160nm，結(jié)合體可實(shí)現(xiàn)200nm或更大的最大長度，即使采用熒光色 素(大小不超過Inm)例如cy-3和cy-5作為標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)中的標(biāo)記。下面描述包封磁體的介電粒子的分散特性。圖4A至4C是本發(fā)明所用的粒徑為150nm的包封磁體的介電粒子的各種狀態(tài)的暗 視野顯微鏡圖，當(dāng)它們最初分散至溶液中(圖4A)，由于施加磁場的磁聚集期間(圖4B)，和 停止施加磁場之后(圖4C)。
出于對照目的，圖5A至5C是與包封磁體的介電粒子的相同粒徑的磁性粒子的 各種狀態(tài)的暗視野顯微鏡圖，當(dāng)它們最初分散至溶液中(圖5A)，由于施加磁場的磁聚 集期間(圖5B)，和停止施加磁場之后(圖5C)。請注意，通過文獻(xiàn)中公開的優(yōu)選已知 方法修飾包封磁體的介電粒子和磁性粒子的表面。即，通過以下公開的方法用羧基修 飾包封磁體的介電粒子的表面日本未審專利公開文本No. 2007-045982的W003]段； "Preparation and Characterization of Monodisperse magnetic Poly(styrene butyl acrylate methacrylic acid)Microspheres in the Presence of a Polar Solvent", G. Xie et al. , Journal of Applied Polymer Science, Vol. 87, pp.1733-1738,2003 ；禾口 "Synthesizing Particles"of "Manufacture of Polystyrene Standard Particles and Their Applications，，，M. Higata et al. , Aerosol Research, Vol. 22, No. 4, pp. 282-288, 2007的3. 1章，其中“具有羧基的磁性聚合物粒子是通過共聚合不帶電單體例如苯乙烯 和具有羧基的單體例如丙烯酸合成的”。通過以下所公開的方法用羧基修飾磁性粒子表 面"Controlling Dispersion Properties，，of “Functionalization of Inorganic Nanoparticles with Organic Molecules，，，A. Narita and Y. Chujo, Papers Regarding Polymer Molecules, Vol. 65，pp.321—333，2008 的 3. 1 章；和"Synthesis of iron oxide nanoparticles under oxidizing environment and their stabilization in aqueous and non-aqueous media，，，D. Maity and D. C. Agrawal, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, Vol. 308，pp.46-55,2007。在圖4A至4C和圖5A至5C中，亮的(白色)部分是顯示粒子的地方。在圖5A中，可觀察到在最初分散期間磁性粒子之間發(fā)生局部聚集，而在最初分散 期間包封磁體的介電粒子均勻分散，僅有很少的聚集。在圖4B和圖5B中，可觀察到當(dāng)施加磁場時(shí)，包封磁體的介電粒子和磁性粒子都聚 集并沿磁場線定位。請注意相對于磁性粒子，包封磁體的介電粒子以更線性方式沿磁場線 定位。在圖5C中，觀察到磁性粒子是相互聚集的狀態(tài)。相反地，圖4C整體是亮的且難以 區(qū)分每個(gè)粒子，但可觀察到包封磁體的介電粒子沒有相互聚集并開始再分散。磁性粒子的分散特性低于包封磁體的介電粒子的分散特性，甚至在通過最佳表面 修飾方法用官能團(tuán)修飾各自表面的情況下。相信這是由于提供給磁性粒子表面作為表面修 飾的官能團(tuán)的絕對數(shù)量遠(yuǎn)低于包封磁體的介電粒子的，這造成了磁化引起的吸引力變得強(qiáng) 于官能團(tuán)極性引起的粒子之間的排斥力。如上所述，與磁性粒子相比，包封磁體的介電粒子具有高得多的分散特性。并認(rèn)為 即使由于儲存條件，在包封磁體的介電粒子內(nèi)的磁性粒子被磁化并且介電粒子聚集，包封 磁體的介電粒子可在液體樣品中分散而不聚集。下文所述的本發(fā)明檢測方法中采用包封磁體的介電粒子。因此，易于進(jìn)行表面修 飾，并可獲得高分散特性。此外，在檢測光學(xué)信號期間當(dāng)光敏標(biāo)記被激發(fā)時(shí)，如果光敏標(biāo)記 在金屬材料附近由于能量轉(zhuǎn)移會發(fā)生金屬淬滅。然而，在包封磁體的介電粒子中，磁性粒子 被包封在電介質(zhì)內(nèi)。因此，磁性粒子和光敏標(biāo)記可從一定程度上分離，并抑制金屬淬滅。[檢測方法的第一實(shí)施方式]本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法是檢測生物樣品(尿液，血液，粘液)中是否存在抗原和/或其存在量(濃度)的生物傳感方法，其中抗原是檢測目標(biāo)物質(zhì)，生物樣品是 檢查的目標(biāo)。圖6是說明用于執(zhí)行本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法的檢測裝置的結(jié)構(gòu) 示意圖。圖7A和7B是解釋本發(fā)明第一實(shí)施方式所述的檢測方法的步驟的圖解。第一實(shí)施方式的檢測方法所用的樣品池10具有透明電介質(zhì)板11作為它的底面， 這是具有樣品接觸表面的樣品池10的接觸液體樣品S的壁。金屬膜12在樣品接觸表面一 側(cè)的電介質(zhì)板11上通過氣相沉積等形成。請注意，形成金屬膜12的區(qū)域構(gòu)成傳感器部件 14。優(yōu)選確定金屬層12的厚度使得表面等離子體被強(qiáng)烈激發(fā)，同時(shí)考慮金屬層12a的材料 和激光束LO的波長。例如，如果采用中心波長為780nm的激光束作為激發(fā)光束，采用Au膜 作為金屬層12，金屬層12的優(yōu)選厚度是50nm士20nm。在這種情況下，更優(yōu)選金屬層12的 厚度是47nm士 10nm。請注意，優(yōu)選金屬層12a是具有Au，Ag，Cu，Al，Pt，Ni，Ti，和它們的合 金中的至少一種作為主要成分的金屬。圖6所示的檢測裝置1裝配有用于將激發(fā)光僅照射在樣品池10內(nèi)的預(yù)定區(qū)域上 的激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20 ；設(shè)置在樣品池10上方的用于檢測熒光的光檢測器30 ；和用于 施加磁場使樣品池10內(nèi)形成的夾心結(jié)合體移動(dòng)(聚集)至金屬膜12附近的局部區(qū)域的磁 場施加裝置35。激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20發(fā)射激光束LO使得它以滿足全反射條件的入射角通過電 介質(zhì)板11的底面進(jìn)入電介質(zhì)板11和金屬層12之間的界面，以在金屬膜12上產(chǎn)生衰減光 作為激發(fā)光。衰減光漏入的區(qū)域E是在來自界面的激光束LO的約單波長內(nèi)。該區(qū)域E對 應(yīng)預(yù)定區(qū)域。激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20裝配有由半導(dǎo)體激光器(LD)構(gòu)成的光源21，用于輸 出激光束LO ；和棱鏡22，其表面之一與電介質(zhì)板11接觸。棱鏡22引導(dǎo)激光束LO進(jìn)入電介 質(zhì)板11使得激光束LO在電介質(zhì)板11和金屬層12之間的界面上被完全反射。請注意，棱 鏡22和電介質(zhì)板11可整體形成，或通過折射率匹配油(refractive index matching oil) 接觸。定位光源21使得激光束LO以大于或等于全反射角的特定角度(可引發(fā)表面等離子 體共振)通過棱鏡22進(jìn)入電介質(zhì)板和金屬膜之間的界面。激光束LO可以包含所述特定角 度的扇束發(fā)射。而且，如有必要可在光源21和棱鏡22之間提供光引導(dǎo)元件。請注意，為了 優(yōu)選誘發(fā)表面等離子體，激光束LO以ρ偏振光進(jìn)入界面?？梢宰鳛楣鈾z測器30的光檢測器的實(shí)例包括(XD’ s, PD' s (光電二極管)，光電 倍增管，和c-MOS’ S。磁場施加裝置35可以是電磁體，或永磁體。如果采用電磁體，當(dāng)要將磁性粒子移 動(dòng)至局部區(qū)域時(shí)，將電流流經(jīng)線圈以產(chǎn)生磁場。如果采用永磁體，當(dāng)要將磁性粒子移動(dòng)至局 部區(qū)域時(shí)，如圖6所示，磁體可放置在傳感器部件14之下。當(dāng)停止施加磁場時(shí)，磁體被轉(zhuǎn)移 至不再在傳感器部件14附近產(chǎn)生磁場的位置。永磁體的實(shí)例包括鋁鎳鈷磁體，鐵氧體磁 體，MK鋼，KS鋼，釤鈷磁體，和釹磁體。然而，用作永磁體的磁體類型沒有特別限制。下面描述根據(jù)第一實(shí)施方式的檢測方法的生物傳感方法的步驟。圖7A和圖7B是 說明施加磁場之前和之后的樣品池的示意圖。在第一實(shí)施方式的檢測方法中，首先，制備賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm，它是與檢測 目標(biāo)物質(zhì)A特異性結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)Bi，其上連接有包封磁體的介電粒子P，該粒子具 有包封在其中的磁性粒子M以及用在液體樣品內(nèi)呈極性的官能團(tuán)修飾的表面。接下來，制 備標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)B0，其是與檢測目標(biāo)物質(zhì)A特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)B2，其上連接有光敏標(biāo)記0。此處，第一結(jié)合物質(zhì)Bl和第二結(jié)合物質(zhì)是與檢測目標(biāo)物質(zhì)A即抗原的不同部位 (表位)結(jié)合的第一抗體和第二抗體。使用作為表面修飾的羧基的胺偶聯(lián)方法可用于將抗 體固定在包封磁體的介電粒子P上。采用熒光色素分子作為光敏標(biāo)記0。請注意，本發(fā)明的光敏標(biāo)記0不限于熒光色素 分子并且可以是任何類型的光敏標(biāo)記，只要它受激發(fā)光照射后產(chǎn)生光學(xué)信號。這種光敏標(biāo) 記的實(shí)例包括受激發(fā)光照射后產(chǎn)生熒光的那些，例如細(xì)熒光粒子，其中熒光色素分子被包 封在透明材料內(nèi)，和量子點(diǎn)；和產(chǎn)生散射光或局部等離子體的那些，例如細(xì)金屬粒子。接下來，如圖7A所示的，將作為檢查目標(biāo)的液體樣品S、賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm 和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO混合以引發(fā)結(jié)合反應(yīng)。請注意，將賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm和標(biāo)記結(jié) 合物質(zhì)BO混合到液體樣品S中的時(shí)間選擇沒有特別限制。這兩者可以同時(shí)或先后混合到 液體樣品S中。如果液體樣品S中存在抗原A，賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm(第一抗體Bi)、 抗原A、和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO (第二抗體Bi)會形成的夾心結(jié)合體。之后，在裝有液體樣品S的樣品池10內(nèi)產(chǎn)生磁場，液體樣品S中混合了賦予了磁 性的結(jié)合物質(zhì)Bm和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)B0。如圖7B所示的，賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm朝金屬 膜12表面移動(dòng)，金屬膜12是在樣品池10內(nèi)的局部區(qū)域。在賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm移 動(dòng)至金屬膜12的表面的狀態(tài)下，進(jìn)行光學(xué)信號的檢測。當(dāng)賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm向局部區(qū)域移動(dòng)時(shí)，結(jié)果與賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì) Bm形成夾心結(jié)合體的抗原A和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO也向包含局部區(qū)域的預(yù)定區(qū)域移動(dòng)。同時(shí)， 未反應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO漂浮在液體樣品內(nèi)而不向預(yù)定區(qū)域移動(dòng)。即，在混合的標(biāo)記結(jié)合 物質(zhì)中，僅與抗原A反應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO被定位在預(yù)定區(qū)域內(nèi)。因此，通過在包含局部區(qū)域的預(yù)定區(qū)域上照射激發(fā)光，并引發(fā)預(yù)定區(qū)域內(nèi)存在的 光敏標(biāo)記0產(chǎn)生光學(xué)信號，可獲得來自與抗原進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)記的信號。激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20使激光束LO在全反射條件下進(jìn)入電介質(zhì)板11和金屬膜 12之間的界面。當(dāng)激光束LO在界面被完全反射時(shí)，衰減光漏出至金屬膜12的表面，也產(chǎn)生 表面等離子體。表面等離子體放大衰減光，放大的衰減光激發(fā)作為光敏標(biāo)記0的熒光色素 分子，以產(chǎn)生熒光Lf。即，在第一實(shí)施方式中，衰減光是激發(fā)作為光敏標(biāo)記的熒光色素分子 的激發(fā)光，而衰減光所漏入的包含金屬膜12表面的區(qū)域E是預(yù)定區(qū)域。光檢測器30檢測熒光Lf。通過表面等離子體共振的電場增強(qiáng)效應(yīng)也放大了熒光 Lf的強(qiáng)度。因此獲得了具有良好的S/N比的信號。檢測目標(biāo)物質(zhì)的量是由檢測到的熒光Lf的量得出。檢測目標(biāo)物質(zhì)的量(濃度) 可以基于表示熒光檢測量和濃度之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。此處請注意，檢測目標(biāo)物質(zhì)的 量的得出包括測定是否存在檢測目標(biāo)物質(zhì)。第一實(shí)施方式的檢測方法是在液體相中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。因此，相對于包括結(jié)合固 體相的結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)速度更快。此外，因?yàn)榱Ｗ臃稚⑻匦愿鼉?yōu)，進(jìn)一步改善了反應(yīng)速度。通 過采用包封磁體的介電粒子有效地使夾心結(jié)合體移動(dòng)至傳感器部件，易于使與作為檢測目 標(biāo)物質(zhì)的抗原反應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)和未反應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)分離。通過采用粒徑為IOOnm 或更大的包封磁體的介電粒子形成200nm或更大的夾心結(jié)合體，施加磁場期間的濃縮速度 (結(jié)合體被定位在局部區(qū)域的速度)是適宜于實(shí)際應(yīng)用的水平。而且，當(dāng)檢測光學(xué)信號期間 光敏標(biāo)記被激發(fā)時(shí)，如果光敏標(biāo)記在金屬材料附近由于能量轉(zhuǎn)移會發(fā)生金屬淬滅。但是，在包封磁體的介電粒子中，磁性粒子被包封在電介質(zhì)內(nèi)。因此，磁性粒子和光敏標(biāo)記在一定程 度上被分離，會抑制金屬淬滅。由此，改善了光學(xué)信號的S/N比，并抑制了信號量的波動(dòng)。請注意在第一實(shí)施方式中，通過在電介質(zhì)板11上提供金屬膜12以利用表面等離 子體共振的電場增強(qiáng)效應(yīng)來改善S/N比。然而，本發(fā)明的檢測方法可應(yīng)用于不采用金屬膜 12的衰減熒光檢測法，和通過采用包封磁體的介電粒子獲得前述有利效應(yīng)。[檢測方法的第二實(shí)施方式]下面參照圖8描述本發(fā)明第二實(shí)施方式的檢測方法和用于執(zhí)行檢測方法的檢測 裝置2。在以下描述中，與第一實(shí)施方式相同的結(jié)構(gòu)元件將以相同的附圖標(biāo)記表示，并省略 了對其的具體描述。檢測裝置2與第一實(shí)施方式裝置1的區(qū)別在于光檢測器30的放置和 由此檢測光學(xué)信號的方法。在第二實(shí)施方式中，光檢測器30位于樣品池10的傳感器部件14的下方，用以檢 測來自被熒光(由熒光標(biāo)記通過激發(fā)產(chǎn)生)再次激發(fā)的在金屬表面的表面等離子體的發(fā)射 光Lp，其向與形成金屬膜的一側(cè)相對的電介質(zhì)板11 一側(cè)的方向發(fā)射。第二實(shí)施方式的檢測方法的傳感步驟與第一實(shí)施方式的相同。第二實(shí)施方式與第 一實(shí)施方式的區(qū)別在于檢測發(fā)射光Lp作為光學(xué)信號被檢測而不是直接檢測熒光，所述發(fā) 射光是由于熒光再次激發(fā)在金屬膜12表面上的表面等離子體產(chǎn)生的，所述熒光是來自光 敏標(biāo)記0的光學(xué)信號。在第二實(shí)施方式中，將液體樣品S、賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm、和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BO 在樣品池10內(nèi)混合以通過結(jié)合反應(yīng)形成夾心結(jié)合體。之后，將磁體35設(shè)置于電介質(zhì)板11 之下以使夾心結(jié)合體朝傳感器部件14移動(dòng)。與第一實(shí)施方式中的相同，當(dāng)夾心結(jié)合體移動(dòng) 至傳感器部件14時(shí)，由激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20發(fā)射激光束L0。由激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20朝電介質(zhì)板11和金屬膜12之間的界面發(fā)射激光束L0， 使得滿足全反射的條件。當(dāng)激光束LO在界面完全反射時(shí)，衰減光漏入金屬膜12的樣品S 上，并產(chǎn)生表面等離子體。表面等離子體放大衰減光，且放大的衰減光激發(fā)作為光敏標(biāo)記0 的熒光色素分子以產(chǎn)生熒光Lf。通過表面等離子體放大熒光Lf，且在金屬膜12表面重新 產(chǎn)生表面等離子體。由此，由表面等離子體引發(fā)的發(fā)射光Lp以特定角度照射在電介質(zhì)板11 的下側(cè)。通過光檢測器30檢測發(fā)射光Lp以檢測與熒光標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BF結(jié)合的檢測目標(biāo) 物質(zhì)A是否存在和/或其存在量。當(dāng)熒光Lf與金屬層12上的特定波數(shù)的表面等離子體偶聯(lián)時(shí)會產(chǎn)生發(fā)射光Lp。熒 光Lf的波長決定了與表面等離子體發(fā)生偶聯(lián)的波數(shù)。因此，發(fā)射光Lp的照射角度由波數(shù) 決定。通常，激光束LO的波長和熒光Lf的波長是不同的。因此，由熒光Lf激發(fā)的表面等 離子體的波數(shù)不同于受激光束LO激發(fā)的表面等離子體的波數(shù)，因此，發(fā)射光Lp的照射角度 不同于激光束LO的入射角。同樣在第二實(shí)施方式中，采用由包封磁體的介電粒子P和第一結(jié)合物質(zhì)Bl構(gòu)成的 賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm進(jìn)行檢測，通過施加磁場裝置例如磁體使包封磁體的介電粒子P 向傳感器部件移動(dòng)，同時(shí)產(chǎn)生熒光。檢測由放大熒光產(chǎn)生的發(fā)射光。因此，可獲得與第一實(shí) 施方式相同的有利效果。而且，第二實(shí)施方式從傳感器背面檢測由傳感器表面產(chǎn)生的熒光所產(chǎn)生的光。因 此，熒光Lf穿過吸收光的介質(zhì)的距離可縮短至幾十納米。因此，例如血液的光吸收變得可被忽略，可以不實(shí)施通過離心從血液中去除色素成分例如紅血球，或使血液通過血液細(xì)胞 過濾器以獲得血清或血漿的預(yù)備步驟而進(jìn)行測量。[檢測方法的第三實(shí)施方式]下面參照圖9描述本發(fā)明第三實(shí)施方式的檢測方法和用于執(zhí)行檢測方法的檢測 裝置3。第三實(shí)施方式的檢測裝置3的結(jié)構(gòu)與第一實(shí)施方式的裝置1相同。但是，第三實(shí)施 方式所使用的樣品池10’不同于第一和第二實(shí)施方式的樣品池10，其中傳感器部件14還配 置有設(shè)置在金屬膜12表面上的光波導(dǎo)層13。第三實(shí)施方式的檢測方法的傳感步驟與第一和第二實(shí)施方式的相同。第三實(shí)施方 式與第一和第二實(shí)施方式的區(qū)別在于傳感器部件14的電場增強(qiáng)原理。在第三實(shí)施方式中，由激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)20發(fā)射激光束LO使得它在全反射條 件下進(jìn)入電介質(zhì)板和金屬膜之間的界面。當(dāng)激光束LO在全反射條件下進(jìn)入界面時(shí)，在傳感 器部件14上產(chǎn)生衰減光作為激發(fā)光，這與第一和第二實(shí)施方式中的方式相同。衰減光激發(fā) 光波導(dǎo)層13的光波導(dǎo)模，以放大漏在光波導(dǎo)層13表面上的衰減光。第三實(shí)施方式與第一 實(shí)施方式的區(qū)別在于通過光波導(dǎo)模的激發(fā)來放大衰減光。光波導(dǎo)層13的厚度沒有特別限制，考慮激光束LO的波長和入射角和光波導(dǎo)層 13的折射率，可以確定厚度使得引發(fā)光波導(dǎo)模。例如，如果采用中心波長為780nm的激光 束作為激光束LO且采用單層的二氧化硅膜作為光波導(dǎo)層13，優(yōu)選光波導(dǎo)層13的厚度為 500nm-600nmo光波導(dǎo)層13可以是包括至少一個(gè)由光波導(dǎo)材料構(gòu)成的內(nèi)部光波導(dǎo)層的層合 結(jié)構(gòu)，優(yōu)選該層合結(jié)構(gòu)是交替的層合結(jié)構(gòu)，其中從金屬膜一側(cè)按此順序交替提供內(nèi)部光波 導(dǎo)層和內(nèi)部金屬層。請注意由熒光色素分子發(fā)射的熒光也可通過光波導(dǎo)模的電場增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)。通過 光檢測器30檢測熒光來檢測與標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)BF結(jié)合的檢測目標(biāo)物質(zhì)是否存在和/或其存在量。同樣在第二實(shí)施方式中，采用由包封磁體的介電粒子P和第一結(jié)合物質(zhì)Bl構(gòu)成的 賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)Bm進(jìn)行檢測，通過施加磁場裝置例如磁體使包封磁體的介電粒子P 向傳感器部件移動(dòng)，同時(shí)檢測熒光。因此，可獲得與第一實(shí)施方式相同的有利效果。請注意，裝配有光波導(dǎo)層13的樣品池10’的結(jié)構(gòu)使得從傳感器部件14下面按照 第二實(shí)施方式的檢測方法檢測發(fā)射光。在這種情況下，熒光(其是由作為光敏標(biāo)記的熒光 色素分子發(fā)射的光學(xué)信號)再次激發(fā)光波導(dǎo)層的光波導(dǎo)模，且通過檢測伴隨光波導(dǎo)模激發(fā) 的發(fā)射光間接檢測光學(xué)信號。如以上每個(gè)實(shí)施方式所述的，本發(fā)明的檢測方法檢測由在預(yù)定區(qū)域內(nèi)的受激發(fā)的 光敏標(biāo)記產(chǎn)生的光學(xué)信號?？芍苯訖z測或間接檢測由光敏標(biāo)記產(chǎn)生的光學(xué)信號(以上實(shí)施 方式中的熒光)。在以上每個(gè)實(shí)施方式中，描述了采用非競爭雙抗夾心法檢測的傳感方法。但是，本 發(fā)明的檢測方法不僅可應(yīng)用于雙抗夾心法，還可應(yīng)用于采用競爭方法檢測的傳感方法。如 果按競爭方法進(jìn)行檢測，可采用第三結(jié)合物質(zhì)作為標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)，所述第三結(jié)合物質(zhì)與和 檢測目標(biāo)物質(zhì)A競爭的第一結(jié)合物質(zhì)(第一抗體)特異性結(jié)合。此外，以上所述的每個(gè)實(shí)施方式采用熒光色素分子作為光敏標(biāo)記。細(xì)金屬粒子是 光敏標(biāo)記的另一優(yōu)選實(shí)例?？捎脕碜鳛闃?biāo)記的細(xì)金屬粒子可以是至少的細(xì)粒子，其粒徑使得受光照射時(shí)產(chǎn)生局部等離子體。細(xì)金屬粒子的形狀沒有特別限制，可 能形狀的實(shí)例包括球形和棒形。細(xì)金屬粒子散射衰減光以產(chǎn)生可作為光學(xué)信號被檢測的散 射光?？蛇x地，如果采用具有選自金(Au)，銀(Ag)，銅(Cu)，鋁(Al)，鉬(Pt)，鎳(Ni)，鈦 (Ti)，和它們的合金的至少一種金屬作為主要成分的材料作為細(xì)金屬粒子的材料(或粒子 表面的金屬膜的材料)，當(dāng)受激發(fā)光照射時(shí)，在細(xì)金屬粒子表面產(chǎn)生局部等離子體。結(jié)構(gòu)可 以調(diào)整，其中局部等離子體作為激發(fā)金屬膜的表面等離子體或激發(fā)光波導(dǎo)層的光波導(dǎo)模的 光學(xué)信號，并檢測伴隨這種激發(fā)的發(fā)射光。請注意在這種情況下，優(yōu)選細(xì)金屬粒子的粒徑小 于激發(fā)光的波長，以有效激發(fā)局部等離子體。 如以上實(shí)施方式中描述的產(chǎn)生衰減光的光學(xué)系統(tǒng)通常用作僅將光照射到預(yù)定區(qū) 域的激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)。但是，如果采用當(dāng)受雙光子吸收激發(fā)而發(fā)射熒光的聚合物作為 光敏標(biāo)記，需要照射具有極高能量水平的光以引發(fā)雙光子吸收激發(fā)。在這種情況下，可采用 如下激發(fā)光照射光學(xué)系統(tǒng)其中通過具有高NA的物鏡將激光束集中在固定夾心結(jié)合體定 位的預(yù)定區(qū)域，使得激光束充當(dāng)僅在預(yù)定區(qū)域內(nèi)引發(fā)雙光子吸收激發(fā)的激發(fā)光。
權(quán)利要求
檢測方法，其包括以下步驟制備賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)，它是與檢測目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)，其上連接有包封磁體的介電粒子，所述介電粒子具有包封于其中的磁性粒子并且其表面被在液體樣品中表現(xiàn)極性的官能團(tuán)修飾；制備標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)，它是與所述檢測目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)和與所述檢測目標(biāo)物質(zhì)競爭地與所述第一結(jié)合物質(zhì)特異性結(jié)合的第三結(jié)合物質(zhì)中的一種，其上連接有光敏標(biāo)記；將作為檢查目標(biāo)的液體樣品、所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)、和所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)混合，以進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；在含有所述液體樣品的其中混合有所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)和所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)的樣品池內(nèi)產(chǎn)生磁場，以使所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)移動(dòng)至樣品池內(nèi)的局部區(qū)域；在所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)移動(dòng)至所述局部區(qū)域的情況下，僅在包含所述局部區(qū)域的預(yù)定區(qū)域上照射激發(fā)光，以引發(fā)由存在于所述預(yù)定區(qū)域內(nèi)的光敏標(biāo)記產(chǎn)生的光學(xué)信號；檢測所述光學(xué)信號；和基于測得的光學(xué)信號的量，確定所述液體樣品中所述檢測目標(biāo)物質(zhì)的量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)、所述檢測目標(biāo)物 質(zhì)、和所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合體的最大長度大于或等于200nm，所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)是其上 連接有光敏標(biāo)記的第二結(jié)合物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述賦予了磁性的結(jié)合物質(zhì)和所述標(biāo)記結(jié)合 物質(zhì)的結(jié)合體的最大長度大于或等于200nm，所述標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)是其上連接有光敏標(biāo)記的 第三結(jié)合物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述包封磁體的介電粒子的粒徑為 IOOnm-I μ m。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，采用鐵系磁性材料和鉬系磁性材料中的一種 作為所述磁性粒子；且采用紅外線作為所述激發(fā)光。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的檢測方法，其中采用一部分壁具有與液體樣品接觸的樣品接觸表面的樣品池作為所述樣品池，所述一 部分壁由透明電介質(zhì)板構(gòu)成；以所述樣品接觸表面的附近作為所述的局部區(qū)域；在全反射的條件下從由電介質(zhì)板構(gòu)成的壁的外部，將光照射在所述電介質(zhì)板的樣品接 觸表面上，使得在所述樣品接觸表面產(chǎn)生衰減光；和采用所述衰減光作為激發(fā)光。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其中，采用在電介質(zhì)板的樣品接觸表面上形成有金 屬膜的樣品池作為所述樣品池。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其中，采用裝配有提供在所述金屬膜上的光波導(dǎo)層 的樣品池作為所述樣品池。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，直接檢測由光敏標(biāo)記受激發(fā)光照射產(chǎn)生的光 學(xué)信號。
10.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其中，通過檢測由于光學(xué)信號在金屬膜上激發(fā)表面等離子體而發(fā)射的發(fā)射光，間接檢測由光敏標(biāo)記受激發(fā)光照射產(chǎn)生的光學(xué)信號。
11.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其中，通過檢測由于光學(xué)信號在光波導(dǎo)層上激發(fā)光 波導(dǎo)模而發(fā)射的發(fā)射光，間接檢測由光敏標(biāo)記受激發(fā)光照射產(chǎn)生的光學(xué)信號。
12.權(quán)利要求1所述檢測方法中所用的包封磁體的介電粒子，其包括 包封在其中的磁性粒子；和用于表面修飾的在液體樣品中表現(xiàn)極性的官能團(tuán)。
13.如權(quán)利要求12所述的包封磁體的介電粒子，其中，所述官能團(tuán)是羧基。
14.如權(quán)利要求12所述的包封磁體的介電粒子，其中，其粒徑為100nm-1μ m。
15.如權(quán)利要求12-14任一所述的包封磁體的介電粒子，其中，采用鐵系磁性材料和鉬 系磁性材料中的一種作為所述磁性粒子。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測方法和在該方法中使用的含有磁性材料的介電粒子。為了改善采用通過磁性粒子定位結(jié)合物的檢測方法的實(shí)際應(yīng)用，將磁性結(jié)合物質(zhì)Bm和標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)B0與液體樣品混合以發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，磁性結(jié)合物質(zhì)Bm是與目標(biāo)物質(zhì)A特異性結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)B1，其上連接有包封磁體的介電粒子P(其中包封著磁性粒子M且其表面被在液體樣品中表現(xiàn)極性的官能團(tuán)修飾)，標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)B0是與目標(biāo)物質(zhì)A特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)B2，其上連接有光敏標(biāo)記O。在樣品池10內(nèi)產(chǎn)生磁場，使磁性結(jié)合物質(zhì)Bm移動(dòng)至局部區(qū)域。激發(fā)光僅照射在包括局部區(qū)域的預(yù)定區(qū)域，當(dāng)磁性結(jié)合物質(zhì)Bm移動(dòng)至局部區(qū)域，其中光敏標(biāo)記O產(chǎn)生光學(xué)信號。檢測該光學(xué)信號。
文檔編號G01N33/543GK101988922SQ20101024347
公開日2011年3月23日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者大塚尚 申請人:富士膠片株式會社